Molekulare Epidemiologie - G ENETISCHE T YPISIERUNG VON PRRSV

2. LITERATUR

2.6 G ENETISCHE T YPISIERUNG VON PRRSV

2.6.1 Molekulare Epidemiologie

In den letzten Jahren nahm die molekulare Technik zur Klassifizierung viraler Erreger mittels Sequenzierung rapide zu. Die genetischen Typisierungen von PRRSV-Isolaten wurden in Anlehnung an die Genotypisierung von CSFV-Isolaten u. a. auch durchgeführt, um Aufschlüsse über epidemiologische Zusammenhänge einzelner Krankheitsausbrüche zu erhalten. Hierfür wurde routinemäßig die Amplifikation des ORF5-Gens des PRRSV verwendet (DEE et al., 2001; FORSBERG et al., 2001; LAROCHELLE et al., 2003;

FORSBERG, 2005). Dieser Genomabschnitt ist sehr variabel (YOON et al., 1994). Werden also Unterschiede zwischen Isolaten angenommen, so zeigen sie sich v. a. in dieser Region.

Literatur

Generell konnte dargelegt werden, dass die Identität der Isolate mit ihrem Verwandtschaftsgrad korreliert ist. Die Prozentangaben über die als identisch bezeichneten Isolate wurden mit 98 % Sequenzidentität gegenüber anderen Isolaten gewählt. Diese Prozentangabe der Identitätsangabe wurde allerdings willkürlich verwendet (COLLINS et al., 1998;

TORREMORELL, 2001).

Unter Einbeziehung der epidemiologischen Daten der Herden ist die Sequenzanalyse von PRRSV Isolaten ein wertvolles Instrument der molekularen Epidemiologie. Dabei konnten bisher folgende epidemiologische Erkenntnisse gewonnen werden:

• Nukleotidsequenzen von PRRSV aus unterschiedlichen Beständen sind selten identisch (MURTAUGH et al., 2001). Dieses gilt für die Analyse von PRRSV-Isolaten im Falle von PRRS-Ausbrüchen aus verschiedenen Herden.

• Impfstämme und Feldstämme können gleichzeitig in einem Bestand zirkulieren.

• Die Bestimmung der Mutationsrate von einzelnen Virusisolaten innerhalb eines bestimmten Zeitraumes ist möglich (GOLDBERG et al., 2003).

• PRRSV-Isolate lassen ein Clustering erkennen, welches allerdings geographisch verzerrt ist (FORSBERG et al., 2002).

3 Eigene Untersuchungen 3.1 Material

3.1.1 Herkunft des Probenmaterials

Der überwiegende Anteil der Proben stammte aus der sehr schweinedichten Region Nord-West Deutschlands (Niedersachsen und Nordrhein Westfalen, Abbildung 7). Aus den Proben konnten 184 Isolate gewonnen werden. Soweit wie möglich, wurden herdenspezifische Daten der Bestände, aus denen Isolate vorlagen, in die Auswertung einbezogen (3.1.3).

Abbildung 7: Herkunft der deutschen PRRSV-Isolate (rote Markierungen) aus den Regionen Deutschlands

Niedersachsen Sachsen-Anhalt Nordrhein

Westfalen

Baden Württemberg

Bayern

Weitere Isolate stammten aus Sachsen-Anhalt (n = 13), aus Baden Württemberg (n = 6) und aus Bayern (n = 6). Zu diesen Proben lagen allerdings keine genauen Angaben zu den Beständen vor, so dass diese nur in die phylogenetische Auswertung mit aufgenommen wurden. 23 weitere Isolate aus Niedersachsen und Nordrhein-Westfalen wurden aufgrund fehlender herdenspezifischer Daten ebenfalls nur in die phylogenetische Analyse einbezogen.

3.1.2 Untersuchungsmaterial

Insgesamt wurden 250 Proben untersucht (Abbildung 8). Aus diesen 250 Proben konnten 232 Isolate aus 84 Herden gewonnen werden. Aus diesen wurden 35 Herden aufgrund ihrer Bestandsstruktur (Kombibestand, Ferkelerzeuger) für eine erneute Beprobung nach einer Zeitspanne von einem bis zwei Jahren ausgewählt. Die ersten Proben, die zwischen Januar 2004 und März 2005 entnommen wurden, stammten aus Einsendungen an die Außenstelle für Epidemiologie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover. Hierbei handelt es sich um Lungengewebeproben von Tieren, die im Rahmen der Routinediagnostik zur Abklärung einer ursächlichen Beteiligung des PRRSV an respiratorischen Erkrankungen oder Reproduktionsstörungen eingesandt worden waren. In die Untersuchung gingen Feten sowie Schweine aller Alters- und Nutzungsgruppen ein.

Die Probengewinnung für die Folgeuntersuchung begann im Februar 2006 und endete im März 2007. Die Probenentnahme erfolgte bei Absetzferkeln in der 4., 7. und 9. Lebenswoche (jeweils 10 Proben pro Altersstufe).

Die erneute Untersuchung wurde mit dem Ziel durchgeführt, die Isolate aus den zwei Probenentnahmezeitpunkten zu vergleichen und den zwischenzeitlichen Eintrag neuer Isolate zu bewerten. Die Untersuchung wurde auf Ferkelerzeuger und sogenannte Kombibestände (Ferkelerzeuger mit angeschlossenem Mastbestand) beschränkt, da in diesen Beständen versucht wird, die Risiken eines Erregereintrages durch gezielte Herdenmanagement-Maßnahmen zu reduzieren. Mastbestände wurden zuvor für eine erneute Probennahme ausgeschlossen, da mit dem regelmäßigen Zukauf größerer Tierzahlen ein bekanntermaßen hohes Risiko für den Eintrag neuer PRRSV-Isolate einhergeht.

Ein Teil der Proben wurde in sieben gegen das PRRSV geimpften Herden, die einen akuten klassischen PRRS-Ausbruch zeigten, entnommen. Zur Charakterisierung der

Eigene Untersuchungen

PRRSV-Problematik wurden zusätzlich die Leistungsdaten (Sauenplaner) dieser sieben Herden ausgewertet. Bei diesen Herden handelt es sich um sechs Kombibestände sowie einen Zuchtbestand, die alle in Niedersachsen liegen. Die Reproduktionsdaten wurden in sämtlichen Beständen routinemäßig per EDV erfasst. In die Auswertung ging ein Zeitraum von sechs bis acht Monaten ein. Da ein Vergleich der Leistungsdaten aufgrund der Verwendung unterschiedlicher Softwareprogramme nur eingeschränkt möglich war, wurden ausschließlich vier Parameter in die Auswertung mit einbezogen: lebendgeborene Ferkel, totgeborene Ferkel, abgesetzte Ferkel und die Trächtigkeitsdauer. Abbildung 8 zeigt einen schematischen Überblick über die in dieser Studie verwendeten Isolate.

Abbildung 8: Verfügbares Untersuchungsmaterial und Auswertung der gesammelten Daten 250 Proben

aus 108 Herden

232 Proben aus 84 Herden positiv

120 Isolate aus 51 Herden:

herdenspezifische Daten verfügbar

2004 / 2005

35 Herden wurden erneut

2006 /2007 untersucht

64 Isolate

7 Herden Reproduktions- daten verfügbar 2004 - 2006

48 Isolate aus 33 Herden:, herdenspezifische Daten nicht verfügbar

Isolate

ausschließlich für Phylogenie

3.1.3 Virusisolate

Das Lelystad-Virus (LV) und der auf einem EU-PRRSV Stamm basierende attenuierte Impfstoff Porcilis^®PRRS dienten als Referenzstämme für die EU-Typ-Isolate; der VR-2332-Stamm und die auf einem NA-PRRSV Stamm basierende attenuierte Vakzine Ingelvac^®PRRS MLV, als Referenz für die NA-Typ-Isolate (Tabelle 2).

Tabelle 2: PRRSV-Referenzstämme

Virusstamm Genotyp Genbank-Nr.

Lelystad EU M96262

Porcilis^®PRRS (DV) EU DQ324710

VR-2332 NA AY150564

Ingelvac^®PRRS MLV NA AF535152

Detaillierte Angaben über die hier verwendeten Isolate, ihre Anzüchtbarkeit und deren Herkunft befinden sich im Anhang unter 8.1.

3.1.4 Herdenspezifische Daten und statistische Auswertung

Herdenspezifische Informationen wurden zeitnah zur ersten Probenentnahme mittels telefonischer und persönlicher Befragung der behandelnden Tierärzte anhand eines Fragebogens erhoben. Der Fragebogen enthielt die Parameter Art und Größe des Bestandes (Kombi, Ferkelerzeuger, Mast,), Lage (Entfernung zu anderen schweinehaltenden Betrieben), Gesundheitsprobleme (Art und Zeitpunkt), Impfmanagement (Art und Zeitpunkt) und allgemeine seuchenhygienische Aspekte (Anhang 8.8.1, Fragebogen I).

Für Bestände, in denen wiederholt Proben entnommen wurden, wurde ein separater Fragebogen erstellt, mit dem hauptsächlich Veränderungen im Bestand erfasst wurden. Hierzu zählten Änderungen des Impfmanagements, Wechsel des Impfstoffes, Art und Größe des Bestandes und Bestandsprobleme, die zwischenzeitlich aufgetreten waren (Anhang 8.8.2, Fragebogen II).

Eigene Untersuchungen

Die in dieser Studie erhobenen Daten wurden mit dem Tabellenkalkulationsprogramm Excel 2003 (Microsoft Corp., Redmond WA, USA) erfasst.

Die Auswertungen des Fragebogens wurden auf vier Parameter beschränkt, da ein Großteil der Beantwortung der allgemeinen seuchenhygienischen Aspekte des Fragebogens zu lückenhaft war. Bei den vier ausgewerteten Parametern handelte es sich: Betriebsart, Betriebsgröße, PRRSV assoziierte klinische Symptome und die PRRS Impfungen. Die Darstellung der vier Parameter erfolgte mit Exel 2003. Die Auswertung mit SigmaStat.

Vor der Auswertung der Reproduktionskennzahlen für die Parameter lebend, totgeborene und abgesetzte Ferkel sowie für die Tragedauer der Sauen, erfolgte eine Berechnung der Mittelwerte mit dem Tabellenkalkulationsprogramm Excel 2003 und die anschließende statistische Auswertung mit SigmaStat (Version 2.03). Als Signifikanzniveau wurde p = <0,05 festgelegt.

3.1.5 Zellkultur

3.1.5.1 Zellen

Zur Virusanzucht und Vermehrung wurden die Zelllinie Marc-145 und eine Primärzellkultur verwendet.

3.1.5.1.1 Marc-145 Zellen

Für die Anzucht von NA-Typ PRRSV-Isolaten wurde die Zelllinie MARC-145 verwendet.

Dies ist ein Klon der epitheloiden Zelllinie MA-104 (ATCC CRL-2378.1), der von fetalen Nierenzellen des Rhesusaffen stammt.

3.1.5.1.2 Porzine Alveolarmakrophagen

Zur Isolierung der EU Isolate wurden porzine Alveolarmakrophagen (PAM) verwendet.

Hierbei handelt es sich um primäre Zellkulturen, die von fünf Monate alten Schweinen gewonnen wurden. Die hier verwendete Charge (SV-1-480) von Lungenmakrophagen wurde von der Firma Intervet International, Boxmeer, Holland, bezogen.

Teilweise wurden auch die EU-Typ-Isolate in der permanenten Zelllinie Marc-145 vermehrt.

3.1.5.2 Sonstige Materialien

Die Rezepturen für Reagenzien, Medien, Puffer, Lösungen und Reaktionsgemische sowie kommerziell erhältliche, einsatzfertige Laborreagenzien befinden sich im Anhang unter 8.2 bis 8.3. Geräte und technische Hilfsmittel sind im Anhang unter 8.4, Verbrauchsmittel unter 8.5 aufgeführt. Angaben zur verwendeten Software befinden sich unter 8.6.

3.2 Methoden

3.2.1 Blutentnahmetechnik

In der vorliegenden Arbeit wurden 35 Herden für eine erneute Untersuchung auf PRRSV-Isolate ausgewählt. Die Blutproben wurden in der 4., 7. und 9. Lebenswoche (jeweils 10 Serumproben pro Altersstufe) entnommen. Größere Absetzferkel wurden mittels Oberkieferschlinge fixiert, kleinere Ferkel in Rückenlage. Das Blut wurde aus der Vena cava cranialis oder aus Vena jugularis externa entnommen. Zur Blutentnahme wurden 9 ml Monovetten^® (Sahrstedt, Nürmbrecht) und Kanülen (Thermo^®, Heiland, Hamburg) der Größe 18 G (kleine Ferkel) bzw. der Größe 20 / 21 für größere Absetzferkel verwendet. Die Proben wurden bei 2000 x g 10 Minuten (min) zentrifugiert, das Serum abgenommen und bis zur weiteren Verwendung bei – 80 °C tiefgefroren.

3.2.2 Klassische virologische Methoden

Um möglichst viele Isolate in Zellkultur anzuzüchten und sie damit zu konservieren, wurden beide Zellkulturen mit allen PCR-positiven Proben beimpft.

3.2.2.1 Passagierung von Marc-145-Zellen

Die Kultivierung der Zelllinie Marc-145 erfolgte in 75 cm² Kunststoff-Zellkulturflaschen im Brutschrank bei 37 °C und 5 % CO2 in feuchter Atmosphäre unter Verwendung von Eagle´s Minimum Essential Medium (EMEM) mit einem Zusatz von 5 % fetalem Kälberserum (FKS) und 5 % L-Glutamin (500 mmolar). Nach Erreichen der Konfluenz wurde der Zellrasen einmal mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und mit 1 ml 5 % iger Trypsinlösung inkubiert, bis sich die Zellen vom Boden der Zellkulturflasche gelöst hatten. Die

Zellen wurden in 5 ml PBS aufgenommen und bei 200 x g 7 min bei Raumtemperatur (RT) zentrifugiert.

Das Sediment wurde anschließend in 5 ml Medium (EMEM + 10 % FKS) resuspendiert. Die resuspendierten Zellen wurden im Verhältnis 1:20 (2 x 10⁶ Zellen / 75 cm²Flasche) in neue Zellkulturflaschen umgesetzt.

3.2.2.2 Kultivierung der porzinen Alveolarmakrophagen

Zur Kultivierung der Lungenmakrophagen wurden die Zellen im Wasserbad zügig aufgetaut, in Kulturmedium (EMEM + 10 % FKS) aufgenommen und anschließend wie in Tabelle 3 angegeben, ausgesät.

Tabelle 3: Aussaat der PAM-Zellen

Gefäß Zellzahl

Gewebekulturplatte mit 24 Kavitäten 2 x 10⁶ Zellen/ml (1 ml / Kavität) Gewebekulturplatte mit 96 Kavitäten 2 x 10⁵ Zellen/ml

(0,5 ml / Kavität) Gewebekulturflasche 25 cm² Fläche 20 x 10⁶ Zellen/ml

(5 ml / Flasche)

3.2.2.3 Virustitration

Zur Bestimmung des Virustiters einer Virussuspension wurden Titrationen nach der Endpunkt-Verdünnungsmethode in Mikrotiterplatten (Greiner, Nürtingen) durchgeführt. Die Verdünnungsreihen wurden in log 10-Stufen von 10^-1 bis 10^-8 angelegt und im vierfachen Ansatz getestet. Dazu wurden jeweils vier Kavitäten der Mikrotiterplatte mit je 100 µl der

Eigene Untersuchungen

verdünnten Virussuspension beschickt. Als Zellkontrolle wurden in vier Spalten der Mikrotiterplatte jeweils 100 µl Medium (EMEM mit 10 % FKS) einpipettiert. Danach wurden jeweils 50 µl einer auf 1,6 x 10⁶ Zellen eingestellten Zellsuspension zugegeben. Die Kultur wurde 72 h bis 96 h in einer feuchten Kammer bei 37 °C und 5 % CO2-Atmosphäre im Brutschrank inkubiert. Der Virusnachweis erfolgte mikroskopisch durch Bestimmung des zytopathischen Effektes (ZPE). Die Kalkulation des Titers als KID50 pro 100 µl erfolgte anhand der Schätzformel nach KAERBER (1931):

logKID50 = L1,0 − Lint(S − 0, 5)

L1,0 = Logarithmus der höchsten Verdünnungsstufe mit der Reaktionsrate 1,0 Lint = Logarithmus des Verdünnungsintervalls

S = Summe der Reaktionsraten, begonnen bei der letzten Reaktionsrate mit 1,0

3.2.2.4 Vorbereitung von virushaltigem Organmaterial für die Virusanzucht und den Virusnachweis

Für die Isolierung von PRRSV aus Organmaterial (Lunge) wurde ein etwa erbsengroßes Stück Lungengewebe mit dem Skalpell steril entnommen und in ein mit 0,4 ml mit 2-(N-Morpholino)-ethanesulfonic acid (MES)-Puffer gefülltes Eppendorfgefäß überführt. Mit einem Mikropistill wurde das Gewebestück so zerkleinert, dass der Gewebeüberstand fleischwasserfarben war. Diese Gewebesuspension wurde eine Minute bei 1300 x g zentrifugiert und der Überstand bis zur weiteren Verwendung bei - 80 °C aufbewahrt.

Hämolytischer Überstand wurde 1:10 verdünnt, bevor er auf die Zellen verimpft wurde.

3.2.2.5 Virusvermehrung

Zur Vermehrung von Virus bzw. zur Anzucht von PRRSV wurden ein bis zwei Tage alte konfluente Marc-145 Kulturen verwendet.

Die Anzucht von PRRSV in porzinen Alveolarmakrophagen erfolgte einen Tag nach Aussaat der Zellen. Die Virusanzucht erfolgte jeweils in 24-Lochkulturplatten (Greiner, Nürtingen) mit einer Zelldichte von 2 x 10⁶ Zellen /1 ml Kulturmedium. Das Anzuchtmedium wurde entfernt und virushaltige Suspension (Gewebeüberstand bzw. virushaltiges Serum unverdünnt, 1:10 und 1:100 verdünnt) hinzugefügt. Nach einer Inkubationszeit von einer Stunde bei 37 °C und 5 % CO2 wurde der Zellkultur wieder jeweils 1 ml Anzuchtmedium hinzugegeben und weiter inkubiert. Die Zellkulturansätze wurden täglich auf das Auftreten eines zytopathischen Effektes (ZPE) untersucht. Dies konnte bereits nach 48 h der Fall sein aber auch bis zu einer Woche dauern.

Die Virusernte erfolgte, wenn 50 % der Zellen einen deutlichen zytopathischen Effekt aufwiesen. Zur Freisetzung des vermehrten Virus wurde ein Gefrier-Tauzyklus durchgeführt.

Dazu wurden die Zellen bei -80 °C für mindestens eine Stunde tiefgefroren und anschließend im Wasserbad bei 37 °C schnell aufgetaut. Das Zelllysat wurde bei 900 x g zentrifugiert und der virushaltige Zellkulturüberstand je nach Verwendungszweck aliquotiert und bei -80 °C eingefroren bzw. umgehend verarbeitet.

Eigene Untersuchungen

Probenmaterial:

Lungengewebe, Serum, Plasma, Abortmaterial

Aufarbeitung der Proben

Infektion von Zellkulturen:

PAM Marc-145

RNA- Isolierung

cDNA- Synthese

PRRSV PCR:

ORF7 ORF5

PCR-Produkt:

Agarose-Gelelektrophorese

PRRSV Typisierung:

PCR-Produkt-Sequenzierung Alignment der Sequenzen

Phylogenetische Analyse unter Einbezug herdenspezifischer Daten

Kryokonservierung der Isolate

(-80 °C)

3.2.3 Molekularbiologische Methoden

Der Versuchsablauf für die Gewinnung von Isolaten durch direkte Isolierung und durch Inokulation von Zellen und die dafür benötigten Arbeitsschritte der genetischen Typisierung sind in Abbildung 9 schematisch dargestellt.

3.2.3.1 Isolierung viraler RNA

Alle RNA-Isolierungen wurden in einem separaten Raum durchgeführt, welcher ausschließlich hierfür genutzt wurde. Für die Nukleinsäureisolierung aus den unterschiedlichen Untersuchungsmaterialien wurden kommerziell erhältliche Systeme nach Herstellerangaben eingesetzt.

3.2.3.1.1 RNA-Isolierung aus infizierten Zellkulturen

Zur RNA-Isolierung aus Lysat von virusinfizierten Zellkulturen wurde das RNeasy MiniKit^® (Qiagen, Hilden) verwendet. Das Prinzip beruht auf Silikat-Gel-Membranen als RNA-bindende Matrix. Die Nukleinsäuren binden in Gegenwart eines chaotropen Salzes an eine Glasoberfläche, welche in für Mikrozentrifugation geeignete Säulen mit separatem Auffanggefäß integriert sind. So ließen sich Binde-, Wasch- und Elutionsschritte in kurzer Zeit durchführen. Im ersten Schritt der Probenbearbeitung wurden 100 µl der virushaltigen Zellsuspension mit 400 µl Lysispuffer versetzt und durch auf- und ab-pipettieren homogenisiert. Anschließend wurde zu den Proben 500 µl Ethanol gegeben, gemischt und über die Silicat-Gel-Säulen getrennt. Nach drei Waschschritten mit Waschpuffern (RW1, 2 x RPE) wurde die an der Membran gebundene RNA mittels RNase-freien Wassers bei 1300 x g eluiert.

Die eluierte RNA wurde sofort weiter verwendet.

Eigene Untersuchungen

3.2.3.1.2 RNA-Isolierung aus Lungengewebe

Zur Isolierung von RNA aus Lungengewebe wurde das Lipid-Tissue-Kit^® (Qiagen, Hilden) verwendet, welches die Phenol-Chloroform Extraktion (CHOMCZYNSKI u. SACCHI, 1987) mit der Silicat-Gel-Membran-Methode verbindet. Das Qiazol-Reagenz^® besteht aus einem Phenol-Guanidin-Isothiocyanat-Gemisch, welches das Probenmaterial lysiert. Nach Zugabe von Chloroform und anschließender Zentrifugation trennt sich die Lösung in eine wässrige und eine organische Phase, wobei die RNA in der wässrigen Phase verbleibt. Diese wird auf RNeasy-Säulen (Qiagen, Hilden) aufgetragen. Dabei bindet die RNA an die Membran. Reste von Phenol und anderen Verunreinigungen werden anschließend durch Waschritte mit den RW1 und 2 x RPE-Waschpuffern entfernt.

Im ersten Arbeitsschritt wurde das Lungengewebe mittels einer sterilen Skalpellklinge in etwa 10-20 mm große Gewebestückchen geschnitten. Die Homogenisierung der Gewebeproben erfolgte im Eisbad mit einem Mikropistill in einem 1,5 ml Eppendorfgefäß, in das 400 µl MES-Pufferlösung vorgelegt wurden. Die Probe wurde solange homogenisiert, bis der Überstand fleischwasserfarben war. Nach anschließender Zentrifugation bei 1300 x g für 15 sec wurden 250 µl des Überstandes abgenommen und mit dem Qiazol-Reagenz^® gemischt.

Nach Zugabe von Chloroform erfolgte eine 15 minütige Zentrifugation bei 4 °C. Der Überstand wurde anschließend abgenommen und mit dem gleichen Volumen Ethanol gemischt. Nach drei Waschschritten (RW1, 2 x RPE) wurde die RNA mit RNAse-freiem Wasser eluiert. Die RNA wurde sofort gekühlt und in der RT- PCR untersucht.

3.2.3.1.3 RNA-Isolierung aus Serum

Zur Isolierung von RNA aus Serum wurde das High Pure Viral RNA Kit^® (Roche, Mannheim) verwendet. Das Testprinzip beruht hier ebenfalls auf Glasfaser-Oberflächen, welche die RNA spezifisch binden. Hierfür wurde zunächst eine Arbeitslösung hergestellt, indem die im Kit enthaltene poly(A)-carrier-RNA mit Bindepuffer versetzt wurde. Das Virus wurde mit dem Bindepuffer lysiert. Anschließend wurden die Nukleinsäuren in Gegenwart von chaotropen

das Serum mit der Arbeitslösung (enthält Lyse- und Bindepuffer und Carrier-RNA) im Eisbad 10 min inkubiert. Anschließend wurde die Probe auf die Säulen gegeben, wobei die RNA an die Silicamembranen gebunden wurde. Nach zwei Waschschritten mit Waschpuffern (Waschpuffer I) wurde die Nukleinsäure mit Hilfe eines Elutionspuffers eine Minute bei 1000 x g eluiert. Die eluierte RNA wurde sofort in der RT- PCR untersucht bzw. bei -80 °C eingefroren.

3.2.3.2 Positive und negative Kontrollen

Als positive Kontrollen für die RT-PCR dienten für EU-Typ Isolate das Impfvirus DV (Porcilis^®PRRS, Intervet, Unterschleißheim) und der Referenzstamm Lelystad. Für NA-Typ Isolate wurden der Impfstamm Ingelvac^®PRRS MLV (Boehringer Ingelheim, Vetmedica, Ingelheim a. Rhein) und der Referenzstamm VR-2332 verwendet. Hierfür wurde aus virushaltigem Zelllysat die RNA isoliert und sofort mit Random Hexamers in eine komplementäre DNA (cDNA) umgeschrieben, portioniert und bis zu deren Gebrauch bei - 20 °C gelagert. Als negative Kontrolle diente ein Ansatz ohne Nukleinsäure. Für jeden PCR-Ansatz wurde jeweils eine positive und negative Kontrolle mitgeführt.

3.2.3.3 Primer

Für die Transkription der RNA in cDNA wurden entweder spezifische RT-Primer oder Hexamere (Random Hexamers) anwendet.

Zur Amplifikation der ORF7-Region wurden die von OLEKSIEWICZ et al., 1998 publizierten Primer verwendet. Sie amplifizieren den gesamten Genomabschnitt mit flankierenden Regionen im 3’NTR und ORF6.

Zur Amplifikation der ORF5-Region wurden die von OLEKSIEWICZ et al., 1998 beschriebenen Primer verwendet und zusätzlich neue Primer entworfen. Diese Primersequenzen wurden so konzipiert, dass sie die gesamte ORF5-Region mit flankierenden

Eigene Untersuchungen

Regionen im ORF4 und ORF6 amplifizieren. Die Erstellung der eigenen Primer erfolgte mit speziellen Programmen (z. B. BioEdit^©) nach den allgemein gültigen Regeln: Die optimale Primerlänge beträgt ca. 18-25 Basen (bis 30 b), der G/C-Gehalt sollte zwischen 20 und 70 % liegen, keine Hairpin-Strukturen aufweisen und die Schmelztemperatur eines Primerpaares nicht mehr als 1 bis 2 °C von der angestrebten Temperatur abweichen. Primer werden in Konzentrationen von 50 nM bis 300 nM eingesetzt. Zu hohe Primerkonzentrationen begünstigen die Bildung von Primer-Dimern und unspezifischen Produkten. Zu niedrige Konzentrationen resultieren in einer herabgesetzter Sensitivität der PCR (KAMPKE et al., 2001; GORELENKOV et al., 2001; HYNDMAN u. MITSUHASHI, 2003).

Die Primer wurden von MWG Biotech AG (MWG, Ebersberg) bezogen und mit DEPC-Wasser (Sigma, Deisenhofen) auf eine Konzentration von 10 pmol/µl eingestellt.

Tabelle 4 gibt einen Überblick über die verwendeten Primer mit Angaben der Nukleotidpositionen der entsprechenden Referenzstämme und ob sie auch als Sequenzierprimer genutzt wurden.

Tabelle 4: Herkunft und Sequenz der Primer

308 EU/US-ORF7 AS 5’-TCGCCCTAATTG AATAGGTGA-3’ 15050 15364 ja

310 EU-ORF5 S 5’-CAATGAGGTGGG CIACAACC-3’ ORF5 60 °C 13442 - 718 bp ja 1*

311 EU-ORF5 AS 5’-TATGTIATGCTA AAGGCTAGCAC-3’

323 EU/US-ORF5 AS 5’-CACCTTIAGGGC ITATATCA-3’ 14191 14482 ja

301 EU-ORF5 S 5’-TGAGGTGGGCTA CAACCATT-3’ ORF5 55 °C 13400 - 702 bp ja 3*

Eigene Untersuchungen

3.2.3.4 Reverse Transkription

Da sich RNA nicht direkt in der PCR amplifzieren lässt, muss sie vorher in eine komplementäre DNA ( cDNA ) transkribiert werden.

Das Prinzip der PCR nach reverser Transkription beruht darauf, mit einem Primer, der als Startsequenz der reversen Transkriptase dient, aus der vorhandenen RNA eine komplementäre DNA zu synthetisieren. Als Primer für die reverse Transkription kommen in Betracht: Oligo-dT-Primer, spezifische Primer oder Random Hexamere. Zur Transkription stehen verschiedene reverse Transkriptasen, die sich in der optimalen Arbeitstemperatur und Effizienz unterscheiden, zur Verfügung. Hierzu gehören die aus Retroviren stammenden Avian-Myeloblastosis-Virus-Reverse-Transcriptase (AMV) (FROHMAN et al., 1988; LYNAS et al., 1989) und die Moloney-Murine-Leukämievirus-Reverse-Transcriptase (MMLV-RT) (BRYNE et al., 1988). Die Effizienz der reversen Transkription kann durch den Einsatz von reversen Transkriptasen mit deletierter RNAse-H-Funktion erhöht werden. Als Beispiel seien die von einer M-MLV-RT abgeleiteten thermostabilen reversen Transkriptasen Superscript^®, (Superscript II und III) reversen Transkriptasen genannt (Invitrogen, Carlsbad, USA).

3.2.3.5 RT-PCR

Die RT-PCR wurde ausschließlich in einem eigens dafür vorgesehenen Labor durchgeführt.

Sämtliche Reaktionsgemische wurden frisch angesetzt. Proben und andere Reagenzien wurden im Eisbad gekühlt.

Die reverse Transkription (RT) erfolgte zunächst nach dem im europäischen Referenzlabor (EURL) für klassische Schweinepest Hannover etablierten Protokoll (SCHEIBNER et al., 2000) und dann nach einem etablierten (s. o.) und für den Nachweis von PRRSV weiter optimierten cDNA-Synthese Protokoll. Außerdem wurde ein Reverse Transkriptase Kit^® (Amersham Bioscience, USA) unter Einsatz eines spezifischen RT-Primers (Nr. #306, #308,

#311, #314, #323) eingesetzt.

3.2.3.6 Reverse Transkriptase Kit

Für die RT mit Hilfe des Ready-to-go-you-prime-frist-Kit^® (Amersham Bioscience, USA) wurden 29 µl der Gesamt-RNA eingesetzt. Diese wurde für 10 min. im Heizblock bei 65 °C inkubiert und anschließend 2 min im Eisbad gekühlt. Anschließend wurde die RNA in das im Kit mitgelieferte, vorbereitete Eppendorfgefäß überführt, mit 4 µl des RT-Primer gemischt (Gesamtvolumen 33 µl) und 60 min bei 37 °C im Thermocycler inkubiert. Die cDNA wurde bei -20 °C gelagert.

3.2.3.7 cDNA-Synthese (Protokoll I, SCHEIBNER et al., 2001)

Der Reaktionansatz für 40 µl cDNA erfolgte in einem 0,5 ml Eppendorfgefäß. Zu 6 µl der Gesamt-RNA wurden 26 µl des Reaktionsansatzes I gegeben. Dieser bestand aus 10 µl DEPC-Wasser, 8 µl 5 x RT-Puffer und 8 µl dNTPs (2,5 mM). Nach sorgfältigem Mischen wurden die Proben für 5 min bei 70 °C inkubiert und anschließend sofort wieder auf Eis

Im Dokument Charakterisierung aktueller PRRSV Isolate aus verschiedenen Regionen in Deutschland (Seite 42-0)