Analyse von Entzündungszellen und –mediatoren im subchondralen

3 Ergebnisse

Innerhalb der subchondralen Endplatte war die Anzahl PGE2+ Osteozyten in Facettengelenken von AS- (p = 0,0074) und OA-Patienten (p = 0,0023) gegenüber Kontrollgelenken signifikant erhöht (Abb. 3.16E). Das Enzym COX-2 wurde in keiner der untersuchten subchondralen Endplatten nachgewiesen (Abb. 3.16F). Für die Rezeptoren EP4 und EP2 wurden erhöhte Zahlen positiver Osteozyten in den Facettengelenken von AS- (p = 0,0035; p = 0,1849) und OA-Patienten (p < 0,0001; p < 0,0001) gegenüber Kontrollgelenken beobachtet (Abb. 3.16G und H).

3 Ergebnisse

Monozyten/Makrophagen anhand von CD163, CD68 und CD14, Dendritische Zellen mittels CD1a und DCsign identifiziert.

Um quantitative Unterschiede in der Anwesenheit von Immunzellen im subchondralen Knochenmark zwischen Facettengelenken der AS-Patienten und Kontrollgelenken zu erfassen, erfolgte eine Übersichtsanalyse des Knochenmarkes in Form einer Quantifizierung von T-Zellen, B-Zellen, Monozyten/Makrophagen und Dendritischen Zellen in jeweils zehn Gesichtsfeldern (ohne Lymphozytenaggregate) bei 400-facher Vergrößerung.

Sowohl in Kontrollgelenken als auch in Facettengelenken von AS-Patienten fielen Zellaggregate auf, die durch das Fehlen von Fettvakuolen gekennzeichnet waren. Es wurde separat die Anzahl, Größe und zelluläre Komposition dieser Zellaggregate über den Nachweis von T-Zellen, B-Zellen, Monozyten/Makrophagen und Dendritische Zellen pro Fläche des jeweiligen Zellaggregats quantifiziert.

Analyse der Anzahl und Größe der Zellaggregate sowie deren Charakterisierung im subchondralen Knochenmark von AS-Patienten im Vergleich zu Kontrollgelenken Wie bereits 2006 von Appel et al. beschrieben, befinden sich innerhalb des subchondralen Knochenmarkes der Patienten mit AS und den Kontrollgelenken vereinzelte Zellaggregate [100]. Die Autoren definieren diese anhand der Anzahl CD3⁺ T-Zellen pro Aggregat in Höhe von ≥ 50 und bezeichneten sie als intertrabekuläre CD3⁺ Lymphozytenaggregate [100].

Innerhalb der im Rahmen dieser Arbeit dargestellten Analyse des Knochenmarkes wurden die detektierten Zellaggregate primär über ihre charakteristische Morphologie definiert und weiter untersucht. Wie in Abbildung 3.17A dargestellt, handelte es sich um eine Ansammlung verschiedenster immunologischer Zellen mit einer Fläche von (Median ± IQR) 85.424 ± 113.994 µm² (KO) beziehungsweise 60.048 ± 39.664 µm² (AS). Klar abgrenzbar sind diese Konglomerate gegenüber dem normalen Knochenmark durch das Fehlen der Fettvakuolen zwischen den vor allem mononukleären Immunzellen (Abb. 3.17D). In den Facettengelenken der AS-Patienten traten tendenziell häufiger derartige Zellansammlungen auf (p = 0,3417; Abb. 3.17B), allerdings waren diese, wie bereits dargestellt, dann auch bedeutend kleiner als in den Kontrollgelenken (p < 0,0001; Abb. 3.17A). Die Zellaggregate beider Untersuchungsgruppen, AS und KO, waren durch das reichhaltige Vorkommen an CD3⁺ T-Zellen (AS 50,12 ± 15,79; KO 47,25 ± 10,11 Zellen pro Zellaggregatfläche) und im geringeren Maße an CD20⁺ B-Zellen (AS 18,73 ± 21,89; KO 22,96 ± 26,02 Zellen pro

3 Ergebnisse

Zellaggregate [Anzahl positiv gefärbter Zellen pro Fläche]

Zellaggregatfläche [µm2]Zellaggregatanzahl [totale Anzahl pro Probe]KO AS

CD1a

CD3 CD20 CD68 CD163 CD14 DCsign

A C

B

D

K O A S K O A S K O A S K O A S K O A S K O A S K O A S 0

2 5 5 0 7 5 1 0 0 2 0 0

2 5 0 C D 3 C D 2 0 C D 6 8 C D 1 6 3 C D 1 4 C D 1 a D C s ig n

K O A S 0 5 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 5 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 2 5 0 0 0 0

3 0 0 0 0 0 ****

K O A S 0 1 2 3 4 5

Zellaggregatfläche) geprägt, während Monozyten/Makrophagen (CD68⁺: AS 5,613 ± 3,875;

KO 4,730 ± 3,435 Zellen pro Zellaggregatfläche) und Dendritische Zellen (CD1a⁺: AS 0,1240 ± 0,9353; KO 0,4728 ± 0,2952 Zellen pro Zellaggregatfläche) in Facettengelenken der AS- und KO-Patienten bedeutend seltener vorkamen. Es bestanden keine signifikanten Unterschiede in der Häufigkeit der Immunzellen innerhalb der analysierten Zellaggregate zwischen Facettengelenken der AS-Patienten und Kontrollgelenken (Abb. 3.17C).

Fläche der Zellaggregate in µm² (A), totale Anzahl der Zellaggregate pro Gewebsprobe (B) und Anzahl der positiven Zellen pro Fläche des Zellaggregats (C) sowie repräsentative immunhistologische Färbungen (D) CD3⁺ T-Zellen, CD20⁺ B-Zellen, CD68⁺, CD163⁺ und CD14⁺ Gewebsmakrophagen/Monozyten sowie CD1a⁺ und DCsign⁺ Dendritischer Zellen innerhalb des subchondralen Knochenmarkes der Facettengelenke von Kontrollen (KO) und Patienten mit Ankylosierender Spondylitis (AS). Originalvergrößerung 100-fach. Dargestellt sind die einzelnen Datenpunkte sowie der jeweilige Median-Wert und der Interquartilabstand. Die statistische Auswertung erfolgte mittels Mann-Whitney-U beziehungsweise ungepaartem t-Test. Der Vergleich zwischen KO und AS war für alle Zellarten nicht signifikant, das heißt p-Wert > 0,05. **** p-Wert < 0,0001.

Abb. 3.17: Größe, Anzahl und zelluläre Komposition der Zellaggregate innerhalb des subchondralen Knochenmarkes der Facettengelenke von Kontrollen und AS-Patienten

3 Ergebnisse

K O A S K O A S K O A S K O A S K O A S K O A S K O A S 0

2 5 5 0 7 5 1 0 0 1 2 5 1 5 0 1 7 5 2 0 0 2 2 5

2 5 0 C D 3 C D 2 0 C D 6 8 C D 1 6 3 C D 1 4 C D 1 a D C s ig n

KO AS

CD1a

CD3 CD20 CD68 CD163 CD14 DCsign

C

Knochenmark [Anzahl positiver Zellen pro Gesichtsfeld]

A

AS-I AS-II AS-IIIAS-IIII 0

50 100 150 200 250

B

[+Zellen pro Gesichtsfeld]

CD3

Quantifizierung spezifischer Populationen von Immunzellen im subchondralen Knochenmark der AS-Patienten im Vergleich zu Kontrollgelenken

Anzahl positiv gefärbter Zellen pro Gesichtsfeld in der 400-fachen Vergrößerung (A) und repräsentative immunhistologische Färbungen CD3⁺ T-Zellen, CD20⁺ B-Zellen, CD68⁺, CD163⁺ und CD14⁺ Gewebsmakrophagen/Monozyten sowie CD1a⁺ und DCsign⁺ Dendritischer Zellen (C) innerhalb des subchondralen Knochenmarkes der Facettengelenke von Kontrollen (KO) und Patienten mit Ankylosierender Spondylitis (AS). Originalvergrößerung 400-fach. Anzahl CD3⁺ Zellen pro Gesichtsfeld in der 400-fachen Vergrößerung pro AS-Gruppe 1–4 (B). Dargestellt sind die einzelnen Datenpunkte sowie der jeweilige Median-Wert und der Interquartilabstand. Die statistische Auswertung erfolgte mittels Mann-Whitney-U beziehungsweise ungepaartem t-Test. Der Vergleich zwischen KO und AS war für alle Zellpopulationen nicht signifikant, das heißt p-Wert > 0,05. Die gestrichelte horizontale Linie in B zeigt den Medianwert der Kontrollgelenke an.

In beiden Untersuchungsgruppen, AS und KO, waren neben den CD68⁺ und CD163⁺ Makrophagen/Monozyten die CD3⁺ T-Zellen die am häufigsten vorkommenden Zellpopulationen. In den Facettengelenken der AS-Patienten war die Zahl an CD3⁺ Zellen mit (Median ± IQR) 79,00 ± 65,15 Zellen pro Gesichtsfeld gegenüber den Kontrollgelenken mit 68,40 ± 62,10 Zellen pro Gesichtsfeld tendenziell erhöht und somit auch größer als die Zahl der CD68⁺ (77,90 ± 17,80 Zellen pro Gesichtsfeld) und CD163⁺ (72,10 ± 35,40 Zellen pro

Abb. 3.18: Quantifizierung spezifischer Populationen von Immunzellen im subchondralen Knochenmark der Facettengelenke von Kontrollen und AS-Patienten

3 Ergebnisse

Gesichtsfeld) Monozyten/Makrophagen innerhalb des subchondralen Knochenmarkes bei AS.

Neben den CD20⁺ B-Zellen (AS 3,500 ± 7,00 Zellen pro Gesichtsfeld) waren vor allem die CD1a⁺ (AS 1,415 ± 2,775 Zellen pro Gesichtsfeld) und DCsign⁺ Dendritischen Zellen (AS 0,000 ± 0,600 Zellen pro Gesichtsfeld) innerhalb des subchondralen Knochenmarkes beider Untersuchungsgruppen nur sehr vereinzelt vertreten. Es bestanden keine signifikanten Unterschiede in der Häufigkeit der analysierten Zellpopulationen zwischen Kontrollgelenken und AS-Patienten (CD20 p = 0,6978; CD1a p = 0,1355; DCsign p = 0,0886; Abb. 3.18A). Die Subanalyse der Facettengelenke von AS-Patienten entsprechend der AS-Gruppen 1–4 ergab ausschließlich für CD3⁺ T-Zellen eine AS-Gruppen-abhängige Expression, da deren Anzahl in Facettengelenken der AS-Gruppe 2 (85,95 ± 59,95 Zellen pro Gesichtsfeld), aber vor allem der AS-Gruppe 1 (219,5 ± 0,000 Zellen pro Gesichtsfeld) gegenüber den Kontrollgelenken (68,40 ± 62,10 Zellen pro Gesichtsfeld) auffällig erhöht war (Abb. 3.18B). Eine statistische Auswertung war aufgrund der zu geringen Fallzahlen der AS-Gruppe 1 nicht möglich.

Auffällig waren die unterschiedlichen Häufigkeiten der verschiedenen Zellpopulationen im subchondralen Knochenmark im Vergleich zu den Zellaggregaten. Während das subchondrale Knochenmark hauptsächlich CD3⁺ T-Zellen und Monoztyen/Makrophagen beherbergte, waren die Zellaggregate beider Untersuchungsgruppen vor allem durch das reichhaltige Vorkommen an CD3⁺ T-Zellen und im geringeren Maße an CD20⁺ B-Zellen geprägt.

Analyse der Expression der pro-inflammatorischen Zytokine IL-6, IL-12, Il-17, IL-22 und IL-23 im subchondralen Knochenmark bei AS

Die Untersuchung des subchondralen Knochenmarkes der Facettengelenke von AS-Patienten im Vergleich zu Kontrollgelenken erbrachte keine signifikanten Differenzen bezüglich der Expression von IL-12 (p = 0,9518), IL-17 (p = 0,2302) und IL-23 (p = 0,2990; Abb. 3.19B, C und E). Erwähnenswert ist, dass für IL-23 eine Tendenz der Hochregulation detektiert wurde (Abb. 3.19E). Signifikant verminderte Zahlen positiver Zellen pro Gesichtsfeld innerhalb des subchondralen Knochenmarkes wurden für die Zytokine IL-6 (p = 0,0045; Abb. 3.19A) und IL-22 (p = 0,0342; Abb. 3.19D) in AS-Patienten verglichen zu Kontrollgelenken nachgewiesen. Im Vergleich der IL untereinander fiel auf, dass jeweils weniger als 50 Zellen pro Gesichtsfeld des subchondralen Knochenmarkes der beiden Untersuchungsgruppen, AS und KO, die Zytokine IL-6, IL-12, IL-22 und IL-23 exprimierten (Abb. 3.19A, B, D, E), während (Median ± IQR) 278,8 ± 247,5 (AS) beziehungsweise 365,3 ± 351,7 (KO) Zellen pro Gesichtsfeld IL-17 exprimierten (Abb. 3.19C).

3 Ergebnisse

A

^IL-6

B

^IL-12

C

^IL-17

D

^IL-22

E

IL-23

subchondrales Knochenmark ![Zellen pro Gesichtsfeld] KO AS

KO AS

0 5 10 15 190020

2000 **

KO AS

0 30 60 90 120 150 1900

2000 n.s.

KO AS

0 200 400 600 800 10001900

2000 n.s.

KO AS

0 20 40 60 80 1900100

2000 *

KO AS

0 50 100 150 200 1900

2000 n.s.

Anzahl positiver Zellen pro Gesichtsfeld in der 400-fachen Vergrößerung sowie repräsentative immunhistologische Färbungen der Interleukine (IL) 6 (A), 12 (B), 17 (C), 22 (D) und IL-23 (E) im subchondralen Knochenmark der Facettengelenke von Kontrollen (KO) und Patienten mit Ankylosierender Spondylitis (AS). Originalvergrößerung der Abbildungen 400-fach. Dargestellt sind die einzelnen Datenpunkte sowie der jeweilige Median-Wert und der Interquartilabstand. Die statistische Auswertung erfolgte mittels Mann-Whitney-U beziehungsweise ungepaartem t-Test. ** p-Wert < 0,01; * p-p-Wert < 0,05; n.s. = nicht signifikant p-p-Wert > 0,05.

Um zu evaluieren, welche Zellen des subchondralen Knochenmarkes die Hauptproduzenten von IL-23 sind, wurden Doppelfärbungen mit Hilfe fluoreszenzmarkierter Antikörper durchgeführt. Antikörper gegen Mastzelltryptase (AA-1), Myeloidperoxidase (MPO) und den Fängerrezeptor CD163 dienten dem Nachweis von Mastzellen (AA-1), neutrophilen Granulozyten (MPO) und Gewebsmakrophagen/Monoztyen (CD163).

Innerhalb des Knochenmarkes der AS-Patienten waren (Median ± IQR) 0,0 ± 0,6750% der DAPI-positiven Gesamtzellzahl doppelt positiv für IL-23 und AA-1 sowie 0,0 ± 0,3500%

IL23⁺/CD163⁺ (Abb. 3.20A). Signifikant höhere Anzahlen ergab die Auszählung IL-23-produzierender MPO⁺ Zellen (8,940 ± 5,185%; Abb. 3.20A). Ein ähnliches, wenn auch extremeres Ergebnis ergab die fluoreszenzmikroskopische Auswertung des Gewebes der Kontrollgelenke, in deren subchondralen Knochenmark weder AA-1⁺, noch CD163⁺ Zellen IL-23 exprimierten, wohingegen 4,920 ± 10,97% der MPO⁺ Zellen auch IL-23⁺ waren (Abb.

3.20B).

Abb. 3.19: Expression der pro-inflammatorischen Zytokine IL-6, IL-12, IL-17, IL-22 und IL-23 im subchondralen Knochenmark der Facettengelenke von Kontrollen und AS-Patienten

3 Ergebnisse

IL-23p19 (rot)

IL-23p19 Doppelfärbung (gelb)

AA-1⁺ Mastzellen

(grün)

CD163⁺ Makrophagen

(grün)

MPO⁺ Granulozyten

(grün)

AA-1⁺ Mastzellen

(grün)

CD163⁺ Makrophagen

(grün)

MPO⁺ Granulozyten

(grün)

Positive Zellen pro DAPI+ Gesamtzellzahl Positive Zellen pro DAPI+ Gesamtzellzahl

Ankylosierende Spondylitis Knochenmark

Autopsiekontrollen Knochenmark A

IL-23p19 (rot)

IL-23p19 Doppelfärbung (gelb)

B

IL23+ A A -1 IL23+

A A -1+

IL23+ C D 163+ IL23+

C D 163+

IL23+ M P O + IL23+

M P O + 0

1 0 2 0 3 0 4 0 9 0

1 0 0 *

*

IL23+ A A -1 IL23+

A A -1+

IL23+ C D 163+ IL23+

C D 163+

IL23+ M P O + IL23+

M P O + 0

5 1 0 1 5 2 0 2 5 9 0

1 0 0 **

**

Repräsentative Doppel-Immunfluoreszenzfärbungen für IL-23p19-positive Mastzellen (AA-1), Monozyten/Makrophagen (CD163) und neutrophile Granulozyten (MPO) im subchondralen Knochenmark der Facettengelenke von Patienten mit Ankylosierender Spondylitis (A) und Kontrollen (B). Gegenfärbung der Zellkerne mittels DAPI in blau. Originalvergrößerung 400-fach. Darunter dargestellt ist jeweils die Anzahl an positiven Zellen pro DAPI⁺ Gesamtzellzahl gezählt in je 5 Gesichtsfeldern in der 400-fachen Vergrößerung. Dargestellt sind die Messbalken mit Median-Wert und dem Interquartilabstand. Die statistische Auswertung erfolgte mittels Kruskal-Wallis und Dunn’s Post-hoc Test. ** Wert < 0,01; * Wert < 0,05. Ohne Balken und Zeichen = n.s. = nicht signifikant p-Wert > 0,05.

Analyse der Expression der pro-inflammatorischen Zytokine TNFα und IFNγ im subchondralen Knochenmark bei AS

Die Anzahl TNFα⁺ mRNA war signifikant größer im subchondralen Knochenmark der AS-und OA-Patienten als in Kontrollgelenken (p = 0,0403, p = 0,0003; Abb. 3.21A). Dabei zeigte der Nachweis IFNγ⁺ mRNA innerhalb des subchondralen Knochenmarkes keine signifikanten Unterschiede zwischen den Untersuchungsgruppen AS und KO (p > 0,9999) sowie OA und

Abb. 3.20: Doppelfärbungen für IL-23/AA-1, IL-23/CD163 und IL-23/MPO im subchondralen Knochenmark von Facettengelenken der Kontrollen und AS-Patienten

3 Ergebnisse

KO AS OA

0 50 100 150 200 250 1900300

2000 * *** n.s.

KO AS OA

0 50 100 150 1900200

2000 n.s. n.s.

*

A ^TNFα B ^IFNγ

TNFα+ mRNA/Gesichtsfeld IFNγ+ mRNA/Gesichtsfeld

A ^TGF-beta B ^IL-10

KO AS

0 50 100 150 1900200

2000 n.s.

KO AS

0 50 100 150 200 1900

2000 **

KO AS KO AS

subchondrales Knochenmark ![Zellen pro Gesichtsfeld] subchondrales Knochenmark ![Zellen pro Gesichtsfeld]

KO (p = 0,0532; Abb. 3.21B). Die Anzahl an TNFα⁺ (Median ± IQR: 23,50 ± 34,50) und IFNγ⁺ (14,50 ± 33,50) mRNA-Kopien pro Gesichtsfeld waren innerhalb des Knochenmarkes von AS-Patienten vergleichbar (Abb. 3.21A und B).

Durchschnittliche Kopienanzahl TNFα⁺ (A) und IFNγ⁺ (B) mRNA pro 10 ausgezählten Gesichtsfeldern bei 1000-facher Vergrößerung im subchondralen Knochenmark der Facettengelenke von Kontrollen (KO), Patienten mit Ankylosierender Spondylitis (AS) und Osteoarthrose (OA). Dargestellt sind die einzelnen Datenpunkte sowie der jeweilige Median-Wert und der Interquartilabstand. Die statistische Auswertung erfolgte mittels Kruskal-Wallis und Dunn’s Post-hoc Test. *** Wert < 0,001; * p-Wert < 0,05; n.s. = nicht signifikant p-p-Wert > 0,05.

Analyse der Expression der anti-inflammatorischen Zytokine TGF-beta und IL-10 im subchondralen Knochenmark bei AS

Anzahl positiver Zellen pro Gesichtsfeld in der 400-fachen Vergrößerung sowie repräsentative immunhistologische Färbungen von TGFβ (A) und Interleukin(IL)-10 (B) im subchondralen Knochenmark der Facettengelenke von Kontrollen (KO) und Patienten mit Ankylosierender Spondylitis (AS). Originalvergrößerung 400-fach. Dargestellt sind die einzelnen Datenpunkte sowie der jeweilige Median-Wert und der Interquartilabstand. Die statistische Auswertung erfolgte mittels Mann-Whitney-U beziehungsweise ungepaartem t-Test. ** p-Wert < 0,01; n.s. = nicht signifikant p-Wert > 0,05.

Abb. 3.21: Expression der pro-inflammatorischen Zytokine TNFα und IFNγ im subchondralen Knochenmark der Facettengelenke von Kontrollen, AS- und OA-Patienten

Abb. 3.22: Expression der anti-inflammatorischen Zytokine TGF-beta und IL-10 im subchondralen Knochenmark der Facettengelenke von Kontrollen und AS-Patienten

3 Ergebnisse

subchondrales Knochenmark [Zellen pro Gescihtsfeld]

KO AS

0 500 1000 1500

2000 *

KO AS

0 200 400 600 800

1000 **

KO AS

0 500 1000 1500

2000 n.s.

KO AS

0 200 400 600 800 1000

1200 *

PGE2 COX-2 EP4 EP2

A B C D

KOAS

Bei der Auswertung des subchondralen Knochenmarkes der Patienten mit AS wurden signifikant weniger IL-10⁺ Zellen gezählt als in den Kontrollgelenken (p = 0,0034, Abb.

3.22B), während keine Unterschiede für die Anzahl an TGF-beta⁺ Zellen ermittelt wurden (p = 0,3964, Abb. 3.22A). Die Anzahl TGF-beta⁺ Zellen pro Gesichtsfeld (Median ± IQR;

KO 71,40 ± 40,98; AS 73,70 ± 99,75) war dabei in beiden Untersuchungsgruppen größer als die des Zytokins IL-10 (KO 57,70 ± 25,93; AS 30,30 ± 35,20; Abb. 3.22A und B).

Analyse der Expression von PGE2, COX-2 und den PGE2-Rezeptoren EP2 und EP4 im subchondralen Knochenmark bei AS

Anzahl positiver Zellen pro Gesichtsfeld in der 400-fachen Vergrößerung sowie repräsentative immunhistologische Färbungen im subchondralen Knochenmark für Prostaglandin (PG) E₂ (A), Cyclooxygenase (COX)-2 (B) sowie die Prostaglandinrezeptoren EP4 (C) und EP2 (D) der Facettengelenke von Kontrollen (KO) und Patienten mit Ankylosierender Spondylitis (AS).

Originalvergrößerung der Abbildungen 400-fach. Dargestellt sind die einzelnen Datenpunkte sowie der jeweilige Median-Wert und der Interquartilabstand. Die statistische Auswertung erfolgte mittels Mann-Whitney-U beziehungsweise ungepaartem t-Test. ** p-Wert < 0,01; * p-Wert < 0,05; n.s. = nicht signifikant p-Wert > 0,05.

Nicht nur im hyalinen Gelenkknorpel und der subchondralen Endplatte (siehe Abb. 3.16), sondern auch im subchondralen Knochenmark der Facettengelenke von AS-Patienten wurden große Mengen (Median ± IQR) an PGE2+ (805,1 ± 522,9), COX-2⁺ (407,1 ± 260,8), EP2⁺ (733,2 ± 275,3) und vor allem EP4⁺ (1060 ± 254,8) Zellen pro Gesichtsfeld nachgewiesen (Abb. 3.23A–D). Während sich diese hohen Zellzahlen bei AS-Patienten in Bezug auf EP4

Abb. 3.23: Expression von PGE2, COX-2, EP4 und EP2 im subchondralen Knochenmark der Facettengelenke von Kontrollen und AS-Patienten

3 Ergebnisse

fib röses P an n u sgew eb e

[Anzahl positiver Zellen pro Gesamtzellzahl]

O A A S O A A S O A A S O A A S O A A S O A A S O A A S 0

3 6 9 1 2 1 5 2 0 0 2 2 5 2 5 0

*** ** ***

C D 3 C D 2 0 C D 6 8 C D 1 6 3 C D 1 4 C D 1 a D C s ig n

nicht signifikant von denen der Kontrollgelenke unterschieden (p = 0,0763; Abb. 3.23C), resultierte daraus eine signifikante Hochregulierung bei AS für PGE2 (p = 0,0320; Abb.

3.23A), COX-2 (p = 0,0078; Abb. 3.23B) und EP2 (p = 0,0308; Abb. 3.23D) gegenüber Kontrollgelenken.

3.5.2 Analyse von Entzündungszellen und –mediatoren im fibrösen Pannusgewebe

Quantifizierung spezifischer Populationen von Immunzellen im fibrösen Pannusgewebe der AS-Patienten im Vergleich zu Kontrollgelenken

Anzahl CD3⁺ T-Zellen, CD20⁺ B-Zellen, CD68⁺, CD163⁺ und CD14⁺ Gewebsmakrophagen/

Monozyten sowie CD1a⁺ und DCsign⁺ Dendritischer Zellen pro Gesamtzellzahl gezählt in 10 Gesichtsfeldern in der 400-fachen Vergrößerung [%] innerhalb des fibrösen Pannusgewebes der Facettengelenke von Patienten mit Osteoarthrose (OA) und Ankylosierender Spondylitis (AS).

Dargestellt sind die einzelnen Datenpunkte sowie der jeweilige Median-Wert und der Interquartilabstand. Die statistische Auswertung erfolgte mittels Mann-Whitney-U beziehungsweise ungepaartem t-Test. *** p-Wert < 0,001; ** p-Wert < 0,01; ohne Balken und Zeichen = n.s. = nicht signifikant p-Wert > 0,05.

Abb. 3.24: Quantifizierung spezifischer Populationen von Immunzellen im fibrösen Pannusgewebe der Facettengelenke von OA- und AS-Patienten

3 Ergebnisse

A B C

D E F

IL-6 IL-12 IL-17

IL-22 IL-23 IL-33

fibröses Pannusgewebe ![%]

AS OA

0 25 50 7590

100 *

AS OA

0 2 4 6 8 1090

100 n.s.

AS OA

0 1 2 3 904

100 *

AS OA

0 20 40 60 80

100 **

AS OA

0 20 40 60 80

100 ***

AS OA

0 20 40 60 80

100 ***

fibröses Pannusgewebe ![%]

Das fibröse Pannusgewebe, das in AS- und OA-Patienten das subchondrale Knochenmark ersetzte, wies als zelluläre Hauptbestandteile vor allem CD68⁺ (Median ± IQR AS 5,832 ± 5,208%; OA 4,974 ± 4,965%), CD163⁺ (AS 2,666 ± 3,488%; OA 2,702 ± 2,336%) und CD14⁺ (AS 3.138 ± 3,822%; OA 2,241 ± 4,226%) Zellen der Monozyten/Makrophagen-Linie auf, ohne dass es signifikante Unterschiede zwischen den beiden Gruppen gab (für alle p > 0,4; Abb. 3.24). Mit einem Anteil von jeweils weniger als 0,015% der Gesamtzellzahl des fibrösen Gewebes war die Anzahl CD3⁺ T-Zellen (p = 0,0003), CD20⁺ B-Zellen (p = 0,0015) sowie CD1a⁺ Dendritischen Zellen (p = 0,0002) in Gewebeproben von AS-Patienten gegenüber OA-Patienten signifikant geringer (Abb. 3.24).

Analyse der Expression der pro-inflammatorischen Zytokine IL-6, IL-12, Il-17, IL-22, IL-23 und IL-33 im fibrösen Pannusgewebe bei AS

Anzahl Interleukin (IL)-6- (A), IL-12- (B), IL-17- (C), IL-22- (D), IL-23- (E) und IL-33- (F) positiver Zellen pro Gesamtzellzahl gezählt in 10 Gesichtsfeldern in der 400-fachen Vergrößerung im fibrösen Pannusgewebes der Facettengelenke von Patienten mit Ankylosierender Spondylitis (AS) und Osteoarthrose (OA). Dargestellt sind die einzelnen Datenpunkte sowie der jeweilige Median-Wert und der Interquartilabstand. Die statistische Auswertung erfolgte mittels Mann-Whitney-U beziehungsweise ungepaartem t-Test. *** Wert < 0,001; ** Wert < 0,01; * Wert < 0,05; n.s. = nicht signifikant p-Wert > 0,05.

Abb. 3.25: Expression der pro-inflammatorischen Zytokine IL-6, IL-12, IL-17, IL-22, IL-23 und IL-33 im fibrösen Pannusgewebe der Facettengelenke von AS- und OA-Patienten

3 Ergebnisse

A ^TNFα B ^IFNγ

TNFα+ mRNA/Gesichtsfeld IFNγ+ mRNA/Gesichtsfeld

AS OA

0 20 40 60 80 1900100

2000 **

AS OA

0 20 40 60 80

100 **

Der Großteil der analysierten pro-inflammatorischen Interleukine demonstrierte signifikant höhere Anteile an positiven Zellen innerhalb des fibrösen Pannusgewebes in den Facettengelenken von OA-Patienten im Vergleich zu AS-Patienten (IL-6 p = 0,0200; IL-22 p = 0,0063; IL-23 p = 0,0004; IL-33 p = 0,0003; Abb. 3.25A und D–F). In den Gewebeproben von nur 4 von 7 AS-Patienten und 2 von 14 OA-Patienten mit fibrösem Pannusgewebe wurden überhaupt IL-12⁺ Zellen nachgewiesen. Der Vergleich der Interleukine untereinander zeigte außerdem, dass die meisten Zellen des fibrösen Pannusgewebes der AS-Patienten IL-23⁺ (7,143 ± 28,49%; Median ± IQR, Abb. 23.5E), IL-33⁺ (13,42 ± 23,92%; Abb. 3.25F) und IL-6⁺ (7,531 ± 11,05%; Abb. 3.25A) waren, während IL-12 (0,1205 ± 0,1739%; Abb. 3.25B), IL-17 (0,9811 ± 0,679%; Abb. 3.25C) und IL-22 (0,5995 ± 6,265%; Abb. 3.25D) nur von jeweils weniger als 1% der Zellen exprimiert wurden.

Analyse der Expression der pro-inflammatorischen Zytokine TNFα und IFNγ im fibrösen Pannusgewebe bei AS

Während keine IFNγ⁺ (Median ± IQR: 0,0 ± 0,0) beziehungsweise nur sehr wenige TNFα⁺ (0,1500 ± 0,525) mRNA-Kopien pro Gesichtsfeld innerhalb des fibrösen Pannusgewebes der AS-Patienten nachgewiesen wurden, war die Anzahl IFNγ⁺ (25,50 ± 27,75) und TNFα⁺ (22,00 ± 35,25) mRNA-Kopien pro Gesichtsfeld im fibrösen Pannusgewebe der OA-Patienten signifikant höher (p = 0,0037; p = 0,0023; Abb. 3.26A und B).

Durchschnittliche Kopienanzahl TNFα⁺ (A) und IFNγ⁺ (B) mRNA pro 10 ausgezählten Gesichtsfeldern bei 1000-facher Vergrößerung im fibrösen Pannusgewebe der Facettengelenke von Patienten mit Ankylosierender Spondylitis (AS) und Osteoarthrose (OA). Dargestellt sind die einzelnen Datenpunkte sowie der jeweilige Median-Wert und der Interquartilabstand. Die statistische Auswertung erfolgte mittels Mann-Whitney-U beziehungsweise ungepaartem t-Test. ** p-Wert < 0,01.

Abb. 3.26: Expression der pro-inflammatorischen Zytokine TNFα und IFNγ im fibrösen Pannusgewebe der Facettengelenke von AS- und OA-Patienten

3 Ergebnisse

Fibröses Pannusgewebe [%]

PGE₂ COX-2 EP4 EP2

A B C D

AS OA

0 20 40 60 80

100 n.s.

AS OA

0 20 40 60

10090 n.s.

AS OA

0 20 40 60 80 100

120 n.s.

AS OA

0 20 40 60 80

100 *

A ^TGF-beta B ^IL-10

AS OA

AS OA

0 20 40 60 90

100 *

AS OA

0 25 50 7590

100 *

AS OA

fibröses Pannusgewebe ![%] fibröses Pannusgewebe ![%]

Analyse der Expression der anti-inflammatorischen Zytokine TGF-beta und IL-10 im fibrösen Pannusgewebe bei AS

Anzahl TGFβ⁺ (A) und IL-10⁺ (B) Zellen pro Gesamtzellzahl gezählt in 10 Gesichtsfeldern in der 400-fachen Vergrößerung sowie repräsentative immunhistologische Färbungen des fibrösen Pannusgewebes der Facettengelenke von Patienten mit Ankylosierender Spondylitis (AS) und Osteoarthrose (OA).

Originalvergrößerung 400-fach. Dargestellt sind die einzelnen Datenpunkte sowie der jeweilige Median-Wert und der Interquartilabstand. Die statistische Auswertung erfolgte mittels Mann-Whitney-U beziehungsweise ungepaartem t-Test. * p-Wert < 0,05.

Die anti-inflammatorischen Zytokine TGFβ (p = 0,0143; Abb. 3.27A) und IL-10 (p = 0,0132;

Abb. 3.27B) wurden im fibrösen Pannusgewebe, welches das subchondrale Knochenmark ersetzte, signifikant seltener von Zellen der Patienten mit AS exprimiert als innerhalb des fibrösen Gewebes der OA-Patienten.

Analyse der Expression von PGE2, COX-2 und den PGE2-Rezeptoren EP2 und EP4 im fibrösen Pannusgewebe bei AS

Anzahl Prostaglandin (PG) E₂- (A), Cyclooxygenase (COX)-2- (B) sowie EP4- (C) und EP2- (D) positiver Zellen pro Gesamtzellzahl, gezählt in 10 Gesichtsfeldern in der 400-fachen Vergrößerung im fibrösen Pannusgewebes der Facettengelenke von Patienten mit Ankylosierender Spondylitis (AS) und Osteoarthrose (OA). Dargestellt sind die einzelnen Datenpunkte sowie der jeweilige Median-Wert und der Interquartilabstand. Die statistische Auswertung erfolgte mittels Mann-Whitney-U beziehungsweise ungepaartem t-Test. * p-Wert < 0,05; n.s. = nicht signifikant p-Wert > 0,05.

Abb. 3.27: Expression der anti-inflammatorischen Zytokine TGF-beta und IL-10 im fibrösen Pannusgewebe der Facettengelenke von AS- und OA-Patienten

Abb. 3.28: Expression von PGE2, COX-2, EP4 und EP2 im fibrösen Pannusgewebe der Facettengelenke von AS- und OA-Patienten

3 Ergebnisse

Das fibröse Pannusgewebe der Facettengelenke von AS- und OA-Patienten war jeweils durch über 88% PGE2+ und EP4⁺ Zellen gekennzeichnet, sodass zwischen den beiden Patientengruppen keine signifikanten Unterschiede detektiert wurden (PGE2 p = 0,1892; Abb.

3.28A; EP4 p = 0,3650; Abb. 3.28C). Auch das Enzym COX-2 wurde jeweils von gleichvielen Zellen des fibrösen Ersatzgewebes der AS- und OA-Patienten exprimiert (p = 0,5879), wenn auch nur von weniger als 20% der Gesamtzellzahl (Abb. 3.28B).

Signifikant höhere Werte ergab nur die Bestimmung der EP2⁺ Zellen der Facettengelenke der OA- im Vergleich zu den AS-Patienten (p = 0,0470), wobei (Median ± IQR) 60,21 ± 44,77%

der Zellen bei AS und 82,59 ± 20,13% der Zellen bei OA EP2⁺ waren (Abb. 3.28D).

3.6 Evaluierung von Mausmodellen hinsichtlich der Knochenneubildung

Im Dokument Histopathologische Charakterisierung des entzündungs-induzierten Gelenkumbaus bei Patienten mit Ankylosierender Spondylitis (Seite 106-119)