Expression bei darmgesunden Hunden

5.1.1 Expression von iNOS

In den Dünn- und Dickdarmbiopsien der Kontrolltiere konnte eine schwache iNOS-Expression in den Enterozyten beobachtet werden.

Für den Menschen gibt es widersprüchliche Untersuchungsergebnisse zur Expression von iNOS. In mehreren Untersuchungen konnte in gesunder Kolonschleimhaut von Menschen immunhistochemisch und mittels Western Blot kein iNOS nachgewiesen werden (BOUGHTON-SMITH et al., 1993; SINGER et al., 1996;

KIMURA et al., 1998; KOLIOS et al., 1998). Neuere Untersuchungen zeigten immunhistochemisch, mittels Immunoblot und in der Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) eine iNOS-Expression in den Enterozyten, in den Blutgefäßen und in den Neuronen des Darmes von gesunden Menschen (GUIHOT et al., 2000; ROBERTS et al., 2001; KRUIDENIER et al., 2003c) und Mäusen (ZINGARELLI et al., 1999). MOKRZYCKA et al. (2010) wiesen in den

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Enterozyten von Duodenumbiopsien von darmgesunden Kindern immunhistologisch eine kräftige iNOS-Reaktivität nach.

Die Expression von iNOS in normaler caniner intestinaler Mukosa stellt möglicherweise eine Antwort auf Antigene wie z.B. Lipopolysaccharide (LPS) in der Ingesta dar, die möglicherweise zu einer Aktivierung der iNOS führen. Es ist denkbar, dass Enterozyten NO als oxidative Barriere gegen schädigende Mikroorganismen bilden, um zu verhindern, dass diese die Mukosa durchdringen und schädigen. Somit würde iNOS eine protektive Barriere des Darms darstellen (BOGDAN et al., 2000; KOLIOS et al., 2004).

Bei den Kontrollhunden konnte eine schwach positive Reaktion für iNOS in einzelnen Immunzellen wie Makrophagen, Plasmazellen und Lymphozyten der Lamina propria mucosae, Tela submucosa und Peyerschen Platten festgestellt werden. Ein ähnliches Reaktionsmuster wurde in verschiedenen Zellen wie Makrophagen, dendritische Zellen, natürliche Killerzellen, T-Zellen und B-Zellen beim Menschen sowie bei Mäusen und Ratten nachgewiesen (BOGDAN, 2001). ZAFRA et al. (2008) stellten in einer Studie mit Leishmanien infizierten Hunden bei den gesunden Kontrollhunden schwach iNOS-positive Makrophagen in Lymphknoten dar, was zeigt, dass bei gesunden Hunden eine iNOS-Expression stattfindet.

Des Weiteren wurde eine iNOS-Färbung der Neuronen des Plexus myentericus und des Plexus submucosus festgestellt. WANG et al. (2010) lokalisierten mit dem auch in dieser Untersuchung eingesetzten iNOS-Antikörper im Zusammenhang mit Ethanol-Stimulierung eine starke iNOS-Expression und NO-Freisetzung im Plexus myentericus des Kolons von Ratten. Die Autoren vermuteten, dass NO (und somit auch Ethanol) einen starken Einfluss auf die Motilität des Gastrointestinaltraktes hat.

VANNUCCHI et al. (2002) beschrieben eine basale Expression von iNOS im Zytoplasma der myenterischen Neuronen der Maus. KRUIDENIER et al. (2003c) stellten im humanen Dickdarm im Plexus submucosus ebenfalls eine positive Immunreaktion fest. Die Expression von iNOS in den gastrointestinalen Neuronen weist darauf hin, dass NO beim Hund, wie auch bei der Ratte, eine motorische Funktion haben könnte.

Vereinzelt stellten sich arterielle und venöse Gefäßwände der Kontrollhunde positiv in der iNOS-Färbung dar. Auch in anderen Studien wurden iNOS-positive Blutgefäße beschrieben. So fanden KRUIDENIER et al. (2003c) bei allen untersuchten Dickdarmproben von Menschen eine iNOS-Färbung der Blutgefäße. PERNER und RASK-MADSEN (1999) berichten von einer iNOS-Expression in vaskulären glatten Muskelzellen. Andere Untersuchungen wiesen eine vaskuläre iNOS-Expression in Zusammenhang mit Infektionen nach, was auf eine systemische Aktivierung hinweist. So stellten DE ABREU VIEIRA et al. (2009) bei Untersuchungen am Hund zur Infektion mit Trypanosoma cruzi mit dem gleichen iNOS-Antikörper bei infizierten Tieren in Arterien und Arteriolen des Herzens eine iNOS-Immunreaktivität fest. In dieser Untersuchung wurde iNOS nur in wenigen Gefäßen (4% der Lokalisationen) nachgewiesen, so dass es sich vermutlich im Gegensatz zu den Ergebnissen von KRUIDENIER et al. (2003c) nicht um eine kontinuierliche iNOS-Expression handelt.

Vereinzelt waren im basalen Kryptepithel des Duodenums, des Jejunums, des Ileums und des Kolons der Kontrollhunde Zellen mit besonders intensiver, zytoplasmatischer, roter Färbung sowie einem grob granulierten Zytoplasma nachweisbar. Im Darmepithel des Hundes kommen neben Enterozyten und Becherzellen weiterhin enteroendokrine Zellen vor (BANKS, 1993). Die zelluläre Zuordnung und Bedeutung dieser iNOS-positiven Zellen bleibt unklar. Eine Charakterisierung wäre z.B. mit Hilfe einer Doppelfärbung unter Einsatz von Markern wie Chromogranin A (CORTINA et al., 2007) zur Darstellung von enteroendokrinen Zellen möglich.

Bei Hunden ist im einschlägigen Schrifttum keine iNOS-Aktivität im Magen untersucht worden. In dieser Untersuchung stellte sich das einschichtige hochprismatische Epithel des Magens vereinzelt geringstgradig immunhistochemisch positiv dar. Im Magenfundus zeigte sich akzentuiert in der basalen Hälfte der Mukosa eine positive Färbung der Hauptzellen. Bei Versuchen an Ratten wurde iNOS im Magen immunhistologisch (gleicher Antikörper), mittels semiquantitativer RT-PCR und mittels Western Blot bestimmt. Bei Kontrolltieren ließ sich mittels RT-PCR und Western Blot geringgradig iNOS nachweisen. Nach Stimulation mit LPS fand sich

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eine starke Protein- und mRNA-Aufregulation und immunhistologisch eine starke Expression in den Epithelzellen des Magens (UNO et al., 2004). Beim Menschen ist eine starke mukosale iNOS-Expression im Magen häufig mit einer Helicobacter pylori-Infektion assoziiert. Bei Gesunden waren hingegen nur geringe Mengen an mRNA nachweisbar (NAITO et al., 2008). Die nachgewiesene iNOS-Expression im Epithel der Kontrollhunde weist auf das Vorhandensein einer schwachen iNOS-Expression in der gesunden Magenschleimhaut hin. Außerdem wurde eine Expression von iNOS in den tiefer gelegenen Anteilen der Drüsenzellen des Magens (vermutlich Hauptzellen) gefunden. Ähnliche Befunde bei anderen Spezies sind in der Literatur nicht vorhanden. Es kann daher nicht ausgeschlossen werden, dass es sich hierbei um unspezifische Reaktionen mit Bestandteilen der Sekrete der Drüsenzellen handelt.

Zur Bestätigung der in dieser Arbeit erhobenen Ergebnisse wäre ein Nachweis von iNOS mittels weiterer Untersuchungsmethoden wie RT-PCR zum Nachweis von iNOS-RNA, Immunoblot zum Nachweis von iNOS-Protein oder Real-Time-quantitative-PCR zur Quantifizierung von iNOS-DNA hilfreich.

5.1.2 Expression von 3-NT

Bei den Kontrollhunden entsprach das immunhistochemische Expressionsmuster von 3-NT dem der iNOS-Expression. 3-NT gilt als Indikator für die Reaktion von NO und Superoxid zu Peroxynitrit, welches Tyrosin zu 3-NT nitriert (MCCAFFERTY, 2000). Daher ist zu vermuten, dass im Gastrointestinaltrakt von gesunden Hunden eine Bildung von NO sowie eine Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies und Peroxynitrit vorkommen. Für den Hund gab es bislang keine Untersuchungen zur Expression von 3-NT im Gastrointestinaltrakt. Bei darmgesunden Menschen fanden KRUIDENIER et al. (2003c) im Kolon eine epitheliale 3-NT-Expression. MILLER et al.

(1995) zeigten bei Meerschweinchen eine 3-NT-Reaktion der Neuronen. Die Untersuchungsergebnisse dieser Arbeit weisen darauf hin, dass bei darmgesunden Hunden eine schwache Expression von 3-NT vorkommt. Aufgrund des ähnlichen Expressionsmusters von NT und iNOS ist zu vermuten, dass die Entstehung von 3-NT mit der Expression von iNOS im Zusammenhang steht. Da es sich um

darmgesunde Hunde handelt, führen geringgradige Mengen an RNS anscheinend nicht (oder nur geringgradig) zu Schäden im Gastrointestinaltrakt.

5.1.3 Expression von Mn-SOD

Bei den Kontrollhunden stellte sich das Mn-SOD-Expressionsmuster ähnlich wie das iNOS- und 3-NT-Expressionsmuster dar. Ähnliche Ergebnisse stellten auch KRUIDENIER et al. (2003a) in Untersuchungen an menschlicher, normaler Darmmukosa fest, wobei sich eine granuläre, zytoplasmatische Mn-SOD-Färbung des Epithels, der neutrophilen Granulozyten und Makrophagen fand. Eine kräftige Färbung des Plexus submucosus war, wie in dieser Untersuchung, ebenfalls darstellbar. Des Weiteren waren eine basale Protein-Aktivität und Mn-SOD-Protein-Konzentration nachweisbar. In einer Spezies-übergreifenden Studie wurde die Mn-SOD-Aktivität in verschiedenen Organen von Hunden mittels eines Enzym-Assays mit anschließender spektrophotometrischer Messung bestimmt. Verglichen mit Herz, Niere oder Leber fand sich im Gastrointestinaltrakt eine relativ niedrige Mn-SOD-Aktivität (MARKLUND, 1984). IKEDA et al. (1995) stellten Mn-SOD immunhistochemisch in Gefäßen des Herzens gesunder Hunde dar. Diese Untersuchungsergebnisse weisen darauf hin, dass eine schwache Mn-SOD-Expression bei gesunden Hunden vorkommt, die wahrscheinlich dem Schutz vor reaktiven Sauerstoffspezies dient.

5.1.4 Expression bei verschiedenen Altersgruppen der Kontrollhunde Bei der iNOS- und Mn-SOD-Färbung zeigten sich jeweils ähnliche Ergebnisse. Die Expressionswerte der Altersgruppen zeigten keine signifikanten Unterschiede. In der 3-NT-Färbung zeigten die mittelalten Tiere eine signifikant höhere Expression als die jungen Tiere. Die alte und die junge Altersgruppe zeigten dagegen eine vergleichbare Expression. Insgesamt ist die Expression von iNOS, 3-NT und Mn-SOD im Gastrointestinaltrakt von darmgesunden Hunden anscheinend nicht altersassoziiert.

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