4 Material und Methodik
4.2 Haltung der Versuchstiere
Kongo-GP (Psittacus erithacus erithacus), 10 Puten (Meleagris gallopavo f. dom.) sowie 10 Mäusebussarden (Buteo buteo) gewonnen werden.
4.2 Haltung der Versuchstiere
Die Tauben wurden in zwei geräumigen Innenvolieren, die jeweils eine Größe von 5 x 3 x 3 Meter aufwiesen, gehalten. Diese in Gruppen untergebrachten Brieftauben wurden einheitlich mit einem kommerziellen Taubenfutter (WEDUCO, Alleinfutter für Tauben) ad libitum ernährt. Im späteren Versuchsablauf, so fern die Tiere klinische Symptome zeigten, erfolgte eine Unterbringung in Einzelboxen (0,6 x 0,3 Meter). Alle Tauben stammten aus einem Schlag eines Brieftaubenzüchters aus Thüringen. Sie waren unterschiedlichen Alters, zu Versuchsbeginn jedoch alle adult (4 bis 7 Jahre). Es wurden männliche und weibliche Tauben zu etwa gleichen Teilen verwendet.
Die Legehennen (aus konventioneller Volierenhaltung) etwa im Alter von 4 Monaten waren in der Versuchszeit in Bodenhaltung in einer Voliere mit der Größe von (5 x 3 x 3 Meter) untergebracht und wurden einheitlich mit einem kommerziellem Legemehl (DEUKA, Legemehl für Legehennen) ad libitum gefüttert.
Die untersuchten Puten der Rasse Big-6-Puten (Heidemark Mästerkreise GmbH & CO.KG) aus dem Lehr- und Forschungsgut Ruthe der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover waren sechs Wochen alt, ausschließlich männliche Tiere und dienten der kommerziellen Fleischgewinnung. Die Puten wurden mit einem handelsüblichen Mastfutter ernährt.
Die für die Untersuchungen verwendeten Mäusebussarde wurden im Zeitraum von 2005 bis 2009 als Wildvögel in die Klinik für Heimtiere, Reptilien, Zier- und Wildvögel eingeliefert.
Die Greifvögel waren alle adult und besaßen einen guten Ernährungszustand. Für die Untersuchungen wurden Mäusebussarde ausgewählt, die als Unfallopfer mit leichten Schädeltraumen ohne größere Verletzungen in der Klinik vorgestellt wurden. Die Haltung der Vögel erfolgte bis zur Rehabilitation durch die Wildtier- und Artenschutzstation Sachsenhagen kurzfristig in Boxen mit der Größe 1,3 x 1,3 x 1,3 Metern. Zur Ernährung der Mäusebussarde wurden Eintagsküken und Mäuse verwendet.
Sämtliche Psittaziden stammten aus einer Privathaltung und wurden gruppenweise in Innenvolieren mit Zugang zu Außenvolieren gehalten. Die Papageien wurden einheitlich mit
Material und Methodik
einer kommerziellen Sämereienmischung (Witte Molen, Sämereienmischung für Ziervögel) unter Zufütterung von Früchten ad libitum ernährt. Die Gruppen der Psittaziden waren heterogen zusammengesetzt. Die einzelnen Tiere stammten überwiegend aus ehemals privater Einzelhaltung, in der Regel aus Wohnungshaltungen. Das Alter war bei wenigen Tieren sicher dokumentiert, alle untersuchten Papageienvögel können aber als adult gelten. Sämtliche Papageien wiesen einen guten Ernährungszustand auf. Sie waren klinisch unauffällig und flugfähig.
Wasser stand allen Vögeln ad libitum zur Verfügung.
Material und Methodik
44 4.3 Vorversuche
4.3.1 cGMP-Blutplasmakonzentrationen verschiedener Vogelarten
Zum Nachweis einer detektierbaren Blutplasmakonzentration von cGMP wurden insgesammt 110 Blutproben von klinisch unauffälligen Vögeln (10 Puten (Meleagris gallopavo f. dom.);
10 Legehennen (Gallus gallus f. dom., Hybrid Lohmann); 10 Brieftauben (Columba livia f.
dom.), 10 Blaustirnamazonen (Amazona aestiva aestiva), 10 Venezuelaamazonen (Amazona amazonica amazonica), 10 Gelbbrustaras (Ara ararauna),10 Kongo-GP (Psittacus erithacus erithacus), 10 Timneh-GP (Psittacus erithacus timneh), 10 Mäusebussarden (Buteo buteo) gewonnen und die Plasmakonzentrationen dieses second Messengers der NP ermittelt.
4.3.2 Nachweis von natriuretischen Peptiden im Blutplasma
Um zu überprüfen, ob kommerzielle und gängige Testsysteme zur Bestimmung von humanem ANP und humanem BNP verwertbare Ergebnisse für die untersuchten Vogelarten erbringen können, wurden sechs Plasmaproben von drei Tauben und drei Kongograupapageien auf diese NP untersucht.
4.3.3 Einfluss eines synthetischen natriuretischen Peptides (chANP) auf die cGMP-Blutplasmakonzentration bei verschiedenen Vogelarten (Hühner, Brieftauben, Kongo-GP)
In diesem Versuch sollte die Wirkung eines i.v. verabreichten synthetischen NP in Form von α-chANP auf die Plasmakonzention des second Messengers überprüft werden. Hierfür wurden sechs Legehennen (Gr. A), drei Kongo-Graupapageien (Gr. B) sowie zwölf Tauben (Gr. C – E) mit chANP in unterschiedlichen Dosierungen behandelt. Die Dosierungen für die jeweiligen Gruppen wurden wie folgt gewählt:
Material und Methodik
Versuchsgruppen (Gruppengröße)
Dosierungen von α-chANP (verabreichte Volumina)
Gr. A (n = 6) 60 µg/ kg KM (0,7 ml)
Gr. B (n = 3) 60 µg/kg KM (0,15 ml)
Gr. C (n = 3) 20 µg/kg KM (0,1 ml)
Gr. D (n = 3) 40 µg/kg KM (0,2 ml)
Gr. E (n = 3) 60 µg/kg KM (0,3 ml)
Das α-chANP wurde in Portionen von 200µg in getrockneter Form in einer gewährleisteten Reinheit von > 95% von der Firma PHOENIX PHARMACEUTICALS, INC. erworben und bei 5°C aufbewahrt. Zur eigentlichen Verwendung wurde das Hormon mit Wasser für Injektionszwecke unmittelbar vor der Verwendung rehydriert.
Um den Einfluss der Injektionsmenge und der Narkose auf die Plasmakonzentration von cGMP zu überprüfen, lagen alle Tiere vor der Hormoninjektion 20 Minuten in Narkose und einem Tier jeder Gruppe wurde die äquivalente Volumenmenge zur späteren Hormoninjektion zwanzig Minuten vor der eigentlichen Hormongabe in Form von Wasser für Injektionszweck i.v. verabreicht.
Auf Grund der besseren Durchführbarkeit der Blutentnahmen wurden die Tiere mit Hilfe von Isofluran (IsoFlo®, Albrecht GmbH) und einem kommerziell erhältlichen Narkosegerät (Stephens Anaesthetic Machine; Eickemeyer Tuttlingen) über eine Maskennarkose narkotisiert (3 Vol% Isofluran Einleitung/ 1 Vol% Isofluran Erhaltung). Die Blutentnahmen erfolgten alle 10 Minuten, so dass sechs Blutwerte pro Tier ausgewertet werden konnten. Blut wurde sowohl für die Blutchemie (Htk, Na+, K+, P) als heparinisiertes Blut sowie für die cGMP-Bestimmung als EDTA-Blut gewonnen (Tabelle 1).
Material und Methodik
46
Tabelle 1: Versuchsplan zu Vorversuch 4.3.3: Einfluss eines synthetischen chANP auf die cGMP Blutplasmakonzentration bei verschiedenen Vogelarten.
Duchzuführende Applikationen und Probengewinnungn in verschiedenen Zeitabschnitten des Versuches Gruppen;
Gr. A: Legehennen; Gr. B: Kongo-GP; Gr. C, Gr. D, Gr. E: Brieftauben
Material und Methodik
4.4 Hauptversuche
Im Hauptversuch I sollte der Einfluss induzierter kardialer Veränderungen auf die cGMP-Blutplasmkonzentration untersucht werden. Hierfür wurde bei Brieftauben durch definierte Nachlasterhöhung das Herz belastet und mögliche Konzentrationsänderungen ermittelt.
Im II. Hauptversuch wurde bei Kongo-Graupapageien mit röntgenologisch feststellbaren kardiologischen Veränderungen und entsprechender klinischer Symptomatik die cGMP-Blutplasmakonzentration bestimmt.
4.4.1 Hauptversuch I
In diesem Versuch sollte über eine Steigerung der Nachlast des Herzens eine Belastung des linken Ventrikels und damit eine mögliche Freisetzung von NP induziert werden.
Resulierende Konzentrationsänderungen des second Messenger (cGMP) sollten ermittelt werden.
Hierfür wurden 28 Brieftauben in vier Gruppen (Gr. A, Gr. B, Gr. CI und Gr. CII) eingeteilt.
Bei den Tauben wurde durch das Subligieren herznaher Arterien eine Nachlasterhöhung des linken Herzens in zwei unterschiedlichen Intensitäten vorgenommen (4.4.1.1). Die Gruppeneinteilung war hierbei wie folgt:
Gr. A (n=6): Kontrollgruppe (Operation ohne Ligaturen)
Gr. B (n=6): ca. 50% Subligatur des rechten Tr. brachio. nach Abgang der A. carotis communis
Gr. C (CI: n=8; CII n=8):
ca. 80 – 90% Subligatur des rechten Tr. brachio. nach Abgang der A.
carotis communis und eine 80-90% Subligatur der Aorta im Bereich des Aortenbogens.
Die Tiere der Gr. A, der Gr. B und der Gr. CI wurden vor der Belastung einer eingehenden klinischen, einer elekrokardiographischen, einer phonokardiographischen sowie blutchemischen Untersuchung unterzogen. In Abhängigkeit von der Klinik der Tiere erfolgten
Material und Methodik
48
nach der Herzbelastung die gleichen Untersuchungen in regelmäßigen Abständen bis zu drei Monaten oder bis zur Euthanasie der Tiere (Untersuchung zu den Zeitpunkten 0h, 8h, 12h, 24h, 48h sowie 3Monate nach Anlegen der Ligaturen).
Die Tiere der Gr. CII wurden neben der Bestimmung der cGMP Konzentration ausschließlich einer echokardiographischen Untersuchung zur Beurteilung der linksventrikulären Funktion unterzogen und beim Auftreten deutlicher Veränderungen in der Sonographie euthanasiert.
Die Bestimmung der cGMP Konzentration erfolgte für alle Tiere vor und während der Phase der kardialen Belastung in Abhängigkeit von der Klinik der Versuchstauben in regelmäßigen Abständen (Untersuchung zu den Zeitpunkten 0h, 8h, 12h, 24h, 48h sowie 3Monate nach Anlegen der Ligaturen).
4.4.1.1 Operationstechnik zum Subligieren herznaher Arterien zur definierten Nachlasterhöhung des linken Ventrikels
Unter einer in der Vogelmedizin standardisierten Inhalationsnarkose mit Isofluran (Einleitungskonzentration 3 Vol% und Erhaltungskonzentration 1 - 2 Vol%.) wurden die Tauben narkotisiert, auf der linken Körperseite gelagert und der rechte Flügel nach dorsal ausgebunden. Die Narkosetiefe wurde über den Zwischenzehenreflex und den Flügelspannhautreflex überprüft und auf das Toleranzstadium eingestellt.
Der Zugang zu den großen Gefäßen des Herzens erfolgte auf Grund der „Rechtsaorta“ von der rechten Seite des Vogelkörpers kranial der ersten Rippe. Nach einem etwa 2 cm großen Hautschnitt und nach Eröffnung des Klavikularluftsackes wurden die Aorta descendens und der rechte Truncus brachiocephalicus dargestellt (Abbildung 6). Das Ligieren der Gefäße erfolgte nach der Methode von ROCKMAN et al. (1991). Hierfür kam eine Ligaturklemme mit den dazugehörigen Ligaclips® der mittleren Größe der Firma ETHICON ENDO SURGERY, INC. zum Einsatz. Die Ligierung der Gefäße erfolgte unter Sichtkontrolle mit einem Endoskop (T 190-2700, Dr. Fritz; Lichtquelle von STORZ, Kaltlicht-Fontäne). Der vollständige Verschluß der Ligaturklemme wurde in Anlehnung an ROCKMAN et al. (1991) mit Kirschner-Bohrdrähten zwischen den Backen der Ligaturklemme verhindert (0,8 mm Durchmesser Draht für die Aorta (80-90% Subligatur), 1,4 mm bzw. 1 mm Durchmesser Draht für den Tr. brachio. (50% bzw. 80-90% Subligatur). Die Aorta wurde hierbei aus anatomischen Gründen erst nach Abgang des rechten und linken Tr. brachio. ligiert
Material und Methodik
(Abbildung 7). Der Wundverschluss erfolgte chirurgisch durch eine fortlaufende Kürschner-Naht (Kürschner-Nahtmaterial: Serafit USP 5/0) der Luftsackwand und einer Hautnaht mit Einzelheften (Nahtmaterial: Serafit USP 5/0).
Abbildung 6: Darstellung des Tr.
brachio. (T), der Aorta (A) sowie der V. cava cranialis (V) unter
endoskopischer Sichtkontrolle.
Abbildung 7: Ligaturen des Tr.
brachio und der Aorta (↓).
Die Tiere der Kontrollgruppe wurden der gleichen Operation unterzogen, jedoch ohne die Gefäße zu ligieren.
A T
V
Material und Methodik
50
Als Abbruchkriterien des Versuches nach der Operation galten eine schwere Störung des Allgemeinbefindens mit Dyspnoe durch Ausbildung eines Lungenödems und völlige Teilnahmslosigkeit an der Umgebung mit vollständiger Verweigerung der Futteraufnahme.
Eine Minderdurchblutung von Körperanhängen und deren Folgen führten ebenfalls zum Abbruch des Versuches. Alle Tauben wurden nach Versuchsende oder nach Abbruch der Studie durch eine Injektion von 1,3 ml Narcoren (200 mg Pentobarbital-Natrium) i.v. in die Vena ulnaris unter Vollnarkose euthanasiert.
4.4.2 Hauptversuch II
In einer zweiten Studie wurde die cGMP-Blutplasmakonzentration von 10 klinisch auffälligen Kongo-Graupapageien (mäßiger Ernährungszustand, verminderte Leistungsfähigkeit sowie Schweratmigkeit nach der Belastung) und einer Gimpeltaube mit einer Ectopia cordis (LEGLER et al., 2009) bestimmt. Für diese Studie wurden Papageien, die in den Jahren 2005 – 2009 in der Klinik für Zier- und Wildvögel der Stiftung Tierärztlichen Hochschule vorgestellt wurden, ausgewählt. Die Tiere zeigten röntgenologisch arteriosklerotische Veränderungen (n=6; Abbildung 8) und/ oder eine Vergrößerung der Herzsilhouette (n=4;
Abbildung 9) im Röntgenbild (Herzsilhouette > 65% der Thoraxbreite; nach PEES et al., 2006). Die Gimpeltaube wies in Zusammenhang mit einer Ectopia cordis eine Insuffizienz der rechten AV-Klappe auf. Bei einem Graupapagei konnte in einer echokardiographischen Untersuchung ebenfalls eine Insuffizienz der rechten AV-Klappe festgestellt werden.
Vier der untersuchten Tiere verstarben im Untersuchungszeitraum und konnten einer pathologischen Untersuchung zugeführt werden. Die hochgradigen röntgenologisch diagnostizierten arteriosklerotischen Veränderungen wurden bei drei Tieren bestätigt. Das vierte Tier wies eine hochgradige Dilatation des rechten sowie des linken Ventrikels auf, was somit die röntgenologisch sichtbare massive Vergrößerung der Herzsilhouette erklärte. Als primäre Ursache konnte in diesem Fall eine Pilzinfektion der Lunge und Luftsäcke diagnostiziert werden.
Material und Methodik
Abbildung 8: Pathologisch-anatomisch sowie röntgenologisch diagnostizierte Arteriosklerose (↓) eines Kongo-Graupapageien.
Abbildung 9: Röntgenologisch erkennbare hochgradige Vergrößerung der Herzsilhouette (H) eines Kongo-Graupapageien.
H
H
Material und Methodik
52
4.5 Diagnostische Methodik und Probengewinnung 4.5.1 Blutentnahme und Probenaufbereitung
Die Blutentnahme erfolgte mittels einer 0,7 x 30 mm starken Kanüle (Nr.12) aus der Vena ulnaris (jeweils im Wechsel an beiden Flügeln) mit Auffangen des Blutes im freien Fluss je 0,8 ml in ein EDTA- und in ein Lithium-Heparin-Röhrchen. Nach der Blutentnahme aus der Vena ulnaris wurde mit einem Mikrohämatokritröhrchen das Blut aus dem Kanülenkonus aufgesogen und anschließend mit Wachs verschlossen und sofort zentrifugiert.
Unverzüglich wurde ebenfalls das Blutplasma gewonnen (Hard spin, Stat Spin®, IDEXX).
Das EDTA-Plasma wurde bis zur Bestimmung des cGMP bei -20°C (nicht länger als fünf Monate) eingefroren. Aus dem Lithium-Heparin-Plasma wurden die blutchemischen Untersuchung am selben Tag der Blutentnahme durchgeführt.
4.5.2 Elektrokardiographische Untersuchung
Die elektrokardiographische Untersuchung erfolgte unter Vollnarkose (Isofluran, siehe oben) entsprechend den Empfehlungen von LUMEIJ und STOKHOF (1985) mit Hilfe des Gerätes MAC®5000 (GE Medical Systems). Hierbei lagen die Tauben auf dem Rücken, die Elektroden wurden dabei an den beiden Flughäuten und den Kniefalten mit Hilfe von Krokodilklemmen angebracht. Das Gerät erlaubte eine Aufzeichnungsgeschwindigkeit von 100 mm/s. Jeweils wurden die drei bipolaren Ableitungen nach EINTHOVEN und drei unipolare Extremitätenableitungen nach GOLDBERGER erfasst.
Die ausführlichere Auswertung erfolgte anhand der II. Standardableitung nach EINTHOVEN.
Beurteilt wurden dazu die Amplituden der P-, der S-Zacke und der T-Welle sowie das Q-T-Intervall und die Herzfrequenz. Aus der II. und III. Standardableitung nach EINTHOVEN wurde die elektrische Herzachse anhand der Amplituden der S-Zacken im EINTHOVSCHEN-Dreieck ermittelt (ZUCKERMANN, 1956).
Material und Methodik
4.5.3 Phonokardiographische Untersuchung
Die phonokardiographische Untersuchung erfolgte mithilfe des elektrischen Stethoskops von Welch Allyn meditron sowie mit der Software The Meditron Analyzer (Version 4.0.2V).
Die Auskultation wurde an der rechten und linken seitlichen Brustwand im Bereich der Projektionsfläche des Herzens durchgeführt. Das in Zusammenhang mit den Herztönen aufgezeichnete EKG in der II. Standardableitung nach EINTHOVEN erlaubte eine bessere Zuordnung der Herztöne den Phasen der Herzaktionen. Hierbei wurden über 20 Sekunden die Herztöne jeder Seite aufgenommen. Die Auswertung erfolgte in Hinblick auf Herztöne und -geräusche. So wurde die Abgesetztheit der Herztöne bei einem Filter von 125Hz beurteilt und erkennbare Nebengeräusche registriert.
4.5.4 Röntgenologische Untersuchung
Die röntgenologische Untersuchung erfolgte mit Hilfe des Röntgengerätes Veterinary Diagnost 40 (Philips) bei 60KV und einer Belichtungszeit von 0,12 s. Die Röntgenplatte Trimax system 3M (Folientyp feinzeichnend) in Kombination mit der Röntgenfolie Medical X-Ray Screen Film grün sensitiv fand dazu Verwendung. Die Tiere wurden direkt auf der Röntgenplatte gelagert. Es wurden die in der Vogelmedizin üblichen standardisierten latero-lateralen und dorso-ventralen Röntgenaufnahmen angefertigt.
Anhand dieser Röntgenaufnahmen konnte auch der Sitz der Ligaturklemmen im Verlauf des Versuches überprüft werden.
4.5.5 Echokardiographische Untersuchung
Die echokardiographische Untersuchung wurde mit dem Gerät Vivid 7 Dimension BT 08, in Kombination mit der Ultraschallsonde 10S, die im B-Mode eine Arbeitsfrequenz von 4,5 – 11,5 MHz aufweist (GE Medical System) durchgeführt. Der Untersuchungsgang erfolgte nach PEES et al. (2006).
Die Tauben wurden in Narkose in der Rückenlage durch die rechte Fenestra des Brustbeines geschallt. Hierbei konnte im B-Mode Verfahren im Vierkammer−Längsachsenschnitt
Material und Methodik
54
(SCHULZ, 1995) der linke Ventrikel beurteilt werden. Die Funktionsbewertung des linken Ventrikels erfolgte anhand der Verkürzungsfraktion (Fraktional Shortening; FS) der Herzkammer.
Die FS (%) ergibt sich aus der Formel: 100 X (LVDd – LVDs) : LVDd ; (LVDd = linksventrikulärer enddiastolischer Durchmesser; LVDs = linksventrikulärer endsystolischer Durchmesser. Die Messung von LVDd/ LVDs erfolgte unmittelbar unter der linken AV-Klappe (Abbildung 32). Zur Bestimmung der Enddiastole und der Endsystole erfolgte zusätzlich die Aufnahme eines EKG in der II. EINTHOVSCHEN-Standardableitung.
Die Funktion der linken AV- Klappe wurde mit Hilfe des Farbdopplers sowie des PW- als auch des CW-Dopplers überprüft. Bei Auftreten von Jets in diesem Bereich wurde wenn möglich die Geschwindigkeit des Refluxes bestimmt.
4.6 Labordiagnostische Untersuchungsverfahren 4.6.1 Blutchemische Untersuchung
Der Hämatokritwert (Htk) wurde bestimmt, indem das Blut mit einem mit Heparin beschichteten Hämatokritröhrchen aufgefangen und zu ¾ gefüllt wurde. Anschließend kam eine Hettich Mikro 12-24 Zentrifuge zum Einsatz, in der das Röhrchen bei 12000 U/min 5 min zentrifugiert wurde. Der Anteil der Erythrozyten-Fraktion an der aufgetrennten Blutsäule wurde mittels einer Hämatokrit-Harfe bestimmt.
Das Plasma aller Probanden wurde am Tag der Gewinnung unter Einsatz des trockenchemischen Analysensystem Vitros (ehemals Kodak Ektachem) DT60 II® bearbeitet.
Folgende Parameter wurden bei 37°C untersucht:
AST (Aspartat-Amino-Transferase)
AST katalysiert die Reaktion: α-Ketoglutarat + L-Aspartat ↔ L-Glutamat + Oxalacetat.
In einer Hilfsreaktion erfolgt durch MDH (Malatdehydrogenase) die Oxidation von NADH zu NAD+ als: Oxalacetat + NADH + H+ ↔ L-Malat + NAD+.
Die Abnahme der NADH-Konzentration im Zeitablauf wird bei einer Wellenlänge von
Material und Methodik
340 nm photometrisch gemessen und in AST-Aktivität umgerechnet (Handbuch ©Eastman Kodak Ektachem, 1992).
LDH (Laktatdehydrogenase)
Die Laktatdehydrogenase in der Probe katalysiert die Reaktion von Pyruvat + NADH zu Laktat und NAD+, wobei eine Änderung der Reflektionsdichte erfolgt. Diese Änderung wird photometrisch bei einer Wellenlänge von 340 nm gemessen, sie ist proportional zur Enzymaktivität (Handbuch ©Eastman Kodak Ektachem, 1992).
CK (Creatinkinase)
Creatinphosphat + ADP ↔ Creatin + ATP.
Die Creatinkinase setzt Creatinphosphat und ADP zu Creatin und ATP um. ATP initiiert eine chemische Kettenreaktion, die eine Änderung der Reflektionsdichte hervorruft. Dies wird photometrisch bei 680 nm gemessen und aus dem Ergebnis lässt sich die CK-Aktivität bestimmen (Handbuch ©Eastman Kodak Ektachem, 1992).
URIC (Harnsäure)
Harnsäure wird oxidiert, wobei sich Allantoin und Hydrogenperoxid bilden. Hydrogenperoxid reagiert mit dem Indikator Leuco-Farbe zu einem farbigen Komplex, dessen Intensität proportional zur Konzentration der Harnsäure ist und photometrisch bei 660 nm gemessen wird (Handbuch ©Eastman Kodak Ektachem, 1992).
K (Kalium)
Den ionenselektiven Elektroden liegt als Messprinzip die Potentiometrie zugrunde. Für Messungen sind eine Referenzelektrode sowie eine Messelektrode erforderlich. Beide sind über eine leitende Brücke miteinander verbunden. Das Potential der Messelektrode ist so zu wählen, dass es auf die Konzentration des Kations, in diesem Fall Kalium, anspricht, während die Referenzelektrode eine konstante Spannung erhält. Die Messelektrode ist an ihrer Spitze mit einer Membran ausgestattet, die die entsprechenden Kationen durchlässt. Hat die Membran Kontakt mit der Lösung, die das entsprechende Kation enthält, so wandern die Kationen über die Membran in die Elektrode und verändern das Potential. Diese Änderung
Material und Methodik
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zwischen Mess- und Referenzelektrode wird gemessen. Es besteht eine logarithmische Beziehung zwischen der messbaren Spannungsänderung und der Konzentration der Probe (Handbuch ©Eastman Kodak Ektachem, 1992).
P (Phosphor/Phosphat)
Im Blut kommt Phosphor als anorganisches Phosphat, organischer Ester und als Phospholipid vor. Diagnostisch von Bedeutung ist das anorganische Phosphat, das mit Ammoniummolybdat die Verbindung Ammoniumphosphomolybdat bildet. Diese wird durch Reduktionsmittel zu Molybdänblau reduziert. Die Intensität der blauen Farbe ist proportional der Phosphatkonzentration und wird photometrisch bei 660 nm gemessen (Handbuch
©Eastman Kodak Ektachem, 1992).
4.6.2 cGMP-Bestimmung
Die cGMP-Bestimmung erfolgte durch die Firma IBL Hamburg, Gesellschaft für Immunochemie und Immunobiologie mbH.
Testprinzip:
Der cGMP Radioimmunoassay (RIA) enthält alle Regenzien für die Quantitative Bestimmung von cGMP in Urin oder Plasma sowie in Gewebe- und Zellextrakten.
Die Methode basiert auf dem von STEINER et al. (1972) beschriebenen RIA für zyklische Nukliotide. Die hohe Spezifität, Empfindlichkeit (5 fmol/ Röhrchen) sowie die geringe Störanfälligkeit des Tests erlaubt die direkte Bestimmung von cGMP in Plasma- und Urinproben.
Bei dem IBL-Radioimmunoassay werden in einem Teströhrchen die Proben bzw. der Standard mit 125I-markiertem cGMP und vorpräzipitiertem Antikörper (Immunkomplex aus erstem und zweitem Antikörper) über Nacht inkubiert. In dieser Gleichgewichtsreaktion konkurrieren das unmarkierte cGMP (Standard/ Probe) und der radioaktive cGMP Tracer um die Bindung an dem spezifischen Antikörper. Die Inkubation wird beendet durch das Zumischen einer kopräzipitierenden Lösung (Trennreagenz) und nachfolgender Zentrifugation. Es bildet sich ein sehr fester Niederschlag. Nach quantitativem Dekantieren
Material und Methodik
des gut ablaufenden Überstandes (freie Aktivität) wird in dem Niederschlag die gebundene Aktivität in einem Gammacounter bestimmt. Die Menge an gebundener Aktivität ist ein Maß für den cGMP-Gehalt der Probe, der an einer simultan erstellten Standardkurve abgelesen wird.
Die Proben wurden im Doppelansatz bei einer Verdünnung von 1:51 untersucht.
4.6.2 Bestimmung von ANP und BNP
Die Bestimmung von ANP und BNP erfolgte aus EDTA–Plasma über das „Medizinische Labor Hannover“. ANP wurde mit dem SHINORIA ANP Kit (CIS bio international) für hANP bestimmt. Das Prinzip ist ein Solid-phase (Sandwich) immunoradiometric Assay. Zur Bestimmung von BNP wurde der BNP Test von Triage® aus der Humandiagnostik verwendet.
Das Prinzip ist ein Fluoreszenz-Immunoassay.
4.7 Pathomorphologische und pathohistologische Untersuchungen
Die nach dem Versuch euthanasierten Tiere wurden einer pathologisch-anatomischen Untersuchung zugeführt. Hierbei wurde die Morphologie des Herzens beurteilt.
Von jeweils drei Tieren der Gr. A, Gr. B sowie Gr. C erfolgte eine pathologisch-histologische Untersuchung des Myokards des linken Ventrikels mit Unterstützung des Instituts für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover. Hierfür wurden Proben in Formalin fixiert und im Anschluss im Institut für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover nach standardisierten Methoden mit Hämatoxylin-Eosin gefärbt und mikroskopisch beurteilt.
4.8 Statistische Methoden
Bei der Beschreibung der Messwerte im Vorversuch sowie im Hauptversuchen ist neben dem arithmetischen Mittelwert (x) die Standardabweichung (S) angegeben.
Für die statistische Untersuchung des Verlaufs der einzelnen Untersuchungsparameter wurden Varianzanalysen und nichtparametrische Gruppenvergleiche (Rangvarianzanalysen)
Material und Methodik
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durchgeführt. Zur statistischen Berechnung diente das Programm SPSS (BÜHL und ZÖFEL, 2002). Die graphische Darstellung wurde mit Hilfe von Microsoft® Excel 5.0 durchgeführt.
In Fällen, wo eine statistische Signifikanz mitgeteilt wird, beruht diese auf einer varianzanalytischen Auswertung, für die eine α-Fehlerwahrscheinlichkeit (Wahrscheinlichkeit, dass ein gefundener Effekt doch nicht in der Gesamtpopulation existiert) von α = 0,05 festgelegt wurde.
4.9 Genehmigung der Tierversuche
Die Untersuchungen dieser Arbeit waren unter dem folgenden Aktenzeichen als Tierversuchsvorhaben genehmigt: 33.42502/05-05.05.
Ergebnisse
5 Ergebnisse
5.1 Voruntersuchungen
5.1.1 Die cGMP-Blutplasmakonzentration verschiedener Vogelarten
In einer ersten orientierenden Voruntersuchung sollten die Plasmakonzentrationen verschiedener Vogelarten für cGMP im Blut bestimmt werden.
In allen untersuchten Spezies ließ sich eine Plasma-cGMP-Konzentration ermitteln. Die
In allen untersuchten Spezies ließ sich eine Plasma-cGMP-Konzentration ermitteln. Die