3 Ergebnisse
3.6 Evaluierung von Mausmodellen hinsichtlich der Knochenneubildung
3 Ergebnisse
Das fibröse Pannusgewebe der Facettengelenke von AS- und OA-Patienten war jeweils durch über 88% PGE2+ und EP4+ Zellen gekennzeichnet, sodass zwischen den beiden Patientengruppen keine signifikanten Unterschiede detektiert wurden (PGE2 p = 0,1892; Abb.
3.28A; EP4 p = 0,3650; Abb. 3.28C). Auch das Enzym COX-2 wurde jeweils von gleichvielen Zellen des fibrösen Ersatzgewebes der AS- und OA-Patienten exprimiert (p = 0,5879), wenn auch nur von weniger als 20% der Gesamtzellzahl (Abb. 3.28B).
Signifikant höhere Werte ergab nur die Bestimmung der EP2+ Zellen der Facettengelenke der OA- im Vergleich zu den AS-Patienten (p = 0,0470), wobei (Median ± IQR) 60,21 ± 44,77%
der Zellen bei AS und 82,59 ± 20,13% der Zellen bei OA EP2+ waren (Abb. 3.28D).
3.6 Evaluierung von Mausmodellen hinsichtlich der Knochenneubildung
3 Ergebnisse
repräsentatives Übersichtsbild Kontrollen
BeckenWirbelsäule
SKG PGISp Wirbelsäule
Zoom Pathologie
A
B
A B
A
B
C
D
C
D
E
F
E F
1 1
1
1 2
2 2 2
3 3 3
3 3 3
4 4
4 4
4
5 5
5 5
3 4
4 3
3 3 3
5 5
4 4
unregelmäßige Knorpeloberfläche mit Proteoglykan- und Knorpelverlusten (Abb. 3.29A, Pathologie Becken).
Die Facettengelenke der SKG-Mäuse waren durch eine schwere chronische granulierende Entzündung geprägt, die häufig zu einem vollständigen Abbau des Gelenkknorpels, aber auch der Knochenendplatte führte und somit eine komplette Zerstörung der Gelenkarchitektur bedingte. Die Wirbelkörper und Bandscheiben waren jedoch nicht betroffen und wiesen keine pathologischen Veränderungen auf (Abb. 3.29A, Pathologie Wirbelsäule).
Repräsentative Safranin-O/Echtgrün-gefärbte Übersichtsmosaikbilder gesunder Kontrollmäuse (erste Spalte) und erkrankter Mäuse (Pathologie, zweite Spalte) inklusive Vergrößerungen (Zoom; 200-fach, dritte Spalte) für ein repräsentatives Becken und eine repräsentative Wirbelsäule des SKG-Mausmodells (A) und eine repräsentative Wirbelsäule des PGISp-Modells (B). 1 = SI-Gelenk;
2 = Hüftgelenk; 3 = Wirbelkörper; 4 = Bandscheibe; 5 = Facettengelenk.
Abb. 3.29: Histomorphologie der SKG- und PGISp-Mausmodelle
3 Ergebnisse
PGISp-Modell
Die naiven BALB/c-Kontrollmäuse aus dem Labor von Prof. Dr. Taurog zeigten Zwischenwirbelscheiben (Discus intervertebralis) inklusive Gallertkern (Nucleus pulposus) und Faserring (Anulus fibrosus) sowie hämatopoetisches Zellgut und Teile der autochthonen Rückenmuskulatur (Abb. 3.29B, Kontrollen). Die histomorphologische Begutachtung der chronischen PGISp-Mäuse verdeutlichte eine pathologische Beteiligung der Facettengelenke und der Bandscheiben. Ein Teil der Facettengelenke zeigte dabei neben einer Kapselfibrose hauptsächlich Veränderungen innerhalb des Gelenkknorpels. Dieser wies eine unregelmäßige Gelenkoberfläche sowie ausgedehnte Brutkapselbildung auf. Teilweise konnte sogar eine Synchondrose beider Gelenkflächen beobachtet werden. Die Wirbelsäule war charakterisiert durch chronisch entzündliche Veränderungen der Bänder, die vor allem degenerative Prozesse verursachten. Pannusgewebe zerstörte Teile des Gelenkknorpels, infiltrierte aber auch in Knochen und Muskeln. Im Gegensatz dazu wurden jedoch auch kompensatorische Mechanismen detektiert, wie Knorpelneubildung und die Verdickung der subchondralen Endplatte (Abb. 3.29B, Pathologie).
3.6.3 Evaluierung eines peripheren Arthritis-Modells hinsichtlich Knochenneubildung
DTH-A-Modell
Da die im Kapitel 3.6.2 beschriebenen Mausmodelle keine Knochenneubildung zeigten, wurde zusätzlich ein Arthritis-Modell, das bekannterweise zu Knochenneubildung führt (siehe Kapitel 1.3), genauer untersucht.
Das DTH-A-Modell verursachte ausschließlich lokale Arthritis-Symptome in der rechten Hinterpfote, da nur in deren Fußballen mBSA injiziert wurde. Die jeweils linke Hinterpfote sowie zusätzlich mitgeführte naive Mäuse mit C57BL/6-Hintergrund dienten als Kontrollen mit entsprechend normalem histologischem Befund, das heißt ohne Anzeichen entzündlicher Veränderungen wie Pannusgewebe, Knochenresorption und/oder -neubildung. Die rechten Hinterpfoten der DTH-A-Mäuse zeigten hingegen großflächige pathologische Veränderungen vor allem in und um die Gelenkstrukturen der Mittelfußknochen. Zu sehen waren neben akuten Entzündungen auch bereits chronisch entzündliche Veränderungen, die in Form einer Arthritis und Synovitis auffielen. In Kombination mit ausgedehntem Pannusgewebe wurden die Knorpel- und Knochenstrukturen der Gelenke derart zerstört, dass oft ein totaler Verlust
3 Ergebnisse
A B
A
B
der Gelenkarchitektur resultierte. Eine Besonderheit dieses Mausmodells war die sichtbare Knochenneubildung. Dabei konnten hypertrophe Chondrozyten (Abb. 3.30B), aber auch neugebildeter Geflechtknochen mit Osteoblasten und mesenchymalen Zellen detektiert werden (Abb. 3.30A).
Repräsentatives Safranin-O/Echtgrün-gefärbtes Übersichtsmosaikbild der rechten Hinterpfote einer DTH-A-Maus sowie die 200-fache Vergrößerung eines Areals mit Knochenneubildung (A) und eines Areals mit Knorpelneubildung (B).
3.6.4 Charakterisierung der DTH-A Mäuse
Zur besseren Darstellung der beobachteten pathologischen Veränderungen innerhalb der rechten Pfoten der DTH-A-Mäuse im Vergleich zu den beiden Kontrollgruppen, linke Pfoten der DTH-A-Mäuse und Pfoten naiver Mäuse, wurde ein neu entwickeltes Punktesystem (Score) angewendet (siehe Kapitel 6). Dieser definierte neben dem Ausmaß von Entzündung, Pannus, Knorpelzerstörung und Knochenresorption, auch das der Knochenneubildung. Die beiden Kontrollgruppen zeigten im Vergleich untereinander für alle fünf Scoringparameter keine signifikanten Unterschiede und waren somit definiert durch das Fehlen eines Pannusgewebes sowie ohne ersichtlichen Knochenabbau oder –aufbau (alle p>0,9999).
Ebenfalls innerhalb beider Kontrollgruppen wurde eine minimale Veränderung des Gelenkknorpels nachgewiesen. Dieser bestand im geringen Verlust an Proteoglykan, detektiert durch eine minimale und oberflächliche Entfärbung des Safranin-O-roten Gelenkknorpels. In drei der zehn untersuchten linken Hinterpfoten der DTH-A-Mäuse wurde außerdem eine geringe Infiltration entzündlicher Zellen innerhalb des periartikulären Gewebes beobachtet. Ein komplett anderes morphologisches Bild ließen die rechten Hinterpfoten der DTH-A-Mäuse erkennen. Diese waren gekennzeichnet durch mäßige bis zumeist schwere Veränderungen bezüglich Entzündung, Pannusgewebe, Knochen- und
Abb. 3.30: Histomorphologie des DTH-A-Mausmodells
3 Ergebnisse
Ent-zündung
Pannus-gewebe
Knorpel-zerstörung
Knochen-resorption Knochen-neubildung
Naiv DTH-A links DTH-A rechts
***
***
****
***
***
**
****
***
****
***
DTH-A rechte Hinterpfote schwer
mäßig minimal keine Symptome
!!
!!
"!
"!
"!
#!
#!
#! #!
$!
$! $!
%!
%!
%!
Knorpelabbau, aber auch Knochenneubildung. Im Detail zeigte die Hälfte dieser Mäuse eine schwere diffuse entzündliche Infiltration mit ausgeprägter Ödembildung, die jeweils die meisten Gelenke sowie periartikuläres Gewebe betrafen. Bei 5/10 zeigte sich zumindest eine mäßige Infiltration entzündlicher Zellen. Zusätzlich wanderte Pannusgewebe in mäßigem (4/10) bis schwerem (6/10) Ausmaß ein. Dieses Entzündungs- und Pannusgewebe verursachte wiederum großflächige Knorpel- und Knochendestruktionen, sodass zumeist (6/10) mäßige Knorpelzerstörungen und (9/10) schwere Knochenresorptionen folgten. Erstaunlich war das Ausmaß an reparativen Vorgängen. So wurden Regionen mit Knorpelhypertrophie mit charakteristischer Darstellung großer zytoplasmatischer Chondrozyten beobachtet sowie auch Regionen von Knochenneubildung in Form unregelmäßigen Geflechtknochens. Vier der zehn untersuchten rechten Hinterpfoten zeigten eine offensichtliche Knochenneubildung in mehreren Gelenken und/oder periartikulären Gewebearealen, während die Mehrheit (6/10) sogar auf einer Seite aller Gelenke oder an beiden Seiten der meisten Gelenke eine sekundäre Knochenneubildung besaß. Dementsprechend waren die detektierten Unterschiede zwischen den erkrankten DTH-A-Pfoten und den beiden Kontrollgruppen stets signifikant (je p < 0,004;
Abb. 3.31).
Punktesystem für das Ausmaß (keine, minimal, mäßig, schwer) an Entzündung, Pannusgewebe, Knorpelzerstörung, Knochenresorption und Knochenneubildung für die Hinterpfoten von drei naiven C57BL/6 Mäusen sowie die linken mit PBS behandelten und die rechten mit mBSA behandelten Hinterpfoten von 10 DTH-A-Mäusen. Daneben dargestellt ist eine repräsentative Safranin-O/Echtgrün-Färbung eines Teils einer rechten Hinterpfote einer DTH-A-Maus in der 50-fachen Vergrößerung, die alle pathologischen Merkmale ( Entzündung, Pannusgewebe, Knorpelzerstörung,
Knochenresorption, Knochenneubildung) aufweist.
Zur weiteren mechanistischen Einordnung der Knorpel- und Knochenneubildung wurden zusätzlich immunhistologische Untersuchungen zur Expression verschiedener Knochen- und Knorpelmarker durchgeführt. In Arealen mit histologischem Nachweis der
Abb. 3.31: Charakterisierung der DTH-A-Mäuse entsprechend Entzündung, Pannusgewebe, Knorpelzerstörung, Knochenresorption und -neubildung
3 Ergebnisse
Knorpel- neubildung Knochen- neubildung
A
B
RUNX2 COL10 MMP13 Osteocalcin β-Catenin
Knorpelneubildung wurde eine erhöhte Expression der Hypertrophiemarker RUNX2, COL10 und MMP13, aber auch des WNT-Zentralmoleküls β-Catenin und in 6 von 10 Gelenken des Mineralisierungsmarkers OC detektiert (Abb. 3.32A). In Regionen mit Knochenneubildung in Form neugebildeten Geflechtknochens fanden sich ebenfalls β-Catenin+, RUNX2+ und OC+ Zellen, aber keine Expressionen von COL10 und MMP13 (Abb. 3.32B).
Repräsentative immunhistologische Färbungen für RUNX2, COL10, MMP13, Osteocalcin und β-Catenin innerhalb von Arealen der Knorpel- (A) und Knochenneubildung (B) der rechten Hinterpfote einer DTH-A Maus; Originalvergrößerung 400-fach.
3.6.5 Variabilitäten der Untersuchungsmethoden
Die Analyse der Variabilitäten innerhalb der Untersuchungsmethoden ergab für die Intraobserver-Variabilität, das heißt die unterschiedlichen Ergebnisse des gleichen Untersuchers zu zwei unterschiedlichen Zeitpunkten und für die Interobserver-Variabilität, das heißt die unterschiedlichen Ergebnisse zweier Untersucher eine durchschnittliche Abweichung in Höhe von 9,617% und 23,453% für die Knorpeldicke (Abb. 3.33A), 7,769%
und 19,177% für die Endplattendicke, 18,735% und 6,431% für die Trabekelfläche, 1,485%
und 20,259% für den Proteoglykangehalt (Daten nicht gezeigt), 5,497% und 17,295% für den Ersatz des subchondralen Knochenmarkes und 9.879% und 11,693% für den Ersatz der Endplatte durch fibröses Pannusgewebe (Daten nicht gezeigt). Die durchschnittliche Abweichung innerhalb von 3 konsekutiven Schnitten innerhalb der Facettengelenke von KO-, AS- und OA-Patienten lag für die Knorpeldicke bei 1,573% (Abb. 3.33B), für die Endplattendicke bei 9,064%, für die Trabekelfläche bei 11,937%, für den Proteoglykangehalt bei 8,905%, für den Knochenmarkersatz durch fibröses Pannusgewebe bei 0,172% und für den Ersatz der subchondralen Endplatte durch fibröses Pannusgewebe bei 8,109%. Die
Abb. 3.32: Charakterisierung der Knochenneubildung in DTH-A Mäusen
3 Ergebnisse
Beobachter 1 erste Messung
Beobachter 1 zweite Messung
= Intra-Observer
Beobachter 2 erste Messung
= Inter-Observer Knorpeldicke [µm]
A
Knorpeldicke [µm] Knorpeldicke [µm]
B C
KO1 KO2 KO3 AS1 AS2 AS3
K O A S O A K O A S O A K O A S O A
0 5 0 0 1 0 0 0 1 5 0 0
2 0 0 0 * n s
n s
n s n s
n s n s
n s n s
K O A S O A
0 2 0 0 4 0 0 6 0 0 8 0 0 1 0 0 0
0 1 0 0 0 2 0 0 0 3 0 0 0
Abweichung bei der Vermessung von 3 Gewebeschnitten aus 3 unterschiedlichen Schnittebenen wurde exemplarisch für die Dicke des hyalinen Gelenkknorpels und der subchondralen Entplatte bestimmt. Die maximaler Abweichung zwischen den 3 Schnittebenen in Kontrollgelenken und Facettengelenken von AS-Patienten betrug für die Knorpeldicke 13,897% (Abb. 3.33C) und für die Endplattendicke 16,381% (Daten nicht gezeigt).
(A) Intra- und Inter-Observer-Variabilitäten für die Vermessung der Knorpeldicke in µm für jeweils 5 Facettengelenke der 3 Untersuchungsgruppen, KO, AS und OA. (B) Vermessung der Knorpeldicke in µm in jeweils 3 konsekutiven Gewebeschnitten in je einem Facettengelenk von Kontrollen (KO), Patienten mit Ankylosierender Spondylitis (AS) und Osteoarthrose (OA). (C) Vermessung der Knorpeldicke in µm in jeweils 3 Facettengelenken von Kontrollen (KO) und Patienten mit AS in jeweils 3 verschiedenen Schnittebenen. AS1 = AS Gelenk mit offenem Gelenkspalt, AS2 = AS-Gelenk mit Knorpelfusion, AS3 = AS-Gelenk mit Knochenfusion. KO1–KO3 bezeichnet 3 Kontrollgelenke von 3 unterschiedlichen Kontrollpatienten. Dargestellt sind die einzelnen Datenpunkte sowie der jeweilige Median-Wert und der Interquartilabstand. Die statistische Auswertung erfolgte mittels Kruskal-Wallis und Dunn’s Post-hoc Test. * p-Wert < 0,05; ohne Balken und Bezeichnung = nicht signifikant p-Wert
> 0,05.
Abb. 3.33: Variabilitäten der Untersuchungsmethoden