Ki-S2 ist ein monoklonaler Maus
tels Hybridom-Technik generiert wurde und in die Familie der Proliferationsmarker einzuordnen ist. Durch die Herstellung des Ki
unbekanntes nukleäres Protein mittels Western Blot zu
mit einem Molekulargewicht von ca. 100kDa wird von den Autoren in der Literatur aktuell als repp86 (restrictedly expressed proliferation
(Heidebrecht et al. 2003).
repp86 ist ein zellzyklusassoziiertes Protein, welches in der S Zellzyklus detektierbar ist. Das kodierende Gen
et al. 2003). Die Immunfluoreszenz körper Ki-S2 erkannte Antigen repp86
diffus im Nukleoplasma verteilt ist, wohingegen es und der Mitosespindel vorliegt
bungen mit Ki-S2 konnten zeigen, dass nach Beendigung der Zellteilung repp86 sofort abgebaut wird. Seine Halbwertszeit beträgt 1 Stunde. Somit zeigt sich, das
schließlich in proliferierenden Zellen exprimiert wird
Abbildung 5: Immunfluoreszenz-Färbung von repp86 mittels Ki zenzkonjugat) (Heidebrecht et al. 2003)
repp86 assoziiert in der Metaphase mit dem Spindelapparat (linke Graphik) Diffuse Verteilung von repp86 im Nukleus während der Interphase (rechte Graphik)
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Allgemeine Grundlagen
S2 ist ein monoklonaler Maus-Antikörper, welcher 1997 von Heidebrecht et al. mi Technik generiert wurde und in die Familie der Proliferationsmarker
Durch die Herstellung des Ki-S2 gelangte Heidebrecht et al. ein bisher unbekanntes nukleäres Protein mittels Western Blot zu detektieren. Dieses Kernprotein, mit einem Molekulargewicht von ca. 100kDa wird von den Autoren in der Literatur aktuell als repp86 (restrictedly expressed proliferation-associated protein) bezeichnet
repp86 ist ein zellzyklusassoziiertes Protein, welches in der S-, G2- und Zellzyklus detektierbar ist. Das kodierende Gen liegt auf Chromosom 20
. Die Immunfluoreszenz-Färbung (Abbildung 5) zeigt, dass das vom Ant S2 erkannte Antigen repp86 bei Interphase-Zellen in der S
verteilt ist, wohingegen es während der Mitose am Spindelp und der Mitosespindel vorliegt (Heidebrecht et al. 2003). Doppelimmunfluoreszenzfä
S2 konnten zeigen, dass nach Beendigung der Zellteilung repp86 sofort abgebaut wird. Seine Halbwertszeit beträgt 1 Stunde. Somit zeigt sich, das
ierenden Zellen exprimiert wird (Heidebrecht et al. 1997)
Färbung von repp86 mittels Ki-S2-Antikörper und Sekundärantikörper (Fluore (Heidebrecht et al. 2003)
repp86 assoziiert in der Metaphase mit dem Spindelapparat (linke Graphik) Verteilung von repp86 im Nukleus während der Interphase (rechte Graphik)
r 1997 von Heidebrecht et al. mit-Technik generiert wurde und in die Familie der Proliferationsmarker
Heidebrecht et al. ein bisher detektieren. Dieses Kernprotein, mit einem Molekulargewicht von ca. 100kDa wird von den Autoren in der Literatur associated protein) bezeichnet
und M-Phase des auf Chromosom 20 (Heidebrecht , dass das vom Anti-Zellen in der S- und G2-Phase während der Mitose am Spindelpol . Doppelimmunfluoreszenzfär-S2 konnten zeigen, dass nach Beendigung der Zellteilung repp86 sofort abgebaut wird. Seine Halbwertszeit beträgt 1 Stunde. Somit zeigt sich, dass repp86
aus-al. 1997).
Antikörper und Sekundärantikörper
(Fluores-34
2.1.2.2 Expression im gesunden Gewebe und im Tumorgewebe
Ki-S2 konnte in gesunden Geweben mit proliferativer Aktivität nachgewiesen werden.
Im Knochenmark waren proliferierende Zellen, wie Promyelozyten, Myelozyten, Proe-rythroblasten und EProe-rythroblasten (E1 und E2) positiv, wohingegen reife Granulozyten keine Reaktion zeigten. In Lymphfollikeln konnten in der dunklen Zone des Keimzent-rums eine erhöhte Reaktion verzeichnet werden. Im Hodengewebe zeigten Spermatogo-nien eine ausgeprägte Reaktion, wohingegen ausgereifte Spermien negativ waren (Hei-debrecht et al. 1997). Ki-S2 konnte ebenfalls in gesunder Mundschleimhaut detektiert werden (Fenner et al. 2005).
In zahlreichen Neoplasien konnte eine Ki-S2-Immunreaktion festgestellt werden, unter anderem im Burkitt-Lymphom, malignem Melanom, Mammakarzinom und Plattenepi-thelkarzinom der Mundhöhle (Fenner et al. 2005, Heidebrecht et al. 1997; Rudolph et al. 1999).
2.1.2.3 Bedeutung in der Onkologie
In zahlreichen retro- und prospektiven Studien konnte der Proliferationsmarker Ki-S2 (repp86) als prognoserelevanter Indikator (Rezidivrisiko, Überlebensrate) identifiziert werden. Die Proliferationsaktivität der Tumorzellen konnte beim Brustkrebs, Larynx-karzinom, Neuroblastom und Mantelzell-Lymphom in direkten Zusammenhang mit der Prognose und Überlebensrate gestellt werden (Cordes et al. 2010; Krams et al. 2003;
Rudolph et al. 1999; Schrader et al. 2005).
Rudolph et al. konnten in einer Langzeitstudie mit 371 schwedischen Frauen, welche an Brustkrebs erkrankt sind, die prognostische Relevanz von Ki-S2 zeigen. Dazu wurde ein Ki-S2-Markierungsindex (Anteil der Ki-S2 -gefärbten Tumorzellkerne) ermittelt. Bei Patientinnen mit einem Ki-S2 Index von <10% wurde keine statistisch signifikante Ver-ringerung der Überlebenswahrscheinlichkeit im Vergleich zu gesunden Frauen festge-stellt. Patientinnen mit einem hohen Ki-S2 Index hatten hingegen ein 20-fach erhöhtes Mortalitätsrisiko (Rudolph et al. 1999).
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Bei Neuroblastom-Patienten konnte ein RI (repp86-Index) von >10% in direkter Korre-lation mit kürzerem krankheitsfreiem Intervall und höherer Mortalität gesetzt werden (Krams et al. 2003).
Auch Cordes et al. kamen bei Larynxkarzinomen zu einem ähnlichen Ergebnis. Patien-ten mit einer niedrigen Proliferationsaktivität hatPatien-ten eine 5-Jahres-Überlebensrate von 95%, während Patienten mit hoher Proliferationsaktivität nur eine 5-Jahres-Überlebensrate von 23% hatten. Für die Studie wurde ein Ki-S2-Proliferationsindex (prozentualer Anteil der Ki-S2-gefärbten Tumorzellkerne in Bezug auf alle gezählten Tumorzellkerne) ermittelt. Eine hohe Proliferationsaktivität des Tumors wurde definiert als Ki-S2-Index >25% eine niedrige Proliferationsaktivität als Ki-S2-Index <25%.
Des Weiteren verglich die Forschergruppe die Proliferationsaktivität der Tumorzelle mit klinisch-pathologischen Parametern (Überleben, TNM-Klassifikation, Grading). So konnte gezeigt werden, dass Patienten mit einem N0-Stadium eine niedrigere Prolifera-tionsaktivität hatten als Patienten mit N1-Klassifikation. Gleiches konnte bei Patienten mit beziehungsweise ohne Fernmetastasen (M1 vs. M0) festgestellt werden. Die Korre-lation zwischen Proliferationsaktivität und Grading war signifikant. Je höher die Prolife-rationsaktivität desto geringer war der Differenzierungsgrad des Tumors (9,33% für G1, 23,91% für G2, 40,2% für G3, p=0,001; Cordes et al. 2010).
Durch die Messung eines Ki-S2-Index könnte die Therapie individueller auf den Patien-ten angepasst werden, um eine eventuell unnötige Chemotherapie zu ersparen, wenn diese keinen therapeutischen Nutzen hat (Rudolph et al. 1999).
2.1.3 PTEN
2.1.3.1 Molekularer Aufbau
PTEN ist ein Tumorsuppressorgen, welches dual als Lipid agieren kann (Planchon et al. 2008)
10q23 lokalisiert. Strukturell ist PTEN aus einer N (AS 1-185) und einer C-terminalen Domäne (AS 186
samt aus 403 Aminosäuren. Beide Domänen werden für enzymatische Aktivität benötigt (Planchon et al. 2008). Die C
dert: eine lipidbindende C2 PTEN Stabilität) und eine PDZ
Domäne, reduziert sich die Inhibitionsfähigkeit von PTEN bildung 6 zeigt einen schematischen Aufbau von PTEN.
Abbildung 6: Struktureller Aufbau von PTEN Die PEST-Domänen befinden sich zwischen der C2 (in dieser Grafik nicht dargestellt)
2.1.3.2 Funktion
Die Funktion von PTEN ist sowohl abhängig von seiner Lokalisation im Gewebe als auch von der Interaktionsfähigkeit als Lipid
im Zellkern, im Zytoplasma als auch an der Zellmembran lokalisiert. Als Lipid phosphatase nimmt es eine Schlüsselfunktion im PI3/Akt
Dowens. 2004). Als Protein Zellinteraktion (Wechselwirkung)
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Molekularer Aufbau
PTEN ist ein Tumorsuppressorgen, welches dual als Lipid- oder Protein
(Planchon et al. 2008). Das kodierende Gen für PTEN ist auf Chromosom 10q23 lokalisiert. Strukturell ist PTEN aus einer N-terminalen Phosphatase Domäne
terminalen Domäne (AS 186-403) aufgebaut und besteht insg samt aus 403 Aminosäuren. Beide Domänen werden für enzymatische Aktivität benötigt
. Die C-terminale Domäne wird in vier Subdomänen untergli dbindende C2-Domäne, zwei PEST-Domänen (verantwor
PTEN Stabilität) und eine PDZ-Domäne (PDZ = Proteindomäne).
Domäne, reduziert sich die Inhibitionsfähigkeit von PTEN (Waite and Eng. 2002) zeigt einen schematischen Aufbau von PTEN.
Struktureller Aufbau von PTEN (Leslie and Dowens. 2004)
Domänen befinden sich zwischen der C2- und PDZ-Domäne in den Abschnitten 350
Die Funktion von PTEN ist sowohl abhängig von seiner Lokalisation im Gewebe als Interaktionsfähigkeit als Lipid- oder Proteinphosphatase. PTEN ist sowohl im Zellkern, im Zytoplasma als auch an der Zellmembran lokalisiert. Als Lipid phosphatase nimmt es eine Schlüsselfunktion im PI3/Akt-Signalweg ein
Als Protein-Phosphatase spielt es eine Rolle bei der Regulation der aktion (Wechselwirkung) (Planchon et al. 2008; Waite and Eng. 2002)
oder Protein-Phosphatase . Das kodierende Gen für PTEN ist auf Chromosom phatase Domäne 403) aufgebaut und besteht insge-samt aus 403 Aminosäuren. Beide Domänen werden für enzymatische Aktivität benötigt
terminale Domäne wird in vier Subdomänen unterglie-Domänen (verantwortlich für die
Fehlt die PDZ-(Waite and Eng. 2002).
Ab-Domäne in den Abschnitten 350-375 und 379-396
Die Funktion von PTEN ist sowohl abhängig von seiner Lokalisation im Gewebe als oder Proteinphosphatase. PTEN ist sowohl im Zellkern, im Zytoplasma als auch an der Zellmembran lokalisiert. Als
Lipid-Signalweg ein (Leslie and bei der Regulation der (Planchon et al. 2008; Waite and Eng. 2002).
37 Nukleäres und zytoplasmatisches PTEN
Nukleäres PTEN spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Chromoso-menstabilität und -integrität sowie bei der Regulation der DNA-Reparatur. Es wird auch als ‚Hüter der Genomintegrität‘ bezeichnet (Shen et al. 2007). Im Zytoplasma wirkt PTEN als Antagonist auf die PI3/Akt-Signaltransduktion. Dieser Signalweg koordiniert und leitet zahlreiche Zellprozesse wie Proliferation, Apoptose, Überleben und Wachs-tum der Zelle ein (Carnero et al. 2008; Leslie and Dowens. 2004) (siehe auch Kapitel 2.1.7.2 Abbildung 14). Ein Verlust der PTEN Expression bewirkt eine Steigerung der PI3/Akt Signaltransduktion, was mit gesteigertem Zellüberleben, Zellproliferation und Angiogenese einhergeht (Rahmani et al. 2012; Squarize et al. 2013).
2.1.3.3 Expression im gesunden Gewebe und im Tumorgewebe
Nukleäres PTEN konnte in zahlreichen gesunden Geweben nachgewiesen werden, unter anderem in Follikelzellen der Schilddrüse (Gimm et al. 2000), Myoepithelzellen der Brustdrüse (Perren et al. 1999) und Langerhanssche Inseln des Pankreas (Perren et al.
2000). Auch während der Embryogenese wird PTEN in zahlreichen Geweben expri-miert (u.a. zentrales und peripheres Nervensystem, Thymus, autonomes Nervensystem des Gastrointestinaltrakts, Ösophagusepithel und Leber) (Gimm. 2000).
In zahlreichen humanen Tumorentitäten konnte ein Verlust der PTEN Aktivität, bedingt durch genetische Mutationen am PTEN-Gen, nachgewiesen werden, unter anderen beim Mamakarzinom, Prostatakarzinom, malignen Melanom, Lungenkarzinom, Blasenkarzi-nom und PlattenepithelkarziBlasenkarzi-nom des Kopf-Hals Bereichs (Alyasiri et al. 2013; Cairns et al. 1998; Celebi et al. 2000; Okami et al. 1998; Soria et al. 2002; Tokunaga et al. 2007;
Wang et al. 1998).
Einen immunhistochemischen Vergleich von PTEN im gesundem und im Tumorgewebe zeigt Abbildung 7 (Kurasawa et al. 2008).
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Abbildung 7: Immunhistochemischer Vergleich von PTEN im gesunden Gewebe versus orales Plattenepithelkar-zinom Gewebe (Kurasawa et al. 2008)
Links: Ausgeprägte PTEN Expression im gesunden Gewebe (IHC Score= 180)
Rechts: Schwach ausgeprägte immunhistochemische Reaktion von PTEN im Tumorgewebe (ICH Score = 15)
2.1.3.4 Bedeutung in der Onkologie
Studien am oralen Plattenepithelkarzinom konnten belegen, dass eine fehlende PTEN-Expression mit einer reduzierten Gesamt- beziehungsweise ereignisfreien Überlebensra-te, einem fortgeschrittenem Tumorstadium und Lymphknotenmetastasen korreliert (Lee et al. 2001; Rahmani et al. 2012; Snietura et al. 2012; Squarize et al. 2013). Weitere Studien an anderen Tumorentitäten (z. Bsp. Ovarialkarzinom, Magenkarzinom, Endo-metriumkarzinom) konnten einen Zusammenhang zwischen einer Down-Regulation der PTEN-Expression und einer Chemotherapie-Resistenz belegen (Oki et al. 2005; Kana-mori et al. 2002; Ying et al. 2015).
39
2.1.4 p53
2.1.4.1 Molekularer Aufbau
p53 ist ein Tumorsuppressorprotein, welches mit einer Größe von 53kDa aus 393 Ami-nosäuren besteht. Das kodierende p53-Gen ist auf dem kurzen Arm von Chromosom 17 lokalisiert (Bai and Zhu. 2006). In seiner aktiven Form liegt p53 als Homotetramer vor, welches aus vier identischen Aminosäure-Ketten (4 x 393 AS) besteht (Joerger and Fersht. 2010). Abbildung 8 zeigt den schematischen Aufbau von p53 mit seinen vier funktionellen Domänen: die N-terminale Transaktivierungsdomäne, die zentrale DNA-Bindungsdomäne, die Tetramerisationsdomäne und die C-terminale Regulator-Domäne (Carboxylende). Die Transaktivierungsdomäne ist für die Transkription verantwortlich und interagiert mit verschiedenen Transkriptionsfaktoren. Das Carboxylende ist für die Regulation der DNA-Bindung verantwortlich (Bai and Zhu. 2006; Kim et al. 2012).
Abbildung 8: Schematische Darstellung von p53 (Bai and Zhu. 2006)
2.1.4.2 Funktion
Als Tumorsuppressor hat p53 die zentrale Aufgabe, die Genomintegrität der Zelle auf-recht zu erhalten und diese vor unkontrollierter Zellproliferation zu schützen. p53 wird deshalb auch als ‚Wächter des Genoms‘ (guardian of the genome) beziehungsweise als
‚zellulärer Torwächter‘ (‚cellular gatekeeper‘) bezeichnet. Die Aktivierung von p53 er-folgt durch ein breites Spektrum von zellulären Stressfaktoren (u.a. DNA-Schäden, Hit-zeschock, Hypoxie, Expression von Onkogenen, UV-Strahlung, Gammastrahlung, Chemotherapeutika). Als aktivierter Transkriptionsfaktor reguliert p53 die Transkription von verschiedenen Genen und fungiert als zentraler Knotenpunkt, welcher in der Zelle
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organisiert, ob die Zelle auf einen bestimmten Stressfaktor mit Apoptose oder Zellzyk-lusarrest reagiert. (Bai and Zhu. 2006; Brooks and Gu. 2003; Kruse and Gu. 2009; Lev-ine et al. 2006).
Bei schweren, unwiderruflichen Schäden am Genom, kann p53 durch Transkription von Apoptose-Faktoren, den Tod der Zelle einleiten. Durch diese Fähigkeit schützt p53 die Zelle vor maligner Transformation (Bai and Zhu. 2006). Desweiteren kann p53 das Ar-retieren des Zellzyklus in der G1-, G2- und S-Phase induzieren, damit genomische Schäden (DNA-Schäden) repariert werden, bevor die Zelle in die kritische Phase der DNA-Synthese und Mitose eintritt. Dadurch gewährleistet p53, dass keine fehlerhaften Zellinformationen an die Tochtergeneration übertragen werden. (Bai and Zhu. 2006).
p53 werden zwei weitere wichtige Rollen bei der Regulierung der DNA-Reparatur zu-geteilt, zum einen beinhaltet das die Nukleotidexzisionsreparatur (NER) zum anderen die Basenexzisionsreparatur (BER) (Offer et al. 2001). p53 ist in der Lage die Bildung von DNA damage-binding-proteins (DDBs) zu veranlassen. Diese können geschädigte DNA erkennen und an sie binden. Dadurch wird die komplexe NER-Signalkaskade ein-geleitet, welche, vereinfacht gesagt, die geschädigte Nukleotid-Sequenz aus dem Gefü-ge herausschneidet, die Neusynthese von DNA am Ort des Defekts veranlasst und den reparierten DNA-Strang wieder schließt (Murken et al. 2006). Bei der BER werden feh-lerhafte, geschädigte Basen aus dem DNA-Gefüge herausgeschnitten und durch intakte Nukleotide ersetzt (Horn. 2012).
Einen Gesamtüberblick über funktionelle Interaktionen von p53 auf wichtige Zellzyk-lusprozesse stellt die nachfolgende Grafik (Abbildung 9) nochmal dar.
Abbildung 9: Vereinfachte Darstellung der regulatorischen Funktion von p53