Aus dem Fachbereich Medizin der Johann Wolfgang Goethe-Universität
Frankfurt am Main
betreut am Zentrum der Chirurgie
Klinik für Mund-, Kiefer- und Plastische Gesichtschirurgie Direktor: Prof. Dr. Dr. Dr. Robert Sader
Markerprofil bei Patienten mit Plattenepithelkarzinomen der Mundhöhle und des anterioren Oropharynx nach intraarterieller
Induktionschemotherapie
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Zahnmedizin des Fachbereichs Medizin
der Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am Main
vorgelegt von
Alexandra Strominski aus Langen (Hessen)
Frankfurt am Main, 2017
2 Dekan: Prof. Dr. Josef M. Pfeilschifter Referent: Prof. Dr. Dr. Dr. Adorján F. Kovács Korreferent: Prof. Dr. Claus Michael Rödel Tag der mündlichen Prüfung: 16.08.2018
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Für meine Tochter Emily
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1 Einleitung _______________________________________________________ 13 1.1 Erörterung der Grundproblematik _____________________________________ 13 1.1.1 Epidemiologie und Ätiologie _____________________________________ 14 1.1.2 Topografische Einteilung, Symptome und Diagnostik __________________ 15 1.1.3 TNM-Klassifikation, Tumorstadium und Grading _____________________ 17 1.1.4 ECOG-Leistungsindex __________________________________________ 19 1.1.5 Therapie ______________________________________________________ 20 1.1.5.1 Chirurgie __________________________________________________ 20 1.1.5.2 Radiotherapie _______________________________________________ 21 1.1.5.3 Chemotherapie ______________________________________________ 22 1.1.5.3.1 Systemische Induktionschemotherapie (ICT) ______________________ 23 1.1.5.3.2 Intraarterielle Induktionschemotherapie (IA) ______________________ 24 1.1.6 Prognose _____________________________________________________ 27
2 Biomarker ______________________________________________________ 28 2.1.1 Survivin ______________________________________________________ 30 2.1.1.1 Molekularer Aufbau __________________________________________ 30 2.1.1.2 Funktion ___________________________________________________ 30 2.1.1.3 Expression im gesunden Gewebe und im Tumorgewebe _____________ 31 2.1.1.4 Bedeutung in der Onkologie ___________________________________ 32 2.1.2 Ki-S2 ________________________________________________________ 33 2.1.2.1 Allgemeine Grundlagen _______________________________________ 33 2.1.2.2 Expression im gesunden Gewebe und im Tumorgewebe _____________ 34 2.1.2.3 Bedeutung in der Onkologie ___________________________________ 34 2.1.3 PTEN ________________________________________________________ 36 2.1.3.1 Molekularer Aufbau __________________________________________ 36 2.1.3.2 Funktion ___________________________________________________ 36 2.1.3.3 Expression im gesunden Gewebe und im Tumorgewebe _____________ 37 2.1.3.4 Bedeutung in der Onkologie ___________________________________ 38
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2.1.4 p53 __________________________________________________________ 39 2.1.4.1 Molekularer Aufbau __________________________________________ 39 2.1.4.2 Funktion ___________________________________________________ 39 2.1.4.3 Expression im gesunden Gewebe und im Tumorgewebe _____________ 41 2.1.4.4 Bedeutung in der Onkologie ___________________________________ 42 2.1.5 Periostin (Syn. OSF-2) __________________________________________ 44 2.1.5.1 Molekularer Aufbau __________________________________________ 44 2.1.5.2 Funktion ___________________________________________________ 44 2.1.5.3 Expression im gesunden Gewebe und im Tumorgewebe _____________ 45 2.1.5.4 Bedeutung in der Onkologie ___________________________________ 46 2.1.6 EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) __________________________ 47 2.1.6.1 Molekularer Aufbau __________________________________________ 47 2.1.6.2 Funktion ___________________________________________________ 48 2.1.6.3 Expression im gesunden Gewebe und im Tumorgewebe _____________ 48 2.1.6.4 Bedeutung in der Onkologie ___________________________________ 49 2.1.7 Her2/neu _____________________________________________________ 50 2.1.7.1 Molekularer Aufbau __________________________________________ 50 2.1.7.2 Funktion ___________________________________________________ 51 2.1.7.3 Expression im gesunden Gewebe und im Tumorgewebe _____________ 52 2.1.7.4 Bedeutung in der Onkologie ___________________________________ 52
3 Fragestellung ____________________________________________________ 53
4 Material und Methode ____________________________________________ 55 4.1 Datenerfassung und Einschlusskriterien für die Studie ____________________ 55 4.2 Patientenkollektiv _________________________________________________ 56 4.2.1 Demographie und Tumordaten ____________________________________ 56 4.2.2 Therapie ______________________________________________________ 57 4.2.3 Remissionsverteilung nach IA Induktionschemotherapie und chirurgischer
Intervention ___________________________________________________ 59 4.3 Untersuchungsmaterial _____________________________________________ 63
6
4.3.1 Herstellung von Tissue Microarrays ________________________________ 63 4.3.2 Immunhistochemische Färbung von Biomarkern allgemein ______________ 65 4.3.2.1 Durchführung der Immunhistochemie am Beispiel Survivin __________ 66 4.3.2.2 Durchführung der Immunhistochemie am Beispiel Ki-S2 ____________ 67 4.3.3 Semiquantitative Auswertung der immunhistochemischen Färbungen _____ 68 4.3.3.1 Survivin ___________________________________________________ 68 4.3.3.2 Ki-S2 _____________________________________________________ 69 4.3.3.3 Her2/neu __________________________________________________ 69 4.3.3.4 EGFR _____________________________________________________ 70 4.3.3.5 p53, OSF-2 (Periostin), PTEN __________________________________ 70 4.4 Statistik _________________________________________________________ 71 4.4.1 Datenverarbeitung ______________________________________________ 71 4.4.2 Datengrundlage ________________________________________________ 71 4.4.3 Angewandte statistische Rechenverfahren ___________________________ 72 4.4.4 Verwendete grafische Darstellungen ________________________________ 73 4.4.4.1 Boxplot ___________________________________________________ 73 4.4.4.2 Histogramm ________________________________________________ 74 4.4.4.3 Heatmap (Wärmekarte) _______________________________________ 74
5 Ergebnisse ______________________________________________________ 77 5.1 Vergleich diagnostische Primärtumorbiopsie versus OP-Präparat des
Primärtumors nach IA Induktionschemotherapie _________________________ 78 5.1.1 Diagnostische Primärtumorbiopsie versus OP-Präparat des Primärtumors als
Heatmap ______________________________________________________ 86 5.2 Vergleich histopathologische Response versus Non-Response ______________ 89
6 Diskussion ______________________________________________________ 91 6.1 Markerprofil bei neoadjuvanter systemischer Chemotherapie (NSC) _________ 92 6.2 Markerprofil bei neoadjuvanter intraarterieller Chemotherapie (NIC) _________ 96 6.2.1 Effektivität einer neoadjuvanten intraarteriellen Chemotherapie __________ 96 6.2.2 Vergleichsstudien zur aktuellen Fragestellung ________________________ 99
7
6.2.3 Tabellarische Übersicht aller Vergleichsstudien ______________________ 102 6.3 Einordnung der eigenen Ergebnisse __________________________________ 104 6.3.1 Biomarker-Verteilung vor und nach Induktion _______________________ 105 6.3.1.1 Survivin __________________________________________________ 105 6.3.1.2 Ki-S2 ____________________________________________________ 107 6.3.1.3 PTEN ____________________________________________________ 109 6.3.1.4 p53110
6.3.1.5 OSF-2, Periostin ___________________________________________ 112 6.3.1.6 EGFR ____________________________________________________ 113 6.3.1.7 Her2/neu _________________________________________________ 114 6.3.2 Markerprofil in der Vergleichsgruppe Responder versus Non-Responder __ 116 6.3.2.1 Survivin __________________________________________________ 117 6.3.2.2 Ki-S2 ____________________________________________________ 118 6.3.2.3 PTEN ____________________________________________________ 119 6.3.2.4 p53119
6.3.2.5 OSF-2 / Periostin ___________________________________________ 121 6.3.2.6 EGFR ____________________________________________________ 121 6.3.2.7 Her2/neu _________________________________________________ 123 6.4 Methodische Kritik _______________________________________________ 126 6.5 Schlussfolgerung _________________________________________________ 127
7 Zusammenfassung _______________________________________________ 129
8 Summary ______________________________________________________ 131
9 Literatur _______________________________________________________ 133
10 Anhang ________________________________________________________ 161 10.1 Abbildungsverzeichnis ____________________________________________ 162 10.2 Tabellenverzeichnis_______________________________________________ 165
8
10.3 Datentabelle_____________________________________________________ 167
11 Danksagung ____________________________________________________ 171
Lebenslauf __________________________________________________________ 172
Schriftliche Erklärung ________________________________________________ 173
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Abkürzungsverzeichnis
Abkürzung Erläuterung293T-Zellen HEK, Human Embryonic Kidney-cells, menschliche embryonale Nierenzellen
A. Arteria
Akt Serin/Threonin-Kinase Akt/PKB Proteinkinase B
AS Aminosäure
BER Basen-Exzisionsreparatur
BiAS Biometrische Analyse von Stichproben BIR Baculovirus IAP Repeat
CPC Chromosomaler Passenger Komplex CR complete remission, komplette Remission Crm1 Chromosomal maintenance 1
CT Computertomogramm
cTNM klinisch festgestellte(s) Vorhandensein/Fehlen/Ausdehnung des Primärtumors, der regionären Lymphknotenmetastasen und Fernme- tastasen
DDB DNA damage-binding-proteins, DNA-Schaden-Bindungs-Proteine DFS Disease free survival, krankheitsfreies Überleben
DNA DNS (Desoxyribonukleinsäure )
DÖSAK Deutsch-Österreichisch-Schweizerischer Arbeitskreis für Tumoren im Kiefer und Gesichtsbereich
ECOG-Index Eastern Cooperative Oncology Group-Index EGFR Epidermal growth factor receptor,
epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor END Elektive Neck-Dissection
ErbB Erythroblastic Leukemia viral oncogene homolog ERND Erweiterte radikale Neck-Dissection
Gy Gray (Energiedosis, 1 Gray entspricht 1 Joule/Kilogramm)
HE Hämatoxylin-Eosin
Her1 human epidermal growth factor receptor 1, menschlicher epiderma- ler Wachstumsfaktorrezeptor 1
Her2/neu human epidermal growth factor receptor 2,menschlicher epiderma- ler Wachstumsfaktorrezeptor 2
Her3 human epidermal growth factor receptor 3,menschlicher epiderma- ler Wachstumsfaktorrezeptor 3
Her4 human epidermal growth factor receptor 4, menschlicher epiderma- ler Wachstumsfaktorrezeptor 4
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IA Intraarterielle Induktionschemotherapie IAP Inhibitor of apoptosis
IARC International Agency for Research on Cancer ICT Induktionschemotherapie
IHC Immunhistochemie
IMRT intensitätsmodulierte Radiotherapie
IRS Immunreaktiver Score
kDa Kilodalton
M. Musculus
m² Quadratmeter
MAPK Mitogen activated protein kinase
mg Milligramm
min Minute
ml Milliliter
mm Millimeter
mM Millimolar
MRND Modifiziert radikale Neck-Dissection
MRT Magnetresonanztomogramm
N. Nervus
NER Nukleotid-Exzisionsreparatur
NSC Neoadjuvante systemische Chemotherapie
OP Operation
OS Overall survival, Gesamtüberleben OSF-2 Osteoblast-specific-factor-2
PD progressive disease, Progression der Erkrankung
PDZ Proteindomäne welche von den Proteinen PSD-95/SAP90, Dlg und ZO-1 abgeleitet wird
PEST reich an Prolin, Glutaminsäure (E), Serin und Threonin PET Positronen-Emissions-Tomographie
PF Kombination aus Cisplatin und 5-Fluorouracil
pH pondus Hydrogenii, negativ dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration in wässriger Lösung PI3K/Akt Phosphatidylinosit-3-Kinase
PR partial remission, partielle Remission
PTEN Phosphatase and tensin homologue deleted on chromosom 10 pTNM pathologisch festgestellte(s) Vorhandensein/Fehlen/Ausdehnung des
Primärtumors, der regionären Lymphknoten- und Fernmetastasen Radiatio Radiotherapie
RCT Radiochemotherapie
repp86 restrictedly expressed proliferation-associated protein RND Radikale Neck-Dissection
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RT Raumtemperatur
SD stable disease, stabile Erkrankung
sec Sekunde
SHND Suprahyoidale Neck-Dissection SND Selektive Neck-Dissection
STAT Signal transducers and activators of transcription TBS TRIS buffered saline, TRIS-gepufferte Saline
TMA Tissue-Microarrays
TNM Tumor, Node, Metastasis
TPF 3er-Kombination aus Cisplatin, Docetaxel und 5-Fluorouracil
UV Ultraviolett
UICC Union International Contre le Cancer
V. Vena
VEGF Vascular endothelial growth factor, vaskulärer Endothel- wachstumsfaktor
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1 Einleitung
1.1 Erörterung der Grundproblematik
Bei Kopf-Hals-Tumoren handelt es sich im Allgemeinen um heterogene Tumorentitäten;
am häufigsten sind Plattenepithelkarzinome (95%). Trotz Anwendung von multimoda- len Therapiekonzepten und intensiver Forschung in Strahlen- und Chemotherapie sind die Prognosen und Überlebensraten als schlecht einzustufen. Zwar können bei Platten- epithelkarzinomen durch bestimmte Therapie-Regimes (z. Bsp. neoadjuvante Indukti- onschemotherapeutika) moderate bis gute Responseraten erzielt oder diese chirurgisch ganz entfernt werden, jedoch stützt sich die Entscheidung bezüglich der eingesetzten Therapievariante vor allem auf die klinische Klassifikation (TNM-Klassifikation), was bedeutet, dass sich die Therapie immer noch nach der Tumorgröße, dem Lymphknoten- befund, der Fernmetastasierung und der statistisch zu erwartenden Prognose richtet (Chung et al. 2004). Biomarker, analog zum Her2/neu-Rezeptor bei Brustkrebspatien- tinnen beziehungsweise zum c-Kit bei gastrointestinalen Stromatumoren (GIST), die Zielstrukturen für eine Antikörper-vermittelte Therapie sind und als prädiktive Marker genutzt werden können, sind beim Plattenepithelkarzinom der Kopf-Hals-Region bis- lang unbekannt. Der Fokus der Forschung, in Bezug auf Kopf-Hals-Tumoren, richtet sich daher zunehmend auf Untersuchungen von Expressionsmustern einzelner Proteine, Protoonkogene und Proliferationsfaktoren, um die molekulare Onkogenese dieser Tu- morart besser zu verstehen und um auf dieser Grundlage mögliche prädiktive und prog- nostische Faktoren zu finden mit dem Ziel, individuellere Therapieentscheidungen tref- fen zu können.
In der vorliegenden Studie wurde das Expressionsmuster ausgewählter Biomarker (Sur- vivin, Ki-S2, PTEN, p53, OSF-2, EGFR, Her2/neu) detektiert, um zu prüfen, ob und wie sich das Expressionsmuster nach intraarterieller Induktionschemotherapie ändert.
Ferner wurde nach einem möglichen Zusammenhang zwischen dem Expressionsverhal- ten und der Ansprechrate auf eine intraarterielle Induktionschemotherapie gesucht.
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1.1.1 Epidemiologie und Ätiologie
Im internationalen Vergleich liegen maligne Tumoren des Kopf-Hals-Bereichs auf Platz sechs der am häufigsten auftretenden Neoplasien (Saman. 2012; Warnakulasuriya.
2009). 95% dieser Tumoren gehen vom Plattenepithel des Larynx, Pharynx oder der Mundhöhle aus. Vor allem das Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle zählt zu den 10 häufigsten bösartigen Neubildungen (Reichart. 2001; Squarize et al. 2013). Schaut man sich für diese Krebserkrankung die altersstandardisierten Inzidenzraten der letzten Jahre an, zeigt sich für Deutschland bei Männern ein leichter Rückgang und bei Frauen ein leichter Anstieg (Abbildung 1). Für das Jahr 2010 wurden in Deutschland 9340 Neuer- krankungen bei Männern und 3490 Neuerkrankungen bei Frauen gezählt; damit erkran- ken Männer im Schnitt dreimal häufiger als Frauen. Das Erkrankungsrisiko steigt mit zunehmendem Alter und ist bei Frauen im Durchschnitt mit 65 und bei Männern mit 61 Jahren beziffert (Robert Koch-Institut und Gesellschaft der epidemiologischen Krebsre- gister in Deutschland e.V. 2013).
Abbildung 1: Neuerkrankungsrate in Deutschland pro 100.000 Einwohner (2003 – 2011) ERS = Altersstandardisierte Rate nach dem Europastandard
(Gesellschaft der epidemiologischen Krebsregister in Deutschland e.V. 2014)
Die Ätiologie dieser Krebsart ist multifaktoriell. Jahrzehntelanger Nikotinabusus und vermehrter Alkoholkonsum zählen vor allem in Industrieländern zu den wichtigsten exogenen Risikofaktoren und können bei singulärem Konsum das Erkrankungsrisiko bis zu 6-fach erhöhen. In Entwicklungsländern ist vor allem das Tabak- und Betelnusskauen als Kofaktor verzeichnet (AWMF et al. 2012; Barnes et al. 2005; Reichart. 2001). Stu- dien konnten für simultanen Tabak- und Alkohol- beziehungsweise Tabak-, Alkohol-
19,8 19,8 19,4 19,7 20,1 20,2 20,4 19,4 19,2
5,3 5,4 5,2 5,3 5,7 6,2 5,9 5,9 6,4
0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0
2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011
ERS/100.000
Männer Frauen
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und Betelnusskonsum sogar einen synergetischen Effekt nachweisen. Das heißt, dass ein rauchender Alkoholiker ein 13-fach erhöhtes Risiko haben kann, an Mundhöhlen- krebs zu erkranken (Castellsague et al. 2004) und jemand der alle drei Habits konsu- miert, hat sogar ein 40-fach erhöhtes Risiko zu verzeichnen (Lin et al. 2011). Weiterhin werden schlechte Mundhygiene, mechanische Irritationen (hervorgerufen durch schlecht sitzenden Zahnersatz) und zu geringer Verzehr von Obst und Gemüse als ein erhöhtes Risiko für Mundhöhlenkarzinome angesehen. Die berufliche Exposition mit Farben, Lacken, Lösungsmitteln und Holzstäubern stellt einen zusätzlichen Risikofaktor dar (Robert Koch-Institut und Gesellschaft der epidemiologischen Krebsregister in Deutsch- land e.V. 2013; Barnes et al. 2005). Zusätzlich konnten Studien belegen, dass der Nachweis des humanen Papillomavirus (HPV-Virus) mit einem erhöhten Risiko für die Entstehung des Mundhöhlenkarzinoms assoziiert ist (AWMF et al. 2012; Herrero. 2003;
Mork et al. 2001; Ringstrom et al. 2002; Smith et al. 2004).
1.1.2 Topografische Einteilung, Symptome und Diagnostik
Topografische Einteilung von Kopf-Hals-Tumoren (Wittekind and Meyer. 2010):
1. Tumoren im Bereich der Lippe und Mundhöhle
2. Tumoren des Pharynx (Oropharynx, Nasopharynx oder Hypopharynx) 3. Tumoren des Larynx (Supraglottis, Glottis und Subglottis)
4. Tumoren im Bereich der Kieferhöhle, Nase, Nasennebenhöhle und Siebbeinzellen 5. Speicheldrüsen- und Schilddrüsentumoren
Die häufigste Malignom-Lokalisation ist im Larynx und in der Mundhöhle vorzufinden (Kovács. 2003b). Während bei der europäischen und amerikanischen Bevölkerung be- vorzugt die Zunge befallen ist, zeigt sich bei der asiatischen Bevölkerung ein gehäufter Befall der bukkalen Schleimhaut (Warnakulasuriya. 2009). Aufgrund der breitgefächer- ten Lokalisationsmöglichkeit von Kopf-Hals-Malignomen können sich Symptome die- ser Neoplasie vielseitig äußern. Unter anderem kann es zu Schluckbeschwerden, Hei- serkeit (bei Tumorbefall der Stimmlippen), schmerzloser Schwellung beziehungsweise Kloßgefühl im Hals, Kieferklemme, Fremdkörpergefühl, Geschmacksirritationen (durch Tumorbefall der Zunge), Räusperzwang, Mundgeruch (bedingt durch Zerfall von Tu-
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morzellen), vergrößerten Lymphknoten an Hals und Unterkiefer und blutigem Auswurf kommen. In späteren Stadien kann dies, bedingt durch die wachsende Raumforderung, bis zu Atembeschwerden und Atemnot führen (AWMF et al. 2012; Barnes et al. 2005).
Dem Kliniker stehen zahlreiche Verfahren zur Auswahl, um eine exakte prätherapeuti- sche Diagnose stellen zu können. Die Basisdiagnostik umfasst eine ausführliche Patien- tenanamnese und körperliche Untersuchung mit genauer Tumordokumentation. Die histologische Diagnose wird mittels einer Biopsie gestellt. Eine eventuelle Tumorinfilt- ration in benachbarte Gewebe und der mögliche regionäre Lymphknotenbefund kann mit Palpation, Sonographie (für die Halslymphknoten) und Computertomogramm (CT) beziehungsweise Magnetresonanztomogramm (MRT) (für Tumorgröße und – ausdehnung sowie die Halsweichteile) eruiert werden. Weitere bildgebende Verfahren wie die Skelettszintigraphie (Auffinden von Fernmetastasen im Skelettsystem, Darstel- lung lokaler Knocheninvasion des Tumors), die Panendoskopie des Aerodigestivtrakts (Darstellung der Ausdehnung des Primärtumors, Ausschluss von synchronen Zweittu- moren) und die Positronen-Emissions-Tomographie (PET) (Darstellung von lokoregio- nären und Fernmetastasen) finden Anwendung in der Praxis. Zum Ausschluss von Fernmetastasen in der Lunge bei fortgeschrittenem Stadium (III und IV) wird eine Röntgen-Thorax-Aufnahme angefertigt und zum Ausschluss von Lebermetastasen eine Abdominalsonographie durchgeführt. Die Gesamtheit aller klinischen und apparativen Diagnostikverfahren dient zur Festlegung von TNM-Klassifikation, Tumorstadium und Differenzierungsgrad des vorliegenden Karzinoms (Staging), was das medizinisch- therapeutische Prozedere maßgeblich beeinflusst (AWMF et al. 2012; Kielbassa. 2004).
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1.1.3 TNM-Klassifikation, Tumorstadium und Grading
Das TNM-System (Tumor, Node, Metastasis) ist ein international anerkanntes und an- gewandtes Verfahren, welches die anatomische Ausbreitung einer malignen Tumorer- krankung klinisch (prätherapeutisch, auch als cTNM bezeichnet) und im Falle einer Operation, histopathologisch (postoperativ, auch als pTNM bezeichnet) klassifiziert. ‚T‘
steht für die Ausbreitung des Primärtumors, ‚N‘ beschreibt das Fehlen oder Vorhanden- sein und die Ausbreitung von regionären Lymphknotenmetastasen. ‚M‘ beschreibt das Fehlen oder Vorhandensein von Fernmetastasen (Wittekind and Meyer. 2010). Für die Einordnung eines Tumors im Kopf-Hals-Bereich eignet sich die TNM-Klassifikation der UICC (Union International Contre le Cancer) (Sobin et al. 2010). Auf Grundlage der TNM-Klassifikation kann eine Einteilung in ein Erkrankungs- und Tumorstadium (Sta- ging) vorgenommen werden. Dieses dient dem Kliniker zum einen zur Beurteilung der Prognose und hilft zum anderen bei der Entscheidung bezüglich der Planung und Durchführung einer geeigneten Tumortherapie. Zusätzlich wird der interdisziplinäre Informationsaustausch zwischen einzelnen Behandlungszentren erleichtert (Wittekind and Meyer. 2010).
Anhand des histopathologischen Präparats kann der Pathologe den Differenzierungsgrad des Tumors in Bezug auf das Ausgangsgewebe feststellen und damit eine Aussage über die Aggressivität des vorliegenden Tumors treffen.
Nachfolgend wird die TNM-Klassifikation, die Stadieneinteilung und der Differenzie- rungsgrade des Mundhöhlen- und des Oropharynxkarzinoms tabellarisch dargestellt (Tabellen 1, 2 und 3).
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Tabelle 1: TNM-Klassifikation, entsprechend der Richtlinien der UICC (Sobin et al. 2010) Ausdehnung und Größe des Primärtumors
TX Primärtumor kann nicht beurteilt werden T0 Kein Anhalt für Primärtumor
Tis Carcinoma in situ
T1 Tumorgröße ≤ 2 cm
T2 Tumorgröße > 2 cm – ≤ 4 cm Mundhöhle
T3 Tumorgröße > 4 cm
T4a Tumorinfiltration in Kortikalis, tiefe Zungenmuskulatur (Mm. genioglossus, hyoglossus, palatog- lossus, styloglossus), Kieferhöhle oder Gesichtshaut. Eine oberflächliche Erosion des Knochens/
Alveolarfortsatzes durch einen Primärtumor der Gingiva ist nicht ausreichend für eine Einstufung in T4
T4b Mastikatorraum, Processus pterygoideus, Schädelbasis oder umschließt die A. carotis interna Oropharynx
T3 Tumorgröße > 4 cm oder Ausbreitung bis auf die linguale Oberfläche der Epiglottis
T4a Tumorinfiltration in Larynx, tiefe Zungenmuskulatur (Mm. genioglossus, hyoglossus, palatoglos- sus, styloglossus), Lamina med. d. Proc. pterygoideus, harter Gaumen, Mandibula
T4b M. pterygoideus lat., Lamina lat. d. Proc. pterygoideus, lateraler Nasopharynx, Schädelbasis oder umschließt die A. carotis
Lymphknotenbefall in der Region
NX Regionäre Lymphknoten können nicht beurteilt werden N0 Keine regionären Lymphknotenmetastasen
N1 Metastase in solitärem ipsilateralen Lymphknoten ≤ 3 cm
N2a Metastase(n) in solitärem ipsilateralen Lymphknoten > 3 cm – ≤ 6 cm N2b Metastasen in multiplen ipsilateralen Lymphknoten ≤ 6 cm
N2c Metastasen in bilateralen oder kontralateralen Lymphknoten ≤ 6 cm N3 Metastase(n) in Lymphknoten > 6 cm
Fehlen beziehungsweise Vorhandensein von Fernmetastasen Mx Fernmetastasen können nicht beurteilt werden M0 Keine Fernmetastasen
M1 Fernmetastasen vorhanden
Tabelle 2: Stadieneinteilung, entsprechend der Richtlinien der UICC (Sobin et al. 2010) Stadium
0 Tis N0 M0
I T1 N0 M0
II T2 N0 M0
III T1,T2,
T3
N1 N0,N1
M0 M0
IVA T1,T2,T3
T4a
N2 N0,N1,N2
M0 M0
IVB jedes T
T4b
N3 jedes N
M0 M0
IVC jedes T jedes N M1
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Tabelle 3: Grading, entsprechend der Richtlinien der UICC (Sobin et al. 2010) Grading
G1 gut differenziertes bösartiges Gewebe („low-grade“), hohe Übereinstimmung mit dem Ursprungsgewebe G2 mäßig differenziertes bösartiges Gewebe
G3 schlecht/niedrig differenziertes bösartiges Gewebe
G4 nicht differenziertes bösartiges Gewebe (undifferenziert, anaplastisch) („high-grade“) GX Grad der Differenzierung kann nicht bestimmt werden
1.1.4 ECOG-Leistungsindex
Der ECOG-Leistungsindex (Eastern Cooperative Oncology Group-Index) ermittelt vor Therapiebeginn die Lebensqualität und den körperlichen Leistungszustand beziehungs- weise den körperlichen Allgemeinzustand von Patienten mit bösartigen Tumorerkran- kungen (Oken et al. 1982). Dabei werden der Aktivitätszustand, die Leistungsfähigkeit, die Pflegebedürftigkeit, die Hilfsbedürftigkeit und die Durchführbarkeit von Alltagstä- tigkeiten beurteilt. Die Einteilung erfolgt anhand einer Skala nummerisch von 0-5. Die- se Einschätzung hat für den behandelnden Arzt vor allem in Bezug auf das Therapiere- gime eine Relevanz. Je nachdem wie sich der körperliche Leistungszustand des Patienten darstellt, muss geschaut werden, welche Chemotherapeutika verabreicht wer- den können, ob eine Chemotherapie durchführbar ist beziehungsweise ob eine Redukti- on der Dosis notwendig ist (Michl and Hiddemann. 2010). Nachfolgend zeigt Tabelle 4 den Leistungsindex.
Tabelle 4: ECOG-Leistungsindex nach (Oken et al. 1982) Scala Zustand des Patienten
0 Normale uneingeschränkte Aktivität wie vor der Erkrankung.
1 Einschränkung bei körperlicher Anstrengung, aber gehfähig; leichte körperliche Arbeit beziehungs- weise Arbeit im Sitzen (z.B. leichte Hausarbeit oder Büroarbeit) möglich.
2 Gehfähig, Selbstversorgung möglich, aber nicht arbeitsfähig; kann mehr als 50 % der Wachzeit auf- stehen.
3 Nur begrenzte Selbstversorgung möglich, Patient ist 50 % oder mehr der Wachzeit an Bett oder Stuhl gebunden.
4 Völlig pflegebedürftig, keinerlei Selbstversorgung möglich, völlig an Bett oder Stuhl gebunden.
5 Tod
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1.1.5 Therapie
Die Therapie des Mundhöhlenkarzinoms kann als, auf interdisziplinärer Ebene, multi- modales Konzept verstanden werden und umfasst im Wesentlichen die drei wichtigen Pfeiler Chirurgie, Strahlentherapie und Chemotherapie, welche einzeln oder in Kombi- nation Anwendung finden. Die Wahl des Behandlungskonzepts richtet sich neben den bereits erwähnten Parametern auch nach der Tumorausdehnung, Metastasierung, Comp- liance und dem Allgemeinzustand des Patienten. Ziel jeglicher Therapiewahl sollte eine dauerhafte beziehungsweise möglichst lange lokoregionäre Tumorkontrolle sein.
1.1.5.1 Chirurgie
Die chirurgische Intervention verfolgt in erster Linie das Ziel einer R0-Resektion, was die Entfernung des Primärtumors in toto einschließlich der Lymphknotenmetastasen voraussetzt. Um tumorfreie Resektionsränder zu gewährleisten, muss ein ausreichender Sicherheitsabstand von 10 mm vom tastbaren Tumorrand beziehungsweise ein Mindest- abstand von 3-5 mm zwischen Resektionsrand und Primärtumor im histologischen Prä- parat vorliegen. Die operative Entfernung des Primärtumors wird durch verschiedene Formen der Halslymphknotenausräumung ergänzt (Blockresektion) (Tabelle 5). Dieses Resektionsverfahren wird als Neck-Dissection bezeichnet und umfasst die Lymphgewe- beentfernung innerhalb festgelegter Halslevel einschließlich des umgebenen Fett- und Bindegewebes mit gegebenenfalls ergänzender Entfernung von nichtlymphatischen, anatomischen Strukturen (M. sternocleidomastoideus, N. accessorius, V. jugularis inter- na). Lage und Ausdehnung des Primärtumors bestimmen Art und Umfang der Operati- on. Das Ausmaß der Neck-Dissection (prophylaktisch oder therapeutisch) wird durch den Befund des präoperativen Lymphknotenstagings festgelegt. Aufgrund der Tatsache, dass beim Mundhöhlenkarzinom in 20%-40% der Fälle bei klinischem N0-Status regio- näre, okkulte Lymphknotenmetastasen (Mikrometastasen) im Halsbereich vorliegen können, wird grundsätzlich eine prophylaktische Neck-Dissection empfohlen (AWMF et al. 2012). Tabelle 5 beschreibt die verschiedenen Formen der Neck-Dissection.
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Tabelle 5: Formen der Neck-Dissection (AWMF et al. 2012)
Kurzform Definition Beschreibung
RND Radikale Neck-Dissection zervikale Lymphadenektomie Level I-V mit zeitgleicher Entfer- nung von N. accessorius, der V. jugularis und des M. sternoclei- domastoideus
MRND Modifizierte
radikale Neck-Dissection
zervikale Lymphadenektomie Level I-V unter gewährleistetem Erhalt einer oder mehrerer nicht-lymphatischer Strukturen SND Selektive Neck-Dissection Selektive zervikale Lymphadenektomie unter gewährleistetem
Erhalt von einer oder mehrerer Lymphknotengruppen. Beim Mundhöhlenkarzinom Ausräumung der Level I-III
ERND Erweiterte
radikale Neck-Dissection
Entfernung von ein beziehungsweise mehreren zusätzlichen Lymphknotengruppen oder nicht-lymphatischen Strukturen (z.
Bps. N. hypoglossus, A.carotis externa, Glandula parotis) END Elektive Neck-Dissection Prophylaktische Ausräumung der zervikale Lymphknoten bei
klinischem N0-Status
SHND Suprahyoidale Neck-Dissection Selektive Neck-Dissection mit Entfernung von Lymphknoten der Level I und II bei klinischem N0-Status (Kovács. 2003b)
1.1.5.2 Radiotherapie
Der Einsatz von Radiotherapie (Radiatio) kann als singuläre Behandlungsmethode, als begleitende Maßnahme prä- beziehungsweise postoperativ (neoadjuvant/adjuvant) oder in Kombination mit simultaner Chemotherapie (Radiochemotherapie) erfolgen. Da die Zerstörung von Tumorzellen bei einmaliger Gabe eine hohe Strahlendosis erfordert, wäre in diesem Zusammenhang mit einer ausgeprägten Schädigung von gesundem Ge- webe zu rechnen. Um gesundem Gewebe Reparaturprozesse zu ermöglichen, wird des- halb die Gesamtdosis über einen definierten Zeitraum in festgelegten kleineren Einzel- dosen verabreicht (Fraktionierung) (Kielbassa. 2004). Je nach Anzahl der Fraktionen und eingesetzter Strahlendosis werden folgende Fraktionierungsschemata unterschie- den: konventionell fraktioniert (Einzeldosis von 1,8-2,0 Gy täglich, 5x pro Woche, bis 60-70 Gy Gesamtdosis), akzeleriert (> 10 Gy pro Woche), hyperfraktioniert (Einzeldo- sis von 1,1-1,2 Gy, 2x täglich, 5x pro Woche, wöchentliche Gesamtdosis ≤ 10 Gy) und hypofraktioniert (Einzeldosis > 2 Gy bei reduzierter Anzahl der Einzelfraktionen) (AWMF et al. 2012). Eine Modifikation der Strahlentherapie stellt die sogenannte inten- sitätsmodulierte Radiotherapie (IMRT) dar. Je nach Tumorlokalisation wird eine Opti- mierung der Strahlendosisverteilung im Zielgebiet angestrebt, um benachbarte Risiko- organe optimal zu schonen und die Toxizität zu minimieren. Ziel ist es, gewisse Toleranzdosisgrenzen, welche sich je nach umliegender Struktur (z. Bsp. Ohrspeichel-
22
drüse, Schlundmuskulatur, Sehbahn) unterscheiden, einzuhalten. Allerdings sind trotz Optimierung Folgeschäden im gesunden Gewebe unvermeidlich. Der Schweregrad des Gewebeschadens hängt vor allem von der Art des Gewebes, der Strahlendosis und der Behandlungsdauer ab. So gibt es zum Beispiel Gewebe, wie die Mundschleimhaut und die Speicheldrüsen (Glandula parotidea, Glandula submandibularis), welche eine hohe Strahlensensibilität aufweisen. Folglich kommt es nach kurzer Behandlungsdauer zur Strahlenmukositis und Xerostomie. Bedingt durch die schlechtere Speichelflußrate und dem damit verbundenen unzureichenden Selbstreinigungsprozess der Mundhöhle, tritt zusätzlich vermehrt Strahlenkaries auf. Ein weiteres wesentliches Problem ist die xeros- tomiebedingte Gewichtsreduktion, welche als Folge der beeinträchtigten und zum Teil sehr schmerzhaften Nahrungsaufnahme auftritt. Den schwerwiegendsten möglichen Folgeschaden post radiationem stellt jedoch die Osteoradionekrose des Unterkiefers dar.
Diese entwickelt sich auf Grundlage eines gestörten Knochenstoffwechsels, welcher durch Verlust von Osteoklasten, aktiven Osteoblasten und Osteozyten (Hypozellularität) ausgelöst wird (Hancock et al. 2003; Jham and da Silva Freire,. 2006; Kielbassa. 2004).
1.1.5.3 Chemotherapie
Die Anwendung von Chemotherapie bei Plattenepithelkarzinomen der Mundhöhle kann sowohl in kurativer als auch in palliativer Absicht erfolgen, wobei grundsätzlich zwi- schen neoadjuvanter, adjuvanter und konkomitanter (in Kombination mit Radiatio) Ap- plikation unterschieden wird. Für Kopf-Hals-Tumoren kommen vor allem folgende Substanzen zum Einsatz: Cisplatin, Carboplatin, 5-Fluorouracil, Methotrexat und Taxa- ne (Docetaxel und Paclitaxel). Ein singulärer Einsatz von systemischer Chemotherapie bei Kopf-Hals-Tumoren ist bislang nur in palliativer Intention bei Patienten mit lokore- gionären Rezidiven und Metastasen indiziert (Kovács. 2013). Eine alleinige Kombinati- on von Chemotherapie und Operation, sowohl in adjuvanter als auch neoadjuvanter Form konnten bislang keinen statistisch signifikanten Vorteil für Patienten in Bezug auf die Gesamtüberlebensrate zeigen (1%, 2% nach 2 beziehungsweise 5 Jahren) (Depondt et al. 1993; Pignon et al. 2000; Pignon et al. 2009; Vokes. 2010), wohingegen der Ein- satz einer simultanen Chemotherapie mit Radiatio (Radiochemotherapie, RCT) einen festen Bestandteil im aktuellen Behandlungsregime von Kopf-Hals-Tumoren darstellt.
23
Ihre postoperative Indikationsberechtigung ist sowohl für fortgeschrittene Erkrankungs- stadien (T3/T4) als auch bei Patienten mit ungünstigen klinischen oder pathologischen Faktoren (positiver Resektionsrand, Gefäßinvasion, perineurale Invasion und/oder Lymphknotenbefall) gegeben (Bernier et al. 2004). Vor allem bei der Behandlung von lokal inoperablen Tumoren wird die RCT als Goldstandard gewertet (Kovács. 2013).
Durch Einsatz beider Modalitäten (Radio- und Chemotherapie), in zeitlich synchroner Anwendung, kommt es zu einem sogenannten gegenseitigen, additiven tumorzelltöten- den Effekt (Semrau et al. 2007). Mit Blick auf den möglichen Überlebensgewinn durch Einsatz von Zytostatika in Kombination mit Radiatio zeigen die Gabe von Cisplatin oder 5-Fluorouracil beziehungsweise die Kombination aus beiden Präparaten (Cisplatin plus 5-Fluorouracil) den größten Nutzen (Budach et al. 2006), wobei das Leitlinienpro- gramm der deutschen Krebsgesellschaft bei konkomitanter RCT grundsätzlich eine Ga- be von Cisplatin beziehungsweise einer cisplatinhaltigen Kombination empfiehlt (AWMF et al. 2012).
1.1.5.3.1 Systemische Induktionschemotherapie (ICT)
Bei der systemischen Induktionschemotherapie handelt es sich um eine neoadjuvante Applikation von Zytostatika, welche präoperativ beziehungsweise präradiotherapeutisch verabreicht wird. Dem Einsatz einer ICT liegt die Überlegung zugrunde, dass im Areal eines nicht vorbehandelten Tumorgewebes, welches dadurch noch gut vaskularisiert ist, eine höhere Chemotherapiekonzentration erreicht wird und, durch Applikation einer Hochdosistherapie, Mikrometastasen zerstört werden. Desweiteren können, im Gegen- satz zu bereits bestrahlten Patienten, unvorbehandelte Patienten toleranter auf Neben- wirkungen reagieren (Posner et al. 2004). Der speziell ausgewählte Zeitpunkt dieser Therapieform, nämlich die Noxenapplikation beim unbehandelten Patienten, verfolgt sowohl das Ziel einer organ- und funktionserhaltenden Behandlungsstrategie als auch das einer Primärtumor-Reduktion zur besseren Resektabilität und Minimierung des Operationsrisikos (Mumme et al. 2010). Als Therapiemöglichkeit wird sie heutzutage vor allem bei Patienten mit inoperablen Tumoren als auch bei resektablen Tumoren mit Ziel des Organerhalts praktiziert. Seit kurzem ist die ICT ein Goldstandard mit dem sogenannten TPF-Regime, einer 3er-Kombination aus Cisplatin, Docetaxel und 5-
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Fluoruacil (Kovács. 2013). TPF hat die ursprüngliche Kombination aus Cisplatin und 5- Fluorouracil (PF) abgelöst, nachdem durch randomisierte Studien und Meta-Analysen gezeigt werden konnte, dass die Triple-Kombination der Cisplatin-5-Fluorouracil- Kombination in Bezug auf Organerhalt, Reduktion von Fernmetastasen, progressions- freies und Gesamtüberleben überlegen ist. Zusätzlich konnte eine verminderte Toxizität bei der Gabe von TPF im Vergleich zu PF festgestellt werden (Vermorken et al. 2007;
Posner et al. 2004).
1.1.5.3.2 Intraarterielle Induktionschemotherapie (IA)
Die intraarterielle Induktionschemotherapie (IA) stellt als neoadjuvante Zytostatikagabe eine spezielle Form der endovaskulären Behandlungsmodalität bei Kopf-Hals-Tumoren dar. Der Zugang erfolgt heute meist transfemoral (Punktion und Katheterisierung der A.
femoralis). Nach Gefäßpunktion erfolgt die Insertion eines hydrophilen Gleitkatheters (Führungskatheter) durch den koaxial ein Mikrokatheter eingeführt wird. Mit Hilfe ei- ner Röntgen-Kontrastmittel-Injektion über den Katheter kann der Mikrokatheter super- selektiv positioniert und das tumorversorgende Gefäß angiographisch dargestellt werden (Abbildung 2). Nach Kontrolle der korrekten Lage des Mikrokatheters mittels Angio- graphie erfolgt über diesen die Applikation von zum Beispiel 150 mg/m² Cisplatin in das Perfusionsgebiet. Zeitgleich wird über einen intravenösen Zugang, mit einer Menge von 9 g/m², der systemische Antagonist Natriumthiosulfat injiziert. Dieser bindet Cisp- latin kovalent und bewirkt seine Inaktivierung. Durch diese periphere Neutralisation werden Komplikationen und systemische Nebenwirkungen minimiert als auch sensible Strukturen wie Rückenmark und Nieren geschont (Kovács. 2003a, 2003b). Die Applika- tionsdauer der IA ist je nach eingesetztem Chemotherapeutikum individuell festzulegen und hängt von dessen Phasenspezifität ab. Bei Cisplatin erfolgt die Injektion als Bolus (Bolusinjektion) da dieses Zytostatikum zellzyklusunspezifisch ist.
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Abbildung 2: retromolares Plattenepithelkarzinom der linken Seite (Kovács. 2013)
Links: Angiographische Kontrolle des Gefäßterritoriums und Illustration des vermuteten Perfusionsgebiets über die A. maxillaris
Rechts: Superselektive Darstellung des Perfusionsgebiets über die A. palatina deszendens (Fotos mit freundlicher Genehmigung von Prof. Dr. Dr. Dr. A. F. Kovács)
Der Vorteil dieser regional verabreichten Chemotherapie ist eine höhere Zytostatika- Konzentration am Zielort (Tumorareal) im Vergleich zur systemischen Applikation. Die Medikamentenaufnahme in die Tumorzelle wird dadurch verbessert. Das Resultat ist eine höhere Medikamentenkonzentration im Tumorgewebe, was die Wahrscheinlichkeit der therapeutischen Ansprechrate erhöhen soll und gleichzeitig die periphere Toxizität verringert. Studien konnten belegen, dass durch Applikation einer neoadjuvanten IA das lokale Tumorwachstum gehemmt und das Volumen des Primärtumors reduziert werden konnte, was letztendlich in einer Verbesserung der Radikaloperation resultiert. Zusätz- lich konnte nachgewiesen werden, dass unter Einsatz einer IA mit nachfolgender Opera- tion die Lokalrezidivrate reduziert war (Kovács. 2003b, 2013). Kovács et al. konnten durch Studien belegen, dass die IA im Rahmen eines multimodalen Behandlungskon- zepts sowohl die lokoregionäre Tumorkontrolle als auch die Gesamtüberlebensrate posi- tiv beeinflusst (Kovács et al. 2002; Kovács. 2006). Auch bei Patienten mit inoperablen, fortgeschrittenen Tumorentitäten konnte ein Benefit in Bezug auf die Überlebensrate gezeigt werden (Rohde et al. 2005). Die Argumentation für eine intraarterielle Chemo- therapie vor Radikaloperation und/oder Radiochemotherapie ist nicht alleine mit dem Ziel einer Komplettremission verbunden, sondern begründet sich vor allem in einer Re- duktion der lokalen und metastatischen Tumoraggressivität. In Folge dessen werden die
Führungskatheter in der A. maxillaris
Tumorareal
Anastomosen zur A. fazialis
Richtige Position des Mikrokatheters Mikrokatheter Führungskatheter
26
Patienten- und Therapiecompliance verbessert und Komplikationen als auch Nebenwir- kungen minimiert (Kovács. 2013). Die nachfolgenden Grafiken (Abbildung 3) zeigen jeweils ein Beispiel einer Komplettremission nach IA.
Vor Therapie Nach IA Chemotherapie
Abbildung 3: Beispiel einer Komplettremission nach Applikation einer IA mit 150 mg/m² Cisplatin (Kovács.
2013)
(Fotos mit freundlicher Genehmigung von Prof. Dr. Dr. Dr. A.F. Kovács)
Die Beurteilung des Ansprechens auf die prächirurgische Therapie und die Festlegung des klinischen Remissionsgrades mittels visueller Inspektion, Palpation und CT erfolgt drei Wochen nach dem ersten IA Induktionschemotherapie-Zyklus. Vier klinische Re- missionsformen werden dabei unterschieden (Tabelle 6).
Tabelle 6: Klinische Remissionsformen
Abkürzung Bedeutung Definition
CR Complete remission komplette Remission
vollständiges Verschwinden der lokalen Tumormasse (klinisch und radiologisch)
PR partial remission partielle Remission
Reduktion der lokalen Tumormasse von mehr als 50%
SD stable disease stabile Erkrankung
Reduktion der Tumormasse um weniger als 50%
PD progressive disease Progression der Erkrankung
Wachstum des Primärtumors um mehr als 25%
27
1.1.6 Prognose
Trotz intensiver Forschung und Einsatz neuer Therapiemodalitäten in Form von multi- modalen Konzepten, einschließlich der Verbesserung der Lebensqualität durch ausge- feilte Wiederherstellungschirurgie, ist die Prognose für das Mundhöhlenkarzinom gene- rell als ungünstig zu bewerten. Die 5-Jahres Überlebensrate nimmt mit steigendem Tumorstadium rapide ab. Liegt sie im Stadium I und II noch bei 75%-90% (Stadium I) beziehungsweise 40%-70% (Stadium II) so ist bei Stadium III und IV lediglich eine Überlebensrate von 20%-50% (Stadium III) beziehungsweise 10%-30% (Stadium IV) zu verzeichnen (Seeber and Schütte. 2007). Wesentliche Faktoren, welche einen Ein- fluss auf die Prognose haben, sind sowohl die Lage und lokoregionäre Ausdehnung des Primärtumors als auch das Vorliegen und die Ausdehnung zervikaler Lymphknotenme- tastasen. Ein wesentliches Problem bei primär therapierbaren Mundhöhlenkarzinomen ist das Auftreten von lokalen und lokoregionären Rezidiven nach abgeschlossener Pri- märtherapie, welche bei 80% der Fälle innerhalb von zwei Jahren entstehen (Kovács.
2003b).
Der ungünstigen Prognose und der damit verbundenen hohen Sterberate liegt die Tatsa- che zugrunde, dass zum Zeitpunkt der Diagnosestellung der Tumor in der Regel schon im fortgeschrittenen Stadium vorliegt (Siriwardena et al. 2006). Die Ursache der zeitli- chen Verzögerung kommt durch zwei wesentliche Aspekte zustande: Da der Verlauf des Plattenepithelkarzinomes der Mundhöhle im Anfangsstadium eher symptom- und schmerzlos verläuft, nimmt der Patient eine Mundschleimhautveränderung in seiner Ernsthaftigkeit oftmals nicht wahr, was eine verspätete Befundabklärung zur Folge hat.
Zusätzlich kann eine Fehlinterpretation des Befundes (Druckstelle, Bissverletzung), bedingt durch Unerfahrenheit des behandelnden Arztes/Zahnarztes auf diesem Gebiet, die Diagnosestellung verzögern, was katastrophale Folgen für den Patienten mit sich zieht (AWMF et al. 2012).
28
2 Biomarker
Definition, allgemeine Anforderungen und Anwendung
Die Untersuchung von Tumoren ist seit geraumer Zeit über die zelluläre Ebene hinaus- gegangen. Es wird zunehmend versucht, mittels bioanalytischer Verfahren, auf Protein- ebene eine genauere Klärung von Tumoreigenschaften zu gewinnen und tumorspezifi- sche Biomarkerexpressionsmuster zu charakterisieren. Ziel der Forschung ist es, bestimmte Proteine (z. Bsp. Enzyme, Isoenzyme, Rezeptoren) auf zellulärer Ebene (in oder auf der Zelle) zu detektieren, welche von malignen Tumorzellen direkt gebildet werden. Diese Proteine (zelluläre Biomarker) sollten, als diagnostisches Hilfsmittel, Rückschlüsse auf das Vorliegen, den Therapieverlauf, die Prognose und die Rezidivbil- dung der Erkrankung geben können. Idealerweise sollten diese Biomarker für eine be- stimmte Tumorentität spezifisch sein und mit der Tumorlast korrelieren.
Mit Hilfe der Immunhistochemie können in aufgearbeiteten Gewebeschnitten Proteine mittels spezieller Antikörper angefärbt werden, so dass, durch spezifische Markierung, ein fragliches Protein unter dem Lichtmikroskop erkennbar wird. Da diese Methode bei einer großen Anzahl von Gewebeproben kosten- und zeitintensiv ist, wird auf die Tis- sue-Microarray-Technik zurückgegriffen. Diese erlaubt eine simultane Untersuchung von mehreren Gewebeproben auf Biomarkerexpressionen durch Einbetten von Gewe- beproben verschiedener Patienten in einen einzelnen Paraffinblock.
Eine Anzahl von sogenannten Biomarkern ist mittlerweile auch bei Mundboden- und Rachenkarzinomen nachgewiesen worden. Eine frühe Übersicht findet sich in der Arbeit von Schliephake (Schliephake. 2003). In dieser wurde die Studienlage von 1997-2002 (162 Artikel) in Bezug auf molekulare Biomarker und ihre Rolle in der Therapie und Prognose des oralen Plattenepithelkarzinoms untersucht. Dabei wurden die einzelnen Biomarker in verschiedene Gruppen, basierend auf ihrer molekularen Funktion, einge- teilt (u.a. Tumorwachstumsmarker, Tumorsuppressionsmarker, Angiogenesemarker, Tumorinvasionsmarker).
Schliephake konnte zeigen, dass, trotz der ausführlichen Datenlage von insgesamt 29 verschiedenen Markern, einzelne Marker weder diagnostisch noch prognostisch eine
29
zuverlässige Aussage ermöglichen. Daher ist die Berücksichtigung einer Gruppe von Markern erfolgsversprechender. Dabei wird eine Kombination von Markern, die je für sich eine Relevanz bei oralen und oropharyngealen Karzinomen aufweisen, in Verbin- dung mit noch wenig untersuchten Markern gleichzeitig untersucht. Da die Marker je- weils differenzierte Funktionen aufweisen und in unterschiedlichen Kompartimenten der Zelle auftreten (u.a. als Wachstumsrezeptor an der Zelloberfläche, im Nukleus als Zellzyklusproteine oder im Zytoplasma als Signaltransduktionsproteine) könnte ein Er- kenntnisgewinn möglich werden. Erfolgsversprechender wäre weiterhin die Verbindung mit therapeutischen Maßnahmen.
Wie alle Tumoren stellt auch das orale und oropharyngeale Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle ein multifaktorielles Geschehen dar. Deshalb wurden für diese Studie Bio- marker untersucht, welche auf molekularer Ebene unterschiedliche Funktionen aufwei- sen. So wurden Marker gewählt, welche bei der Signaltransduktion involviert sind (PTEN, EGFR, Her2/neu), nukleäre Zellzyklusprozesse regeln (p53, Survivin), Prolife- rationsaktivitäten der Tumorzelle messen (KI-S2) und bei der Angiogenese eine Rolle spielen (OSF-2).
Die folgenden Kapitel stellen eine Übersicht über die wichtigsten molekularbiologi- schen Aspekte (u.a. Aufbau, Funktion, Expression) der einzelnen Biomarker dar.
30
2.1.1 Survivin
2.1.1.1 Molekularer Aufbau
Survivin ist in die Kategorie der Apoptose-hemmenden-Proteine (IAP = Inhibitor of apoptosis) einzuordnen. In menschlichen Zellen umfasst diese Familie acht Mitglieder.
Survivin ist mit 16,5kDa das kleinste Mitglied der IAP. Es wird während der G2/M Pha- se des Zellzyklus exprimiert. Als Monomer ist es zusammengesetzt aus einer zinkbin- denden BIR-Domäne (N-terminaler Anteil) und einer α-helikalen „coiled–coil-domain“
(c-terminaler Anteil) (Verdecia et al. 2000). Verbunden werden beide Anteile durch eine sogenannte Linker-Sequenz. (Bourhis et al. 2007). Die BIR-Domäne (Baculovirus IAP Repeat) wurde identifiziert als doppelt wiederholte Sequenz von 70 Aminosäuren wel- che in Baculovirus-Proteinen gefunden wurde (Miller. 1999). Abbildung 4 zeigt eine grafische Darstellung von Survivin.
Abbildung 4: Darstellung des Survivin-Dimers (Chantalat et al. 2000) Links: in der Ebene, rechts: 90 Grad gedreht um die x-Achse
2.1.1.2 Funktion
Für Survivin werden in der Literatur zwei wesentliche Hauptfunktionen beschrieben:
Regulation der Zellteilung (nukleär exprimiert) und Apoptoseinhibition (zytoplasma- tisch exprimiert) (Mita et al. 2008; Pavlyukov et al. 2011; Song et al. 2003). Die Rolle von Survivin bei der Zellteilung wird in der Forschung einstimmig angenommen, wo- hingegen der Mechanismus, mit dem Survivin direkt an der Regulation der Apoptose involviert ist, umstritten bleibt und kontrovers diskutiert wird (Banks et al. 2000;
Knauer et al. 2007; Li et al. 2008; O'Connor et al. 2000; Song et al. 2003; Tamm et al.
1998).
31 Zellzyklus-Regulation
Die Zellteilung beinhaltet einen komplexen, auf chromosomaler Ebene koordinierten Prozess. Dieser beinhaltet eine Verdopplung der Chromosomen mit anschließender Auf- teilung des genetischen Materials auf beide Tochterzellen.
Survivin ist ein Teil des Chromosomalen Passenger Komplexes (CPC), welcher ein ent- scheidender Schlüsselregulator für die Chromosomen-Separation ist (Mita et al. 2008).
CPC bindet zunächst an das Zentromer (Einschnürungsstelle des Chromosoms). Beim Übergang von der Meta- in die Anaphase trennt er sich vom Zentromer und bindet an die Spindelfasern des Spindelapparats, welcher eine zentrale Rolle bei der Trennung der Chromatiden spielt (Jeyaprakash et al. 2007).
2.1.1.3 Expression im gesunden Gewebe und im Tumorgewebe
Survivin ist in terminal differenzierten adulten Geweben nicht detektierbar, wohingegen eine starke Expression in verschiedenen Geweben während der fötalen Entwicklung (u.a. endokrines Pankreas und Thymus) nachweisbar ist (Adida et al. 1998). Zusätzlich wird es in einer Vielzahl von menschlichen Tumoren unterschiedlichen Ursprungs (u.a.
Lunge, Pankreas, Kolon, Prostata und Brust) stark exprimiert (Ambrosini et al. 1997).
Sowohl im Nukleus als auch im Zytoplasma einer Tumorzelle ist Survivin nachweisbar (Stauber et al. 2007). Survivin weist eine dynamische Lokalisation zwischen Nukleus und Zytoplasma auf, welche durch ein Exportprotein namens Crm1 (Chromosomal Maintenance 1) reguliert wird (Rodriguez et al. 2002). Dadurch wird die Zytoplasma- konzentration von Survivin aufrecht erhalten. Dies könnte seine zytoprotektive Wirkung bei Tumorzellen erklären (Stauber et al. 2007; Knauer et al. 2007).
32
2.1.1.4 Bedeutung in der Onkologie
Einige Studien postulieren, dass es prognostisch vor allem auf die Lokalisation des Sur- vivins in der Tumorzelle ankommt, wobei die Ergebnisse kontrovers ausfallen. Im Ver- gleich von nukleärer versus zytoplasmatischer Expression von Survivin soll die nukleä- re Variante mit einem günstigen Krankheitsverlauf korrelieren, während das Vorhandensein der zytoplasmatischen Variante einen ungünstigen Verlauf charakteri- siert. Engels et al. beschreiben für orale Karzinome, dass zytoplasmatisches Survivin für die Tumorzelle als Protektor fungiert. Es schützt diese vor Chemo- und Strahlentherapie induzierter Apoptose (Engels et al. 2007). Preuss et al. hingegen fanden beim Oropha- rynxkarzinom heraus, dass vor allem eine nukleäre Survivinexpression mit einer un- günstigen Überlebensrate assoziiert ist und ordneten die Anwesenheit von nukleärem Survivin als negativen Prognosefaktor ein (Preuss et al. 2008b).
2.1.2 Ki-S2
2.1.2.1 Allgemeine Grundlagen
Ki-S2 ist ein monoklonaler Maus
tels Hybridom-Technik generiert wurde und in die Familie der Proliferationsmarker einzuordnen ist. Durch die Herstellung des Ki
unbekanntes nukleäres Protein mittels Western Blot zu
mit einem Molekulargewicht von ca. 100kDa wird von den Autoren in der Literatur aktuell als repp86 (restrictedly expressed proliferation
(Heidebrecht et al. 2003).
repp86 ist ein zellzyklusassoziiertes Protein, welches in der S Zellzyklus detektierbar ist. Das kodierende Gen
et al. 2003). Die Immunfluoreszenz körper Ki-S2 erkannte Antigen repp86
diffus im Nukleoplasma verteilt ist, wohingegen es und der Mitosespindel vorliegt
bungen mit Ki-S2 konnten zeigen, dass nach Beendigung der Zellteilung repp86 sofort abgebaut wird. Seine Halbwertszeit beträgt 1 Stunde. Somit zeigt sich, das
schließlich in proliferierenden Zellen exprimiert wird
Abbildung 5: Immunfluoreszenz-Färbung von repp86 mittels Ki zenzkonjugat) (Heidebrecht et al. 2003)
repp86 assoziiert in der Metaphase mit dem Spindelapparat (linke Graphik) Diffuse Verteilung von repp86 im Nukleus während der Interphase (rechte Graphik)
33
Allgemeine Grundlagen
S2 ist ein monoklonaler Maus-Antikörper, welcher 1997 von Heidebrecht et al. mi Technik generiert wurde und in die Familie der Proliferationsmarker
Durch die Herstellung des Ki-S2 gelangte Heidebrecht et al. ein bisher unbekanntes nukleäres Protein mittels Western Blot zu detektieren. Dieses Kernprotein, mit einem Molekulargewicht von ca. 100kDa wird von den Autoren in der Literatur aktuell als repp86 (restrictedly expressed proliferation-associated protein) bezeichnet
repp86 ist ein zellzyklusassoziiertes Protein, welches in der S-, G2- und Zellzyklus detektierbar ist. Das kodierende Gen liegt auf Chromosom 20
. Die Immunfluoreszenz-Färbung (Abbildung 5) zeigt, dass das vom Ant S2 erkannte Antigen repp86 bei Interphase-Zellen in der S
verteilt ist, wohingegen es während der Mitose am Spindelp und der Mitosespindel vorliegt (Heidebrecht et al. 2003). Doppelimmunfluoreszenzfä
S2 konnten zeigen, dass nach Beendigung der Zellteilung repp86 sofort abgebaut wird. Seine Halbwertszeit beträgt 1 Stunde. Somit zeigt sich, das
ierenden Zellen exprimiert wird (Heidebrecht et al. 1997)
Färbung von repp86 mittels Ki-S2-Antikörper und Sekundärantikörper (Fluore (Heidebrecht et al. 2003)
repp86 assoziiert in der Metaphase mit dem Spindelapparat (linke Graphik) Verteilung von repp86 im Nukleus während der Interphase (rechte Graphik)
r 1997 von Heidebrecht et al. mit- Technik generiert wurde und in die Familie der Proliferationsmarker
Heidebrecht et al. ein bisher detektieren. Dieses Kernprotein, mit einem Molekulargewicht von ca. 100kDa wird von den Autoren in der Literatur associated protein) bezeichnet
und M-Phase des auf Chromosom 20 (Heidebrecht , dass das vom Anti- Zellen in der S- und G2-Phase während der Mitose am Spindelpol . Doppelimmunfluoreszenzfär- S2 konnten zeigen, dass nach Beendigung der Zellteilung repp86 sofort abgebaut wird. Seine Halbwertszeit beträgt 1 Stunde. Somit zeigt sich, dass repp86 aus-
al. 1997).
Antikörper und Sekundärantikörper (Fluores-
34
2.1.2.2 Expression im gesunden Gewebe und im Tumorgewebe
Ki-S2 konnte in gesunden Geweben mit proliferativer Aktivität nachgewiesen werden.
Im Knochenmark waren proliferierende Zellen, wie Promyelozyten, Myelozyten, Proe- rythroblasten und Erythroblasten (E1 und E2) positiv, wohingegen reife Granulozyten keine Reaktion zeigten. In Lymphfollikeln konnten in der dunklen Zone des Keimzent- rums eine erhöhte Reaktion verzeichnet werden. Im Hodengewebe zeigten Spermatogo- nien eine ausgeprägte Reaktion, wohingegen ausgereifte Spermien negativ waren (Hei- debrecht et al. 1997). Ki-S2 konnte ebenfalls in gesunder Mundschleimhaut detektiert werden (Fenner et al. 2005).
In zahlreichen Neoplasien konnte eine Ki-S2-Immunreaktion festgestellt werden, unter anderem im Burkitt-Lymphom, malignem Melanom, Mammakarzinom und Plattenepi- thelkarzinom der Mundhöhle (Fenner et al. 2005, Heidebrecht et al. 1997; Rudolph et al. 1999).
2.1.2.3 Bedeutung in der Onkologie
In zahlreichen retro- und prospektiven Studien konnte der Proliferationsmarker Ki-S2 (repp86) als prognoserelevanter Indikator (Rezidivrisiko, Überlebensrate) identifiziert werden. Die Proliferationsaktivität der Tumorzellen konnte beim Brustkrebs, Larynx- karzinom, Neuroblastom und Mantelzell-Lymphom in direkten Zusammenhang mit der Prognose und Überlebensrate gestellt werden (Cordes et al. 2010; Krams et al. 2003;
Rudolph et al. 1999; Schrader et al. 2005).
Rudolph et al. konnten in einer Langzeitstudie mit 371 schwedischen Frauen, welche an Brustkrebs erkrankt sind, die prognostische Relevanz von Ki-S2 zeigen. Dazu wurde ein Ki-S2-Markierungsindex (Anteil der Ki-S2 -gefärbten Tumorzellkerne) ermittelt. Bei Patientinnen mit einem Ki-S2 Index von <10% wurde keine statistisch signifikante Ver- ringerung der Überlebenswahrscheinlichkeit im Vergleich zu gesunden Frauen festge- stellt. Patientinnen mit einem hohen Ki-S2 Index hatten hingegen ein 20-fach erhöhtes Mortalitätsrisiko (Rudolph et al. 1999).
35
Bei Neuroblastom-Patienten konnte ein RI (repp86-Index) von >10% in direkter Korre- lation mit kürzerem krankheitsfreiem Intervall und höherer Mortalität gesetzt werden (Krams et al. 2003).
Auch Cordes et al. kamen bei Larynxkarzinomen zu einem ähnlichen Ergebnis. Patien- ten mit einer niedrigen Proliferationsaktivität hatten eine 5-Jahres-Überlebensrate von 95%, während Patienten mit hoher Proliferationsaktivität nur eine 5-Jahres- Überlebensrate von 23% hatten. Für die Studie wurde ein Ki-S2-Proliferationsindex (prozentualer Anteil der Ki-S2-gefärbten Tumorzellkerne in Bezug auf alle gezählten Tumorzellkerne) ermittelt. Eine hohe Proliferationsaktivität des Tumors wurde definiert als Ki-S2-Index >25% eine niedrige Proliferationsaktivität als Ki-S2-Index <25%.
Des Weiteren verglich die Forschergruppe die Proliferationsaktivität der Tumorzelle mit klinisch-pathologischen Parametern (Überleben, TNM-Klassifikation, Grading). So konnte gezeigt werden, dass Patienten mit einem N0-Stadium eine niedrigere Prolifera- tionsaktivität hatten als Patienten mit N1-Klassifikation. Gleiches konnte bei Patienten mit beziehungsweise ohne Fernmetastasen (M1 vs. M0) festgestellt werden. Die Korre- lation zwischen Proliferationsaktivität und Grading war signifikant. Je höher die Prolife- rationsaktivität desto geringer war der Differenzierungsgrad des Tumors (9,33% für G1, 23,91% für G2, 40,2% für G3, p=0,001; Cordes et al. 2010).
Durch die Messung eines Ki-S2-Index könnte die Therapie individueller auf den Patien- ten angepasst werden, um eine eventuell unnötige Chemotherapie zu ersparen, wenn diese keinen therapeutischen Nutzen hat (Rudolph et al. 1999).
2.1.3 PTEN
2.1.3.1 Molekularer Aufbau
PTEN ist ein Tumorsuppressorgen, welches dual als Lipid agieren kann (Planchon et al. 2008)
10q23 lokalisiert. Strukturell ist PTEN aus einer N (AS 1-185) und einer C-terminalen Domäne (AS 186
samt aus 403 Aminosäuren. Beide Domänen werden für enzymatische Aktivität benötigt (Planchon et al. 2008). Die C
dert: eine lipidbindende C2 PTEN Stabilität) und eine PDZ
Domäne, reduziert sich die Inhibitionsfähigkeit von PTEN bildung 6 zeigt einen schematischen Aufbau von PTEN.
Abbildung 6: Struktureller Aufbau von PTEN Die PEST-Domänen befinden sich zwischen der C2 (in dieser Grafik nicht dargestellt)
2.1.3.2 Funktion
Die Funktion von PTEN ist sowohl abhängig von seiner Lokalisation im Gewebe als auch von der Interaktionsfähigkeit als Lipid
im Zellkern, im Zytoplasma als auch an der Zellmembran lokalisiert. Als Lipid phosphatase nimmt es eine Schlüsselfunktion im PI3/Akt
Dowens. 2004). Als Protein Zellinteraktion (Wechselwirkung)
36
Molekularer Aufbau
PTEN ist ein Tumorsuppressorgen, welches dual als Lipid- oder Protein
(Planchon et al. 2008). Das kodierende Gen für PTEN ist auf Chromosom 10q23 lokalisiert. Strukturell ist PTEN aus einer N-terminalen Phosphatase Domäne
terminalen Domäne (AS 186-403) aufgebaut und besteht insg samt aus 403 Aminosäuren. Beide Domänen werden für enzymatische Aktivität benötigt
. Die C-terminale Domäne wird in vier Subdomänen untergli dbindende C2-Domäne, zwei PEST-Domänen (verantwor
PTEN Stabilität) und eine PDZ-Domäne (PDZ = Proteindomäne).
Domäne, reduziert sich die Inhibitionsfähigkeit von PTEN (Waite and Eng. 2002) zeigt einen schematischen Aufbau von PTEN.
Struktureller Aufbau von PTEN (Leslie and Dowens. 2004)
Domänen befinden sich zwischen der C2- und PDZ-Domäne in den Abschnitten 350
Die Funktion von PTEN ist sowohl abhängig von seiner Lokalisation im Gewebe als Interaktionsfähigkeit als Lipid- oder Proteinphosphatase. PTEN ist sowohl im Zellkern, im Zytoplasma als auch an der Zellmembran lokalisiert. Als Lipid phosphatase nimmt es eine Schlüsselfunktion im PI3/Akt-Signalweg ein
Als Protein-Phosphatase spielt es eine Rolle bei der Regulation der aktion (Wechselwirkung) (Planchon et al. 2008; Waite and Eng. 2002)
oder Protein-Phosphatase . Das kodierende Gen für PTEN ist auf Chromosom phatase Domäne 403) aufgebaut und besteht insge- samt aus 403 Aminosäuren. Beide Domänen werden für enzymatische Aktivität benötigt
terminale Domäne wird in vier Subdomänen unterglie- Domänen (verantwortlich für die
Fehlt die PDZ- (Waite and Eng. 2002). Ab-
Domäne in den Abschnitten 350-375 und 379-396
Die Funktion von PTEN ist sowohl abhängig von seiner Lokalisation im Gewebe als oder Proteinphosphatase. PTEN ist sowohl im Zellkern, im Zytoplasma als auch an der Zellmembran lokalisiert. Als Lipid-
Signalweg ein (Leslie and bei der Regulation der (Planchon et al. 2008; Waite and Eng. 2002).
37 Nukleäres und zytoplasmatisches PTEN
Nukleäres PTEN spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Chromoso- menstabilität und -integrität sowie bei der Regulation der DNA-Reparatur. Es wird auch als ‚Hüter der Genomintegrität‘ bezeichnet (Shen et al. 2007). Im Zytoplasma wirkt PTEN als Antagonist auf die PI3/Akt-Signaltransduktion. Dieser Signalweg koordiniert und leitet zahlreiche Zellprozesse wie Proliferation, Apoptose, Überleben und Wachs- tum der Zelle ein (Carnero et al. 2008; Leslie and Dowens. 2004) (siehe auch Kapitel 2.1.7.2 Abbildung 14). Ein Verlust der PTEN Expression bewirkt eine Steigerung der PI3/Akt Signaltransduktion, was mit gesteigertem Zellüberleben, Zellproliferation und Angiogenese einhergeht (Rahmani et al. 2012; Squarize et al. 2013).
2.1.3.3 Expression im gesunden Gewebe und im Tumorgewebe
Nukleäres PTEN konnte in zahlreichen gesunden Geweben nachgewiesen werden, unter anderem in Follikelzellen der Schilddrüse (Gimm et al. 2000), Myoepithelzellen der Brustdrüse (Perren et al. 1999) und Langerhanssche Inseln des Pankreas (Perren et al.
2000). Auch während der Embryogenese wird PTEN in zahlreichen Geweben expri- miert (u.a. zentrales und peripheres Nervensystem, Thymus, autonomes Nervensystem des Gastrointestinaltrakts, Ösophagusepithel und Leber) (Gimm. 2000).
In zahlreichen humanen Tumorentitäten konnte ein Verlust der PTEN Aktivität, bedingt durch genetische Mutationen am PTEN-Gen, nachgewiesen werden, unter anderen beim Mamakarzinom, Prostatakarzinom, malignen Melanom, Lungenkarzinom, Blasenkarzi- nom und Plattenepithelkarzinom des Kopf-Hals Bereichs (Alyasiri et al. 2013; Cairns et al. 1998; Celebi et al. 2000; Okami et al. 1998; Soria et al. 2002; Tokunaga et al. 2007;
Wang et al. 1998).
Einen immunhistochemischen Vergleich von PTEN im gesundem und im Tumorgewebe zeigt Abbildung 7 (Kurasawa et al. 2008).
