Isolierung und Identifizierung von thermophilen Campylobacter spp

Bei der Isolierung und Identifizierung von Campylobacter spp. sind aufgrund der physiologischen Eigenschaften einige Besonderheiten zu beachten. Das spiegelt sich auch in der Tatsache wider, dass für Campylobacter seit Mitte der 1970er Jahre mit der Entwicklung von ersten Selektivmedien (SKIRROW 1977) unzählige Kulturmedien und Kultivierungsbedingungen publiziert wurden (CORRY et al. 1995).

Da Campylobacter spp. empfindlich auf erhöhte O2-Gehalte und Superoxide reagieren können, enthalten Nährböden zur Kultivierung von Campylobacter spp.

Zusätze, die die schädigende Sauerstoffwirkung abschwächen. Einige Nährböden enthalten einen Kohlezusatz, andere Nährböden enthalten Blut als Radikalfänger. Je

nach Nährboden wird dabei defibriniertes oder lysiertes Pferdeblut oder Blut anderer Tierarten in Konzentrationen zwischen 5 % und 15 % eingesetzt. Auch die Kombination aus Eisensulfat, Natriummetasulfit und Natriumpyruvat (FBP) wird in manchen Nährböden eingesetzt (GEORGE et al. 1978). Nährböden zur Isolierung von Campylobacter spp. enthalten zusätzlich verschiedene Antibiotika wie z.B.

Amphotericin B, Bacitracin, Cephalothin, Cefalozin, Cefoperazon, Colistin, Novobiocin, Polymyxin B, Rifampicin, Trimetoprim oder Vancomycin, die das Wachstum der Begleitflora unterdrücken (GILCHRIST et al. 1981; CORRY et al.

1995). Es ist zu beachten, dass einige Campylobacter-Spezies sensibel auf die zugesetzten antibiotischen Substanzen reagieren können. Dies machte man sich z.T.

für die Speziesidentifizierung zunutze, ist heute aber kein sicheres Kriterium mehr.

Um falsch negative Ergebnisse zu vermeiden, ist es notwendig, je nach Spezies den passenden Nährboden auszuwählen. Aufgrund der Unterschiede im Resistenzverhalten der Campylobacter spp. ist es sinnvoll, bei Verwendung eines selektiven Nährmediums parallel auch ein nicht selektives Nährmedium zu verwenden, um die Sensitivität zu steigern (GOOSSENS et al. 1990; GOOSSENS u.

BUTZLER 1991).

Häufig eingesetzte kohlehaltigen Selektivnährböden sind der Nährboden nach KARMALI et al. (1986) und der modifizierte-Charcoal-Cefoperazone-Desoxycholate–

Agar (mCCD) (BOLTON et al. 1984). Bluthaltige Selektivnährböden sind beispielsweise der Skirrow-Agar (SKIRROW 1977), der Preston-Agar (BOLTON u.

ROBERTSON 1982) und der Campy-BAP-Agar (BLASER et al. 1978).

GUN-MUNRO et al. (1987) verglichen in einer Studie verschiedene Selektivnährböden zur Isolierung thermophiler Campylobacter spp. Dabei erwiesen sich der mCCD-Agar sowie der blutfreie Karmali-Selektivagar den bluthaltigen Medien bezüglich der Re-Isolierung und der Hemmung der fäkalen Begleitflora überlegen. Diese Beobachtungen werden in Versuchen von POTTURI-VENKATA et al. (2007) bestätigt.

Für den Nachweis von Campylobacter spp. in Lebensmitteln ist ein Voranreicherungsschritt sinnvoll, besonders wenn der Verdacht besteht, dass die Campylobacter spp. in irgendeiner Weise vorgeschädigt sind bzw. wenn mit starker Begleitflora zu rechnen ist. Die Voranreicherung wird in flüssigen Nährmedien durchgeführt. Dafür eignen sich beispielsweise die Preston-Bouillon (BOLTON u.

ROBERTSON 1982), der Campylobacter-Enrichment-Broth (CEB) (MARTIN et al.

1983) oder die blutfreie mCCD-Bouillon (BOLTON et al. 1984). Die Grundzusammensetzung der flüssigen Voranreicherungsmedien ist mit derjenigen fester Selektivmedien vergleichbar (CORRY et al. 1995).

Bis Mitte der 1970er Jahre wurden Campylobacter spp. durch eine Kombination von Membranfiltration und nicht-selektiven Nährmedien kultiviert (BUTZLER et al. 1973).

Bei der Membranfiltration wird eine cellulosehaltige Filtermembran mit einer Porengröße von 0,65 μm oder 0,45 μm auf ein Nährmedium aufgebracht und eine kleine Menge der zu untersuchenden Probensuspension auf dem Filter verteilt.

Campylobacter spp. besitzen im Gegensatz zu anderen Keimen die Fähigkeit diese Membran zu durchdringen. Nach Entfernung des Filters und mikroaerophiler Inkubation des Nährbodens können sie spezifisch nachgewiesen werden.

Diese Methode findet auch heute noch Anwendung, insbesondere, wenn Campylobacter spp. in keimreichen Proben nachgewiesen werden sollen (STEELE u. MCDERMOTT 1984). WILSON u. AITCHISON (2007) konnten zeigen, dass eine Anreicherungs-Membranfiltration in Kombination mit der Kultivierung auf Selektivnährböden im Bezug auf den Campylobacter-Nachweis signifikant sensitiver ist als die Direktkultur.

In der EN ISO 10272 (1995), welche Vorgehensweisen für den Nachweis und die Quantifizierung von Campylobacter spp. vereinheitlicht darstellt, wird für den Anreicherungsschritt in der Preston-Bouillon eine Inkubation für 24-48 h ± 2h bei 41,5 °C ± 0,5 °C in mikroaerophiler Atmosphäre (5 % O2, 10 % CO2 und 85 % N2) festgelegt. Für Ausstriche auf mCCD-Agar oder anderen Selektivnährmedien wird eine Inkubation für 48 h ± 2h bei 41,5 °C ± 0,5 °C in

mikroaerophiler Atmosphäre empfohlen. Anschließend können die Zell-Kulturen identifiziert und differenziert werden.

2.3.1 Biochemische Identifizierung

Die Differenzierung anhand biochemischer Eigenschaften ermöglicht weitergehende Aussagen zur Spezieszugehörigkeit. Zur Unterscheidung von thermophilen Campylobacter spp. eignen sich besonders die Katalase-Reaktion, Hippurathydrolyse, H2S-Hydrolyse, Nitrat-Reduktion, Urease-Bildung und Indoxyl-Acetat-Hydrolyse (VANDAMME 2000). Eine weitere Möglichkeit Campylobacter spp.

zu differenzieren ist die Überprüfung der Empfindlichkeit auf die antibiotisch wirksamen Substanzen Cefalothin und Nalidixinsäure. C. coli und C. jejuni spp. jejuni zeigen eine Resistenz gegenüber Cefalothin, sind aber empfindlich gegenüber Nalidixinsäure, was sie von C. lari unterscheidet, der i.d.R. resistent gegenüber Nalidixinsäure reagiert. Allerdings zeigen aktuelle Untersuchungen zunehmend auch Nalixidin-resistente C. jejuni und C. coli-Stämme, sodass dieses Unterscheidungsmerkmal in Zukunft mit Vorsicht beurteilt werden sollte (HÄNEL u.

ATANASSOVA 2007; VARELA et al. 2007a).

Die Unterscheidung von C. jejuni und C. coli ist schwierig, da beide Spezies annähernd gleiche biochemische Eigenschaften aufweisen. Das verlässlichste Unterscheidungsmerkmal ist die Untersuchung auf Hippurat-Hydrolyse, zu der C. jejuni im Gegensatz zu C. coli fähig ist (HARVEY 1980). Einige C. jejuni Stämme scheinen dazu jedoch nicht in der Lage zu sein (BAR u. FRICKE 1987). Die wichtigsten biochemischen Eigenschaften für die Campylobacter spp. wurden von VANDAMME (2000) zusammengefasst (Tabelle 2).

Tabelle 2: Ausgewählte biochemische Eigenschaften für Campylobacter spp.

(modifiziert nach VANDAMME 2000).

+: 90 % der untersuchten Stämme zeigten die Reaktion; -: Reaktion in weniger als 11 % der untersuchten Stämme positiv; V: stammabhängige Reaktion; ^a:mindestens 80 % der untersuchten Stämme zeigten diese Reaktion; ^b: inkl. Untergruppe 1 und 2;

c: inkl. NASC (Nalidixinsäure-empfindliche Campylobacter) und UPTC (Urease-positive thermophile Campylobacter); ^d: inkl. Biovar sputorum, faecalis, paraureolyticus.

Wachstum: Resistenz:

Spezies

α-Hämolyse Katalase Hippurat Hydrolyse Urease Nitrat-Reduktion Selenit-Reduktion H2S / TSI (Spuren) Indoxyl Acetat Hydrolyse 25 °C 42 °C Minimal- Medium Mac-Conkey- Agar Glycin 1 % NaCl 4 % Cepho- perazon (64 mg/l) Nalidixin Cefalotin

C. coli V + - - + + V + - + + V + - + - +

C. concisus V - - - V V - - - V - - V - - V -

C. curvus V - V - + - V V - V V^a V^a + - V^a + -

C. fetus

ssp. fetus - + - - + V^a - - + V^a V V + - + + - C. fetus

ssp. venerealis V V^a - - + - - - + - V^a V - - - V -

C. gracilis - V - - V^a - - V - V V V^a + - - V -

C. helveticus + - - - + - - + - + - - V - V - -

C. hyointestinalis

ssp. hyointestinalis V + - - + + + - V + V V + - - + V C. hyointestinalis

ssp. lawsonii V + - + + + + - - + V V V - V + - C. jejuni

ssp. doyley + V + - - - - + - - - - V - - - - C. jejuni

ssp. jejuni + + + - + V - + - + - - + - + - +

C. lari^c V + - V + V - - - + - - + - + V +

C. mucosalis - - - - - - + - - + - V^a V - V V^a -

C. rectus + V - - + - - + - V - - + - - V^a -

C. showae + + - - + - V V - V V + V - - - -

C. sputorum^d + V - V + V + + - + V V + V - V -

C. upsaliensis + - - - + + - - - V^a - - + - V - V

2.3.2 Serotypische Identifizierung

Die serotypische Identifizierung basiert auf der Erkennung von antigenen Oberflächenstrukturen mit poly- oder monoklonalen Antikörpern. Heute gibt es drei gebräuchliche Verfahren für die serotypische Identifzierung von Campylobacter-Spezies.

Das Penner-Schema (PENNER u. HENNESSY 1980) basiert auf der Unterscheidung löslicher hitzestabiler Antigene (HS- oder O-Antigene) mittels passiver Hämagglutionation, während das Lior-Schema hitzelabile Antigene (HL) mittels Objektträgeragglutination unterscheidet (LIOR et al. 1982). Das LEP- Schema wurde 1998 vom Laboratory of Enteric Pathogens in Großbritannien vorgeschlagen. Es basiert auf den Prinzipien der Penner-Typisierung (FROST et al. 1998).

Weite Verbreitung hat besonders das Penner-Schema gefunden (JACOBS-REITSMA et al. 1995a). In einer Studie von MCKAY et al. (2001) wurden 66 O-Antisera zur Penner-Serotypisierung von 3788 Campylobacter-Isolaten eingesetzt. Besonders häufig wurde der Serotyp-4 (18,4 %), der Serotyp-2 (17,4 %) und der Serotyp-58 (13,3 %) nachgewiesen. Der Differenzierungsgrad der Serotypisierung ist damit deutlich geringer als der Differenzierungsgrad anderer Verfahren (vgl. Kapitel 2.6). Zudem ist die Serotypisierung aufwendig und es kommen nicht selten Kreuzreaktionen zwischen verschiedenen Serotypen vor (MCKAY et al. 2001).

Neue Untersuchungen weisen darauf hin, dass die eingesetzten Antikörper nicht wie lange angenommen an Lipopolysacharide, sondern an Kapsel-Polysacharide binden (CHART et al. 1996; KARLYSHEV et al. 2000; DORRELL et al. 2001).