Aus der Abteilung Zellbiologie im Zentrum Anatomie der Medizinischen Hochschule Hannover
Untersuchungen zur Dissoziation der Proteinhülle von Clathrin-bedeckten Vesikeln
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Tobias Frank geboren 1978 in Bremen
Hannover 2007
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover
Präsident: Professor Dr. Dieter Bitter-Suermann
Betreuer der Arbeit: Professor Dr. Ernst Ungewickell
Referent: Professor Dr. Matthias Gaestel
Korreferentin: Professorin Dr. Beate Sodeik
Tag der mündlichen Prüfung: 18.02.2008
Promotionsausschussmitglieder: Professor Dr. Sigurd Lenzen
Professor Dr. Symeon Papadopoulos Professor Dr. Reinhard Schwinzer
I
Inhaltsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis... IV Abkürzungen ...VI
1 Einleitung...1
1.1 Einführung - Vesikeltransport in eukaryotischen Zellen...1
1.2 Clathrin-vermittelte Endozytose...3
1.2.1 Funktion der Clathrin-vermittelten Endozytose...4
1.2.2 Komponenten der Clathrin-vermittelten Endozytose...4
1.2.2.1 Clathrin...4
1.2.2.2 Adaptoren...6
1.2.2.3 AP180...7
1.2.2.4 Auxilin...8
1.2.2.5 Hsc70...10
1.2.3 Entstehung und Wiederverwertung von Clathrin-bedeckten Vesikeln...11
1.2.4 Regulation der Clathrin-vermittelten Endozytose...15
1.3 Aufgabenstellung und Zielsetzung...17
2 Material und Methoden...18
2.1 Material...18
2.1.1 Chemikalien...18
2.1.2 Geräte...18
2.1.3 Verbrauchsmaterialien...19
2.1.4 Enzyme und Proteine...19
2.1.5 Primärantikörper...20
2.1.6 Sekundärantikörper...20
2.1.7 Bakterienstämme...20
2.1.8 Kommerzielle Systeme...20
2.1.9 Lösungen und Puffer...21
2.2 Methoden...24
2.2.1 Molekularbiologische Methoden – allgemeiner Teil...24
2.2.1.1 Präparation von DNA (Plasmiden) aus E.coli Bakterien...24
2.2.1.2 Verdau von DNA mit Restriktionsendonukleasen...24
2.2.1.3 Reinigung von Nukleinsäuren...26
2.2.1.4 Agarosegelelektrophorese...27
2.2.1.5 Extraktion von DNA aus Agarosegelen...28
2.2.1.6 Ligation...28
2.2.1.7 Transformation von DNA in E.coli Bakterien...29
2.2.1.8 Klonierung von Oligonukleotiden...30
2.2.2 Molekularbiologische Methoden – spezieller Teil ...31
2.2.2.1 Erstellung eines Fusionsproteins aus einem AP180-Fragment und der J-Domäne (AP180(653-739)-J)...31
2.2.2.2 Erstellung eines Fusionsproteins mit einer kurzen Peptidsequenz (SDPWGSDPWG) und der J- Domäne (DPW-J)...32
2.2.3 Proteinexpression und Proteinaufreinigung...33
2.2.3.1 AP180(653-739)-J (Fusionsprotein mit 6x Histidinappendix)...33
2.2.3.2 DPW-J (Fusionsprotein mit GST-Appendix)...34
2.2.4 Proteinanalytik...35
2.2.4.1 TCA-Fällung...35
2.2.4.2 Fällung mit Ammoniumsulfat...35
2.2.4.3 Differenzielle Ultrazentrifugation...36
2.2.4.4 Konzentration von Proteinen durch Ultrafiltration...36
2.2.4.5 SDS-PAGE (Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese)...37
2.2.4.6 Western Blot...38
2.2.4.7 Photometrie...38
2.2.4.8 Dialyse...39
2.2.4.9 Chromatographische Trennmethoden...39
2.2.5 Transmissionselektronenmikroskopie...40
2.2.6 Auswertung...41
2.2.6.1 Densitometrie...41
2.2.6.2 Computerprogramme...42
2.2.7 Spezielle Methoden und funktionelle Untersuchungen...42
2.2.7.1 Präparation von Hsc70 aus Schweinehirn...42
2.2.7.2 Präparation von Clathrin-bedeckten Vesikeln ...44
2.2.7.3 Aufreinigung von Clathrin-Käfigen aus Clathrin-bedeckten Vesikeln...45
2.2.7.4 Herstellung von Clathrin ohne leichte Ketten...46
2.2.7.5 Trypsinverdau von Clathrin-bedeckten Vesikeln...46
2.2.7.6 Thrombinverdau von GST-Fusionsproteinen...47
2.2.7.7 Clathrinbindungsexperimente...47
2.2.7.8 Bindung von DPW-J an die Ohrdomäne von AP-2...48
2.2.7.9 Zusammenlagerung von Clathrin-Käfigen...48
2.2.7.10 Uncoatingexperimente...49
2.2.7.11 Aufreinigung von AP-2 per Hydroxyapatitchromatographie...50
2.2.7.12 Depletierung von Auxilin aus Clathrin-bedeckten Vesikeln...51
3 Ergebnisse...52
3.1 Die Rolle von Hsc70, Auxilin und Adaptorproteinen beim Uncoating...52
3.1.1 Einfluss auf Hsc70 zur Ausbildung der biphasischen Reaktionskinetik beim Uncoating...54
3.1.2 Komplexierung der CCV-Komponenten nach Uncoating?...55
3.1.3 Wiederzusammenlagerung (Reassembly) von dissoziierten Clathrin-Triskelia durch hohe Konzentrationen von Auxilin...58
III
3.2 Einfluss der leichten Ketten auf das Uncoating...62
3.2.1 Assoziation von Hsc70 mit leichten Ketten...62
3.2.2 Vergleich der Uncoating-Effektivität mit und ohne leichte Ketten...63
3.3 Funktion von DLL- und DPW-Motiven in Auxilin bei der Dissoziation der Clathrin-Hülle .66 3.3.1 Klonierung und Aufreinigung von AP180(653-739)-J und DPW-J aus BL-21 Zellen...66
3.3.1.1 AP180(653-739)-J ...66
3.3.1.2 DPW-J...68
3.3.2 Bindungsverhalten von AP180(653-739)-J und DPW-J ...69
3.3.2.1 Bindung von AP180(653-739)-J an Clathrin...69
3.3.2.2 Bindung von DPW-J an die Ohrdomäne von AP-2 ( -appendage)α ...70
3.3.3 Uncoating mit AP180(653-739)-J und DPW-J...70
3.3.3.1 Uncoating mit AP180(653-739)-J...71
3.3.3.2 Uncoating mit DPW-J...77
4 Diskussion...81
Zusammenfassung...89
Anhang...91
Literaturverzeichnis...92
Danksagung...98
Curriculum vitae...99
Erklärung nach § 2 Abs. 2 Nr. 5 und 6 PromO...100
Abbildungsverzeichnis
Abbildung Titel Seite
1.1 Endozytose von membranständigen Rezeptoren (LDL + Rezeptor) 1
1.2 Vesikeltransport innerhalb der eukaryotischen Zelle 2
1.3 Clathrin- und COP-bedeckte Vesikel 3
1.4 Clathrin 5
1.5 AP-1 und AP-2 6
1.6 AP180 8
1.7 Auxilin 9
1.8 Hsc70 11
1.9 Vesikelformation an der Plasmamembran 12
1.10 Clathrin-vermittelte Endozytose 13
1.11 Prinzip der ATP-abhängigen Reaktion von Hsc70 mit J-Proteinen 15
2.1 ECL-Reaktion 38
2.2 Ionenaustauschchromatographie eines Schweinehirnsubstrates 43
2.3 Affinitätschromatographie an ATP-Agarose zur Aufreinigung von Hsc70 44
2.4 Flussdiagramm – Präparation von Clathrin-bedeckten Vesikeln 45
2.5 Purifikation von Clathrin-Käfigen 46
3.1 Überblick über die für eine Uncoating-Reaktion wichtigen Komponenten 53
3.2 Einfluss des Uncoatings auf die Aktivität von Hsc70 55
3.3 Gelchromatographische Auftrennung der CCV-Komponenten nach Uncoating 56
3.4 Gelfiltration eines CCV-Tris-Extraktes mit Superose 12®-Säule 58
3.5 Reassembly nach Uncoating durch Auxilin 59
3.6 Titration von GST-J bei einer Uncoating-Reaktion 60
3.7 Reassembly-Aktivität von GST-Auxilin 61
3.8 Assoziation von Hsc70 mit leichten Ketten beim Uncoating 63
3.9 Uncoating-Aktivität in Abhängigkeit von den leichten Ketten 64
3.10 Kinetik einer Uncoating-Reaktion mit und ohne leichte Ketten 65
3.11 Vergleich der erstellten Fusionsproteine mit AP180 66
3.12 Klonierung von AP180(653-739)-J 67
3.13 SDS-PAGE nach präparativer Expression und Purifikation von AP180(653-739)-J 67
3.14 Klonierung von DPW-J 68
3.15 SDS-PAGE nach präparativer Expression und Purifikation von DPW-J 69
3.16 Bindung von AP180(653-739)-J an Clathrin-Käfige 69
3.17 Bindung von DPW-J an die α-Ohrdomäne 70
3.18 Uncoating von trypsinverdauten CCVs mit AP180(653-739)-J 71
3.19 Nähere Untersuchungen zur Uncoating-Fähigkeit von AP180(653-739)-J 72
3.20 Zusammenlagerung von Clathrin-Triskelia durch Auxilin und AP180(653-739)-J 73
3.21 Membranfragmente von CCVs nach Uncoating 74
V
Abbildung Titel Seite
3.22 Uncoating von Clathrin-Käfigen mit AP180(653-739)-J 75
3.23 Uncoating trypsinverdauter CCV-Pellets durch Auxilin nach Behandlung mit AP180(653-739)-J 76 3.24 Uncoating von H6-57 stabilisierten Clathrin-Käfigen mit AP180(653-739)-J 77
3.25 Uncoating trypsinverdauter CCVs mit DPW-J 78
3.26 Aufreinigung von Coat-Proteinen 79
3.27 Uncoating von Clathrin-Käfigen mit DPW-J 80
4.1 Bindungsstellen Auxilins an Clathrin 82
4.2 Clathrin-Käfige verschiedener Größe 85
4.3 Dynamik eines Uncoatings 87
Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
ADP Adenosin-5´-diphosphat AP Assemblyprotein
AP180 Assemblyprotein mit einer apparenten Molmasse von 180 kDa
AS Aminosäure
ATP Adenosin-5´-triphosphat ATPase Adenosin-5´-triphosphatase
Aux Auxilin
Bp Basenpaare
BSA Rinderserumalbumin (bovine serum albumin)
C- Carboxy-
CCV Clathrin-bedeckte Vesikel (clathrin coated vesicle) cDNA complementary DNA
CHC schwere Kette von Clathrin (clathrin heavy chain) CHCR clathrin heavy chain repeat
CIP Alkalische Phosphatase aus Kälberdarm (calf intestine alcaline phosphatase) CLC leichte Kette von Clathrin (clathrin light chain)
COP coat protein
Da Dalton
DD distale Domäne
DEAE O-2-Diethylaminoethyl
DNA Desoxyribonukleinsäure (desoxynucleic acid) dNTP Desoxyribonukleotidtriphosphat
DTT Dithiotreitol E.coli Escherichia coli
ECL enhanced chemoluminescence EDTA Ethylendiamintetraacetat
EGTA Ethylenbis(oxyethylennitrilo)-tetraacetat Epsin Eps15-interagierendes Protein
ER Endoplasmatisches Retikulum
FRAP Fluorescence Recovery After Photobleaching GAK Cyclin G assoziierte Kinase
VII
GBP Golgibindungspuffer GSH Glutathion
GST Glutathion-S-Transferase GTP Guanosin-5´-triphosphat GTPase Guanosin-5´-triphosphatase H6 6 x Histidin
HEPES [4-(2-Hydroxyethyl)-piperazino]-ethansulfonsäure HRP Meerrettichperoxidase (horseraddish peroxidase) Hsc70 konstitutiv exprimiertes Hsp70
Hsp70 Hitzeschockprotein mit einer Größe von 70 kDa IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactosid
kB kiloBasenpaare
LB Luria Bertani
mAb monoklonaler Antikörper (monoclonal antibody) MBN Mungobohnennuklease
MW Molekulargewichtsstandard (molecular weight)
N- Amino-
P Pellet
PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese PBS phoshate buffered saline
PCR Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction)
PD proximale Domäne
PI Phosphatidylinositol
PIC Phenyl-Isoamyl-Chloroform PIP Phosphatidylinositolphosphat PMSF Phenylmethylsulfonyfluorid
PTEN Phoshatase und Tensinhomolog deletiert auf Chromosom 10
RT Raumtemperatur
SDS Natriumdodecylsulfat (sodium dodecyl sulfate)
SH Src Homologie
TBE Tris-Borsäure-EDTA
TBST Tris-buffered saline with Tween 20 TD terminale Domäne
TE Tris-EDTA
TGN Transgolginetzwerk
Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
U Units
Ü Überstand
rpm Umdrehungen pro Minute UV Ultraviolett
Aminosäuren wurden entsprechend des Einbuchstabencodes abgekürzt. Die Symbole Φ, p und (-) wurden für große hydrophobe, polare bzw. saure Aminosäurereste verwendet.
Einleitung 1
1 Einleitung 1 Einleitung
1.1 Einführung - Vesikeltransport in eukaryotischen Zellen
Eukaryotische Zellen sind, im Gegensatz zu Bakterien, aus mehreren Kompartimenten aufgebaut. Diese Kompartimente, oder Zellorganellen, sind voneinander durch Membranen getrennt. Der Transport von Proteinen oder anderen Makromolekülen erfolgt unter anderem durch Transportpakete aus Membranen, die auf Grund ihrer Form und der Bestandteile Membranvesikel heißen. Dieser Prozess findet innerhalb der Zelle zwischen zwei Kompartimenten oder von außen in die Zelle statt [1].
Die Aufnahme von Stoffen in die Zelle wird Endozytose genannt. Damit ist die Zelle nicht nur in der Lage Nahrung aufzunehmen, sondern auch durch Aufnahme von Rezeptoren und konsekutiver Signaltransduktion mit anderen Zellen zu kommunizieren [2]. Man unterscheidet bei der Endozytose die Pinozytose und die Phagozytose. Bei der Pinozytose („cellular drinking“) enstehen kleine Membranvesikel, die nicht größer als 100 nm sind, während über die Phagozytose („cellular eating“) feste Bestandteile aufgenommen werden, die teilweise so groß wie die Zellen selbst sind (> 250 nm) [1]. Durch Endozytose aufgenommenes Material, das nicht aus den Endosomen zur Plasmamembran zurückgeführt wird (frühes Endosom), wird über späte Endosomen den Lysosomen zugeführt:
Abb. 1.1: Endozytose von membranständigen Rezeptoren (LDL + Rezeptor) Modifiziert nach Alberts, 2002.
Endozytose, wie aber auch Transport innerhalb der Zelle, funktioniert über zielgerichtete,
präzise regulierte Routen. Auch die Wiederverwertung von Membran-Rezeptoren erfolgt als ein Weg der endozytotischen Verkehrsrouten. Nach Abschnürung von der Plasmamembran fusioniert das Vesikel mit einem frühen Endosom. Im frühen Endosom findet eine Selektion der Vesikelfracht statt (eng.: Sorting). Die Liganden der Rezeptoren und Rezeptoren, die degradiert werden sollen (Signalherunterregulation), werden weiter zu späten Endosomen
„geschickt“ und gelangen dann weiter in Lysosomen (Abb. 1.2). Rezeptoren, die wieder zurück zur Zelloberfläche sollen, werden über recycling endosomes zur Plasmamembran transportiert. Ob ein Rezeptor zum recycling endosome oder späten Endosom gelangt, wird durch verschiedene Prinzipien vermittelt. Es sind zum Beispiel lysosomale Zielsignale identifiziert worden oder spezielle Motive in zytoplasmatischen Domänen die die Selektion beeinflussen. Außerdem soll die Ubiquitylierung von zytoplasmatischen Domänen eine Rolle spielen [3]. Allerdings ist noch kein Wiederverwertungssignal entdeckt worden, so dass man davon ausgeht, dass die Wiederverwertung stattfindet, wenn kein Signal vorliegt. Dann aber verlassen die wiederzuverwertenden Moleküle das frühe Endosom und finden sich in tubulären Strukturen wieder. Der Transport der recycling endosomes hängt anschließend vom Actin-Skelett und speziellen Myosin-Motoren ab.
Ein Beispiel für so einen Vesikeltransport, der im Inneren der Zelle beginnt und dann über den Extrazellularraum wieder seinen Weg in die Zelle findet, ist die Aufnahme eines sezernierten lysosomalen Enzyms über einen Mannose-6 Phosphat Rezeptor, welcher zuvor im rauhen ER synthetisiert worden ist [4].
Abb. 1.2: Vesikeltransport innerhalb der eukaryotischen Zelle Modifiziert nach Alberts, 2002.
Da die meisten Vesikel, die sich abspalten, aus spezialisierten Regionen hervorgehen, die auf ihrer zytoplasmatischen Seite noch mit spezifischen Proteinen bedeckt sind, entstehen bedeckte Vesikel (eng.: coated vesicles). Man unterscheidet Clathrin-bedeckte Vesikel
Einleitung 3
(clathrin coated vesicles = CCVs) und COPI- bzw. COPII- bedeckte Vesikel. Diese Bedeckung von Membranen ermöglicht, dass sich überhaupt ein Vesikel von einer Membran abschnüren und eine Selektion der Vesikelfracht vorgenommen werden kann. Klar ist allerdings nicht, ob sich erst die Fracht (z.B. Rezeptoren) oder die bedeckenden Proteine konzentrieren. Beschichtete Vertiefungen der Plasmamembran stellen somit einen wirkungsvollen Aufnahmemechanismus dar, um spezifisch Makromoleküle aus der extrazellulären Flüssigkeit aufzunehmen, die teilweise nur in sehr geringen Mengen vorkommen.
COPII-bedeckte Vesikel vermitteln den anterograden Transport vom Endoplasmatischen Retikulum zum Golgi-Apparat. Der retrograde Transport von Proteinen, die den Golgi- Apparat verlassen und zum ER zurückkehren, wird durch COPI-bedeckte Vesikel vermittelt [5] (Abb. 1.3).
Abb. 1.3: Clathrin- und COP-bedeckte Vesikel Modifiziert nach Alberts, 2002.
CCVs sind an vielen selektiven Transporten von membrangebundenen Proteinen beteiligt. Sie transportieren dabei Lipide und Proteine zwischen den Kompartimenten [6]. Einerseits sind sie hierbei wichtig für die Beförderung von lysosomalen Enzymen aus dem Golgi-Apparat und somit für die Funktion von Lysosomen und Sekretionsgranula [7]. Andererseits sind CCVs entscheidend bei der Rezeptor-vermittelten Endozytose, was auch der Gegenstand dieser Dissertation ist. Es gibt verschiedene Formen der Rezeptor-vermittelten Endozytose.
Die bei weitem wichtigste ist die Clathrin-vermittelte Endozytose. Dieser Prozess ist schon seit den sechziger Jahren bekannt und ein sehr gut untersuchter Vorgang [8].
1.2 Clathrin-vermittelte Endozytose
1.2.1 Funktion der Clathrin-vermittelten Endozytose
Die Rezeptor-vermittelte Endozytose ist ein Spezialfall der Pinozytose und ein regulierter und selektiver Prozess, dem die Bindung von Makromolekülen an spezifische Rezeptoren der Plasmamembran vorausgeht. Neben der Internalisierung und Wiederverwertung von Rezeptoren ist sie auch an der Nahrungsaufnahme, der Aufnahme und Neubildung synaptischer Vesikel, der Aufnahme von Antigenen und der Signaltransduktion beteiligt [2].
Beispiele sind die Aufnahme von LDL über LDL-Rezeptoren oder die Aufnahme von Insulin über Insulin-Rezeptoren. Auch der Eisenstoffwechsel des Menschen ist von der Rezeptor- vermittelten Endozytose abhängig. Eisen, als zentrales Element für die Hämoglobinsynthese (und somit für den Sauerstofftransport), wird im Serum fast ausschließlich an das β-Globulin Transferrin gebunden transportiert. Um in die unreifen Erythrozyten zu gelangen, besitzt die Erythrozytenmembran einen Transferrinrezeptor, der als Rezeptor-Transferrin-Eisen-Komplex über die Rezeptor-vermittelte Endozytose in die Zelle aufgenommen wird, wo dann das Eisen verwertet werden kann.
Gut untersucht ist auch die Funktion von Clathrin in Neuronen. Viele Proteine, die bei der Bildung von CCVs eine Rolle spielen, haben eine neuronenspezifische Form. Sie sorgen dafür, dass die Membran von synaptischen Vesikeln nach der Ausschüttung von Neurotransmittern endozytiert wird und regulieren die Größe des synaptischen Vesikels [5].
Für das Immunsystem spielen CCVs eine wichtige Rolle, weil sie sowohl an der Aufnahme des T-Zell-, wie auch des B-Zell-Rezeptors beteiligt sind. Somit können sie die Expression von Antigenrezeptoren auf der Zelloberfläche, sowie die Präsentation von MHC Klasse II Molekülen beeinflussen [5].
Störungen in der Rezeptor-vermittelten Endozytose sind meistens gravierend. Bei einer Form der familiären Hypercholesterinämie ist ein Erkennungssignal in der zytoplasmatischen Domäne des LDL-Rezeptors defekt. Auch die hereditäre Hämochromatose resultiert aus einem Defekt der Rezeptoraufnahme [9]. CCVs spielen auch eine wichtige Rolle bei der Aufnahme von Viren. Sie bilden die Pforte für die Infektion, zum Beispiel mit Influenza- Viren.
Einleitung 5
1.2.2 Komponenten der Clathrin-vermittelten Endozytose
1.2.2.1 Clathrin
Das Protein Clathrin (griech.: Clathrate = wie ein Käfig) wurde 1976 von Barbara Pearse enteckt [10]. Es besteht in seiner Grundstruktur aus einem Triskelion (griech.: dreibeinig) (Abb. 1.4). Ein Triskelionbein besteht aus einer schweren Kette, der eine leichte Kette angelagert ist. Die schweren Ketten werden von 1675 Aminosäuren (AS) gebildet und haben eine Größe von 192 kDa [11]. Es werden vier Domänen unterschieden. Die C-terminale Domäne (auch Trimerisierungsdomäne genannt; AS 1675-1550) bildet mit den anderen schweren Ketten den Mittelpunkt oder die Nabe des Triskelions. Hier befinden sich auch die Bindungsstellen für die leichten Ketten. Nach außen folgt die proximale Domäne (PD; AS 1552-1074), die vorwiegend aus kurzen α-helikalen Segmenten besteht, die kurze Hohlnadelschleifen bilden. Eine ähnliche Struktur hat auch die distale Domäne der schweren Ketten (DD; AS 1073-495), die durch eine leichte Krümmung von der proximalen Domäne getrennt ist. Insgesamt kommt dieser sogenannte CHC repeat sieben Mal in der gesamten schweren Kette vor und trägt zur Trimerisierung der Triskelia bei [5]. Am Ende eines Triskelionbeines befindet sich die globuläre terminale Domäne (TD; AS 494-1). Sie bildet eine β-Propeller Struktur mit 7 „Blättern“ aus und enthält unter anderem Bindungsstellen für AP-2 [12], AP180 [13, 14] und Auxilin [15]. Die TD ist über einen α-zig-zag linker mit der distalen Domäne verbunden [16].
Abb. 1.4: Clathrin
A) Transelektronenmikroskopische Aufnahme von Clathrin-Triskelia (Ungewickell und Branton 1981). B) Schematische Übersicht über die Komponenten eines Clathrin-Käfiges (Nathke et al., 1992). C) Dreidimensionale Rekonstruktion eines Clathrin-Käfiges (nach Smith et al., 1998).
Die leichten Ketten (LC) von Clathrin liegen in zwei verschiedenen Formen vor: LCa und
LCb. Ein funktioneller Unterschied zwischen LCa und LCb scheint nur in höher organisierten Organismen vorhanden zu sein, da LCa und LCb je nach Gewebeursprung in verschiedenem Maße exprimiert werden. Sie stimmen in 60% der Aminosäuresequenz überein und sind zwischen 25-29 kDa groß. Auffällig ist, dass sie stark negativ geladen sind (in der Gelelektrophorese entspricht ihre Motilität Polypeptiden mit Größen zwischen 30-36 kDa).
Ohne leichte Ketten können die schweren Ketten schon bei physiologischem pH zu Käfigen polymerisieren. Wenn leichte Ketten binden, tritt diese Zusammenlagerung erst bei einem pH unter 6,5 auf. Adaptoren (s. auch 1.2.2.2) können den inhibitorischen Effekt der leichten Ketten wieder aufheben und die Zusammenlagerung der Triskelia bei physiologischem pH stimulieren. Damit könnten die leichten Ketten verhindern, dass Triskelia im Zytosol zu Aggregaten zusammenlagern und so die Zusammenlagerung von Clathrin modulieren [17 - 19]. Die leichten Ketten sollen auch Hsc70 stimulieren, zusammengelagertes Clathrin zu dissoziieren [19, 20] und scheinen für die in vivo Trimerisierung der schweren Ketten nötig zu sein [21].
Fasst man nun schwere Ketten und leichte Ketten zusammen, erreicht ein Triskelion eine Größe von ca. 650 kDa (3 schwere Ketten + 3 leichte Ketten). Wenn sich mehrere Triskelia zusammenlagern, zum Beispiel um einen Membranvesikel, ensteht eine polyhedrale Struktur mit exakt 12 Pentagonen und einer variablen Anzahl an Hexagonen die einen Vesikel umhüllen kann.
1.2.2.2 Adaptoren
Adaptorproteine sind Komponenten von CCVs, die Clathrin mit Membranen verbinden. Sie wurden als clathrin assembly factor 1979 von Keen et al. entdeckt [22]. Man unterscheidet AP-1 und AP-2. Sie verbinden Clathrin mit der Plasmamembran (AP-2) oder den Membranen des trans-Golgi-Netzwerkes (AP-1). Adaptoren induzieren aber nicht nur die Zusammenlagerung von CCVs, sondern sind auch an der Selektion der Vesikelfracht beteiligt und rekrutieren akzessorische Proteine, die die Vesikelform regulieren.
Einleitung 7
Abb. 1.5: AP-1 und AP-2
Schematische Darstellung der AP-1- und AP-2-Komplexe (aus Robinson und Bonifacino, 2001).
Die Adaptoren sind Heterotetramere mit zwei großen Untereinheiten von 100-130 kDa (γ und β1 in AP-1; α und β2 in AP-2), einer mittelgroßen Untereinheit von 50 kDa (μ1/μ2) und einer kleinen Untereinheit von 17-20 kDa (σ1/σ2) (Abb. 1.5). Elektronenmikroskopische Aufnahmen konnten eine typische Morphologie der Adaptoren aufzeigen. So weisen Adaptoren nicht nur eine Kernregion aus den oben beschriebenen Untereinheiten auf, sondern noch „Anhängsel“ (eng.: appendage domain). Damit sehen die Adaptoren aus wie ein Kopf mit Ohren. Die Ohrdomänen sind über ein Scharnier (eng.: hinge region) mit dem Kopf verbunden.
Durch Peptidbindungsexperimente und kristallographische Methoden wurden den jeweiligen Untereinheiten verschiedene Domänen und Motive zugewiesen, die mit bestimmten Funktionen verknüpft sind. So haben die α- und γ-Untereinheiten am N-terminalen Ende Bindungsseiten für Phosphoinositide. Bekannt ist auch, dass an die α-Ohrdomäne Proteine binden können, die DΦF/W-, FxbxF- oder WxxW-Motive haben. Das kann zum Beispiel Auxilin, AP180 oder Epsin 1 sein. In der β-Untereinheit wurde ein sogenanntes Clathrin-Box- Motiv charakterisiert, das für die Bindung an Clathrin verantwortlich ist. Das Motiv hat die Sequenz: [L (L,I) (D,E,N) (L,F) (D,E)] [23]. Auch in anderen Proteinen wie AP180, Amphiphysin oder AP-3 kommt ein Clathrin-Box-Motiv vor. Es hat die Sequenz WDPW oder LMDLA [24]. Den Clathrin-Box-Motiven ist gemeinsam, dass sie mit der terminalen Domäne von Clathrin interagieren können. Eine Variante des Clathrin-Box-Motives wurde in der γ- Untereinheit von AP-1 entdeckt: LLDLL [25].
1.2.2.3 AP180
Auch an synaptischen Membranen spielt die Clathrin-vermittelte Endozytose eine wichtige Rolle. Dieser Prozess setzt die Anwesenheit von AP180 voraus. Es wurde zunächst als spezifische Komponente von CCVs in Neuronen entdeckt [26]. AP180 ist ein
Phosphoprotein, das an Serinresten phosphoryliert werden kann. Das ensprechende Homolog in anderen Geweben ist das Protein CALM (clathrin assembly lymphoid myeloid leukemia protein) [27].
AP180 fördert die Zusammenlagerung von Clathrin und bestimmt die Größe der CCVs [28 - 30]. Bei der synaptischen Übertragung ist nicht nur die Freisetzung von Neurotransmittern von entscheidender Bedeutung, sondern auch die Wiederverwertung der Membranen. Die Schlüsselschritte dieses Vorgangs bestehen - ähnlich der Rezeptor-vermittelten Endozytose - aus Abschnürung des Vesikels von der Membran und Clathrin-Dissoziation, damit die Vesikel ins Zytoplasma gelangen können [31].
AP180 ist ein monomeres Protein mit einer Größe von ca. 92 kDa (Abb. 1.6). Es verfügt am N-terminalen Ende über eine ANTH-Domäne, die für die Bindung an PIP2 verantwortlich ist (AP180 N-terminal homology domain). Diese konservierte Domäne, die auch in anderen Proteinen zu finden ist, ist für die Regulation der Vesikelgröße und Bindung an Membranen wichtig [31, 32].
C-terminal befinden sich Motive, die für die Bindung an Clathrin verantwortlich sind. Das wichtigste Motiv ist das DLL-Motiv, welches die Bindung an Clathrin vermittelt und die Zusammenlagerung zu Käfigen fördert [13]. Ein weiteres wichtiges Motiv ist das DΦF/W- Motiv (s.a. 1.3.2), das in Form von DPF- oder DPW-Motiven die Assoziation mit AP-2 vermittelt.
Abb. 1.6: AP180
Schematische Darstellung von AP180 einschließlich relevanter Bindungsmotive.
AP180 hat einige ungewöhnliche molekulare Eigenschaften. In den meisten SDS-PAGE- Systemen migriert die AP180-Bande wie ein 155-180 kDa großes Polypeptid (eigentliche Größe nach Sequenz 92 kDa, abhängig von der Splice-Variante) [33]. Zusätzlich hat es einen sehr niedrigen Extinktionskoeffizienten und wird nur sehr schwach von Coomassie Brilliant Blau gefärbt. Außerdem kann es leicht durch proteolytische Enzyme angegriffen werden. Der Grund für diese Eigenschaften liegt in der ungewöhnlichen Struktur von AP180. Neben der ANTH-Domäne ist der carboxyterminale Teil von AP180 nur sehr schwach strukturiert und verhält sich wie ein flexibles Polymer. Die Folgen sind ein geringer Sedimentationskoeffizient und eine Resistenz gegen Hitzedenaturierung des C-terminalen Bereiches. Außerdem verhindern die negativ geladenen Aminosäuren in diesem Bereich die Bindung von SDS und
ANTH
Einleitung 9
Coomassie, was das besondere Laufverhalten in der SDS-PAGE erklärt. Ein Modell, das die Struktur von AP180 erklärt, geht davon aus, dass AP180 mit der ANTH-Domäne in Regionen an der Plasmamembran bindet, wo hohe Konzentrationen von PIP2 vorkommen. Mit dem flexiblen carboxyterminalen Segment könnte es dann Clathrin und AP-2 „einfangen“ und an der Plasmamembran konzentrieren [32].
1.2.2.4 Auxilin
Auxilin wurde ursprünglich als neuronale Komponente von CCVs entdeckt [34]. Es kommt aber auch eine Form vor, die in allen Säugetierzellen vorhanden ist – Auxilin 2 [35]. Auxilin 2 ist auch als GAK bekannt, weil es eine Cyclin G-assoziierte Kinase ist. Beiden Auxilins ist gemeinsam, dass sie am N-terminalen Ende eine PTEN- und Tensin-Homologie- Domäne besitzen. Die PTEN-Domäne, die enzymatisch inaktiv ist, bindet an Ptd(4)P [36]. Der PTEN- Domäne folgt in beiden Auxilins ein Clathrinbindungssegment und eine J-Domäne. Auxilin 2 unterscheidet sich von Auxilin durch eine aktive Serin/Threonin Proteinkinase-Domäne, die sich N-terminal zwischen AS 40-315 befindet.
Auxilin besteht aus 910 AS und hat eine Größe von ca. 110 kDa (Abb. 1.7). Das Clathrinbindungssegment liegt zwischen AS 547-813. Danach folgt von AS 814-910 die J- Domäne, die als Kofaktor beim Uncoating von CCVs mitwirkt. Die J-Domäne zeigt große Homologien zu anderen eukaryotischen DnaJ-Proteinen und zu bakterieller DnaJ auf [37].
Der Rest von Auxilin ist einzigartig. Das bestätigt, dass DnaJ-Proteine als gemeinsames Strukturprinzip über konservierte Domänen verfügen und über Domänen, die spezifisch für jedes Protein sind [38].
Die AS 1-546 sind für das Uncoating in vitro nicht entscheidend. Die PTEN-Domäne könnte aber eine regulatorische Funktion ausüben [39].
Abb. 1.7: Auxilin
Schematische Darstellung von Auxilin1 (nach Umeda et al., 2000).
Über das Clathrinbindungssegment kann Auxilin 2 auch AP-1 und AP-2 binden [15, 35].
Owen et al. zeigten 1999, dass die beiden DPF/W-Motive im Clathrinbindungssegment eine Rolle bei der Interaktion mit AP-2 spielen. Diese DPF/W-Motive sind auch in AP180 und Epsin 1 vorhanden und die Anzahl dieser Motive scheint mit der Bindungsaffinität zur α- Ohrdomäne von AP-2 zu korrelieren [40]. Scheele et al. zeigten, dass auch Auxilin über diese
Motive an die α-Ohrdomäne bindet, sowie die Bindung mit der β2-Ohrdomäne von AP-2 vermittelt [41].
Die Bindung an Clathrin erfolgt über die bekannten Motive DLL (an die terminale Domäne/proximale Domäne) und DPF (distale Domäne). Neue Motive, die kürzlich entdeckt wurden, sind FS, WDW und NWQ. Damit besitzt Auxilin multiple Motive, um an alle Domänen der schweren Kette von Clathrin binden zu können [41]. Diese Motive gehören nicht zu den bekannten Clathrin-Box-Motiven und erweitern die mögliche Interaktion mit Clathrin.
Die Relevanz der Bindung an die terminale Domäne wurde unterschätzt, weil Ungewickell et al. 1995 zeigten, dass die Bindung von Auxilin an die proximale oder distale Domäne ausreicht, um ein Uncoating zu vermitteln [37]. Die Verwendung von trypsinverdauten Clathrin-Käfigen ohne die TD, weist darauf hin, dass die TD für die Funktion von Auxilin beim Uncoating keine Bedeutung hat.
CD-spektroskopische Daten [41] und ältere NMR-Daten [42, 43] demonstrieren, dass das Clathrinbindungssegment keine Struktur besitzt und die J-Domäne über α-helikale Strukturen verfügt. Das ist vergleichbar mit den Clathrinbindungsdomänen in AP180 oder Epsin 1 [43, 32].
Funktionell wurde Auxilin ursprünglich als Protein beschrieben, das an der Zusammenlagerung von Clathrin zu Käfigen beteiligt ist [34] (auxiliare = lat.: helfend, unterstützend). Diese Funktion tritt bei relativ hohen Konzentrationen von Auxilin auf. Bei niedriger Konzentration kann es die Dissoziation von CCVs und aufgereinigten Clathrin- Käfigen induzieren. Auxilin wirkt dann als katalytischer Kofaktor. Das geschieht im Zusammenspiel mit Hsc70, einem Hitzeschockprotein, wobei der entscheidende Teil von Auxilin, der mit Hsc70 interagiert, die J-Domäne ist [37, 44 - 46]. Über Sequenzanalysen und Mutationsexperimente konnte das HDP-Motiv in der J-Domäne als zentrales Hsc70- Bindungsmotiv identifiziert werden [47].
1.2.2.5 Hsc70
Hsc70 ist ein Protein, welches im Zytosol aller Zellen vorkommt und ursprünglich als Hitzeschockprotein identifiziert wurde. Es zeigt Homologien zu dem Protein BiP und anderen Hitzeschockproteinen vergleichbarer Größe (alle um 70 kDa) auf. Hitzeschockproteine binden an entfaltete Abschnitte denaturierter Proteine und verhindern deren Präzipitation innerhalb der Zelle. Weil sie die Faltung vieler Proteine unterstützen und verhindern, dass Proteine eine falsche Konformation einnehmen, werden sie auch Chaperone („Ammenproteine“) genannt [4].
Einleitung 11
Hsc70 (heat shock cognate) ist die konstitutive Form des Hitzeschockproteins Hsp70 (heat shock protein). Es ist somit immer in der Zelle vorhanden und wird nicht nur bei „Stress“
exprimiert. Die Funktionen von Hsc70 sind vielfältig. Es wirkt bei der korrekten Faltung von Proteinen mit, bei der Translokation von Proteinen durch Membranen, bei der Reorganisation von makromolekularen Komplexen und bei der Dissoziation von Proteinkomplexen [48, 49].
Hsc70 hat eine Größe von ca. 70 kDa und besteht aus 3 Abschnitten [50] (Abb. 1.8). N- terminal befindet sich eine ATPase Domäne, die ca. 45 kDa groß ist. Es folgt eine 15-18 kDa große Substratbindungsdomäne, deren Struktur zweigeteilt ist. Die erste Hälfte besteht aus einer β-sandwich-Domäne mit zwei viersträngig antiparallelen β-Faltblättern, dann folgen α- Helices [51]. Die C-terminale Domäne kann enzymatisch abgespalten werden und ergibt dann ein Fragment von 10 kD Größe. Ohne diese 10 kDa-Domäne kommt es zu einer deutlich geringeren Stimulation der ATPase Aktivität durch Auxilin [47]. Der C-Terminus ist auch die Domäne, die am wenigsten konserviert und relativ variabel ist [52].
Abb. 1.8: Hsc70
Schematische Darstellung von Hsc70 modifiziert nach Wakeham et al. 2000.
Hsc70 und andere Proteine dieser Klasse wie z.B. das bakterielle Dank sind dafür bekannt, Interaktionen mit J-Domänen einzugehen. Dabei können die J-Domänen die ATPase-Domäne von DnaK und Hsc70 stimulieren. Die Kombination der Substratbindungsdomäne von Hsc70 mit der J-Domäne von Auxilin erlaubt Hsc70 erst mit seinem spezifischen Substrat zu interagieren.
Die Interaktion von Hsc70 mit seinen Bindungspartnern ist ATP-abhängig. Dabei hat Hsc70 eine hohe Affinität zu Polypeptiden, wenn es im ADP-Zustand ist. Im ATP-Zustand ist es
„aktiviert“. Das heißt, dass es sofort eine Bindung eingeht, wenn ein Partner angeboten wird [53, 54]. Hier kommt die Struktur von Hsc70 zum Tragen. Die Substrate können in einem Kanal gebunden werden, der durch die β-sandwich-Struktur der Substratbindungsdomäne
erzeugt wird. Die α-Helices sind flexibel und können den Kanal wie ein Deckel verschließen [47]. Mit seinem Kanal und dem flexiblen Deckel kann es zu Wechselwirkungen zwischen dem gebundenen Protein und Hsc70 kommen – zum Beispiel um Bindungen aufzubrechen.
Man könnte Hsc70 auch mit einer Schachtel vergleichen, deren Deckel schließt, sobald Hsc70 im ADP-Zustand ist. Wenn Hsc70 im ATP-Zustand ist, geht der Deckel auf und es erfolgt die Freisetzung bzw. Bindung neuer Peptide oder Proteine.
1.2.3 Entstehung und Wiederverwertung von Clathrin-bedeckten Vesikeln
Bei der Enstehung von Membranvesikeln bildet ein Teil der Donor-Membran zunächst eine vesikuläre „Knospe“. Dann schnürt sich ein Vesikel ab, um anschließend wieder mit einer Zielmembran zu fusionieren. Dadurch gelangt der Inhalt des Vesikels in das Zielkompartiment (Abb. 1.9).
Abb. 1.9: Vesikelformation an der Plasmamembran Aus: Alberts, 2002.
Bei der Clathrin-vermittelten Endozytose lagern sich Clathrinmoleküle zunächst an der zytosolischen Seite der Plasmamembran an (Abb. 1.10). Die Interaktion von Clathrin mit der Plasmamembran erfolgt nicht direkt, sondern über Adaptorproteine (AP-2) und andere akzessorische Proteine wie zum Beispiel Epsin [2].
Die Anlagerung von Clathrin an der Plasmamembran erzeugt zunächst eine charakteristisch aussehende Bedeckung, die schon in den sechziger Jahren als „Stachelsaum“ beschrieben wurde [8]. Es entsteht zunächst eine vesikuläre Grube (eng: coated pit). Die Grube reift zu einem Vesikel mit einem polygonalem Käfig aus Fünf- und Sechsecken (Maturation) .
Die Abspaltung des ausgebildeten CCVs von der Membran setzt die Aktivität der GTPase Dynamin voraus. Die GTP-Hydrolyse von oligomeren Dynamin-Ringen um den „Hals“ des CCV an der Plasmamembran ist eine Vorraussetzung für die Abschnürung des Vesikels. Es werden mehrere Möglichkeiten diskutiert, wie dieser Vorgang abläuft: direkte Konstriktion (Durchschnürung: eng.: `Pinchase´) und helikale Dynamin-Expansion am „Hals“ des Vesikels (`Poppase´) [55, 56].
Einleitung 13
Abb. 1.10: Clathrin-vermittelte Endozytose Modifiziert nach Takei, 2001.
Damit die Vesikelfracht an den Ort ihrer Bestimmung gelangen kann, muss der Clathrin-Käfig verschwinden. Diese Dissoziation von Clathrin (Uncoating) wird hauptsächlich durch das DnaJ-Homolog Auxilin und dem Hitzeschockprotein Hsc70 vermittelt. Schon 1984 konnten Schlossmann et al. zeigen, dass für diesen Vorgang eine sogenannte `Uncoating ATPase´
benötigt wurde. Dieses Protein wurde als Hitzeschockprotein mit einer Größe von 70 kDa charakterisiert [57]. Der Uncoating-Prozess findet in einer ATP-abhängigen Reaktion statt [58]. Prasad et al. zeigten 1993, dass für diese Reaktion ein Kofaktor mit eine Größe von 100 kDa nötig ist, der diese Reaktion reguliert [59]. Überraschenderweise wurde dieser Kofaktor als Auxilin identifiziert, obwohl es eher als Assembly-Protein bekannt war [37]. Ungewickell et al. stellten fest, dass Auxilin mit hoher Affinität an zusammengelagertes Clathrin bindet und in der Anwesenheit von ATP Hsc70 rekrutieren kann. Genauere Strukturanalysen zeigten, dass für diese Reaktion der mittlere Teil von Auxilin (AS 547-813) für die Bindung an Clathrin und die J-Domäne (AS 814-910) für die Rekrutierung von Hsc70 essenziell sind [60]. Zwar geht die J-Domäne auch alleine mit Hsc70 in Reaktion (es folgt schnelle Hydrolyse von gebundenem ATP), aber für das Uncoating sind der Bindungsteil und die J-Domäne erforderlich.
Die Uncaoting-Reaktion ist ein inzwischen sehr gut untersuchter Prozess. Mit der Entdeckung von Auxilin 2, das in allen Zellen vorkommt [35] und den Untersuchungen zur Rolle von Hsc70 und Auxilin während der neuronalen Endozytose [61], wurde die Vermutung bestätigt,
dass es sich um eine ubiquitäres Geschehen handelt. Letztendlich wurde über Immunpräzipitation und Mutationsanalysen des DnaJ Proteins Aux1 von Saccharomyces cervisiae auch in vivo bewiesen, dass das Uncoating eine große physiologische Relevanz hat [62].
Obwohl noch genaue Kentnisse über den Ablauf des Uncoatings fehlen, stellt man sich den Vorgang folgendermaßen vor (s. Abb. 1.11 A):
Zunächst bindet Auxilin an Clathrin und rekrutiert Hsc70 mit seiner J-Domäne (ATP- Zustand). Die Interaktion mit der J-Domäne stimuliert die ATPase von Hsc70 und stabilisiert die Bindung von Hsc70 an Clathrin. Als nächstes vermittelt die J-Domäne die Hydrolyse von ATP und es entsteht ein metastabiler Komplex aus Auxilin-Hsc70-Clathrin und ADP+Pi. Auxilin kann sich vom Clathrin lösen und weitere Reaktionen katalysieren. Hsc70 verursacht wahrscheinlich Konformationsänderungen und destabilisiert Bindungen zwischen zwei
„Triskelia-Beinen“. Studien zeigten, dass die carboxyterminalen Enden der schweren Ketten in den Scheitelpunkt von jedem dreibeinigem Triskelion projizieren, so dass diese Scheitelpunkte dann in den „Gelenken“ der Triskelia liegen (Abb. 1.11 B). An diesem Scheitelpunkt können auf Grund variabler „Gelenkwinkel“ unterschiedliche Interaktionen stattfinden, so dass damit eine Regulation von Assembly und Uncoating des Clathrin-Käfigens stattfinden könnte. Einen weiteren regulatorischen Einfluss könnten auch die leichten Ketten ausüben [5, 19, 20]. Leichte Ketten können Clathrin-Käfige sowohl destabilisieren als auch deren Zusammenlagerung fördern. In vitro Studien belegten, dass eine LCa-ähnliche Sequenz in der Anwesenheit von Calcium die ATPase-Aktivität von Hsc70 stimulieren kann.
Allerdings ist dieser Einfluss nicht essenziell, da die Dissoziation von Clathrin auch ohne LCs stattfinden kann [63].
Einleitung 15
Abb. 1.11: Prinzip der ATP-abhängigen Reaktion von Hsc70 mit J-Proteinen
A) Schematische Darstellung einer ATP-abhängigen Reaktion von Hsc70 mit J-Proteinen. B) Darstellung der vulnerablen Überlappung mehrere Triskelia (aus: [64]).
Auch der genaue Ablauf des Uncoatings ist noch unklar. Einige Autoren glauben, dass sich nach dem Uncoating ein Komplex aus Clathrin, Hsc70, Auxilin und den Adaptoren bildet, der dann, je nach Komponenten, spezifische Eigenschaften hat, die das folgende Uncoating beeinflussen und freies Clathrin an der Membran zur Verfügung stellen [65, 66].
1.2.4 Regulation der Clathrin-vermittelten Endozytose
Am Vorgang der Rezeptor-vermittelten Endozytose sind noch eine Vielzahl von regulatorischen Proteinen beteiligt. Sie bilden ein fein abgestimmtes Netzwerk von Protein- Protein-Interaktionen aus, das die Clathrin-vermittelte Endozytose zu einem gut regulierten Prozess macht.
An den Interaktionen der verschiedenen Proteine untereinander sind häufig kurze Peptidsequenzen beteiligt. Als Beispiel sei das DLL-Motiv von AP180 genannt, das die Bindung an die globuläre terminale Domäne von Clathrin vermittelt.
Eine große Bedeutung haben auch Phosphoinositide bei der Regulation der rezeptor- vermittelten Endozytose. Viele Proteine, die an der Endozytosemaschinerie beteiligt sind, haben eine Affinität zu Phosphoinositiden. Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphat (PIP2)
A
B
Hsc70
S = Substrat
J = J-Protein (z.B. Auxilin)
scheint ein Schlüsselregulator bei der Formation, Abspaltung und dem Uncoating von CCVs zu sein. Eine Affinität zu PIP2 konnte unter anderem für Dynamin, AP-2, AP180, CALM und Epsin gezeigt werden. Die letzten beiden binden PIP2 über ihre ENTH-Domäne (epsin N- terminal homology-domain) [30]. Die Regulation der verschiedenen Phosphorylierungszustände der Phosphoinositide übernehmen spezielle Phosphatasen und Kinasen (z.B. Synaptojanin und Phosphatidylinositol-3-Phosphat-Kinasen) [39]. Auch die Affinität zu bestimmten Signalpeptiden, die mit den Adaptoren interagieren, ist vom Phosphorylierungszustand abhängig. So wurden zwei Bindungsstellen für Phosphatidylinositide in AP-2 entdeckt. Dieses YxxPhi-Motiv ist aber maskiert, so dass eine Bindung nur durch eine Konformationsänderung stattfinden kann. Diese Konformationsänderung wird durch Phosphorylierung vermittelt [67].
Genau wie die Phosphoinositide, ist die Funktion der akzessorischen Proteine aber auch vom Zustand der Phosphorylierung bzw. Dephosphorylierung abhängig [68]. Diese Abhängigkeit konnte für Dynamin, Amphiphysin und Synaptojanin gezeigt werden [69].
Einleitung 17
1.3 Aufgabenstellung und Zielsetzung
Die Dissoziation Clathrin-bedeckter Vesikel setzt die Interaktion von Auxilin mit Hsc70 voraus. Bindungsort von Auxilin ist die schwere Kette Clathrins, wobei multiple Domänen in der Struktur Auxilins zu finden sind, die die Assoziation an diversen Orten im Clathrin- Molekül erlauben. Ein Ziel dieser Arbeit war es, die funktionelle Relevanz einer Bindung von Auxilin an der terminalen Domäne Clathrins näher zu untersuchen. Kürzlich konnten Proteinmotive in Auxilin detektiert werden, die eine Bindung an die terminale Domäne vermitteln. Diese DLL-Motive finden sich auch in anderen akzessorischen Proteinen, wie zum Beispiel dem neuronalen Adaptorprotein AP-180, welches wichtig ist, damit Clathrin sich an der Plasmamembran anlagern kann. Ob diese Bindungsmotive auch beim Uncoating eine Rolle spielen, wurde mit einem Fusionsprotein untersucht, welches über mehrere DLL-Motive selektiv an der terminalen Domäne Clathrins binden sollte und über eine J-Domäne die ATPase-Funktion von Hsc70 stimulieren kann.
Eine ähnliche Fragestellung wurde mit einem zweiten Fusionsprotein untersucht, welches DPW als Bindungsmotiv und die J-Domäne als ATPase-Stimulator enthielt. Dieses Motiv ist allerdings kein Clathrinbindungsmotiv, sondern findet sich in Proteinen, die an AP-2 binden.
Da AP-2 im Clathrin-bedeckten Vesikel mit Clathrin assoziiert ist, stellte sich die Frage, ob eine Bindung über AP-2 ausreicht, um ein Uncoating von dieser Stelle im Clathrin-Käfig zu induzieren.
Ergänzt wurden diese Untersuchungen um Experimente, in denen die Dynamik und die Rolle der leichten Ketten und Hsc70 beim Uncoating eruiert wurden. Als wichtiges Protein, welches zu Aufbruch von Clathrin-Clathrin-Interaktionen führt, liegen keine Erkenntnisse vor, wie Hsc70 diese Reaktion vermittelt und was nach erfolgtem Uncoating passiert. Es ist bekannt, dass es von Auxilin rekrutiert wird und kürzlich konnten hochauflösende strukturelle Untersuchungen den wahrscheinlichen Ort dieser Reaktion detektieren. Hsc70 wird von Auxilins J-Domäne stimuliert und bindet in einer ATP-abhängigen Reaktion an Clathrin. Ob es zusätzlich an die leichten Ketten bindet wird widersprüchlich diskutiert. In kinetischen und thermodynamischen Experimenten wurde die Assoziation von Hsc70 mit leichten Ketten und anderen akzessorischen Proteinen untersucht.
Die Ergebnisse führten zu einem besseren Verständnis der molekularen Abläufe bei der Dissoziation Clathrin-bedeckter Vesikel und es konnte ein neues Modell entwickelt werden, wie Auxilin und Hsc70 interagieren.
2 Material und Methoden 2 Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Chemikalien
Alle Säuren und Basen wurden von Riedel de Häen bezogen. Sofern nicht gesondert angegeben, wurde Wasser verwendet, das über eine Milli-Q-Filteranlage der Firma Millipore gereinigt und vollentsalzt war.
2.1.2 Geräte
Gerät Modell Hersteller
Blotapparatur MHH-Forschungswerkstätten
Brutschrank B12 Function line Heraeus
Digitalkamera Coolpix 995 Nikon
Eismaschine Scotsman
Elektronenmikroskop EM-10 C Zeiss
Elektrophoresekammer für Agarose- Gele
BioRad Elektrophoresekammer für SDS-
PAGE
Mighty-Small II G & E
Elektroporator MicroPulser BioRad
Entwickerlmaschine Typ TR Optimax
Fotoapparat Oscilloplot M4 Polaroid
FPLC-Sytem Controller LCC-501 Plus
Pumpe P-500
Pharmacia Optical Unit UV-1
x/t-Schreiber REC-102 Fraktionssammler FRAC-100
Rotationsinkubator 3025 GFL
Heizblock Dri-Block DB-2A Techne
Küchenmixer Waring
Kühlgerät für SDS-PAGE F12 Jalabo
Kühlschränke 4°C
-80°C
Liebherr GFL
Netzgerät PowerPac 300, PowerPac 1000 BioRad
pH-Meter MultiCal WTW
Photometer DU-640 Spectrophotometer Beckman
Pipetten Nichipet EX
Reinstwasseranlage MilliQ Millipore
Reprogerät 250 W - Birne/Photolita Leitz
Säulen : Superose 6 prep grade Pharmacia
Superose 12 HR 10/30 Superdex 200 HR 10/30
Schüttelinkubator KS 15A Control Edmund Bühler
Scanner Duoscan Agfa
Thermocycler UNO-Thermoblock Biometra
Ultraschallgerät Sonifier 250 Branson
UV-Leuchttisch UVT-20 S Herolab
Vortex Vortex-Genie 2 Scientific Industries
Material und Methoden 19
Waage AC 2115 Sartorius
Wasserbad WB 29 Memmert
Wippinkubator Duomax 1030 Heidolph
Zentrifugen:
Tischzentrifugen 5410 Eppendorf
Optima LE 80K (Rotor 45Ti) Beckman
5417R Eppendorf
Megafuge 1.0 R Heraeus
Standzentrifunge J2-HS (Rotor JA-10/JA-20) Beckman
Ultrazentrifugen Optima 100 TL (Rotor TLA 45 und 100.4) Beckman
2.1.3 Verbrauchsmaterialien
Material Modell Hersteller
Blotpapier 3 mm Chr Whatman
Centricon Centricon-10, Centricon-30 Amicon
Centriprep Centriprep-30 Amicon
Dialyseschläuche Spectra/Por 1 Spectrum Medical Industries
Gaze
Gelfiltrationssäulen NAP-5, NAP-10, PD-10 Amersham
Nitrozellulosemembran Protran Schleicher & Schuell
Parafilm M American National Can
Pasteurpipetten Brandt
Pipetten-Spitzen Plastibrand Brandt
Plastikklammern Spectrum Medical Industries
Polycarbonatröhrchen (UZ) Beckman
Reaktionsgefäß 1,5 ml Sarstedt
Reaktionsgefäß 1,5 ml Safelock Eppendorf
Reaktionsgefäß 2 ml Eppendorf
Reaktionsgefäße 15 und 50 ml Cellstar Greiner Bio-One
Röntgen- und
Chemilumineszensfilme
Hyperfilm ECL Amersham
Trägermaterialien ATP-Agarose Sigma
Ni-NTA-Agarose Qiagen
DEAE-Zellulose DE52 Whatman
GSH-Sepharose 4B Amersham
Sepharose CL-B4 Amersham
Ultrazentrifugenröhrchen 3,2 ml/ 38 ml Beckman
Zellulosenitratfilter 0,2 µm Porengröße Sartorius
Glimmer Plannet GmbH
2.1.4 Enzyme und Proteine
Enzym Hersteller
beta-Galactosidase Sigma
BSA Sigma
Carbanhydrase Sigma
CIP (Calf Intestinal Phosphatase) Boehringer Mannheim
Creatinphosphokinase Sigma
Hexokinase
Polymerase I Klenow-Fragment Roche
Mungobohnenexonuclease New England Biolabs
Phosphorylase b Sigma
Restriktionsenzyme:
EcoR1, Sal1, BamH1, Bgl2, Nco1 MBI Fermentas
Ava1 New England Biolabs
T4-DNA-Ligase MBI Fermentas
Thrombin ICN
Trypsin Worthington Biochemicals
Trypsininhibitor aus Sojabohnen Worthington Biochemicals
2.1.5 Primärantikörper
Antikörper Antigen Quelle Referenz Poly-
klonal
Mono- klonal
1974 Auxilin (J-Domänen-
Sequenz: -MADL)
Kaninchen Arbeitsgruppe Prof. Ernst
Ungewickkell x
3c5 Hsc70 Maus (Hönig et al.) x
Anti-GST GST Ziege x
anti-J GAK-J-Peptid Kaninchen Arbeitgruppe Prof. Ernst
Ungewickell x
CVC.7 LCa Maus (Brodsky F, PNAS 80, 1983,
2481) x
mAb 100/1 β/β´-appendage (AP-1/AP- 2).
Maus (Ahle, Eichelsbachen; EMBO
88/89) x
mAb 100/2 α-appendage von AP-2 Maus (Ahle, Eichelsbachen; EMBO
88/89) x
mAb 100/4 Auxilin Maus (Ahle & Ungewickell; JCB) x
mAb AP180-I AP180 Maus (Ahle & Ungewickell; EMBO) x
R460 LC Kaninchen (Ahle et al.) x
TD.1 TD Maus (Näthke et al., Cell 68, 1992,
899)
x
2.1.6 Sekundärantikörper
Antikörper Antigen Konz. Quelle
Meerrettichperoxidase konjugiertes Kaninchen IgG Maus IgG 1,99 mg/ml ICN Meerrettichperoxidase konjugiertes Maus IgG Kaninchen IgG 1,99 mg/ml ICN
2.1.7 Bakterienstämme
Stamm Hersteller Genotyp
DH5αF` Novagen F` endA1 hsdR17(rK-mK+) supE44 thi-1 recA1 gyrA relA1 Φ80lacZ∆M15 ∆ (lacZYA-argF)U169
BL21 Novagen F` om pT hsdSB(rB- mB-) gal dcm
2.1.8 Kommerzielle Systeme
QIA Prep spin Miniprep Kit, Qiagen QIA Quick Gelextraction Kit, Qiagen
DNA Molekulargewichtsstandard VII, Roche
Vektoren: pET32c, Novagen / pGEX4T2, Pharmacia Biotech / pQB4, Qiagen
Material und Methoden 21
2.1.9 Lösungen und Puffer
Acrylamidlösung (9%) 9% Acrylamid
0,1% Bisacrylamid 6,7% Glycerin 0,1% SDS
375 mM Tris-HCl (pH 8,8) angefärbt mit Bromphenolblau
Acrylamidlösung (19%) 19% Acrylamid
0,4% Bisacrylamid 13,3% Glycerin 0,1% SDS
375 mM Tris-HCl (pH 8,8)
Auftragspuffer 2 mM EDTA
(Probenpuffer 4x) 50% Glycerin
10% β-Mercaptoethanol 10% SDS
100 mM Tris-HCl (pH 8,0)
angefärbt mit Bromphenolblaulösung (10%)
Blockreagenz 8% Magermilchpulver
0,1% Tween 20 in PBS
Coomassie-Färbelösung 0,2% Coomassie Brilliant Blue R250 47,5% Ethanol
10% Essigsäure DNA-Auftragspuffer (10X) 0,25% Bromphenolblau
1,5% Ficoll 400 0,25% Xylencyanol
Elutionspuffer (GSH) 10 mM GSH
50 mM Tris-HCl (pH 8,0) Elutionspuffer (Imidazol) 250 mM Imidazol
300 mM NaCl
50 mM NaH2PO4 (pH 8)
Entfärber 10% Essigsäure
10% Methanol
Geltrocknungslösung 10% Glycerin
20% Ethanol
LB-Medium 0,5% Hefeextrakt
1% NaCl 1% Trypton
auf pH 7,5 eingestellt Laufpuffer (nach Laemmli) 370 mM Glycin
0,1% SDS 50 mM Tris 10 mM MgCl2
10 mM DTT
5 mM ATP (pH 7,8 bei 25°C)
Lysispuffer 10 mM Imidazol
300 mM NaCl 1% Triton X-100
1 Tablette Proteinaseinhibitorcocktail
50 mM NaH2PO4 (pH 8)
Molekulargewichtsstandard je 5 mg/ml BSA, Carbanhydrase, β-Galactosidase, Ovalbumin und Phosphorylase b in Probenpuffer
PBS 2,7 mM KCl
1,9 mM KH2PO4
137 mM NaCl 8,2 mM Na2HPO4
Ponceau S-Färbelösung (6x) 15% Essigsäure 40% Methanol 0,3% Ponceau S
Puffer A 100 mM MES
1 mM EGTA
0,5 mM MgCl2 (pH 6,4) 0.002 % N3
Puffer B 25 mM Imidazol (pH 7,0)
1 mM DTT
Puffer G (Golgibindungspuffer) 125 mM Kaliumacetat 5 mM Magnesiumacetat 25 mM HEPES (pH 7,1)
Puffer C 25 mM KCl
10 mM NH4SO4
2 mM MgCl2
20 mM HEPES (pH 7,8) Puffer Y+ /Tango TM 33 mM Tris-Azetat (pH 7,9)
10 mM Mg-Azetat 66 mM K-Azetat 0,1 mg/ml BSA
Puffer O+ 50 mM Tris-HCl (pH 7,5)
10 mM MgCl2
100 mM NaCl 0,1 mg/ml BSA
Regenerationsmix (12x) 24 mM ATP
60 mM Creatinphosphat 24 U/ml Creatinphosphokinase 12 mM DTT
Sammelgellösung 4% Acrylamid
1% APS
0,1% Bisacrylamid 3,3% Glycerin 0,1% SDS 0,1% TEMED
125 mM Tris-HCl (pH 6,8)
leicht angefärbt mit Bromphenolblau
SOC-Medium 20 mM Glucose
0,5% Hefeextrakt 2,5 mM KCl 10 mM MgCl2
10 mM MgSO4
10 mM NaCl 2% Trypton
Material und Methoden 23
TE-Puffer 1 mM EDTA
10 mM Tris-HCl (pH 8,0)
Transferpuffer 39 mM Glycin
20% Methanol 0,04% SDS
50 mM Tris (pH 8,0)
Thrombinpuffer 2,5 mM CaCl2
150 mM NaCl 20 mM Tris-HCl
ψ-Broth 10 mM KCl
4 mM MgSO4
in LB-Medium
Waschpuffer 20 mM Imidazol
300 mM NaCl
50 mM NaH2PO4 (pH 8)
2.2 Methoden
2.2.1 Molekularbiologische Methoden – allgemeiner Teil
2.2.1.1 Präparation von DNA (Plasmiden) aus E.coli Bakterien
Die Präparation von DNA aus Bakterien erfolgte mit einem kommerziellen System von Qiagen (QIAprep).
Die Präparation verlief in 3 Schritten. Zunächst erfolgte eine modifizierte alkalische Lyse der Bakterien nach Birnboim und Doly 1979. Dabei wurden die Wände der resuspendierten Bakterien durch Komplexierung zweiwertiger Kationen durch EDTA-haltigen Puffer destabilisiert (Puffer P1). Dem Puffer war noch frische RNase zugesetzt. Die vollständige Lyse fand durch SDS (sodium dodecyl sulfate) und NaOH statt (Puffer P2). Durch einen Kaliumacetatpuffer wurde die Suspension neutralisiert (Puffer N3) und dann die unlöslichen Komponenten abzentrifugiert. Der nächste Schritt war die DNA-Adsorption an eine Silika- Membran. Zuletzt wurde die Membran mit Ethanol gewaschen und die DNA mit 50 µl Elutionspuffer (Puffer EB: 10 mM Tris-Cl, pH 8,5) extrahiert. Die DNA-Menge betrug ca.
150 ng. Die genaue Anleitung kann man dem Handbuch von Qiagen entnehmen.
Prozedur Puffer Zusammensetzung
Resuspension P1 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 100 µg/ml RNase A
Lyse P2 200 mM NaOH, 1% SDS
Neutralisation N3 3,0 M Kaliumacetat, pH 5,5
Waschen PE 10 mM Tris-HCl, pH 7, 50% Ethanol
Elution EB 10 mM Tris-Cl, pH 8,5
2.2.1.2 Verdau von DNA mit Restriktionsendonukleasen
Um spezifische DNA-Sequenzen herzustellen, wurden DNA-Fragmente aus bakeriellen Plasmiden ausgeschnitten und in andere Plasmide eingefügt. Dafür musste die DNA des jeweiligen Plasmides aufgeschnitten werden und mit dem Insert (eng.: Einsatz; DNA- Fragment, das aus einem anderen Plasmid heraus getrennt wurde) ligiert werden. Um die Phosphodiesterbindungen von DNA-Strängen hydrolytisch zu spalten, wurden Restriktions- endonukleasen eingesetzt. Dabei handelte es sich meistens um Isoschizomere der Firma Fermentas. Die Menge der eingesetzten DNA betrug ca. 3 - 5 µg. Die Enzymkonzentration wurde so gewählt, dass ca. 3 U/µg DNA vorlag. Ein U (Unit) entspricht hierbei der Enzymmenge, die 1 µg DNA in 60 Min hydrolysieren kann. Die Bedingungen für eine
