3 Material und Methoden
3.4 Immunhistochemische Untersuchungen
3.4.1 Vorversuche zur Immunhistochemie
Zur immunhistologischen Darstellung der induzierbaren Stickoxidsynthase (iNOS), der Mangan-Superoxid-Dismutase (Mn-SOD) und des Nitrotyrosins (3-NT) wurden Paraffinschnitte verwendet und die Avidin-Biotin-Komplex (ABC)–Methode eingesetzt. Für alle Antikörper wurden die optimalen Demaskierungsverfahren, Inkubationszeiten und –temperaturen sowie die passende Gebrauchsverdünnung ermittelt. Gegebenenfalls wurde mit einer Verstärkungsreaktion gearbeitet.
Material und Methoden 43
3.4.2 Primärantikörper
Zur Darstellung von iNOS wurde ein kommerziell erhältlicher polyklonaler Antikörper (Isotyp IgG) aus dem Kaninchen gegen den humanen N-Terminus von NOS2 (NOS2 (N-20), Cat.No. sc-651, Santa Cruz Biotechnology, Inc., USA) eingesetzt. Laut Hersteller wird dieser Antikörper für die Detektion von iNOS in der Maus, in der Ratte und im Mensch empfohlen. Dieser Antikörper detektiert iNOS beim Hund in Milz und Herz nach einer Trypanosoma cruzi-Infektion (DE ABREU VIEIRA et al., 2009).
Mn-SOD wurde mit einem polyklonalen Antikörper (Isotyp IgG) aus dem Schaf gegen humane SOD aus der Leber (Anti-Superoxide Dismutase (Mn-Enzyme), Sheep pAb, Cat.No. 574596, Calbiochem) detektiert. Nach Herstellerangaben ist dieser Antikörper spezifisch für Mensch, Mause, Ratte, Kaninchen und Hamster (schwach).
Zur Darstellung von 3-NT wurde ein polyklonaler Antikörper (Isotyp IgG) aus dem Kaninchen (Anti-Nitrotyrosine, Cat. 06-284, MILLIPORE GmbH, Schwalbach) gewählt. Laut Herstellerangaben detektiert dieser Antikörper Nitrotyrosin in allen Spezies.
Die Gebrauchskonzentrationen wurden bei jeder einzelnen Färbung durch Verdünnung mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit Zusatz von 1%igem bovinem Serumalbumin (BSA; Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen) frisch hergestellt. Die Antikörper wurden unverdünnt und aliquotiert bei -20°C gelagert.
3.4.3 Sekundärantikörper
Als Sekundärantikörper wurde biotinyliertes Ziege-anti-Kaninchen-Immunglobulin G (H+L; Cat.No. BA-1000, Vector Laboratories, Inc. Burlingame, USA) bzw.
biotinyliertes Kaninchen-anti-Schaf-Immunglobulin G (H+L; Cat.No. BA-6000, Vector Laboratories) verwandt.
3.4.4 Detektionssystem
Bei dem Detektionssystem handelte es sich um einen Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (Vectastain-ABC-Kit Elite, Cat.No. PK-6100, Vector Laboratories).
3.4.5 Färbemethode
Die Färbung erfolgte mittels AEC + High Sensitivity Substrate Chromogen Ready-to-Use Lösung (DAKO North America, Inc., Via Real, USA, Cat.No. K3469).
3.4.6 Immunhistochemische Nachweismethode
Die Paraffinschnitte wurden zunächst in Rotihistol (Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe) entparaffiniert. Da die Immunhistologie in wässrigem Medium abläuft, wurden die Schnitte anschließend in einer absteigenden Alkoholreihe (Isopropanol, Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, 6966.4; Ethanol vergällt, Carl Roth GmbH &
Co. KG, Karlsruhe, K928.2) rehydriert. Gewebeeigene endogene Peroxidasen können zu unspezifischen Reaktionen mit dem AEC führen. Aus diesem Grund wurde im nächsten Schritt durch Zugabe von 0,5%igem Wasserstoffperoxid (Wasserstoffperoxid 30%, VWR TM International GmbH, Darmstadt, 1.07209.0250) in 70%igem Ethanol eine irreversible Hemmung der endogenen Peroxidasen durchgeführt.
Während der Formalinfixierung kommt es zum Verlust der Immunreaktivität vieler Antigene. Verantwortlich ist die formalininduzierte Bildung chemischer Quervernetzungen innerhalb eines Proteins und/oder zwischen verschiedenen Proteinen, die zur Veränderung vieler Epitope führt. Man spricht auch von einer
„Maskierung“ des Antigens. Um diese Antigene wieder zugänglich zu machen, existieren verschiedene Ansätze. Möglich ist ein Aufschluß mit proteolytischen Enzymen oder die Wiederherstellung der Antigene mittels Erhitzung in einer Pufferlösung. Die Vorbehandlung erfolgte bei der Reaktion mit iNOS und Mn-SOD mit Citratlösung (ProTaqs, pH 6, Biocyc GmbH & Co. KG, Luckenwalde, 400300692) und Erhitzen in der Mikrowelle. Die Demaskierung für 3-NT fand bei 37°C in PBS mit Zusatz von 0,05% Pronase E (VWR TM International GmbH, Darmstadt, 0743) und 0,05% CaCl2 x 2H2O (VWR TM International GmbH, Darmstadt, 2382) statt.
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Unmittelbar vor dem Auftragen des Primärantikörpers wurden die Schnitte in 1:5 mit PBS verdünntem Ziegennormalserum (bei 56°C für 30 Min. inaktiviert) inkubiert.
Dieser Schritt sorgte für eine Verringerung der hydrophoben Wechselwirkungen zwischen den Gewebe- und Reagenz-Proteinen. Die hydrophoben Wechselwirkungen können zum einen durch die Fixierung oder durch die Zusammensetzung des Antikörper-Verdünnungspuffers bedingt sein. Zum anderen neigen einige Gewebe, wie z.B. Bindegewebe, durch ihre Kollagen- und Elastin-Elemente zu hydrophoben Wechselwirkungen und rufen so unspezifische Hintergrundfärbungen hervor. Eine weitere Methode zur Reduzierung der unspezifischen Hintergrundfärbungen war der Einsatz eines blockierenden Proteins (Rinderserumalbumin) und die Zugabe von Detergens (Tween-20) zum Antikörper-Verdünnungsmedium.
Die Inkubation mit dem Primärantikörper erfolgte über Nacht bei 4°C. Dieser war in PBS mit 1%igem Rinderserumalbumin und 0,05%igem Tween-20 gelöst.
Anschließend fand eine Kopplung an einen biotinylierten Sekundärantikörper statt.
Im nächsten Schritt wurde der ABC-Komplex hinzugefügt, welcher an das Biotinmolekül des sekundären Antikörpers bindet. Durch die Peroxidase wurde das anschließend zugegebene Chromogen 3-Amino-9-ethylcarbazol (AEC) zu einem rotbraunen Farbprodukt ausgefällt.
Die Gewebeschnitte wurden mit Hämalaunlösung nach Mayer (Carl Roth GmbH und Co. KG, Karlsruhe, T865.2) gegengefärbt und mit Glycergel Mounting Medium (Dako, C0563) eingedeckt.
Bei der Färbung mit anti-3-NT wurde eine Tyramin-Signalverstärkung nach dem ABC-Schritt eingeschaltet. Hierbei wurde an den bereits gebundenen ABC-Komplex zusätzlich in einem weiteren Inkubationsschritt biotinyliertes Tyramin gebunden.
Durch die Reaktion mit biotinyliertem Tyramin und zugegebenem Wasserstoffperoxid entstanden neue Bindungsstellen, an die sich in dem darauf folgenden Inkubationsschritt mit dem gleichen Peroxidase-markierten ABC-Komplex weitere Komplexanlagerungen anschließen konnten. Dadurch kam es zu einer erheblichen Signalverstärkung und der Antikörper konnte in einer höheren Verdünnung eingesetzt werden (WASIELEWSKI et al., 1997).
In Tabelle 4 sind die verschiedenen Antikörper mit Verdünnungsfaktor, Demaskierungsverfahren sowie das jeweilige Blockserum und die Sekundärantikörper mit der Arbeitsverdünnung ersichtlich.
Tabelle 4: Antikörper, Demaskierung, Blockserum, Verdünnung des Primär- und Sekundärantikörpers
Primär-antikörper Demaskierung Blockserum
Verdünnung
biot. = biotinyliert; IgG = Immunglobulin G; Min. = Minuten;
3.4.7 Durchführung der Immunhistochemie (ABC-Methode)
1. Deparaffinierung und Rehydratisierung der Paraffinschnitte wie folgt: Rotihistol 3x je 5 Min., Isopropanol 5 Min., 96% Ethanol 3 Min., 70% Ethanol 3 Min.
2. Hemmung der endogenen Peroxidase für 30 Min. in 70% Ethanol mit 0,5%
Wasserstoffperoxid, Ansatz: 3 ml Wasserstoffperoxid + 197 ml PBS.
3. Dreimaliges Spülen der Schnitte in PBS für 5 Minuten bei Raumtemperatur, dabei langsam rühren.
4. Demaskierung der Antigene in Citratpuffer für 20 Min. in der Mikrowelle (500 Watt) bzw. für 20 Min. in 0,05% Pronase E mit 0,05% CaCl2 x 2H2O bei 37°C im
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Brutschrank bei 37°C, Ansatz: je 0,1 g Pronase E und CaCl2 x 2H2O in 200 ml vorgewärmtes PBS einfüllen und gut durchrühren.
5. Dreimaliges Spülen der Schnitte in PBS für 5 Min. bei Raumtemperatur, dabei langsam rühren.
6. Verbringen der Schnitte in Coverplates; überschichten mit 1:5 verdünnten inaktivierten Ziegennormalserum bzw. Kaninchenserum in PBS. Inkubation für 20 Min. bei Raumtemperatur.
7. Überschichten mit verdünntem Primärantikörper (siehe Tabelle 4). Inkubation über Nacht im Kühlschrank bei 4°C.
8. Schnitte bei Raumtemperatur 30 Min. stehen lassen, dreimaliges Spülen der Schnitte in PBS für 5 Min. bei Raumtemperatur.
9. Inkubation der Schnitte mit den verdünnten Sekundär-Antikörpern (Tabelle 4) für 30 Min. bei Raumtemperatur.
10. Dreimaliges Spülen der Schnitte in PBS für 5 Min. bei Raumtemperatur.
11. Inkubation der Schnitte mit dem ABC für 30 Min. bei Raumtemperatur, Ansatz: 1 ml PBS vorlegen, 15 µl Reagenz A zufügen und mischen, dann 15 µl Reagenz B hinzufügen und mischen; 30 Min. vor Gebrauch ansetzen.
12. Dreimaliges Spülen der Schnitte in PBS für 5 Min. bei Raumtemperatur.
13. Enzymhistochemische Reaktion: Zugabe von AEC-Reagenz: 4 Tropfen pro Schnitt; Inkubation 15 Min. bei Raumtemperatur.
14. Dreimaliges Waschen der Schnitte in PBS für 5 Min. bei Raumtemperatur.
15. Verbringen in eine Küvette mit Leitungswasser, 10 Min. spülen.
16. Gegenfärben der Schnitte mit Hämalaun für 20 Sekunden bei Raumtemperatur.
17. Bläuen der Schnitte in Leitungswasser für 10 Min. bei Raumtemperatur.
18. Eindecken mit angewärmtem Glycergel Mounting Medium und Deckgläschen.
3.4.8 Spezifitätskontrollen
Als Positivkontrolle für den iNOS-Nachweis wurden Lymphknotenschnitte eines nachweislich an Leishmaniose erkrankten Hundes verwandt. Die Paraffinblöcke stammten aus dem Department of Anatomy and Comparative Pathology, Faculty of Veterinary Medicine, University of Córdoba, Spanien, und wurden von R. Zafra zur Verfügung gestellt. Nach ZAFRA et al. (2008) zeigten die Makrophagen des Popliteallymphknotens von Leishmanien-infizierten Hunden eine positive Expression für iNOS. Als interne Kontrolle eignete sich die positive Reaktion des Plexus myentericus für iNOS, die auch von VANNUCCHI et. al (2002) für das Kolon von Mäusen und von WANG et al. (2010) für das Kolon der Ratte beschrieben wurde.
Eine basale Immunreaktion der Neuronen wurde auch für 3-NT und für Mn-SOD von verschiedenen Autoren beschrieben: Eine positive Reaktion für Nitrotyrosin fand sich laut MILLER et al. (1995) für die Neuronen im Meerschweinchenileum. TANNAHILL et al. (1995) wiesen eine Expression für Mn-SOD im Plexus myentericus der Ratte nach. Für die Negativkontrollen wurde an Stelle des Primärantikörpers mit PBS oder mit Kaninchenserum (3-NT-Färbung) inkubiert.
Des Weiteren erfolgte die Ermittlung der Spezifität des anti-Nitrotyrosin-Antikörpers mittels einer Absorptionsreaktion. Dabei wurde der Antikörper mit 1µMol 3-Nitro-tyrosine (Sigma-Aldrich, N7389-5G) über Nacht im Kühlschrank inkubiert, abzentrifugiert und anschließend wie oben beschrieben eingesetzt (RADI et al., 2001). Eine immunhistologische Reaktion an Darmschnitten von Kontrollhunden war anschließend nicht nachweisbar.
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3.4.9 Auswertung der Immunhistochemie
Die Beurteilung der immunhistochemischen Reaktionen erfolgte unter Verwendung eines Mikroskops (Zeiss Axiostar plus, Oberkochen). Die Schnitte wurden mäanderförmig abgefahren. Die Auswertung der Expressionsmuster für iNOS, NT und Mn-SOD wurde semiquantitativ durchgeführt, da eine Auszählung der immunhistochemischen Zellen auf Grund des Färbemusters nicht möglich war. Dabei wurde ein Zahlenscore von 0 bis 3 verwendet:
0 = keine Expression
0,5 = geringstgradige Expression 1 = geringgradige Expression
1,5 = gering- bis mittelgradige Expression 2 = mittelgradige Expression
2,5 = mittel- bis hochgradige Expression 3 = hochgradige Expression.
Die statistische Auswertung der semiquantitativ ermittelten Daten der Tiere erfolgte mittels des Statistikprogrammes „Statistical Analysis System“ (SAS) für Windows, Version 9.1, SAS Institute Inc., Cary, USA, in Zusammenarbeit mit dem Institut für Biometrie, Epidemiologie und Informationsverarbeitung der Tierärztlichen Hochschule Hannover.
Die ermittelten Werte wurden mittels des Shapiro-Wilk-Tests auf ihre Normalverteilung untersucht. Da keine Normalverteilung der Daten vorlag, kamen ausschließlich nicht-parametrische Tests zur Anwendung. Im Einzelnen kamen der Kruskal-Wallis-Test zum globalen Gruppenvergleich und der Wilcoxon-Two-Sample-Test zum paarweisen Vergleich zum Einsatz. Die Werte der einzelnen Gruppen wurden als signifikant verschieden gewertet, wenn der p-Wert < 0,05 lag. Außerdem wurden mit dem Programm SPSS (Superior Performing Software Systems, Version 15.0) Boxplot-Diagramme erstellt. Die Untersuchungen auf eine Korrelation zwischen histopathologischem Entzündungsgrad und der Expression von iNOS, 3-NT und
Mn-SOD erfolgten durch Spearman`sche Rang-Korrelation für nicht parametrische Daten (Programm: SPSS).
Das jeweilige Expressionsmuster von iNOS, Mn-SOD und NT wurde histologisch jeweils für die Kontrolltiere und die IBD-Tiere ausführlich beschrieben und verglichen.
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