Blutproben

3.2.4.1 Entnahme & Aufbereitung

Zu allen Laufbandtests wurden Blutproben unmittelbar vor, während und im Anschluss an die Belastung gezogen und sowohl photometrisch im Vollblut als auch enzymatisch im Plasma bestimmt. Eine Ausnahme bildete hier der zweite Test, der im Februar in Warendorf stattfand.

Da kein Gerät für den enzymatischen Nachweis zur Verfügung stand, beschränkte sich die Analyse auf die photometrische Methode.

Erfahrungswerte vorheriger Studien zeigten keinen signifikanten Unterschied zwischen den einen Ruhewert repräsentierenden Nullproben, die im Stall und solchen, die unmittelbar vor Belastungsbeginn gezogen wurden.

Aus diesem Grund wurde in dieser Studie die Nullprobe erst direkt am Band entnommen.

Weitere Proben entnahm man innerhalb der letzten zehn bis fünfzehn Sekunden einer jeden Belastungsstufe, wodurch sich eine Schritt-, eine Trab- und vier Galoppproben ergaben.

Zudem wurden Blutproben innerhalb von 2,4,6,8,10,15,30,60 und 120 Minuten nach Belastungsende (d.h. nach Galoppstufe IV ) erhoben.

Alle Proben wurden ohne Störung des Pferdes über den Verlängerungskatheter entnommen, wobei jeweils ungefähr die ersten 20 Milliliter über eine Spritze aufgezogen und verworfen wurden. Zwischen den einzelnen Proben wurden Verlängerung und Katheter mit physiologischer Kochsalzlösung gespült.

Die Proben 30,60 und 120 Minuten nach Belastungsende wurden im Stall ebenso wie die Nullprobe direkt aus dem Venenverweilkatheter gezogen.

Alle Proben, die der photometrischen Bestimmung dienten, wurden zunächst in einem Reaktionsgefäß ( Eppendorf ) aufgefangen, aus dem jeweils 10 µl in die entsprechenden Glasküvetten für Glukose- und Laktatbestimmung des Dr. Lange Küvetten –Tests pipettiert wurden. Diese enthalten die für die Analyse erforderlichen Reagenzien. Auf den Nachweis selbst wird im nächsten Kapitel detaillierter eingegangen. Bis zum Analysezeitpunkt (innerhalb einer Stunde) wurden die Küvetten in Styroporkartons unter Raumtemperatur gelagert.

Für den enzymatischen Nachweis mit Hilfe des Biosensors wurde das Blut aus dem Katheter bzw. der Verlängerung mittels 1 Milliliter Tuberkulinspritzen ( Luer Lock, Termo Europe, Leuven, Belgien ) gewonnen. Hierfür wurde am Versuchsvortag in ihren Konus Heparin - Natrium ( von Ratiopharm; 25 I.E. / 5 ml ) aufgezogen, um die Blutgerinnung zu hemmen.

Das Blut wurde unmittelbar nach der Gewinnung in der Spritze auf Eis gelagert und binnen 60 Minuten analysiert.

3.2.4.2 Analyse

Die Analyse der Blutproben verlief nach folgendem Schema:

Abb. 5: Schema der Blutanalyse

3.2.4.2.1 Vollblut

Sowohl die Bestimmung des Laktats als auch der Glukose im Vollblut wurde mit dem Miniphotometer plus LP 20 ( Art. Nr. 335, Dr. Bruno Lange GmbH, Berlin ) durchgeführt, das ein programmiertes Auswertverfahren für beide Parameter beinhaltet. In beiden Fälle verwendete man für die photometrische Messung denselben Interferenzfilter. Gemessen wurde bei einer Messwellenlänge von 520 nm. Um die Richtigkeit der Ergebnisse zu überprüfen, wurden an jedem Messtag Kontrollmessungen mit standardisierten Lösungen von 2,4,10,15 und 20 mmol/l aus dem Laktat-Kontrollset LCQ 140 (ebenfalls Dr. B. Lange GmbH ) durchgeführt. Für die Kontrolle der Messgenauigkeit von Glukose wurde als Standardlösung Precinorm ® verwendet. Diese Standards wurden wie Blut zur Analyse eingesetzt. Die Messwerte lagen immer im erwarteten Bereich.

Für die Bestimmung beider Parameter ( Laktat und Glukose ) wurden zunächst je 10µl Vollblut aus dem Reaktionsgefäß ( Eppendorf ) in die entsprechende Glasküvette pipettiert.

Diese wurde bis zur Analyse, die binnen einer Stunde stattfand, bei Raumtemperatur gelagert.

Die in den Röhrchen befindliche Pufferlösung führt zu einer Hämolyse des Blutes, wobei das Gerät bei der Auswertung das Erythrozytenvolumen der Probe berücksichtigt.

Blutanalysator 865

Laktat [mmol/l] Glukose[mg/dl]

Photometer

Laktat [mmol/l] Glukose [mg/dl]

Vollblut Plasma

Laktat

Die Bestimmung des Laktatgehaltes geschieht nach der LOX-PAP-Methode (beschrieben bei Böning D., Clasing D. u. Weicker H.: Stellenwert der Laktatbestimmung in der Leistungsdia-gnostik, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1994 ).

Nachdem das Blut durch die Puffersubstanz der Glasküvette ( LKM 140 ) hämolysiert wird, werden nach Zugabe des Startreagenzes aus der Verschlusskappe folgende chemische Reaktionen in Gang gesetzt:

Laktat + O2 Lactatoxidase Pyruvat + H2O2

H2O2 + 4-Aminophenazon + 4-Chlorphenol POD roter Chinonimimfarbstoff Hier wurde photometrisch quantifiziert.

Glukose

Die Glukosebestimmung geschieht mittels der GOD-PAP-Methode (Bahrmann D., Trinder P., Analyst 1972; 97:142). Da für den Ablauf der chemischen Reaktionen eine höhere Temperatur nötig ist, werden die Küvetten ( LKM 141 ) vor der Analyse in einem Wasserbad erwärmt.

α-D-Glukose Mutarotase β-D-Glukose

β-D-Glukose + O2 ^GOD D-Gluconsäure + H2O2

H2O2 + 2,4-Dichlorphenol + 4-Aminophenazon ^POD roter Chinoniminfarbstoff.

Dieser wird wiederum photometrisch gemessen.

Da das Gerät die Ergebnisse in [mg/dl] angibt, wurde diese Einheit übernommen (Umrechnungsfaktor in mmol/l: x 0,0555 oder /18,061).

3.2.4.2.2 Plasma

Die in den Tuberkulinspritzen aufgezogenen Blutproben wurden mit Hilfe des Blutanalysators 865 ( Bayer Vital, Geschäftsbereich Diagnostics, Fernwald ) über dessen Biosensoren ausge-wertet, die zwei Tage vor jedem Versuch neu in das Gerät eingesetzt wurden, um eine einwandfreie Funktion der Sensoren zu gewährleisten, da diese nach einer längeren Betriebsdauer an Leistungsfähigkeit verlieren. Auch hier wurde zu Beginn eines jeden Messtages eine Überprüfung der Messgenauigkeit mittels definierter Probelösungen durchgeführt, wobei sich keine Abweichungen herausstellten. Zudem kalibrierte das Gerät selbständig in kürzeren Abständen die Elektroden.

Ein solcher Biosensor kann als eine Art elektrochemische Zelle mit zwei Elektroden ver-standen werden. Dabei besteht die eine Elektrode, die sogenannte Messelektrode, aus Platin und ist mit dem für die Bestimmung des jeweiligen Parameters notwendigen Enzym inklusive eines Cofaktors beschichtet. Im Falle einer Glukosemessung handelt es sich hierbei um die Glukoseoxidase bzw. bei der Laktatanalyse um die Laktatoxidase.

Das Gerät zieht nun zunächst 200 µl Vollblut – die eigentliche Messung findet jedoch später im Plasma statt – aus der aufgesetzten Spritze auf. In einem ersten Schritt diffundiert der zu messende Parameter an die Membran bzw. die enzymbeschichtete Elektrode und bildet dort einen Enzym-Substrat-Komplex. Das sich im Verlauf der chemischen Reaktion bildende Wasserstoffperoxid wird dann im nächsten Schritt durch die als Anode fungierende zweite Platinelektrode, die sich hinter der ersten Membran befindet, zu Sauerstoff oxidiert. Dies geschieht, weil zwischen beiden Elektroden eine konstante Polarisationsspannung besteht, deren Veränderung durch die im Rahmen der Oxidation freiwerdenden Elektronen gemessen wird. Der Stromfluss wird dabei durch die freien Elektronen proportional zur Konzentration des Parameters verändert. Dabei entspricht 1 Mol des oxidierten Wasserstoffperoxids jeweils einem Mol Laktat / Glukose. Letztlich wird also ( nach vorheriger Kalibration ) der Stromfluss pro Zeit gemessen und elektronisch in eine Konzentration umgesetzt.

Im einzelnen finden folgende chemische Reaktionen statt:

Laktat:

L-Laktat + Laktatoxidase + Cofaktor + O2 Pyruvat ( Brenztraubensre. ) + H2O2.

Glukose:

β-D-Glukose + Glukoseoxidase + Cofaktor +O2 Glukonat ( Glukonsre. ) + H2O2.

Laktat / Glukose:

H2O2 2 H⁺ + 2 e^- + O2 [ Anode (+) ] 2 e^- + 2 H⁺ + ½O2 H2O [ Kathode (-) ].

Auch hier wird das Ergebnis der Glukosemessungen in [mg/dl] ausgedruckt und daher in dieser Form übernommen (Umrechnungsfaktor: x 0,0555 oder / 18,061).