Aufbereitung des Probenmaterials

Alle Hormonanalysen wurden in der Abteilung für Reproduktionsbiologie des Deutschen Primatenzentrums in Göttingen durchgeführt. Die Aufarbeitung wie auch die Hormonquantifizierung wurde in Anlehnung an die Methoden von HEISTERMANN et al.

(1993) und FIESS et al. (1999) durchgeführt.

Die Zusammensetzung der Lösungen, die für die Hormonanalysen verwendet wurden, wie auch die Herstellernachweise von verwendeten Materialien und die IUPAC-Nomenklatur einiger Substanzen werden im laufenden Kontext sowie im Anhang (Anhang I bis III) beschrieben.

3.1.6.1 Hydrolyse von Urinproben

Die in den hier verwendeten Testsystemen eingesetzten Antikörper zur Quantifizierung von Cortisol und Testosteron zeigen eine erhöhte Affinität gegenüber der unkonjugierten Form des jeweiligen Hormons. Da Steroidhormone im Urin, im Gegensatz zu den Fäzes, vor allem in der konjugierten Form vorkommen, mußte zuerst eine hydrolytische Spaltung der ausgeschiedenen Androgene und Glucocorticoide vorgenommen werden.

Die Urinproben wurden deshalb vor der Extraktion einer enzymatischen Hydrolyse mittels β-Glucuronidase-Sulfatase unterzogen (FIESS et al. 1999). Dazu wurden jeweils 50 µl Urin mit 300 µl Natrium-Acetat-Puffer (41 g Natriumacetat in einem Liter H2O; eingestellt mit Essigsäure auf pH 4,7) und 20 µl (500 UI in 20 µl NaAC) β-Glukuronidase-Sulfatase aus Weinbergschnecken (Helix pomatia) versetzt. Zusätzlich wurden jeder Probe 20 µl (5000 cpm) 3H-Pregnandiol-Glucuronid-Tracer zugesetzt, um die Effizienz der Hydrolyse/Extraktion und den daraus resultierenden Korrekturfaktor für die Berechnung der absoluten Hormonmenge jeder Probe zu bestimmen. Die Reaktionsgefäße wurden mit einem Deckel und zusätzlich mit Parafilm sorgfältig verschlossen. Nach einer zweiminütigen Homogenisierung auf dem Vortex folgte eine Inkubation bei 37° C über Nacht im Schüttelwasserbad.

3.1.6.2 Steroidextraktion aus den Urinproben

Die freigesetzten Steroidhormone wurden mit jeweils 5 ml Diethylether bei zehnminütigem Schütteln auf einem Multi Tube Vortex extrahiert. Auf eine gleichmäßig starke Trombe in allen Reaktionsgefäßen wurde geachtet, um eine starke Schwankung der Extraktionseffizienz zu vermeiden. Anschließend erfolgte das Ausfrieren der wäßrigen Phase mittels eines Methanol/Trockeneis-Gemisches. Die leichtere und zu diesem Zeitpunkt noch flüssige Etherfraktion, die auch das freie Hormon enthält, wurde in ein 15 ml Glasröhrchen dekantiert.

Daraufhin wurde die Etherfraktion, unter zwischenzeitlichem Wiederaufschütteln auf einem Vortex, bei 37° C auf einem Heizblock bei Stickstoffzufuhr vollständig eingedampft. Die eingedampften Extrakte wurden anschließend in 500 µl 70 %igem Ethanol aufgenommen und unter fünfminütigem Schütteln auf einem Multi Tube Vortex wieder gelöst. Die Glasröhrchen mit den in Ethanol aufgenommenen Extrakten wurden nun mit Deckel und Parafilm verschlossen und bis zur Analyse bei – 20° C gelagert. Um die kombinierte Hydrolyse- und Extraktionseffizienz zu ermitteln, wurden jeweils 50 µl der in Ethanol rekonstituierten Extrakte mit jeweils 3 ml Szintillationsflüssigkeit versetzt. Anschließend wurde die enthaltene Radioaktivität durch fünfminütiges Zählen in einem Szintillationszähler (Typ 1209 RackBeta, Firma Pharmacia/Wallac Oy) gemessen und daraus die Wiederfindungsrate berechnet.

3.1.6.3 Bestimmung der Creatininkonzentration im Urin

Um eine aussagekräftige Angabe über Hormonkonzentrationen im Urin machen zu können, muß man bedenken, daß die Konzentration des Urins von der Flüssigkeitsaufnahme und -abgabe sowie der Fütterung, Aktivität usw. des Individuums abhängig ist. Um die auftretenden starken Schwankungen dieser Variablen zu berücksichtigen, müssen die gemessenen Hormonwerte auf Substanzen mit einer konstanten Ausscheidungsrate, wie z.B.

Creatinin, bezogen werden.

Die Creatininkonzentrationen wurden mit Hilfe der Jaffé-Reaktion (TAUSKY 1954) photometrisch bestimmt. Bei dieser Reaktion entstehen aus dem Creatinin der Probe und der zugegebenen alkalischen Pikrat-Lösung (0,77 g Pikrinsäure in 45 ml H2O + 180 ml 0,12 mol/l NaOH) über das Creatininpikrat zwei Meisenheimer-Komplexe, die das Licht bei 484 bzw. 384 nm absorbieren. Die Geschwindigkeit dieser Reaktion, die direkt proportional

zum Creatiningehalt der Urinprobe ist, wird nach einer vorgegebenen Zeitspanne photometrisch erfaßt .

Hierzu wurde nach der Methode von BAHR et al. (2000) nach Auftauen und zweiminütigem Homogenisieren auf dem Vortex eine Verdünnung der nativen Urinproben von 1:10 mittels Aqua bidest. hergestellt. Nach der Herstellung einer achtstufigen Verdünnungsreihe (1:10 µg/50µl bis 1:0,078 µg/µl) des Creatinin Standards und dem Pipettieren von jeweils 150 µl H2O als blank und 50 µl H2O als Nullstandard zero wurden die Verdünnungsreihe, Qualitätskontrollen (jew. 50 µl hoch bzw. niedrig konzentrierte Creatinin-Lösungen) sowie die verdünnten Proben (jew. 50 µl) auf eine Mikrotiterplatte pipettiert. Anschließend wurden, mit Ausnahme des blank, jeweils 50 µl der alkalischen Pikratlösung in die gefüllten well der Mikrotiterplatte pipettiert. Die mit einer Cellophanfolie verschlossene Mikrotiterplatte wurde nun auf einen im Dunkeln stehenden Rüttler gleichmäßig bewegt. Die Messung der optischen Dichte erfolgte nach 15 Minuten mittels eines Photometers bei 490 nm (Referenzfilter:

630 nm). Die Auswertung erfolgte dann mit Hilfe eines in dem Photometer installierten automatischen Computerprogramms.

3.1.6.4 Gefriertrocknen und Pulverisieren von Kotproben

Alle Kotproben wurden zur Kompensation der unterschiedlichen Wassergehalte bei 20,3 mbar und – 20° C für drei bis fünf Tage gefriergetrocknet (Anlagentyp Alpha II-12, Firma Christ). Die trockenen Fäzes wurden anschließend homogenisiert. Dieses geschah, indem die Proben gemörsert und dabei größere unverdaute Fremdpartikel wie Obstkerne oder Pflanzenfasern, Steine und Plastikteilchen entfernt wurden. Das gewonnene Kotpulver wurde nun in das Plastikgefäß zurückgegeben und zur weiteren Lagerung bei – 20° C mit einem Deckel luftdicht verschlossen.

3.1.6.5 Steroidextraktion aus dem Kot

Nach SCHWARZENBERGER et al. (1996) liegen Steroide im Kot zu einem hohen Prozentsatz unkonjugiert vor, weshalb hier auf eine Hydrolyse verzichtet werden kann. Für die Extraktion wurden etwa 50 mg Kotpulver in ein 15 ml Plastikröhrchen eingewogen, wobei das exakte Gewicht jeder Probe vermerkt wurde. Jede Probe wurde mit 3 ml eines Methanol/Wasser-Gemisches (80:20) versetzt und für 15 Minuten auf dem Multi Tube Vortex

geschüttelt. Anschließend wurden die Extrakte für 10 Minuten bei 3000 U/min zentrifugiert (Typ Cryofuge 8000, Rotortyp Sepatech 6606). Der Überstand wurde in ein 15 ml Reagenzglas dekantiert, welches im Anschluß mit Deckel und Parafilm fest verschlossen und bei – 20° C bis zur weiteren Analyse gelagert wurde.

3.1.7 Hormonquantifizierung

In dieser Studie diente die Methode des kompetitiven Enzymimmunoassays (EIA) der Quantifizierung aller Hormontiter. Bei den hier verwendeten Testsystemen konkurriert das in der Probe enthaltene Hormon mit einem durch ein Enzym markierten exogenen Hormon um die hormonspezifischen Antikörper, welche über einen unspezifischen Antikörper gebunden sind und sich limitiert an der Oberfläche einer Mikrotiterplatte befinden. Als klassische Vertreter wurden hier im Probenmaterial enthaltenes Cortisol und Testosteron quantifiziert, welche als zuverlässige Indikatoren für die Nebennierenrindenfunktion bzw. die Hodenfunktion bei Säugetieren bzw. Primaten gelten (DORFMANN 1969; YAMAMOTO et al. 1978; HAGEY u. CZEKALA 2003).

3.1.7.1 Eingesetzte Immunreagenzien

Bezeichnung: Bezugsquelle:

• Testosteron Label: Dr. Dehnhard; IZW Berlin

Testosteron-3-(O-carboxymethyl)oxim-HRP

• 5α Androstanolon Label: Prof. Dr. Möstl, vet. med.

5α Androstan-17α ol-3one-CMO-Biotinamin Universität Wien

• Cortisol Label: Bioclin (Art.-Nr.:AB-1080)

Cortisol

• 5βAndrostandiol Label: Prof. Dr. Möstl, vet. med.

5β Androstan-3α,11β-diol-17on-HRP Universität Wien

• 11 – Keto – Tulln Label: Prof. Dr. Möstl, vet. med.

11-Ketoetiocholanolon-Tulln Universität Wien

• Testosteron Antikörper: Bioclin (Art.-Nr.: 1030) Immunglobulin G aus dem Kaninchen gegen

Testosteron-3-(O-carboxymethyl)oxim-BSA

Bezeichnung: Bezugsquelle:

• 5α Androstanolon Antikörper: BioGenes GmbH

Immunglobulin G aus dem Kaninchen gegen 5α Androstan-17α-ol-3-one-CMO-BSA

• Cortisol Antikörper: Bioclin (Art.-Nr.: 1002) Immunglobulin G aus dem Kaninchen gegen

Cortisol

• 5βAndrostandiol Antikörper: IZW, Berlin Immunglobulin G aus dem Schaf gegen

5β Androstan-3α,11β-diol-17-CMO-BSA

• 11 – Keto – Tulln Antikörper: Prof. Dr. Möstl, vet. med.

Immunglobulin G aus dem Kaninchen gegen Universität Wien

11-Ketoetiocholanolon-Tulln

• Beschichtungsantikörper:

Immunglobulin G aus dem Schaf gegen den Quartett (Nr. 090790150) Fc-Teil des Immunglobulin G aus Kaninchen

3.1.7.2 Präparation der Mikrotiterplatten

Für die Quantifizierung wurden zunächst die verwendeten Microtiterplatten (Typ immuno Maxisorp F96, Firma Nunc) mit Schaf – Immunglobulin G, welches gegen die Fc-Teile von Kaninchen – Immunglobulin G gerichtet ist, beschichtet. Für diesen Vorgang wurde jedes well mit 300 µl Beschichtungspuffer (1 µg Schaf – Immunglobulin G + 0,48 mg Na2CO3 + 0,88 mg NaHCO3 in H2O; pH: 9,6) gefüllt. Die Platten wurden daraufhin mit Cellophanfolie verschlossen und bei 4° C über Nacht inkubiert. Am nächsten Morgen wurde der Beschichtungspuffer dekantiert, die Platten auf Fliespapier trocken geklopft und anschließend jedes well mit 300 µl Absättigerlösung (2,42 g Tris + 23,3 g NaCl + 3 g BSA + 0,5 ml Tween 80 ad 1 l H2O; pH:7,5) wieder befüllt. Die Platten wurden wiederum mit Cellophanfolie verschlossen und bei 4° C über Nacht inkubiert. Nach dieser zweiten Inkubation wurden die Platten, nach Dekantieren der Absättigerlösung, erneut auf Fliespapier trocken geklopft und zur anschließenden Lagerung bei – 20° C mit Cellophanfolie verschlossen.

3.1.7.3 Verwendbarkeit der eingesetzten Assays

Im Rahmen dieser Arbeit wurden fünf verschiedene Assays auf ihre Verwendbarkeit bezüglich der qualitativen Erfassung von Metaboliten testiculären bzw. adrenocorticoiden Ursprungs getestet. Die spezifischen Eigenschaften und Bezeichnungen der entsprechenden Assays (Label, Antikörper, Sensitivität, linearer Bereich, Intra- und Inter-Assay-Varianz sowie Parallelität) sind soweit möglich unter 3.1.7.1 sowie in Tabelle 9 aufgeführt. Über Kreuzreaktionen geben für Cortisol und Testosteron die Tabellen 7 und 8 Aufschluß, Kreuzreaktionen von 5α Androstanolon, 5β Androstandiol und 11 Keto-Tulln sind im Anhang V aufgeführt. Für die eigentliche Probenanalyse wurde der Testosteronassay (für die Quantifizierung von immunreaktiven Androgenmetaboliten) und der Cortisolassay (für die Quantifizierung von immunreaktiven Glucocorticoidmetaboliten) verwendet.

3.1.7.4 Quantifizierung von immunoreaktivem Cortisol und Testosteron im Urin Zur Konzentrationsbestimmung von Cortisol im Urin wurden die Extrakte der Urinproben mit Assaypuffer (2,42 g Tris + 23,3 g NaCl + 1 g BSA + 0,5 ml Tween 80 ad 1 l H2O;

pH:7,5) bis zu 1:320 verdünnt und dann in das Testsystem eingesetzt. Zur Vorbereitung wurden alle Reagenzien und Materialien auf Raumtemperatur erwärmt und die 96 well Platte mit dem automatischen Wascher (AM 60 MRW, Firma Dynatech Laboratories) viermal mit einer Waschlösung (9,6 l H2O + 0,05 % Tween 20 + 400 ml PBS – Lösung: 0,136 mol NaCl + 8,1 mmol Na2HPO4 + 2,7 mmol KCl + 1,5 mmol KH2PO4 ad 2 l H2O; pH:7,2) gespült und danach auf Fliespapier trocken geklopft. Um die Steroidkonzentrationen aus den Extinktionen errechnen zu können, wurde aus einem Cortisol Standard eine neunstufige Verdünnungsreihe (500 pg/50 µl bis 1,9 pg/50 µl) mit Assaypuffer hergestellt. Nach der Füllung des blank mit 100 µl Assaypuffer und des zero mit 50 µl Assaypuffer wurde die Verdünnung für die Kalibrierkurve wie auch die Qualitätskontrollen (zweimal QC high: 20 pg Cortisol /50 µl Assaypuffer und QC low: 2 pg Cortisol/50 µl Assaypuffer) und schließlich die verdünnten Urinextrakte mit jeweils 50 µl als Doppelbestimmung auf die Platte pipettiert. Danach wurden zuerst jeweils 50 µl des Cortisol Labels (Verdünnung: 1:1·10⁶) und anschließend jeweils 50 µl eines Cortisol-Antikörpers (Verdünnung: 1:2000) auf die Platte pipettiert. Die Platte wurde erneut verschlossen und danach für 12 bis 16 h bei 4° C inkubiert. Nach dieser Inkubation wurde die Platte mit Hilfe des automatischen Waschers (siehe oben) gewaschen, anschließend

jedes well mit 150 µl Streptavidin-Peroxidase-Lösung (20 ng/150 µl) befüllt und mit Cellophanfolie verschlossen. Die verschlossene Platte wurde nun zu einer 30 Minuten langen Inkubation im Dunkeln bei Raumtemperatur auf einen Schüttler (MTS 4, Firma IKA-Labortechnik) gestellt. Nach der Inkubation wurde die Platte wiederum gewaschen und danach pro well mit 150 µl einer Zwei-Komponenten-Indikatorlösung (Lösung 1: 1,0 g Wasserstoffperoxid-Harnstoff + 18 g Na2HPO4 x H2O + 10,3 g Citronensäure x H2O ad 1 l H2O; Lösung 2: 0,5 g Tetramethylbenzidin + 40 ml DMSO + 960 ml H2O) befüllt. Nach Verschließen der Mikrotiterplatte und einer 30 bis 50minütigen Inkubation bei Raumtemperatur auf dem Schüttler im Dunkeln wurde die Farbreaktion durch Zugabe von 50 µl einer 2 mol/l H2SO4- Lösung pro well gestoppt. Die Extinktion wurde bei 450 nm (Referenzfilter: 630 nm) mittels eines Photometers (MRX Revelation Microplate Reader, Firma Dynatech Laboratories) gemessen. Ein integriertes Computerprogramm errechnete mit Hilfe der Standardkurve die jeweiligen Steroidhormonkonzentrationen (pg/50µl) aus den gemessenen Extinktionswerten.

Die Quantifizierung von Testosteronkonzentrationen im Urin erfolgte nach dem gleichen Prinzip. Allerdings konnte durch die direkte Koppelung von Peroxidase an Testosteron (Testosteron -3- (O-carboxymethyl) oxim-Peroxidase) auf den Schritt der Streptavidin-Peroxidase Zugabe und Inkubation verzichtet werden. Die hier verwendete Testosteron -3- (O-carboxymethyl) oxim-Peroxidase wurde mit Assaypuffer 1:30.000 verdünnt und der gegen Testosteron-3-(O-carboxymethly)oxim-BSA eingesetzte Antikörper wurde in einer Verdünnung von 1:2000 in den Assay eingesetzt. Die acht Verdünnungsstufen des Testosteronstandards für die Kalibrierkurve lagen zwischen 20 pg/50 µl und 0,15 pg/50 µl.

Die Extrakte der Urinproben wurden in einer Verdünnung von bis zu 1:320 eingesetzt. Die verwendeten Qualitätskontrollen hatten für den QC high eine Konzentration von 8 pg Testosteron/50 µl Assaypuffer und für den QC low von 0,31 pg Testosteron/50 µl Assaypuffer. Auch hier wurden die Steroidhormonkonzentrationen (pg/50 µl) aus den gemessenen Extinktionswerten durch ein an das Photometer angeschlossenes Computerprogramm errechnet.

3.1.7.5 Quantifizierung von immunoreaktivem Cortisol und Testosteron in Kot

Nach einer Verdünnung der Probenextrakte erfolgte die Quantifizierung von fäkalem Testosteron und Cortisol nach dem gleichen Prinzip der Bestimmung der Hormonkonzentrationen im Urin (siehe Kapitel 3.1.7.4). Zur Messung von Testosteron wurden die Extrakte 1:50 verdünnt. Die Verdünnung zur Messung von Cortisol betrug bis zu 1: 200.

3.1.8 Validierung

3.1.8.1 Validierung der verwendeten Testsysteme

Die Validierung bezieht sich auf die Reproduzierbarkeit, Genauigkeit und Spezifität bei den angewandten Assays. Die Datensätze waren zum Teil schon im Vorfeld bekannt oder wurden während der Versuchszeit erfaßt.

3.1.8.2 Kreuzreaktivität von Testosteron

Die Kreuzreaktivität gibt an, zu wieviel Prozent strukturverwandte Antigene das eigentliche Antigen von der N-terminalen Domäne am Fab-Fragment des Antikörpers verdrängen können, welches durch die Spezifität des Enzymimmunoassays zum Ausdruck kommt. Die hier angeführten Kreuzreaktionen (Tabelle 8) wurden von den Produktspezifikationen des Herstellers (Firma BIOCLIN) übernommen.

Tabelle 8: Kreuzreaktivitäten des gegen ein Testosteron 3-(O-carboxymethyl)oxim-BSA Konjugat gebildeten Antiserums.

Kreuzreaktion mit

Trivialname IUPAC Nomenklatur in Prozent (%)

Testosteron 4-Androsten-17β-ol-3-on 100

Epiandrosteron 5α-Androstan-3β-ol-17on 1,2 5α-Dihydrotestosteron 5α-Androstan-17β-ol-3on 16

Androstandion 5α-Androstan-3,17-dion 1,2

Androstendion 4-Androsten-3,17-dion 8,8

Dihydroepiandrosteron 5-Androsten-3β-ol-17-one 0,04 Cortisol 4-Pregnen-11β, 17, 21-triol-3, 20-dion < 0,01 Oestradiol-17β 1,3,5(10)-Estratrien-3,17β-diol < 0,2

3.1.8.3 Parallelität von Testosteron

Die Parallelität wurde bestimmt, um zu kontrollieren, ob interferierende Substanzen im Probenmaterial vorhanden sind und den Enzymimmunoassay stören (Matrixeffekte). Aus dem Probenmaterial wurde eine Verdünnungsreihe erstellt, um zu überprüfen, ob sie einen parallelen Verlauf zu der mitgeführten Standardkurve aufweist. Repräsentativ für das gesamte Untersuchungsmaterial wurde aus den Kotextrakten jeweils eine Probe von einem adoleszenten sowie zwei adulten männlichen Gorillas sowie von den Tieren zur Validierung jeweils eine Probe von zwei ein bis vierjährigen und einem weiblichen Gorilla ausgewählt.

Aus den Extrakten wurde eine fünfstufige Doppel-Verdünnungsreihe von 1:5 bis 1:80 hergestellt. Auch für die Urinproben wurden aus dem Probenmaterial Verdünnungsreihen erstellt, um den parallelen Verlauf zu der mitgeführten Standardkurve zu überprüfen.

Repräsentativ wurde jeweils ein Urinextrakt von fünf männlichen Gorillas sowie von zwei weiblichen und von zwei Tieren unter vier Jahren eingesetzt. Zur Bestimmung der Parallelität wurde hier, analog zur Bestimmung der Parallelität von Testosteron aus Kot, eine fünf- bzw.

sechsstufige Doppel-Verdünnungsreihe aus den Urinextrakten hergestellt, die zwischen 1:5 und 1:80 bzw. 1:40 und 1:1280 lag. Stark störende interferierende Substanzen im Probenmaterial, die den hier angewendeten Enzymimmunoassay beeinflussen, konnten ausgeschlossen werden.

3.1.8.4 Biologische Validierung, Nachweis für Testosteron

Die biologische Validierung dient als Kontrolle der Ergebnisse; mit ihrer Hilfe wird festgestellt, ob die Messung der Testosteronmetabolite tatsächlich die Gonadenfunktion widerspiegelt. Die Androgenkonzentrationen im Kot und Urin wurden zwischen drei Gruppen verglichen. Gruppe eins bestand aus adoleszenten und adulten männlichen Tieren, Gruppe zwei aus adulten weiblichen Tieren und Gruppe drei aus männlichen und weiblichen Jungtieren, deren Alter unter zwei Jahren lag. Die Proben der ersten Gruppe sollten erwartungsgemäß eine deutlich höhere Androgenkonzentration haben. Von jeder Gruppe wurden, soweit möglich, fünf Individuen ausgewählt, von denen jeweils fünf an unterschiedlichen Tagen gesammelte Proben analysiert wurden. Da es äußerst schwierig war, mehrere Urinproben von Tieren unter vier Jahren zu bekommen, wird die Gruppe „juvenile Gorillas/Urin" nur von zwei Tieren repräsentiert.

3.1.8.5 Kreuzreaktivität von Cortisol

Analog zur Kreuzreaktivität von Testosteron wurden hier die aus den Produktspezifikationen des Herstellers (Firma BIOCLIN) übernommenen Kreuzreaktionen für Cortisol (siehe Tabelle 9) dargestellt.

Tabelle 9: Kreuzreaktivitäten des gegen ein Cortisol Konjugat gebildeten Antiserums.

Kreuzreaktion mit

Trivialname IUPAC Nomenklatur in Prozent (%) Cortisol 4-Pregnen-11β, 17, 21-triol-3, 20-dion 100 11-Deoxycortisol 4-Pregnen-17, 21-diol-3, 20-dion 13,0 Cortisone 4-Pregnen-17, 21-diol-3, 11, 20-trion 8,4 17α-Hydroxyprogesterone 4-Pregnen-7α-ol-3, 20-dion 7,0 Corticosterone 4-Pregnen-11β, 21-diol-3, 20-dion 4,0

Progesterone 4-Pregnen-3, 20-dion 1,2

Deoxycorticosterone 4-Pregnen-21-ol-3, 20-dion 1,0

3.1.8.6 Parallelität von Cortisol

Analog zu 3.1.8.3 wurde die Parallelität von Cortisol bestimmt, um zu kontrollieren, ob der Enzymimmunoassay durch interferierende Substanzen im Probenmaterial gestört wird (Matrixeffekte). Aus dem Probenmaterial wurden Verdünnungsreihen erstellt, um den parallelen Verlauf zu der mitgeführten Standardkurve zu überprüfen. Repräsentativ wurden aus den Kotextrakten des zur Validierung zur Verfügung stehenden Tieres neun Proben ausgewählt. Es wurde eine dreistufige Doppel-Verdünnungsreihe hergestellt, die zwischen 1:5 und 1:500 lag. Auch von den Urinproben wurden Verdünnungsreihen erstellt, um den parallelen Verlauf zu der mitgeführten Standardkurve zu überprüfen. Repräsentativ wurde jeweils ein Urinextrakt von zwei adoleszenten sowie drei adulten männlichen Gorillas eingesetzt. Hier wurde eine fünfstufige Doppel-Verdünnungsreihe aus den Extrakten hergestellt, die zwischen 1:5 bis 1:80 lag. Die Steigungen zeigten einen parallelen Verlauf.

Auch hier können stark störende interferierende Substanzen im Probenmaterial, die den hier angewendeten Enzymimmunoassay beeinflussen, ausgeschlossen werden.

3.1.8.7 Biologische Validierung, Nachweis für Cortisol

Als Kontrolle der Ergebnisse wurde hier eine biologische Validierung durchgeführt, um feststellen zu können, ob die gemessenen Cortisolwerte (Glucocorticoide) tatsächlich die Funktion der Nebennierenrinde widerspiegeln. Es war aus tierschutzrechtlichen und ethischen Gründen nicht möglich, eine ACTH (adrenocorticotrophes Hormon)- Studie an einem oder mehreren Gorillas durchzuführen. Deshalb wurde ein Gorilla zur Validierung (Tabelle 3,

„Catou“) gewählt, für den eine tierärztliche Untersuchung angestrebt wurde. Da der Gorilla zu diesem Zweck mittels Blasrohr in eine Ketaminnarkose gelegt werden sollte, war davon auszugehen, daß dieser Eingriff eine sehr streßvolle Situation für den Gorilla darstellt und daß es infolgedessen zu einem starken Anstieg der nativen Glucocorticoidkonzentration kommen würde. Mehrere Tage vor und nach der Narkose von „Catou“ wurden Kot, und soweit möglich, Urinproben gesammelt, um den Anstieg und Abfall von Cortisol zu dokumentieren und so festzustellen, ob die Messung von Cortisol eine aussagekräftige Methode darstellt.

3.1.8.8 Reproduzierbarkeit

Um eine Aussage über die Reproduzierbarkeit der jeweiligen Hormonkonzentrationen machen zu können, wurde die Variabilität innerhalb der enzymimmunologischen Meßsysteme (Inter-Assay-Varianz) und die Variabilität innerhalb einer Mikrotiterplatte (Intra-Assay-Varianz) ermittelt. Die Inter-Assay-Varianz wurde ermittelt, indem bei jeder zur Hormonquantifizierung eingesetzten Mikrotiterplatte jeweils zwei voraliquotierte und bei - 20° C gelagerte Qualitätskontrollen (QC) mitgeführt wurden (siehe Kapitel 3.1.6.3 und 3.1.7.4). Die Konzentrationen dieser Qualitätskontrollen lagen etwa bei 70% (QC high) und bei 30% (QC low) der Bindung des entsprechenden „gelabelten“ Hormons. Um die Intra-Assay-Varianz zu bestimmen, wurde für jedes Testsystem eine Mikrotiterplatte mit Qualitätskontrollen anstelle des Probenmaterials bestückt und anschließend quantifiziert (siehe Kapitel 3.1.7.2). Aus den hier erhaltenen Datensätzen wurde der Variationskoeffizient (siehe Formel 1) ausgerechnet, mit dem sowohl Inter- also auch Intra-Assay-Varianz mittels einer Prozentzahl ausgedrückt werden können.

Formel 1: Berechnung des Variationskoeffizienten.

Variationskoeffizient in % (VK) =

Die Ergebnisse der Validierung sowie die gemessene Sensitivität, der lineare Bereich und die Parallelität der benutzen Enzymimmunoassays sind in Tabelle 10 zusammengefaßt.

Tabelle 10: Validierungsergebnisse der verwendeten Assays.

Testosteron

* eine Prozentangabe der Inter-Assay-Varianz ist hier aufgrund der niedrigen Anzahl an Mikrotiterplatten nicht möglich.

Im Dokument Aspekte des Verhaltens und der Physiologie männlicher Flachlandgorillas (Gorilla g. gorilla) in Familien- und Junggesellengruppen (Seite 39-50)