Expression von iNOS, 3-NT und Mn-SOD bei Hunden mit IBD

5.2.1 Expression von iNOS

Bei dem Vergleich zwischen Kontrollhunden und Hunden mit EGE bzw. LPE waren signifikante Unterschiede in der iNOS-Expression festzustellen. Im Dünndarm und Kolon wies die EGE-Gruppe eine signifikante Erhöhung der iNOS-Expression auf.

Die LPE-Gruppe zeigte im Dünndarm signifikante Unterschiede. Wurden beide Gruppen als IBD-Gruppe zusammengefaßt, waren die Unterschiede für Dünn- und Dickdarm im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant. Für den Magen ergaben sich beim Vergleich der IBD-Gruppe und der Kontrollgruppe keine Unterschiede. Für den Magen der LPE-Gruppe zeigte sich eine signifikante Erhöhung der iNOS-Expression.

Diese Ergebnisse stehen in Einklang mit Untersuchungen bei Hunden mit IBD, die in der Kolon-Lavage-Flüssigkeit erhöhte Nitrit-Konzentrationen aufwiesen und somit ebenso auf eine erhöhte iNOS-Expression hinweisen (GUNAWARDANA et al., 1997). Im Gastrointestinaltrakt wird NO durch ortsständige Bakterien oder durch iNOS produziert (GUNAWARDANA et al., 1997). Erhöhte Nitrit-Konzentrationen sind eine indirekte Meßmethode zur Bestimmung von NO. Bei Menschen mit aktiver IBD (ROEDIGER et al., 1986) und bei Meerschweinchen mit induzierter Ileitis (MILLER et al., 1992) zeigten sich ähnliche Ergebnisse. LUNDBERG et al. (1994) wiesen bei Patienten mit ulzerativer Kolitis (UC) NO direkt mit einer Chemilumineszenzmethode in Gasproben aus dem Kolon nach. Die NO-Konzentrationen waren im Vergleich zu Gesunden mehr als 100fach erhöht. Dagegen war die iNOS-Aktivität in der Untersuchung von BOUGHTON-SMITH et al. (1993) nur um das Achtfache erhöht.

LUNDBERG et al. (1994) vermuteten, dass die hohen luminalen NO-Konzentrationen hauptsächlich von oberflächlichen Mukosabereichen gebildet werden und dass das NO in tieferen Schichten sofort gebunden wird (z.B. von Hämoglobin in Blutgefäßen) und daher im Vergleich weniger stark erhöht ist als die luminale NO-Konzentration.

In dieser Untersuchung wurde iNOS hauptsächlich in intestinalen Epithelzellen nachgewiesen. Ähnliche Ergebnisse sind für Untersuchungen bei Menschen mit UC oder Morbus Crohn (MC) bekannt (SINGER et al., 1996; KIMURA et al., 1998;

KOLIOS et al., 1998; KRUIDENIER et al., 2003c). Eine erhöhte iNOS-Expression

konnte in den vorliegenden Untersuchungen an Hunden mit IBD sowohl in entzündeten wie auch in nicht-entzündeten Bereichen der Mukosa der gastrointestinalen Proben festgestellt werden. Diese Ergebnisse stimmen mit denen von KRUIDENIER et al. (2003c) und ROBERTS et al. (2001) überein. SINGER et al.

(1996), KIMURA et al. (1998) und KOLIOS et al. (1998) fanden dagegen nur in der entzündlich veränderten Mukosa von Menschen mit UC eine iNOS-Expression.

Bei Hunden mit IBD wies das Entzündungszellinfiltrat gleicherweise eine iNOS-Immunreaktivität auf. Bei Untersuchungen an humanen IBD-Fällen fand sich eine iNOS-Expression in Phagozyten, dendritischen Zellen, natürlichen Killerzellen sowie T- und B-Lymphozyten (BOGDAN, 2001). Außerdem wiesen Entzündungszellinfiltrate in intestinalen Bioptaten von Patienten mit IBD eine positive iNOS-Färbung auf (SINGER et al., 1996). KRUIDENIER et al. (2003c) fanden in wenigen Proben NOS-positive mononukleäre Zellen in der Lamina propria. Über eine fehlende iNOS-Aktivität in Entzündungszellen berichteten KOLIOS et al. (1998).

Diese unterschiedlichen Ergebnisse beruhen möglicherweise auf Unterschieden bezüglich des Studiendesigns, verwendeter Antikörper und Färbeprotokolle oder unterschiedlicher Reagenzien, wie z.B. Pufferlösungen. So benutzten KRUIDENIER et al. (2003c) einen universellen NOS-Antikörper, der die Kalzium-abhängige und Kalzium-unabhängige NOS erkennt, während andere Untersuchungen nur die Kalzium-unabhängige iNOS berücksichtigten.

In den vorliegenden Untersuchungen war eine erhöhte iNOS-Expression in entzündeter und nicht-entzündeter Darmmukosa von IBD-Hunden festzustellen.

Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass eine höhere Expression von iNOS nicht unbedingt mit einem erhöhten Vorkommen von Entzündungszellen assoziiert ist.

KRUIDENIER et al. (2003c) fanden ebenfalls eine erhöhte epitheliale NOS-Expression in der nicht-entzündlich veränderten Mukosa von IBD-Patienten. Andere Untersuchungen hingegen fanden iNOS-Expression nur in Verbindung mit entzündlichen Veränderungen der Mukosa (SINGER et al., 1996; KIMURA et al., 1998; KOLIOS et al., 1998).

In der vorliegenden Untersuchung war keine Korrelation zwischen der iNOS-Expression und dem Grad der histologischen Veränderungen feststellbar. Die

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Intensität der Expression von iNOS lässt daher keine Schlüsse auf den Grad der intestinalen Entzündung zu.

Zwischen der LPE- und der EGE-Gruppe waren in dieser Untersuchung keine signifikanten Unterschiede in der iNOS-Expression festzustellen. Daher ist zu vermuten, dass beide Erkrankungsformen mit einer erhöhten iNOS-Expression einhergehen. KLEINSCHMIDT et al. (2007) vermuteten, dass bei Hunden mit LPE/LPK ein Th1-Zytokinspektrum und bei Hunden mit EGEK möglicherweise Th2-vermittelte Hypersensitivitätsmechanismen vorliegen. Andere Studien bei Hunden deuten auf eine gemischte Th1- und Th2-Zytokin Aktivierung hin (GERMAN et al., 2000b; JERGENS et al., 2009a). Weitere Untersuchungen ergaben wiederum keine eindeutigen Hinweise auf eine erhöhte Expression von bestimmten Zytokinen (PETERS et al., 2005; JERGENS et al., 2009a; DE MAJO et al., 2008). Beim MC des Menschen handelt es sich um eine Th1-dominierte Entzündungszellreaktion (BISCHOFF et al., 1996), während bei der UC ein Anstieg des Th2-Zytokinspektrums zu finden ist (FUSS, 2008). Eine erhöhte iNOS-Expression könnte auf eine verstärkte Th1-Antwort hindeuten, da eine Th1-Immunaktivierung zusammen mit verschiedenen Transkriptionsfaktoren wie NF-κB oder signal transducer and activator of transcription (STAT)-1α bei Menschen und Nagern anscheinend zu einer (pathologischen) iNOS-Expression führen können (MÜHL et al., 2011).

Untersuchungen von SHI et al. (2006) führen ebenfalls zu dem Schluß, dass von Th1-Zellen abgegebene Zytokine eine iNOS-Expression induzieren.

Außerdem ergab eine Studie von MODOLELL et al. (1995), daß Th2-Zytokine (IL-4 und IL-10) vermutlich die Expression von iNOS unterdrücken. In Versuchen an Makrophagen aus dem Knochenmark von Mäusen induzierten Th1-Zellen und deren Zytokine eine Expression, während Th2-Zellen und deren Zytokine die iNOS-Expression supprimierten (MODOLELL et al., 1995).

Des Weiteren ist IL-17 (Th17-Zellen) anscheinend in der Lage, eine iNOS-Expression zu induzieren. Diese Beobachtung wurde bisher nur in humanen Chondrozyten gemacht und ist noch nicht für epitheliale Zellen verifiziert (MÜHL et al., 2011).

KRUIDENIER et al. (2003c) fanden in der Darmmukosa von UC-Patienten eine signifikant höhere iNOS-Expression als in der Mukosa von MC-Patienten. In dieser Untersuchung waren keine Unterschiede der iNOS-Expression in der Mukosa von LPE- und EGE-Hunden feststellbar, was vermuten läßt, dass beide Erkrankungsformen ähnliche Pathomechanismen, die zur verstärkten Expression von iNOS führen, aufweisen könnten.

Bei Hunden mit IBD war im Plexus submucosus sowie im Plexus myentericus eine verstärkte iNOS-Färbung darstellbar. Die Bedeutung dieser Befunde ist weitgehend ungeklar. MILLER et al. (1995) zeigten bei Meerschweinchen mit induzierter Ileitis gleiche Beobachtungen und auch KRUIDENIER et al. (2003c) fanden bei Menschen mit UC und MC eine verstärkte Expression von NOS in den submukosalen Neuronen. KLEINSCHMIDT et al. (2011) führten bei Katzen mit chronischen Magen-Darmerkrankungen histologische und immunhistochemische Untersuchungen zur Beteiligung des enteralen Nervensystems durch und fanden Hinweise auf eine mögliche neuronale Störung. Möglicherweise ist die verstärkte Expression von iNOS (und 3-NT) in den Neuronen des enterischen Nervensystems bei Hunden mit IBD ebenfalls als ein Hinweis auf eine Schädigung der Neuronen (durch NO) zu interpretieren.

5.2.2 Expression von 3-NT

Bei der immunhistologischen Reaktion zur Darstellung von 3-NT fanden sich ähnliche Ergebnisse wie bei der iNOS-Reaktion. Es ergaben sich im Dick- und Dünndarm vor allem zwischen der EGE- und der Kontrollgruppe signifikante Unterschiede. Eine erhöhte Expression von 3-NT wurde auch in intestinalen Biopsien von Menschen mit IBD und bei Mäusen und Meerschweinchen mit experimentell induzierter Kolitis festgestellt (MILLER et al., 1995; DIJKSTRA et al., 1998; KIMURA et al., 1998; ZINGARELLI et al., 1999; KUBES und MCCAFFERTY, 2000;

KRUIDENIER et al., 2003c). In der vorliegenden Untersuchung war die iNOS- und 3-NT-Expression in den gleichen Lokalisationen zu finden (Epithelzellen, Entzündungszellen, Gefäßwände, Plexus submucosus und Plexus myentericus).

Außerdem lag eine schwache Korrelation zwischen der Expression von 3-NT und iNOS im Dünndarm vor. Daher ist zu vermuten, dass in der intestinalen Mukosa von

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Hunden mit IBD vermehrt Peroxynitrit aus NO und Superoxid gebildet wird und zu einer Nitration von Tyrosin führt und die iNOS- und 3-NT-Expression somit miteinander im Zusammenhang stehen. In Tiermodellen mit iNOS-defizienten Mäusen und induzierter Kolitis war eine reduzierte Bildung von 3-NT feststellbar (ZINGARELLI et al., 1999), was zeigt, dass iNOS für die Entstehung von 3-NT notwendig ist. MILLER et al. (1995) und SINGER et al. (1996) stellten zusätzlich eine Kolokalisation von 3-NT und iNOS fest und kamen zu dem Schluß, dass iNOS für die Bildung von Peroxynitrit verantwortlich ist. Im Gegensatz dazu stehen andere Untersuchungen, die eine Bildung von 3-NT nicht in Verbindung mit einer iNOS-Expression fanden (DIJKSTRA et al., 1998; KRUIDENIER et al., 2003c). Zusätzlich fanden EISERICH et al. (1998) heraus, dass Nitrotyrosin nicht nur mittels Peroxynitrit, sondern durch die Reaktion verschiedener anderer reaktiver Stickstoffspezies entstehen kann, was vermuten läßt, dass noch weitere Reaktionen an der Entstehung von Nitrotyrosin beteiligt sind.

Die Ergebnisse der vorliegenden Untersuchung lassen vermuten, dass die Formation von 3-NT bei Hunden mit IBD mit der iNOS-Expression in Zusammenhang steht.

Untersuchungen an der Lunge von Hunden unterstützen diese Ergebnisse.

Immunhistochemisch wurden iNOS und Nitrotyrosin in den gleichen Lungenlokalisationen nachgewiesen. Der Einsatz von iNOS-Inhibitoren verminderte auch die Nitrotyrosin-Produktion (NUMATA et al., 1998).

Eine Korrelation von 3-NT-Bildung und dem Grad der histologischen Veränderungen ergab sich in dieser Untersuchung nicht.

5.2.3 Expression von Mn-SOD

Die Mn-SOD-Färbung ergab ein ähnliches Expressionsmuster wie die iNOS- und 3-NT-Färbung. Verglichen mit der Kontrollgruppe wiesen die gastrointestinalen Bioptate der IBD-Gruppe signifikant erhöhte Expressionswerte auf. Superoxid Dismutasen zählen neben Katalasen und Glutathionperoxidasen zu den wichtigsten Enzymen, die vor oxidativem Stress durch reaktive Sauerstoffspezies schützen (KRUIDENIER und VERSPAGET, 2002). Eine Erhöhung der Expression der Mn-SOD deutet daher auf ein erhöhtes Vorkommen von reaktiven Sauerstoffspezies wie Superoxid hin. Ähnliche Ergebnisse finden sich in Untersuchungen an humaner IBD

(KRUIDENIER et al., 2003a) und bei Ratten mit experimentell induzierter Kolitis (TANNAHILL et al., 1995). WATTERLOT et al. (2010) zeigten bei Mäusen mit induzierter Kolitis, dass aus Lactobacillus casei gewonnene Mn-SOD oxidativen Stress und entzündliche Veränderungen in der Mukosa mildert. Fraglich ist, ob genügend Mn-SOD gebildet wird, um den gewebeschädigenden reaktiven Sauerstoffspezies entgegenzuwirken. KRUIDENIER et al. (2003a) vermuteten, dass ein Teil der Mn-SOD bei Menschen mit IBD in enzymatisch inaktiver Form vorliegt und diese Dysfunktion zur Induktion und/oder Unterhaltung der entzündlichen Prozesse beiträgt. Da bei den Hunden mit IBD in dieser Untersuchung trotz Erhöhung der Mn-SOD chronische, entzündliche Prozesse in der intestinalen Mukosa vorlagen, ist ebenfalls nicht auszuschließen, dass funktionale Störungen der antioxidativen Schutzmechanismen beteiligt sein könnten. Möglicherweise tragen die hohen, entzündungsbedingten Mengen reaktiver Sauerstoffspezies zur Inaktivierung der Mn-SOD bei. Außerdem wäre ist es auch möglich, dass eine Erhöhung von oxidativem Stress durch Wasserstoffperoxid, welches durch Mn-SOD entsteht, auftritt.

Eine Korrelation der Expression der Mn-SOD mit der Expression von iNOS oder 3-NT oder mit dem Grad der histologischen Veränderungen konnte nicht festgestellt werden.