Uncoating mit AP180 (653-739) -J

Die Verwendung von trypsinverdauten CCVs erlaubt einen direkten Vergleich der Fusionsproteine mit Auxilin. Auxilin wirkt katalytisch und wird somit nur in geringen Mengen benötigt. In einem Stoffmengenverhältnis von 1:10 - 1:20 zum Clathrin lag meistens eine ausreichende Aktivität vor. Andererseits wirkt es bei hohen Konzentration sogar käfigstabilisierend, so dass man ab einem Auxilin:Clathrin Verhältnis von 1:1 wieder eine Abnahme der Uncoating-Effektivität feststellen kann (s. Abb. 3.5). AP180(653-739)-J wurde im Standard Uncoating-Assay im Vergleich zu Auxilin (547-910) getestet. Es wurde zunächst in verschiedenen Stoffmengen eingesetzt (Abb. 3.18).

Abb. 3.18: Uncoating von trypsinverdauten CCVs mit AP180(653-739)-J

Verwendet wurden verschiedene Stoffmengen AP180(653-739)-J (1-4, Angaben in Tabelle in pmol). Die Reaktion erfolgte mit Hsc70 im Stoffmengenverhältnis 1-1,5fach zum Clathrin. Es wurden ca. 92 pmol Clathrin eingesetzt (bezogen auf eine schwere Kette). Es wurde GST-Auxilin (547-910) als Positivkontrolle verwendet. Den Ansätzen wurde noch ein ATP-regenerierendes System 1:10 beigefügt und die Proben für 20 Min bei 25 °C inkubiert. Nach Ultrazentrifugation bei 86000 g für 20 Min wurden Überstand und Pellet auf ein SDS-PAGE System aufgetragen. Neg: nur Puffer, CCVs und RegMix; +Aux: Positivkontrolle mit GST-Auxilin, CCVs, Hsc70, Puffer und RegMix. Aufgeführt ist ein repräsentatives Gel. Es zeigt sich ein konzentrations-abhängiges Uncoating durch das Konstrukt.

Man erkennt, dass ohne Zugabe von Auxilin oder AP180(653-739)-J kaum Clathrin-Triskelia im Überstand zu finden sind. Verwendet man Auxilin (547-910), dissoziieren die CCVs und die leichteren Triskelia erscheinen im Überstand. Auch AP180(653-739)-J ist in der Lage, die Dissoziation von CCVs zu katalysieren. Durch Verwendung verschiedener Stoffmengen lässt sich eine Konzentrationsabhängigkeit feststellen, die allerdings in diesem System die Effektivität von 50 % dissoziierter CCVs nicht überschreitet. Es scheint allerdings auch kein

Umkehreffekt zu geben, der bei Auxilin in hoher Konzentration zu sehen ist (Assembly).

Die Konzentrationsabhängigkeit wurde in kinetischen Versuchen getestet (Abb. 3.19). Zum besseren Vergleich zu Auxilin (547-910), sollte zunächst die Konzentration gesucht werden, bei der 50 % der CCVs dissoziieren (Abb. 3.19 A). Anschließend folgte eine Kinetik (Abb.

3.19 B).

Abb. 3.19: Nähere Untersuchungen zur Uncoating-Fähigkeit von AP180(653-739)-J

Für diese Experimente wurde ein typischer Uncoating-Assay verwendet, der den jeweiligen Experimenten angepasst wurde.

Für die Experimente wurden trypsinverdaute CCVs eingesetzt. Nach Kenntnis der notwendigen Konzentration von AP180 (653-739)-J, um die halbmaximale Geschwindigkeit zu erreichen, wurde ein kinetisches Experiment angefügt. Die Experimente erfolgten im Vergleich zu Auxilin (547-910). A zeigt die Auswertung eines repräsentativen SDS-Gels, B stellt die Auswertung von 2 Experimenten dar, die jeweils mit Doppelbestimmungen durchgeführt worden sind. A) Vergleich AP180(653-739)-J und Auxilin (547-910). Aufzeigen der Stoffmenge zum Erreichen des halbmaximalen Uncoatings. Eingesetzt wurden ca. 0,1 nmol Clathrin (ca. 30 µg) (bezogen auf 1 HC / 1 LC). Hsc70 lag im Überschuss mit 0,7 nmol vor (ca. 50 µg). B) Kinetische Untersuchungen von AP180(653-739)-J im Vergleich zu Auxilin (547-910). Eingesetzt wurden 300 pmol AP180(653-739)-J oder 25 pmol Auxilin sowie 95 pmol Clathrin. Hsc70 lag im Überschuss vor. Die Reaktion wurde mit Hexokinase/Glucose abgestoppt.

Im Vergleich zu Auxilin lässt sich feststellen, dass AP180(653-739)-J:

 in wesentlich höherer Konzentration vorliegen muss, um die halbmaximale Uncoating-Effizienz für CCVs zu erreichen

 das steady-state später erreicht als Auxilin

 über eine Effizienz von ca. 55 % nicht hinauskommt

Es konnte festgestellt werden, dass in Experimenten mit CCVs eine höhere Stoffmenge von AP180(653-739)-J als 280 pmol keinen Effizienzzuwachs mehr ergibt (ca. 2,8:1 bezogen auf 1 HC). Die erhobenen Ergebnisse zeigen, dass ein deutlicher Unterschied in der

Uncoating-A

B

Ergebnisse 73

Effektivität zwischen Auxilin (547-910) und AP180(653-739)-J besteht, wenn CCVs verwendet werden. Zunächst einmal benötigt man wesentlich weniger Auxilin (547-910) im Verhältnis zum Clathrin als AP180(653-739)-J. Ein Unterschied in der Kinetik lässt sich dabei aber nicht sicher feststellen. So führen Auxilin und AP180(653-739)-J innerhalb der ersten 5-10 Min rasch zur maximal erreichbaren Uncoating-Effektivität und gehen dann in eine Plateauphase über.

Es stellte sich die Frage, warum das Konstrukt bei Verwendung von CCVs nur eine Uncoating-Effektivität von 55 % erreichen konnte. Um diese Frage zu beantworten, wurden mehrere Experimente durchgeführt.

Wie aufgezeigt, ist Auxilin in der Lage, ab einer bestimmten Konzentration Clathrin-Triskelia zu Käfigen zusammenzulagern. Andererseits kann Auxilin nach erfolgtem Uncoating auch zum Reassembly führen, also dem Wiederzusammenlagern von freien Clathrin-Triskelia zu polygonalen Käfigen. Dieser Effekt ist konzentrationsabhängig. Um diese Möglichkeit für AP180(653-739)-J in Betracht zu ziehen, wurde zuerst überprüft, ob das Konstrukt in der Lage ist, Clathrin-Triskelia zusammenzulagern (Assembly) (Abb. 3.20).

Abb. 3.20: Zusammenlagerung von Clathrin-Triskelia durch Auxilin und AP180(653-739)-J

Verwendet wurde ein Clathrin-Pellet, das in Ammoniumsulfat aufbewahrt war. Dieses wurde in 0,5 M Tris-HCl resuspendiert und über Nacht in 10 mM Tris-HCl dialysiert. Damit sollten nur freie Triskelia vorliegen. GST-Auxilin ((547-910) und AP180 (653-739)-J wurden im Verhältnis 2:1 zum Clathrin zugefügt und in Puffer G 1 h auf Eis inkubiert. Die Abtrennung der zusammengelagerten Clathrin-Käfige erfolgte in der Ultrazentrifugation. Die Negativkontrolle (Neg) enthielt nur Clathrin in Puffer G. Es ist nur ein leichter Assembly-Effekt von AP180(653-739)-J zu erkennen.

Wie zu sehen ist, kann man AP180(653-739)-J allenfalls eine geringe Assembly-Aktivität zugestehen. Damit konnte ein Reassembly von dissoziierten CCVs nicht für die verminderte Uncoating-Effektivität verantwortlich sein.

Ein weitere Möglichkeit lag in der Morphologie eines internalisierten Clathrin-bedeckten Vesikels. Es wurde untersucht, ob vielleicht Membranen ein Grund sein könnten, AP180 (653-739)-J im Gegensatz zu Auxilin daran zu hindern, alle CCVs zu dissoziieren, da die Bindung des Konstruktes spezifischer ist, als die von Auxilin mit multiplen Bindungsorten an Clathrins schwerer Kette (Abb. 3.21). CCVs wären somit resistent gegüber eines Uncoating durch

AP180(653-739)-J. Schweinehirnpräparationen zur Aufreinigung von CCVs enthalten nicht nur mit Membranen bedeckte Clathrin-Käfige („echte“ CCVs), sondern auch unbedeckte. Es wurde eine quantitative Analyse von durch AP180(653-739)-J dissoziierte im Vergleich zu unbehandelten CCVs gemacht, um zu eruieren, ob sich in der Folge mehr Membran-bedeckte Clathrin-Käfige im Pellet befinden.

Coats + Membranen Coats - Membranen % Coats + Membranen n

Unbehandelte Transmissionselektronenmikroskopie visualisiert. Untersucht wurden pelletierte CCVs nach Uncoating mit AP180(653-739)-J und unbehandelte pelletierte CCVs. Exemplarisch wurden Fotos gemacht, die dann zufällig ausgewählt wurden und die Anzahl an Clathrin-Käfigen mit (A) und ohne (B) Membranen ausgewertet. (►) die weiße Pfeilspitzte in A zeigt auf solche Membranen. Das Ergebnis ist in der Tabelle aufgeführt. Von AP180(653-739)-J nicht dissoziiertes Clathrin weisen einen leicht erhöhten Anteil an CCVs mit Membranen auf.

Die Untersuchung hat gezeigt, dass tatsächlich relativ mehr Clathrin-Käfige, die mit Membranen bedeckt sind, vorhanden sind, wenn man ein Pellet untersucht, dass nach einem Uncoating-Experiment mit AP180(653-739)-J übrig blieb. Es handelt sich hierbei also um die CCVs, die nicht durch AP180(653-739)-J dissoziiert wurden und somit auch nicht im Überstand erscheinen. Der Effekt ist allerdings gering.

Da CCVs nicht nur aus Clathrin bestehen, sondern auch noch andere Komponenten enhalten (AP-1, AP-2, AP180), bestand die Möglichkeit, dass die verminderte Effektivität dadurch zustande kommt, dass die TD als Bindungsstelle für AP180(653-739)-J teilweise schon besetzt ist.

AP180, dessen Fragment auch ein Substrat für die Chimäre war, enthält Motive, die bekanntlich mit der TD assoziieren können (z.B. DLL). Somit bestand die Möglichkeit, dass die Chimäre um die freien Bindungsplätze an der TD mit anderen akzessorischen Proteinen kompetitierte. Um diese These zu überprüfen, wurden Uncoating-Experimente durchgeführt, in denen aufgereinigte Clathrin-Käfige verwendet wurden (Abb. 3.22). Die verwendeten Clathrin-Käfige wurden nach dem Protokoll erstellt, das auch für die Experimente mit den leichten Ketten angewandt wurde.

A BB

Ergebnisse 75

Abb. 3.22: Uncoating von Clathrin-Käfigen mit AP180(653-739)-J

45 pmol Clathrin-Käfige, 60/120/240 pmol AP180(653-739)-J, GST-Auxilin (547-910) (1:6,5) und Hsc70 (2:1) wurden in einem Standard Uncoating-Assay eingesetzt. Die Clathrin-Käfige wurden aus CCVs aufgereinigt und die leichten Ketten mit Thiocyanat abdissoziiert. Die Proben wurden 20 Min bei 25 °C inkubiert und Pellet und Überstand bei 86000 g getrennt. Es folgte eine SDS-PAGE. Zu sehen ist ein exemplarisches Gel. Schon bei 62 pmol kann AP180(653-739)-J eine ähnliche Effektivität wie GST-Auxilin (547-910) (= Pos) erreichen.

Es ist gut zu erkennen, dass sich nun eine Effektivität einstellt, die vergleichbar mit der von Auxilin ist. Um die These zu festigen, dass das Konstrukt vorraussichtlich durch die verdeckte Bindungsstelle nicht die volle Effektivität erreicht, wurde ein Pellet nach einem Uncoating von CCVs durch AP180(653-739)-J mit Auxilin und Hsc70 versehen (Abb. 3.23). Dadurch sollte überprüft werden, ob es sich generell um „resistente“ CCVs handelte oder nur Substrate nötig sind, die multiple Bindungstsstellen haben, damit die J-Domäne Hsc70 induzieren kann, CCVs zu dissoziieren.

Abb. 3.23: Uncoating trypsinverdauter CCV-Pellets durch Auxilin nach Behandlung mit AP180(653-739)-J

A) Es erfolgten zwei Runden Uncoating. Uncoating 1: 460 pmol Clathrin + AP180(653-739)-J 1:2 zum Clathrin + Hsc70 2:1 zum Clathrin + Regenerationsmix wurde auf 500 µl mit 1xG aufgefüllt. Inkubation bei 25 °C für 20 Min. Dann Trennung von Überstand und Pellet bei 86000 g. Das Pellet wurde über Nacht resuspendiert und dann nochmals zentrifugiert, um instabile Käfige abzutrennen. Das Pellet wurde in 100 µl 1x G aufgenommen. Uncoating 2: Je 22 µl (ca. 100 pmol Clathrin) versehen mit AP180(653-739)-J (4:1) oder Auxilin (547-910) (1:5) oder C58J (1:2). Die Reaktion erfolgte im Überschuss von Hsc70 und Regenerationsmix. B) Kinetik pelletierter CCVs nach Uncoating mit AP180(653-739)-J: trypsinisierte CCVs wurden mit AP180 (653-739)-J im Stoffmengenverhältnis 1:3 und mit Hsc70 im Stoffmengenverhältnis 1:1 inkubiert. Die Uncoating-Effizienz lag bei ca.

50 %. Die nicht dissoziierten pelletierten CCVs wurden daraufhin mit Auxilin (547-910) in einem Verhältnis 1:5 zwischen 0 – 60 Min inkubiert. Zur Kontrolle wurde die selben CCVs mit AP180(653-739)-J im Verhältnis 5:1 zwischen 0 – 60 Min inkubiert.

Es stellte sich heraus, dass die Zugabe von Auxilin und Hsc70 nach einem Uncoating durch AP180(653-739)-J zu einer Effektivität von ca. 80 % führt. Das Ergebnis stützt die These, dass die TD der CCVs noch durch andere Proteine belegt sind und erst Auxilin mit multiplen Bindungsstellen an Clathrin die Dissoziation der restlichen CCVs katalysieren kann.

Um sicherzugehen, dass die Bindung des Konstruktes an der TD von Clathrin erfolgt, wurden Käfige hergestellt, die durch H6-57, einem AP180-Fragment der Größe 57 kDa mit einem Polyhistidintag, stabilisiert waren (Abb. 3.24). H6-57 bindet an diversen Stellen des Triskelions, so dass praktisch nur die TD zur Bindung des Konstruktes übrig bleibt. Ein wichtiger Unterschied zu CCVs ist die ausschließliche Anwesenheit von Clathrin-Triskelia, die nur noch durch H6-57 stabilisiert werden. Damit lag ein „reines“ System vor.

A

B

Ergebnisse 77

Abb. 3.24: Uncoating von H6-57 stabilisierten Clathrin-Käfigen mit AP180(653-739)-J

Die verwendeten Käfige (aufbewahrt als Ammoniumsulfatpellet) wurden in Puffer G resuspendiert und mit unterschiedlichen Mengen aufgereinigtem H6-57 für 30 Min auf Eis inkubiert. Freie Triskelia und instabile Käfige wurden nach Inkubation im Wasserbad bei 25°C für 20 Min per Ultrazentrifugation abgetrennt. Die so stabilisierten Käfige wurden in einem Uncoating- Assay mit und ohne Auxilin (547-910) getestet und die stabilsten für die Experimente mit AP180(653-739)-J verwendet. Die Käfige lagen in einer Stoffmengenkonzentration von ca. 100 pmol vor. Es wurden 175 (P1) und 350 (P2) pmol AP180(653-739)-J eingesetzt. Hsc70 lag im Überschuss vor, GST-Auxilin wurde in einem Ansatz als Positivkontrolle (Pos) verwendet. In der Negativkontrolle fehlten Auxilin und AP180(653-739)-J (Hsc70) und Hsc70(Neg).

Das Experiment zeigt, dass sich ein Uncoating von H6-57 stabilisierten Clathrin-Käfigen durch AP180(653-739)-J induzieren lässt. Auch in diesem „reinen“ System liegt eine mit Auxilin vergleichbare Aktivität vor.

Die Ergebnisse mit AP180(653-739)-J zeigen, dass die Bindung an die TD ausreicht, ein Uncoating zu induzieren. Allerdings scheinen die schweren Ketten Clathrins mit vielen Proteinen assoziiert zu sein, so dass viele terminale Domänen in CCVs schon mit Bindungspartnern belegt sind. Es konnte keine katalytische Aktivität, vergleichbar mit der Auxilins, festgestellt werden.