4 ERGEBNISSE
4.5 M OLEKULARE E PIDEMIOLOGIE DEUTSCHER PRRSV-I SOLATE
Um die genetische Diversität aktueller deutscher PRRSV-Isolate beurteilen zu können, wurden die Sequenzen miteinander und mit weiteren EU-Typ-Isolaten aus Europa verglichen.
Die Sequenzvergleiche basieren auf den Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von 232 PRRSV-Isolaten aus den verschiedenen Regionen Deutschlands. Dafür wurden die vollständigen Sequenzen des ORF5 verwendet. Die Sequenzierung des ORF5 der PRRSV-Isolate aus Niedersachsen und Nordrhein Westfalen (n = 184 + 23), Sachsen-Anhalt (n = 13), Baden Württemberg (n = 6) und Bayern (n = 6) ergab, dass insgesamt 133 EU-Typ-Isolate und 99 NA-Typ-EU-Typ-Isolate differenziert werden konnten. Darüber hinaus wurden zur Untersuchung, ob es eine typisch deutsche Clusterbildung innerhalb des europäischen Genotyps gibt, weitere 36 Sequenzen aus der PRRSV-Datenbanki und NCBI sowie die Sequenzen von den Impfstämmen Porcilis®PRRS, Ingelvac®PRRS MLV, vom amerikanischen Referenzstamm VR2332 sowie vom EU-Referenzstamm Lelystad für die phylogenetische Analyse herangezogen. Um nur jeweils einen Vertreter von Isolaten mit identischen Sequenzen in die Berechnung einzubeziehen, wurden Isolate eines Genomabschnittes mit vollständig identischen Sequenzen mit Hilfe der Alignment-Programme BioEdit© und CLUSTAL-X© bestimmt.
Während sich die Nukleotidsequenzen der EU-Typ-Isolate sehr heterogen erwiesen, konnten die NA-Typ-Isolate lediglich in zwei Cluster gruppiert werden. Die NA-Typ-Isolate gruppierten sich in das schon bekannte NA-Referenzstamm Cluster (NA-I) und die eine Gruppe von Isolaten (H-16-2), die eine Nukleotididentität von nur noch 96,7 % gegenüber dem NA-Impfstamm Ingelvac®PRRS MLV zeigten (NA-II). Insgesamt war die Diversität der Nukleotidsequenzen innerhalb dieses Genotyps deutlich geringer als innerhalb des EU-Genotyps (Tabelle 13). Die Nukleotididentiät im ORF5 zwischen den EU-Typ-Isolaten variierte zwischen 81,4 und 100 %. Die Identität zwischen den EU-Wildtyp-Isolaten und dem NA-Impfstamm Ingelvac®PRRS MLV variierte zwischen 58,6 und 62,5 %.
Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen der EU-Typ-Isolate waren ebenfalls sehr heterogen (Abbildung 37). Vier hypervariable Bereiche wurden lokalisiert. Neben der hypervariablen N-terminalen Region (Position 4-35) wurden auch an den Positionen 57-72, 100-130 und 159-180 hypervariable Domänen festgestellt. Die Identitäten der Aminosäuresequenzen mit dem EU-Referenzstamm Lelystad lagen zwischen 83 % und 99,6 %.
Abbildung 34: Phylogenetische Analyse mit 89 Nukleotidsequenzen des ORF5, durchgeführt mit der N-J-Methode (Kimura-2-Parameter); Gesamtübersicht;
DV-EU
Ergebnisse
Die phylogenetischen Analysen wurden mit Einzelsequenzen mit der N-J-Methode und CLUSTALX© durchgeführt. Die Darstellung der Baumtopologie erfolgte als rechtwinkliges Phylogramm und als Kladogramm mit den Programmen TreeView© und MEGA© (3.3.16) (Abbildung 34, 35 und 36). Der Übersicht halber wurden nur 89 Sequenzen im Baum dargestellt. Nur einzelne identische Sequenzen der Cluster wurden aufgeführt.
Für die phylogenetische Analyse wurden ausschließlich Isolate des EU-Genotyps und die NA-Referenzstämme verwendet. Auf eine Analyse der NA-Typ-Isolate wurde aufgrund ihrer großen Sequenzidentität verzichtet.
Die EU-Typ-Isolate zeigten eindeutig ein Clustering. Die PRRSV-Isolate ließen sich innerhalb des EU-Genotyps in 14 Cluster gruppieren. Innerhalb des Clusters des europäischen Genotyps ließ sich ein Lelystad Cluster (Cluster 3) erkennen. Viele der aktuellen deutschen Isolate bildeten innerhalb des europäischen Genotyps eigene Cluster (Cluster 1, 2, 4, 5, 6, 7 und 10). Ein großes zusammenhängendes Cluster wird von Isolaten aus Nord-West-Deutschland aus dem Zeitraum 2004 bis 2007 geformt (Cluster 1). Diese sind eng verwandt mit Isolaten aus Spanien aus dem Jahr 2003 (Cluster 12). In unmittelbarer Nähe zu bayrischen Isolaten (Cluster 6) aus dem Jahr 2005 gruppierten sich Isolate aus den Niederlanden (Cluster 8). Italienische Isolate aus den Jahren 2001 bis 2003 bildeten ein zusammenhängendes Cluster (Cluster 14), wie auch die dänischen Isolate (Cluster 13).
Zwischen den einzelnen Clustern des EU-Genotyps lassen sich fünf Gruppen mit einzelnen Isolaten bestimmen. Diese werden nur von einzelnen Isolaten repräsentiert und lassen sich nicht den definierten Untergruppen zuordnen (z. B. V1139, H-39-1a, H-47-1a, P0125) und fallen scheinbar willkürlich zwischen die Isolate der anderen Gruppen des EU-Genotyps.
Isolate aus SA (V1755) aus dem Jahr 1993 und 1995 wurden zwischen Isolaten aus Spanien (Cluster 11) aus dem Jahr 2004 eingeordnet. Innerhalb des EU-Genotyps bildeten die Isolate H-02-1 ein eigenständiges Cluster (Cluster 5). Die Nukleotididentität der Isolate H-02-1 mit den Sequenzen des Referenzstammes Lelystad und des EU-Impfstammes Porcilis®PRRS lag zwischen 87,7 und 88,4 % (Tabelle 13). Die Eingruppierung der hier untersuchten PRRSV-Isolate wurde durch Bootstrap-Werte unterstützt.
i Persönliche Mitteilung Greiser-Wilke, I.,2007
Tabelle 13: Darstellung der %-Identität der Nukleotidsequenzen (EU-Typ-Isolate) des ORF5 innerhalb der Cluster im Gesamtvergleich der EU-Isolate. Die Einteilung bezieht sich auf die phylogenetische Analyse von 262 Isolaten (Abbildung 34)
% Cluster
Ergebnisse
Die zuvor schon beschriebenen Cluster mit den aktuellen deutschen Isolaten waren auch hier vertreten.
Zum besseren Vergleich und der Bestätigung der Einteilung bzw. der Gruppierungen sämtlicher Isolate aus Deutschland und aus anderen europäischen Staaten wurden die phylogenetischen Analysen als einfaches Kladogramm dargestellt. Die bisherige Gruppierung der Isolate, wie sie in Abbildung 34 dargestellt ist, konnte bestätigt werden, wenn nur PRRSV-Isolate in die Berechnung mit einbezogen wurden (Abbildung 35). Um festzustellen, ob ein weit entfernter Verwandter des PRRSV die Baumtopologie unterstützt, wurde ein anderes Isolat der Familie Arteriviridae, das LDV, in die Berechungen mit aufgenommen. Mit dieser Berechnung war das Clustering nicht mehr eindeutig zu erkennen. Mit der Einführung des LDV ergaben sich lediglich drei Hauptcluster für die EU-Typ-Isolate (Abbildung 36).
Das EU-II-Cluster war nicht mehr identifizierbar.
Abbildung 35: Darstellung der phylogenetischen Analyse der in dieser Studie einbezogenen PRRSV-Isolate als Kladogramm mit MEGA©, dargestellt sind nur die Cluster;
rot = Referenzen LELY-EU
VR2332-US
0.05
EU-II 14
13
12 11
10 9
7 8 6 3
2 5 4
1
NA-I NA-II
Ergebnisse
Abbildung 36: Darstellung der phylogenetischen Analyse der in diese Studie einbezogenen PRRSV-Isolate als Kladogramm mit MEGA©, Referenzen = rot markiert,
VR2332-US
LDV 0.1
1 / 2 Lelystad
13 10 3/4 9
11
Ergebnisse 102 ildung 37: Ausschnitt aus einem Aminosäurealignment des GP5-Proteins der EU-TIsolate von 32 PRRSV-Isolaten durchgeführt mit GenDoc ©. Verglichen wurmit dem EU-Impfstamm (1. Position)
DV-EU : MRCSHKLGRFLTPHSCFWWFFLLCTGLSWSFADGNGNSSTYQYIYNLTICELNGTDWLSSHFGWAVETFVFYPVATHILSLGFLTTSHFF LELY-EU : ...L...L...
524-05 : ...C...L...E...V...L...I...
525-05 : ...C...L...E...V...L...I...
590/05 : ...C...L...E...V...L...I...
GER-Vi7 : ....RT..F...YC..L...GC...A...D..Y...L...
GER296 : ...V...Y...L...S...A...D...L...
H-01-2a : ...I...L...A...D..Y...L H-02-1b : ...S..S...S...F..S.A...G...D...L...
H-02-1d : ...S..S...S...F..S.A...G...D...L...
H-02-2c : ...S...S...F..S.A...G...D...L...
H-03-1a : ...H...L...A...Y...L...
H-03-1b : ...L...A....Y.Y...L...
H-03-1c : ...L...A....Y.Y...L...
P0001 : ...I...YP.CC.L...A...G..D...L...
P0002 : ...F...I....S..L.FS.I...EC.NG...Q...DK.Y...L...
P0003 : ...L...D...T...G..D...L...
P0004 : ...I...Y...L...A...K..D...L..A...
P0005 : ...L...D...T...G..D...L...
P0014 : ...I...YP.CC.L...A...N..Q...L...V...I....
P0015 : ...L...
P0016 : ...L...
P0018 : ...F...I....S..L.FS.I...EC.NG...Q...DK.Y...L...
P0019 : ...F...I....S..L.FS.I...EC.NG...Q...DKLY...L...
P0020 : ...F...I....S..L.FS.I...EC.NG...Q...DK.Y...L...
P0021 : ...F...I....S..L.FS.I...EC.NG...KWDQ...DK.Y...L...
P0023 : ...I...YP.CC.L...A...N..Q...L...VN...I....
P0053 : ...S...L...E..Y...D...L...
P0054 : ...S...L...E..Y...D...L...
P0055 : ...E....Q...L...P...A..Y...D....A..L...V..A...
P0056 : ...S...L...E..Y...D...L...
P0057 : ...E....Q...L...P...A..Y...D....A..L...V..A...