1 Klinik für Augenheilkunde, Universitätsklinikum des Saarlandes, UKS, Homburg/Saar, Deutschland 2 Experimentelle
Ophthalmologie, Universität des Saarlandes UKS, Homburg/Saar, Deutschland 3 Klinik für
Augenheilkunde, Semmelweis
Universität, Budapest, Ungarn
Abbildung 1
n Arginin Metabolismus in Keratozyten. Argina
se2, ein zytoplasmatisches Enzym katalysiert die Umwandlung von LArginin zu Harnstoff und LOrnithin. In weiteren enzymatischen Schritten wird Prolin mithilfe der Prolyl4Hydroxylase (P4H) zu Hydroxyprolin hydroxyliert. Stickstoff
monoxid (NO) ist das Produkt der enzymatischen Umwandlung von iNOS von LArginin.
1
Buch_096-517.indb 154 11.09.17 13:29
i n s i d e r m e d i z i n 155
Als kompetitives Enzym agiert die Stickstoff-monoxidsynthase (NOS = nitric oxide synthase), welche ebenfalls L-Arginine als Substrat nutzt und Stickstoffmonoxid (NO) synthetisiert. Ein funktio-nierendes Gleichgewicht zwischen den L-Arginin verbrauchenden Enzymen ist entscheidend für die Kollagensynthese (Abbildung 1) [12].
Um diesen Mechanismus bei Patienten mit Kera-tokonus zu analysieren, haben wir folgende Expe-rimente durchgeführt.
In einer initialen Studie haben wir das Kammer-wasser von 100 Patienten mit diagnostiziertem Keratokonus (KC) und 100 Patienten mit Katarakt als Kontrollgruppe untersucht. Hier konnten wir nachweisen, dass die Harnstoffkonzentration in der KC-Gruppe unabhängig von Alter und Ge-schlecht signifikant erniedrigt ist [13].
Diese Ergebnisse sind in Übereinstimmung mit der Studie von McKay, die ebenfalls erniedrigte Harn-stoffkonzentrationen im Speichel von Patienten mit KC nachweisen konnte [14]. Die Gruppe um Jäger et al. zeigte, dass erniedrigte Harnstoffkon-zentrationen in Tränenflüssigkeit beim trockenen Auge zu finden sind [15]. Bei etwa 20 % der Patienten mit Keratokonus kann auch ein trocke-nes Auge nachgewiesen werden [16].
In einer weiteren Studie untersuchten wir die Harnstoffkonzentrationen in Zelllysaten von KC-Keratozyten, und fanden auch dort erniedrigte Werte im Vergleich zu normalen Zellen (Abbil-dung 2). Die Tatsache, dass erniedrigte Harn-stoffkonzentrationen bei KC-Keratozyten in der Zellkultur nach einigen Passagen immer noch nachgewiesen werden können, obwohl das Milieu optimal auf die Bedürfnisse der Zellen ausgerich-tet ist, spricht für eine genetische Komponente der Krankheitsentstehung.
Neben den veränderten Harnstoffwerten konnten wir in weiteren Experimenten eine erniedrigte Arginase-Aktivität und erniedrigte Hydroxyprolin
Konzentrationen von KC-Keratozyten im Vergleich zu normalen Keratozyten nachweisen (Abbildun-gen 3 und 4) [17].
Aufgrund dieser Ergebnisse haben wir den Arginin Metabolismus der KC-Keratozyten näher unter-sucht. Die Hypothese war, dass durch einen gerin-geren Umsatz des Arginins durch Arginase weni-ger Harnstoff, damit möglicherweise weniweni-ger Ornithin, und weiter folgend weniger Prolin und Hydroxyprolin synthetisiert werden.
Die Stickstoffmonoxid-Synthase (NO-Synthase, NOS), als kompetitives Enzym zur Arginase sollte dann mehr Arginin zu Stickstoffmonoxid umwan-deln. Dies haben wir in unseren Experimenten ebenfalls nachgewiesen. Arginase liegt in 2 Iso-formen vor. Arginase 1 kommt hauptsächlich in Leberzellen vor, während Arginase 2 in vielen anderen Geweben zu finden ist. In Keratozyten konnten wir Arginase 2, jedoch nicht Arginase 1 nachweisen.
Abbildung 2
n Harnstoffkonzentration in Zelllysaten von KCKeratozyten und normalen Kontrollproben [16].
2
3
Abbildung 3
n ArginaseAktivität in Zelllysaten von KCKerato
zyten und normalen Kontrollproben [16].
Abbildung 4
n Hydroxyprolinkonzentration im Zellkulturüber
stand von KCKeratozyten und normalen Kontroll
proben [16].
4
Buch_096-517.indb 155 11.09.17 13:29
O p h t h a l m O l O g i e 156
Von der NO-Synthase liegen 3 Isoformen vor: die endotheliale NO-Synthase (eNOS), die neuronale NO-Synthse (nNOS) und die induzierbare NO- Synthase (iNOS). Während eNOS und nNOS konstitutiv exprimiert werden, wird iNOS durch inflammatorische Proteine und Lipopolysacchari-de induziert [18, 19]. In KC-Keratozyten konnten wir ausschließlich iNOS nachweisen.
Di e mR NA-Expression von Arginase 2 bei KC-Kera-tozyten zeigte keine messbaren Unterschiede in der qPCR, im Vergleich zu den Kontrollzellen (Ab-bildung 5). Die iNOS mRNA der KC-Keratozyten zeigte dahingegen eine 6-fach erhöhte Expres-sionsrate gegenüber der Kontrollgruppe (Abbil-dung 5) [20]. Auch die Konzentration an Nitrite (ein stabiles Abbauprodukt des Stickstoffmono-xids) war in den KC-Keratozyten signifikant erhöht (Abbildung 6) [20].
Dagegen ist Prolin4Hydroxylase (P4H), welche Prolinreste im Kollagenmolekül hydroxyliert, in den KC-Keratozyten signifikant erniedrigt, im Ver-gleich zu den Kontrollzellen (Abbildung 7) [20].
Das könnte mehrere Gründe haben. Zum einen liegen von der P4H mehrere Isoformen vor (Kolla
genP4H, HIFP4H und TransmembranP4H). Die KollagenP4H hydroxyliert die Prolinreste im Kol-lagenmolekül und ist damit maßgeblich an der Stabilität der Kollagenfibrillen beteiligt [11].
Der Hypoxie Induced Factor 1α (HIF-1α) dient als Substrat für die HIFP4H und die Transmembrane
P4H (TMP4H). Unter normalen Sauerstofflevels wird HIF-1α degradiert. HIF-1α wird durch eine Entzündungsreaktion (IL-6 und IFN-g) exprimiert.
Liegt eine Hypoxie vor, hydroxyliert die HIFP4H das HIF-1α Protein, welches sich mit dem HIF-1b bindet und aktiv als Transkriptionsfaktor die Transkription von z. B. iNOS startet [21].
Eine erhöhte Transkriptionsrate von iNOS lässt daher auch auf eine veränderte Sauerstoffregu-lation im kornealen Stroma schließen. Weitere Experimente sind erforderlich, um mehr über die Sauerstoffregulation der KC-Keratozyten zu lernen und damit mehr über die Entstehung der Erkran-kung. Diese Ergebnisse können ebenfalls in Rich-tung Beteiligung des oxidativen Stresses oder gar auf eine entzündliche Co-Genese des KC verwei-sen.
Die Entstehung des Keratokonus ist komplex.
Zusammengefasst zeigen unsere molekularbio-logischen und biochemischen Experimente Veränderungen im Arginin Metabolismus bei KC-Keratozyten. Um eine geeignete Therapie zu entwickeln müssen die genetischen und metabo-lischen Prozesse besser erforscht werden. Das Verständnis um die Pathogenese hat eine hohe klinische Relevanz.
5
7
6
Abbildung 5
n qPCR Experiment von KCKeratozyten und normalen Kontrollproben. KCKeratozyten zeigen im Vergleich zu Kontrollzellen eine 6fach höhere Expression der iNOSmRNA, während die Ex pres
sion der ArginasemRNA unverändert ist [19].
Abbildung 6
n NitritMessung nach Griess aus dem Zellkultur
überstand von KCKeratozyten und Kontrollpro
ben [19].
Abbildung 7
n Durchflusszytometrische Messung der Prolyl4Hydroxylase (P4H) [19].
Buch_096-517.indb 156 11.09.17 13:29
i n s i d e r m e d i z i n 157
l i t e r at u r
1. Rabinowitz Y. S. (1998) Keratoconus. Surv Ophthalmol 42: 297 – 319.
2. Kluhspies U., Grunder A., Goebels S., Schirra F., Seitz B.
(2013) Keratoconus lenses: the small correction miracle.
Ophthalmologe 110: 830 – 836, 838.
3. El-Husseiny M., Daas L., Langenbucher A., Seitz B. (2016) Intracorneal Ring Segments to treat keratectasia – inte-rim results and potential complications. Klin Monbl Augenheilkd 233: 722 – 726.
4. Seitz B., Cursiefen C., El-Husseiny M., Viestenz A., Langenbucher A., Szentmary N. (2013) DALK and penetrating laser keratoplasty for advanced kerato-conus. Ophthalmologe 110: 839157 – 848.
5. Nowak D. M., Gajecka M. (2011) The genetics of kera-toconus. Middle East Afr J Ophthalmol 18: 2 – 6.
6. Wojcik KA, Blasiak J, Szaflik J, Szaflik JP (2014) Role of biochemical factors in the pathogenesis of keratoconus.
Acta Biochim Pol 61: 55 – 62.
7. Abu-Amero K. K., Al-Muammar A. M., Kondkar A. A.
(2014) Genetics of keratoconus: where do we stand?
J Ophthalmol 2014: 641708.
8. Galvis V., Sherwin T., Tello A., Merayo J., Barrera R., Acera A. Keratoconus: an inflammatory disorder? Eye (Lond) 2015; 29: 843 – 59.
9. Karamichos D., Hutcheon A. E. K., Rich C. B., Trinkaus-Randall V., Asara J. M., Zieske J. D. (2014) In vitro model suggests oxidative stress involved in keratoconus disease. Sci Rep 4: 4608.
10. Wollensak G., Sporl E., Seiler T. (2003) Treatment of keratoconus by collagen cross linking. Ophthalmologe 100: 44 – 49.
11. Holmgren S. K., Taylor K. M., Bretscher L. E., Raines R. T.
(1998) Code for collagen’s stability deciphered. Nature 392: 666 – 667.
12. Morris, Sidney M. J (2007) Arginine metabolism: bound-aries of our knowledge. J Nutr 137: 1602S – 1609.
13. Stachon T., Stachon A., Hartmann U., Seitz B., Langen-bucher A., Szentmáry N. (2017) Urea, uric acid, prolactin and fT4 concentrations in aqueous humor of kerato-conus patients. Curr Eye Res 42: 842 – 846.
14. McKay T. B., Hjortdal J., Sejersen H., Asara J. M., Wu J., Karamichos D. (2016) Endocrine and metabolic pa-thways linked to keratoconus: implications for the role of hormones in the stromal microenvironment. Sci Rep 6:
25534.
15. Jager K., Kielstein H., Dunse M., Nass N., Paulsen F., Sel S. (2013) Enzymes of urea synthesis are expressed at the ocular surface, and decreased urea in the tear fluid is associated with dry-eye syndrome. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 251: 1995 – 2002.
16. Zemova E., Eppig T., Seitz B., Toropygin S., Arnold S., Langenbucher A., Gräber S., Szentmary N. (2014) Inter-action between topographic/tomographic parameters and dry eye disease in keratoconus patients. Curr Eye Res 39: 1 – 8.
17. Stachon T., Kolev K., Flasko Z., Seitz B., Langenbucher A., Szentmary N. (2017) Arginase activity, urea, and hydro-xyproline concentration are reduced in keratoconus keratocytes. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 255:
91 – 97.
18. Wong V., Lerner E. (2015) Nitric oxide inhibition strate-gies. Futur Sci 1: pii.FSO035.
19. Gould A., Naidoo C., Candy G. P. (2009) Arginine meta-bolism and wound healing. Wound Heal South Africa 1:
48 – 50.
20. Stachon T., Latta L., Langenbucher A., Seitz B., Szent-máry N. (2107) Arginase, P4H and iNOS expression and the effect of iNOS inhibitor 1400W on urea, hydroxypro-line and nitrite formation of keratoconus keratocytes.
Invest Ophthalmol Vis Sci 58: ARVO E-Abstract 3557.
21. Gorres K. L., Raines R. T. (2010) Prolyl 4-hydroxylase. Crit Rev Biochem Mol Biol 45: 106 – 124.
Tanja Stachon ist Master of Science und wis
senschaftliche Mitarbeiterin und leitet seit 2010 das biologische Labor der Klinik für Augenheilkunde in Homburg/ Saar. Sie stu
dierte Molecular Life Sciences an der Hooge
school Arnhem in Nijmegen. Sie arbeitet u. a.
an Forschungsprojekten über die Entstehung des Keratokonus.
PREISE UND AUSZEICHNUNGEN
Im Jahr 2012 ist Frau Stachon mit dem Poster
preis der DOG ausgezeichnet worden und er
hielt 2016 den 1. Vortragspreis der Tagung der RheinMainischen Augenärzte.
M. Sc. Tanja Stachon Klinik für Augenheilkunde und Hochschulambulanz
Universitätsklinikum des Saarlandes Kirrberger Straße 100
66424 Homburg/Saar Telefon: 06841 16-22325 Telefax: 06841 16-22400 E-Mail:
tanja.stachon@uniklinikum-saarland.de
K O n ta K t
Buch_096-517.indb 157 11.09.17 13:30