Immunhistochemie einschließlich immunhistologischer Färbungen

Die Immunhistochemie verfolgt das Ziel der eindeutigen Identifikation von Epitopen, die aufgrund spezifischer Antigen-Antikörper-Reaktionen Rückschlüsse auf bestimmte Gewebeeigenschaften zulassen. Dabei wird das jeweilige Epitop am Gewebeschnitt, idealerweise spezifisch und stark, von einem Antikörper gebunden, der wiederum mit einem Detektionssystem gekoppelt ist, sichtbar gemacht. Für eine erfolgreiche immunhistochemische Färbung ist die Erreichbarkeit des Epitops durch den Antikörper eine zwingende Voraussetzung und wird während der gesamten histotechnischen Bearbeitung des Gewebes beeinflusst. Da in FFPE-Gewebe vor allem infolge der Fixierung und Einbettung Proteinquervernetzungen und Formaldehydbindungen entstehen, die zu Veränderungen bis hin zum Verlust antigener Bindungsstellen (Maskierung) führen [205], wurde stets eine Antigen-Demaskierung durchgeführt. Zur Freilegung maskierter Epitope musste daher für jeden verwandten Antikörper eine passende Demaskierungsmethode ermittelt werden. Diese beinhalteten die Andauung durch proteolytische Enzyme (wie Proteinase 2%, Protease 0,1%

2 Material und Methoden

und 0,2%, Hyaluronidase 0,2% und Pepsin 0,1% gelöst in TBS), die Anwendung von feuchter Hitze (bei 100 °C auf der Heizplatte, bei 85 °C im Wasserbad oder im Dampfdruckkochtopf bei 120 °C und konstantem Druck von maximal 2 bar), beziehungsweise eine Kombination beider Methoden (Details siehe Tab. 2.5 und Tab. 2.6) [206]. Im Anschluss an die Demaskierung erfolgte eine Umrandung der Gewebeschnitte mit einem hydrophoben Begrenzungsstift, um ein späteres Abfließen der Antikörperverdünnungen zu vermeiden. Vor den immunhistologischen Einzel- und Doppelfärbungen wurden alle Präparate in TBS oder, für die Permeabilisierung der Zellmembran bei intrazellulär nachzuweisenden Epitopen, in TBS-Triton (siehe Tab. 2.1) gewaschen (3x 5 min).

Enzym-gekoppelte immunhistologische Einzelfärbungen

Für alle immunhistologischen Färbungen, die später mittels Durchlicht-Hellfeld-Mikroskopie ausgewertet werden sollten, wurde die enzymmarkierte Streptavidin-Biotin (LSAB)-Färbemethode gewählt [207]. Bei dieser Methode wurde das Gewebe zunächst mit dem gewünschten unkonjugierten Primärantikörper in gewünschter Verdünnung mit Antikörperverdünnungspuffer in einer Feuchtkammer bei 4 °C über Nacht inkubiert. Als zweiter Schritt folgte die Inkubation eines entsprechend gegen den Primärantikörper gerichteten biotinmarkierten Sekundärantikörpers, verdünnt in Antikörperverdünnungspuffer (1:400) für eine Stunde bei Raumtemperatur (RT). Die folgende 1-stündige Inkubation bei RT mit einer alkalischen Phosphatase-markierten Streptavidin-Lösung (1:200) bewirkte eine Signalamplifikation. Die Enzymmarkierung mit alkalischer Phosphatase wurde außerdem gewählt, da die behandelten Gewebeproben blutreich waren und somit der Einfluss der endogenen Peroxidase umgangen werden konnte. Abschließend wurde mittels einer Substrat-Chromogen fast red-Lösung ein sichtbares rotes Farbprodukt erzeugt. Die alkalische Phosphatase (AP) setzte dabei durch Hydrolyse das angebotene organische Phosphat um und verband sich anschließend mit dem Chromogen zu einem sichtbaren hellroten Azo-Farbstoff.

Enzym-gekoppelte immunhistologische Einzelfärbungen wurden für den Nachweis der Marker RUNX2, COL10, MMP13, Osteocalcin (OC), β-Catenin, Wif-1, DKK-1, Sclerostin, BMP-2 und -7, Sox9, COL2, COL1, OPG, RANKL, Caspase-3, 6, 10, 12, 17, IL-22, IL-23, IL-33, TGFβ, PGE2, COX-2, EP2, EP4, CD3, CD20, CD68, CD163, CD14, CD1a und DCsign an allen Facettengelenken der Patienten mit AS, OA und Konrollen durchgeführt.

Beurteilt wurde anschließend die Anzahl positiv gefärbter Zellen pro Gesamtzellzahl des gesamten hyalinen Gelenkknorpels und der subchondralen Endplatte, sowie bei 400-facher

2 Material und Methoden

Vergrößerung innerhalb von jeweils zehn Gesichtsfeldern des fibrösen Bindegewebes (siehe Kapitel 3.5.2). Für die Auswertung der CD3-, CD20-, CD68-, CD163-, CD14-, CD1a- und DCsign-Färbungen wurde die durchschnittliche Anzahl positiv gefärbter Zellen pro Gesichtsfeld in 10 Gesichtsfeldern (400-fache Vergrößerung) des subchondralen Knochenmarkes sowie pro Gesamtfläche der Zellaggregate bestimmt (siehe Kapitel 3.5.1).

Der Nachweis der Marker RUNX2, COL10, MMP13, OC und β-Catenin erfolgte außerdem für die Hinterpfoten aller DTH-A-Mäuse (siehe Kapitel 3.6.4). Diese Färbungen dienten als Grundlage für die anschließende Auswertung der Gewebeproben mittels eines Punktesystems (histologischer Score siehe Kapitel 6).

Enzym-gekoppelte immunhistologische Doppelfärbungen

Bei der Doppelfärbung mit Anti-CD56 als ersten unkonjugierten Primärantikörper für die Darstellung der Osteoblasten und Anti-TRAcP5b als zweiten unkonjugierten Primärantikörper für die Visualisierung der Osteoklasten wurden nur die Osteoklasten über die eben beschriebene AP-LSAB-Methode in rot detektiert. Für den Nachweis der Osteoblasten wurde ein Meerrettichperoxidase-markierter Sekundärantikörper, gerichtet gegen das Immunglobulin (Ig) der Spezies des Primärantikörpers, für 30 Minuten bei RT inkubiert. Durch das anschließende Auftragen von Fluoresceintyramid und Wasserstoffperoxid in Puffer sowie Meerrettichperoxidase-markiertem Anti-Fluorescein-Antikörper in Puffer jeweils für 30 Minuten bei RT erfolgte eine Signalamplifikation aufgrund einer Peroxidase-katalysierten Abscheidung einer fluorescein-markierten Phenolverbindung. Die Färbung wurde mittels 6-minütiger Inkubation einer Diaminobenzidintetrahydrochlorid/Wasserstoffperoxid-Lösung als Chromogen-substrat abgeschlossen, sodass sich die Osteoblasten im Lichtmikroskop braun darstellten.

Die CD56/TRAcP5b-Doppelfärbung wurde für alle Facettengelenke der AS- und OA-Patienten sowie der Kontrollgelenke durchgeführt und anschließend innerhalb des subchondralen Knochenmarkes und des fibrösen Bindegewebes ausgezählt und histomorphometrisch vermessen (siehe Kapitel 3.4.1).

Zur besseren Darstellung der noch ungefärbten Gewebsanteile wurde bei allen enzym-gekoppelten Einzel- und Doppelfärbungen abschließend für 5–10 Sekunden mit Mayer’s Hämalaun gegengefärbt und für 5 Minuten unter fließendem Leitungswasser gebläut, bevor das Gewebe endgültig mit Kaisers Glyceringelatine eingedeckt wurde. Für alle Färbeschritte

2 Material und Methoden

wurden je 200 µl des entsprechenden Reagenz auf jeden Objektträger aufgetragen. Zwischen allen Schritten wurde jeweils dreimal 5 Minuten bei RT mit TBS gewaschen.

Fluorochrom-gekoppelte immunhistologische Färbungen

Doppelfärbungen, die für die Detektion von Zytokinen und den entsprechenden produzierenden Zellen erfolgten, wurden mittels zwei hintereinander geschalteter indirekter Färbemethoden mit je einem Fluorochrom-markierten Sekundärantikörper durchgeführt. Bei dieser doppelten Zwei-Schritt-Methode wurde das Gewebe zuerst mit einem ersten unkonjugierten Primärantikörper bei 4 °C über Nacht und anschließend mit einem ersten Fluorochrom-markierten Sekundärantikörper für 40 Minuten bei RT inkubiert. Danach erfolgte die Detektion des zweiten Antigens durch einen zweiten unkonjugierten Primärantikörper für 1 Stunde bei RT und einem zweiten Fluorochrom-markierten Sekundärantikörper für 40 Minuten und ebenfalls bei RT. Einer der beiden Sekundärantikörper war dabei stets mit Alexa Fluor^® 488 und der jeweils andere mit Alexa Fluor^® 555 markiert (siehe Tab. 2.7) [208]. Als Kerngegenfärbung wurden die Gewebeschnitte mit Phenylindol (DAPI 1:1000, blau) für 5 Minuten inkubiert, abschließend mit Fluoromount G eingedeckt und bei 4 °C im Kühlschrank gelagert. Dieses Eindeckmedium verlangsamte das Verblassen des Fluorochroms, was als Nachteil dieser Färbemethode angesehen wird, da die Färbung dadurch nicht dauerhaft stabil ist.

Die Fluorochrom-gekoppelten Doppelfärbungen IL-23/AA-1, IL-23/CD163 und IL-23/MPO wurden an jeweils 5 repräsentativen Facettengelenken der AS- und OA-Patienten sowie den Kontrollgelenken durchgeführt und innerhalb des subchondralen Knochenmarkes als Anzahl der positiven Zellen pro DAPI⁺ Gesamtzahl pro fünf Gesichtsfeldern in der 400-fachen Vergrößerung ausgezählt (siehe Kapitel 3.5.1).

Hintergrund-Färbungen und entsprechende Blockierung

Um unspezifische Anfärbungen und somit gegebenenfalls falsch-positive Reaktionen zu vermeiden, mussten verschiedene Blockierungsschritte eingebaut werden. So wurde bei allen Gewebeschnitten bereits vor dem Primärantikörper für 10 Minuten ein Protein-Block aufgetragen, um unspezifische Bindungen der Reagenzien an Gewebeproteine zu vermeiden.

Hierbei wurden die elektrostatischen Ladungen der Proteine im Gewebe abgesättigt und

2 Material und Methoden

dadurch potenzielle unspezifische Bindungsstellen für Antikörper unzugänglich gemacht. Bei Gewebeproben der Versuchstiere erfolgte dieser Blockierungsschritt mit Esel-Serum 10%.

Bei der AP-LSAB-Methode musste zusätzlich neben dem endogenen Biotin auch die endogene Phosphataseaktivität geblockt werden. Endogenes Biotin kann mit einer der vier Bindungsstellen des Avidins binden, wodurch AP an den Ort des endogenen Biotins gelangt und dort eine falsch positive Farbreaktion auslöst. Um dem entgegenzuwirken, erfolgte vor dem Auftragen des biotinylierten Sekundärantikörpers eine Biotinblockierung mittels Streptavidin-Biotin-Block für jeweils 15 Minuten bei RT. Hierbei wurde das endogene Biotin zuerst durch das Streptavidin gebunden, dessen übrige freie Bindungsstellen nachfolgend durch das Biotin wieder abgesättigt wurden [209].

Erhöhte endogene Phosphataseaktivität kommt verstärkt in Knochengewebe vor und hätte in den untersuchten knöchernen Gewebeproben ebenfalls unspezifische Hintergrundfärbungen verursachen können [210]. Eine zusätzliche Enzymblockierung war allerdings nicht erforderlich, da erstens die verwendete Substratlösung Levamisol enthielt und zweitens hauptsächlich Hitze-induzierte Antigendesmaskierungen stattfanden [211], wodurch die endogene AP ebenso inaktiviert wurde.

Bei der Verwendung Meerrettichperoxidase-markierter Sekundärantikörper in Kombination mit dem Diaminobenzidintetrahydrochlorid-Chromogen mussten mögliche unspezifische Hintergrundfärbungen durch eine endogene Peroxidaseaktivität bedacht werden. Durch das in den Reagenzien enthaltene Wasserstoffperoxid wurde diese jedoch ausreichend kompetetiv gehemmt [212], sodass eine zusätzliche Enzymblockierung nicht erforderlich war.

Positiv- und Negativkontrollen

Als Positivkontrollen wurden Gewebe eingesetzt, die das gesuchte Antigen nachgewiesenermaßen und somit sicher enthielten. Bezogen aus dem Institut für Pathologie der Charité – Universitätsmedizin Berlin, Campus Benjamin Franklin, wurden diese bei der Etablierung eines neuen Antikörpers stets auf einem zusätzlichen Objektträger mitgeführt.

Negativkontrollen zeigen alle unspezifischen und somit unerwünschten Reaktionen an. Diese wurden jeweils an Positivgewebe und am Probengewebe der Patienten durchgeführt. Drei verschiedene Möglichkeiten der Negativkontrolle standen zur Verfügung. Bei der ersten erfolgte ein Austausch des primären Antikörpers durch einen irrelevanten Antikörper des gleichen Subtyps, wodurch unspezifische Bindungen des primären Antikörpers aufgezeigt

2 Material und Methoden

werden sollten (siehe Tab. 2.6). Bei der zweiten Negativkontrolle wurde ausschließlich mit Antikörperverdünnungspuffer ohne den Primärantikörper inkubiert. Hierbei wären positive Farbreaktionen auf unspezifische Bindungen des Detektionssystems zurückzuführen gewesen.

Als dritte Möglichkeit stand die kompetitive Hemmung zur Verfügung, die jedoch aufgrund der hohen Herstellungskosten nicht durchgeführt wurde.

Positiv- und Negativkontrollen wurden bei jeder Etablierung eines neuen Färbeprotokolls, allerdings nicht für jede Patientenprobe, extra mitgeführt. Grund war eine negative Kosten-Nutzen-Bewertung und insbesondere der enorme Gewebebedarf.