Molekularbiologische Methoden – allgemeiner Teil

2.2.1.1 Präparation von DNA (Plasmiden) aus E.coli Bakterien

Die Präparation von DNA aus Bakterien erfolgte mit einem kommerziellen System von Qiagen (QIAprep^).

Die Präparation verlief in 3 Schritten. Zunächst erfolgte eine modifizierte alkalische Lyse der Bakterien nach Birnboim und Doly 1979. Dabei wurden die Wände der resuspendierten Bakterien durch Komplexierung zweiwertiger Kationen durch EDTA-haltigen Puffer destabilisiert (Puffer P1). Dem Puffer war noch frische RNase zugesetzt. Die vollständige Lyse fand durch SDS (sodium dodecyl sulfate) und NaOH statt (Puffer P2). Durch einen Kaliumacetatpuffer wurde die Suspension neutralisiert (Puffer N3) und dann die unlöslichen Komponenten abzentrifugiert. Der nächste Schritt war die DNA-Adsorption an eine Silika-Membran. Zuletzt wurde die Membran mit Ethanol gewaschen und die DNA mit 50 µl Elutionspuffer (Puffer EB: 10 mM Tris-Cl, pH 8,5) extrahiert. Die DNA-Menge betrug ca.

150 ng. Die genaue Anleitung kann man dem Handbuch von Qiagen entnehmen.

Prozedur Puffer Zusammensetzung

Resuspension P1 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 100 µg/ml RNase A

Lyse P2 200 mM NaOH, 1% SDS

Neutralisation N3 3,0 M Kaliumacetat, pH 5,5

Waschen PE 10 mM Tris-HCl, pH 7, 50% Ethanol

Elution EB 10 mM Tris-Cl, pH 8,5

2.2.1.2 Verdau von DNA mit Restriktionsendonukleasen

Um spezifische DNA-Sequenzen herzustellen, wurden DNA-Fragmente aus bakeriellen Plasmiden ausgeschnitten und in andere Plasmide eingefügt. Dafür musste die DNA des jeweiligen Plasmides aufgeschnitten werden und mit dem Insert (eng.: Einsatz; DNA-Fragment, das aus einem anderen Plasmid heraus getrennt wurde) ligiert werden. Um die Phosphodiesterbindungen von DNA-Strängen hydrolytisch zu spalten, wurden Restriktions-endonukleasen eingesetzt. Dabei handelte es sich meistens um Isoschizomere der Firma Fermentas. Die Menge der eingesetzten DNA betrug ca. 3 - 5 µg. Die Enzymkonzentration wurde so gewählt, dass ca. 3 U/µg DNA vorlag. Ein U (Unit) entspricht hierbei der Enzymmenge, die 1 µg DNA in 60 Min hydrolysieren kann. Die Bedingungen für eine

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optimale Enzymaktivität war durch einen optimalen Reaktionspuffer gegeben. Wenn mehrere Enzyme verwendet wurden, betrug die Aktivität beider Enzyme mindestens 50% in dem ausgewählten Puffer. Ansonsten fand ein Restriktionsverdau in mehreren Schritten statt. Die Puffer lagen 10fach konzentriert vor und wurden für den Ansatz entsprechend verdünnt eingesetzt. Das Volumen des Ansatzes musste so gewählt sein, dass die Glycerinkonzentration unter 5% lag (die Enzyme wurden in 50%igem Glycerin geliefert, damit sie bei –20°C nicht gefrieren und zerstört werden). Aufgefüllt wurde der Ansatz mit Milliporewasser. Die Inkubationszeit betrug eine Stunde bei 37°C. Danach wurden die Enzyme in der Regel hitzeinaktiviert (65°C oder 80°C). Andere Inkubationszeiten oder sonstige Besonderheiten wurden dem Katalog entnommen.

Damit eine optimale Enzymaktivität vorlag, ist darauf geachtet worden, dass die Enzyme keine Staractivity entwickelten und dass sie auch methylierte DNA schnitten. Staractivity kann aufteten, wenn der pH des Puffers zu hoch ist, eine zu hohe Enzymkonzentration verwendet wird, die Glycerolkonzentration zu hoch ist oder die Inkubationszeit verlängert ist.

Dadurch kann die Substratspezifität reduziert sein und unter extremen Bedingungen können weitere Sequenzen geschnitten werden (z.B. bei BamH1).

Einige Restriktionsenzyme schneiden nur unmethylierte DNA. Bei der Basenmethylierung sind ausgewählte Sequenzen methyliert, so dass einige Enzyme an dieser Stelle inaktiv sind, obwohl sie die passende Sequenzspezifität haben. Auf drei verschiedene Typen der Basenmethylierung wurde geachtet: Dam-, Dcm- und CG-Methylierung. Die entsprechenden Sequenzen sind dem Katalog entnommten worden. Wäre die Funktion eines Enzymes beeinträchtigt gewesen, so wurde ein anderes gewählt.

Im Allgemeinen ergab der Restriktionsverdau ein offenes Plasmid mit sogenannten „klebrigen Enden“ (sticky ends), d.h., dass ein DNA-Strang den anderen überragte. Diese sticky ends verbessern die Ligationseffektivität, weil es zu komplementären Basenpaarungen zwischen den sticky ends des Plasmids und der Insert-DNA kommt. Im optimalen Fall wird ein Insert mit zwei verschiedenen Restriktionsenzymen aus einem Plasmid herausgeschnitten und dann in ein anderes Plasmid gerichtet eingefügt, das mit denselben Enzymen aufgeschnitten wurde.

Bei einigen Klonierungen war es aber nötig, die offenen Plasmide so zu modifizieren, dass sogenannte „stumpfe Enden“ (blunt ends) vorlagen. Das war zum Beispiel der Fall, wenn Insert und Zielplasmid mit unterschiedlichen Restritionsenzymen geschnitten wurden. Dafür konnten zwei Enzyme verwendet werden: die Klenow-Polymerase oder die Mungobohnen-exonuklease (MBN).

Das Klenow-Fragment verstärkt die 5´→3´ Polymerase- und die 3´→5´ Exonukleaseaktivität der DNA Polymerase I. Das führt entweder zum Auffüllen oder zum Abbau von sticky ends.

Für die Reaktion wurden 0,1 - 4 µg DNA mit 20 U Klenow-Fragment versehen. Eine Unit des Enzyms katalysiert die Verlängerung einer DNA um 10 nmol Desoxyribonukleotide in 30 Min bei 37°C, wenn man 4dNTPs (poly dA, dC, dG, dT; 0,05 mM) und den passenden Puffer zufügt. Der Ansatz wurde mit Milliporewasser aufgefüllt und 10 Minuten bei 37°C inkubiert.

Eine Hitzeinaktivierung bei 70°C für 10 Min schloss das Auffüllen der sticky ends ab. Dem Ansatz konnten nun direkt weitere Enzyme zugefügt werden.

Sollten die sticky ends abgedaut werden, wurde die MBN verwendet. Die MBN besitzt eine Exonukleaseaktivität mit Einzelstrangspezifität für DNA und RNA. Sie degradiert damit 5´- und 3´- Enden zu blunt ends. Die MBN konnte direkt einem Restriktionssansatz zugefügt werden. Allerdings war es nötig, zuvor den Hochsalzpuffer der Restriktionsenzyme durch Zugabe von Milliporewasser zu verdünnen. Die Endkonzentration der MBN betrug ca. eine U pro µg DNA und der Ansatz inkubierte 30 Minuten bei 30°C. Eine U des Enzyms ist die Enzymmenge, die nötig ist, um 10 nmol Desoxyribonukleotide in 30 Min bei 37°C freizusetzen.

Ein weiteres Enzym, das eingesetzt wurde, war CIP – eine alkalische Phosphatase (Calf Intestine Alkaline Phosphatase), die die Hydrolyse von 5´-Phosphatresten katalysiert. Damit sollte die Selbstligation von offenen Plasmiden verhindert werden. Ca. ein U des Enzyms wurden dem Restriktionsansatz zugefügt und bei 37°C für 30 Min inkubiert. Eine U Enzym katalysiert die Hydrolyse von 1 µg 4-Nitrophylphosphat in einer Minute bei 37°C. Das Enzym wurde dann bei 85°C für 15 Min hitzeinaktiviert.

2.2.1.3 Reinigung von Nukleinsäuren

Für die Aufreinigung von Nukleinsäuren nach einem Restriktionsverdau (s.a. 2.2.1.2) wurden zwei Methoden angewendet. Zum einen die Extraktion mit Phenol/Isoamylalkohol/

Choloroform (PIC) und zum anderen die Fällung von DNA mit Ethanol.

Die PIC-Extraktion von DNA kam zum Einsatz, wenn zwei verschiedene Restriktionsenzyme nicht gleichzeitig im gewünschten Puffer reagieren konnten. Um das Plasmid nach dem Verdau zu extrahieren, wurde ein Restriktionsansatz (10 - 20 µl) mit Milliporewasser auf 50 µl aufgefüllt. Die DNA-Konzentration betrug damit ca. 0,05 mg/ml. Der DNA-Lösung wurde dann 50 µl kommerzieller PIC-Lösung unter dem Abzug beigefügt. Die PIC-Lösung besteht zu gleichen Teilen aus gepuffertem Phenol und Isoamlyalkohol/Chloroform (Das Verhältnis Isoamylalkohol:Chloroform betrug 1:24). Durch die Zugabe von PIC wurden die Proteine, die in der DNA-Lösung vorhanden waren (z.B. Enzyme nach einem Restriktionsverdau), denaturiert. Im Reaktionsgefäß entstanden drei Phasen, wobei die obere wässrige Phase die DNA enthielt, die untere organische Lösungsmittel und die Interphase die denaturierten

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Proteine. Die Phasentrennung wurde durch ein kurzes Zentrifugieren (2-3 Min) bei 10600 g in der Tischzentrifuge beschleunigt. Der Überstand wurde dann abgenommen und die untere Phase nochmals mit 50 µl TE-Puffer versehen, um die restliche DNA zu extrahieren. Dieser Überstand wurde mit dem ersten Überstand vermischt und die DNA mit Ethanol zum Konzentrieren gefällt.

Bei der Ethanolfällung bilden DNA und RNA in Anwesenheit monovalenter Kationen ein unlösliches Pellet. Zu diesem Zweck wurde 0,3 M Natriumazetat verwendet. Hinzu kam das 2-3fache vom Ausgangsvolumen an 99% eiskaltem Ethanol. Die Lösung wurde geschüttelt und 20 Min auf Eis gestellt. Die gefällte DNA wurde abzentrifugiert und der Überstand entfernt. Es folgte ein Waschschritt mit 1 ml 70% Ethanol (Raumtemperatur), in dem das Pellet in Ethanol durch Schütteln resuspendiert und bei 10600 g abzentrifugiert wurde. Der Überstand wurde wieder verworfen und das Pellet wurde nach Trocknung im Vakuum anschließend in 8 µl Milliporewasser aufgenommen. Durch Zugabe von 1 µl eines entsprechenden Puffers (10fach) und 1 µl eines Restriktionsenzymes, konnte die aufgereinigte DNA direkt weiterverwendet werden.

2.2.1.4 Agarosegelelektrophorese

Für die Elektrophorese von Nukleinsäuren wurde Agarose als Trägermaterial verwendet. Die Auftrennung hing zum einen von der DNA-Form ab (superhelikal, offen, doppelsträngig-linear) und zum anderen von der Agarosekonzentration. Offene, relaxierte DNA läuft in einem Agarosegel wesentlich langsamer als superhelikale und lineare. Lineare DNA wiederum läuft im Agarosegel langsamer als superhelikale. Die Agarosekonzentration beeinflusst den Auftrennungsbereich von DNA-Fragmenten. Je höher die Konzentration, desto kleiner können die aufzutrennenden DNA-Fragmente sein. Benutzt wurde 0,8 - 1,5%

w/v Agarose. Die Agarose wurde in der Mikrowelle verflüssigt und erstarrte in den Gelkammern. Ethidiumbromid (3,8-Diamino-5-ethyl-6-phenyl-phenanthridiumbromid) als interkalierender Farbstoff für die DNA wurde der erwärmten, flüssigen Agarose in einer Endkonzentration von 1,43 µg/ml zugesetzt. Mit Hilfe eines Kammes, der in die noch flüssige Agarose gesteckt wurde, wurden Vertiefungen für die aufzutragenden Proben ausgespart. Als Laufpuffer wurde ein Tris-Borat-Puffer verwendet (TBE-Puffer), der in die Kammer bis auf Höhe der Agarose gegossen wurde. Die DNA-Probe in Auftragspuffer wurde in die Vertiefungen im Agarosegel gefüllt. Der DNA-Auftragspuffer (6fach) bestand aus Bromphenolblau als Farbstoff und Ficoll zur Erhöhung der Dichte des Puffers. Als DNA-Längenstandard wurde MW VII^® der Firma Roche mit einem Anzeigenbereich von 81 – 8576

bp benutzt. Für die Elektrophorese wurde eine Spannung von 80 V für ca. eine Stunde angelegt. Das Ethidiumbromid wird durch UV-Licht mit einer Wellenlänge von 256-366 nm zu Fluoreszenz angeregt, wenn es in die DNA-Fragmente interkaliert. Dadurch konnten nach der Elektrophorese die DNA im Agarosegel unter einer UV-Handlampe (330 nm) sichtbar gemacht werden und gegebenfalls mit einem Skalpell herausgetrennt werden und weiter verarbeitet werden.

Zwecks Überprüfung analytischer Restriktionsverdaus wurden Plasmide mit neu integrierten Inserts mit zwei oder mehr Restriktionsenzymen geschnitten und durch Agarosegel-elektrophorese analysiert.

2.2.1.5 Extraktion von DNA aus Agarosegelen

Die Extraktion von DNA aus Agarosegelen erfolgte mit einem kommerziellen System von Qiagen (QIAquick^).

Ähnlich wie das QIAprep^-System, basiert die Gelextraktion auf der Bindung von DNA an einer speziellen Silika-Membran unter optimalen pH-Konditionen. Zunächst wurde das Gelstück in einem Puffer mit pH-Indikator aufgelöst (Puffer QG; 50°C/10 Min). Dieser Puffer enthält chaotrope Salze, die Agarose auflösen. Dann folgte die Bindung der DNA an die Silikamembran, wofür spezielle Reaktionsgefäße verwendet wurden. Zuletzt konnten Agarosereste, Ethidiumbromid, Salze usw. in einem Waschschritt mit einem ethanolhaltigen Puffer entfernt werden (Puffer PE) und die DNA mit 30 µl Elutionspuffer (Puffer EB: 10 mM Tris-Cl, pH 8,5) extrahiert werden. Dieses System eignete sich für die Extraktion von DNA mit einer Größe von 70 – 10000 bp. Die genaue Anleitung kann man dem Qiagen-Handbuch entnehmen.

Prozedur Puffer Zusammensetzung Auflösen des Gels QG Enthält Guanidinthiozyanat

Isopropanol Isopropanol 100%

Waschen PE 10 mM Tris-HCl, pH 7,0, 50% Ethanol

Elution EB 10 mM Tris-Cl, pH 8,5

2.2.1.6 Ligation

Für das Zusammenfügen von DNA-Fragmenten wurde eine T4 DNA-Ligase verwendet, die die Ausbildung eines Phosphodiesters zwischen einem 5´-Phosphatende und eines 3

´-Hydroxylendes einer Doppelstrang-DNA katalysiert. Das Volumen des Reaktionsansatzes, die Menge des Enzyms, die Temperatur und die Inkubationszeit hing von der Klonierungsstrategie und der vorraussichtlichen Effizienz ab. So konnte der Ansatz einerseits

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bei 22°C für eine Stunde inkubiert werden (Sticky-Ligation oder viel vom Insert vorhanden) oder sechzehn Stunden bei Raumtemperatur (Blunt-Ligation oder geringe Menge des Inserts).

Die Vektor-DNA lag in einer Stoffmenge von 50 - 400 ng vor. Dagegen sollte die molare Konzentration der Insert-DNA 3x höher sein. Die Reaktion fand in einem Ligationspuffer statt (40 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP, pH 7,8). Anschließend wurde spezifische DNA-Sequenzen in Form von Plasmiden in Bakterien überführen. Die Bakterien wurden hierfür kompetent gemacht (z.B. durch CaCl2) und einem Schock (Temperatur, elektrischer Impuls) ausgesetzt. Für die Aufnahme und Replikation von Plasmiden wurde auf zwei verschiedene Bakterienstämme zurückgegriffen. Es lagen Bakterien vor, die thermokompetent waren und Bakterien, die elektrokompetent waren. Die verwendeten E.coli-Stämme waren DH5α für die Amplifikation von DNA und BL21 für die Proteinexpression.

Für die Transformation in thermokompetente Bakterien, die auf Eis aufgetaut wurden, wurde ca. 0,15 – 0,75 µg des Ligationsansatzes auf 90 µl der Bakterien gegeben. Im Eisblock konnte die DNA dann für 30 Min adhärieren. Es folgte ein Hitzeschock im Thermoblock für 3 Min bei 42°C und die Aufnahme der Bakteriensuspension in 500 µl ψ-Broth. Die Inkubationszeit betrug dann 30 Min im Schüttelinkubator (37°C und 230 UpM). Die Bakteriensuspension wurde abzentrifugiert und auf Agarplatten mit Ampicillin ausgestrichen, da die verwendeten Vektoren pET32c und pGEX4T-2 ein Gen für eine Ampicillin-Resistenz besitzen (β-Lactamase). Die Konzentration des Ampicillins betrug für DH5α-Stämme 100 µg/ml und für BL21-Stämme 50 µg/ml. Die Bakterienkolonien wuchsen über Nacht und wurden dann je nach Strategie selektiert.

Durch die Elektrotransformation konnte die Transformationseffizienz verbessert werden. Man benötigte 40 µl der elektrokompetenten Bakterien und ca. 0,15 µg des Ligationsansatzes. Die Suspension wurde 1 Minute in einem Reaktionsgefäß auf Eis gestellt und dann in die kalte Elektroporforationsküvette überführt. Die Küvette wurde dann in den Gene Pulser^ eingesetzt.

Nachdem der Impuls gesetzt war (Programm EC2), wurde der Suspension 1 ml SOC-Medium zugefügt. Nach Überführung in ein 15 ml Reaktionsgefäß inkubierte der Ansatz für eine Stunde bei 37°C im Schüttelinkubator. Anschließend wurde die Bakteriensuspension wieder

ausplattiert und über Nacht inkubiert.

Am nächsten Morgen wurden die gewachsenen Bakterienkolonien mit Pipettenspitzen aufgenommen („gepickt“) und in ein 15 ml Reaktionsgefäß mit 2 ml LB-Medium und Ampicillin (50 bzw. 100 µg/ml) überführt. Diese Suspension stellte die Startkultur dar. Die Inkubationzeit betrug mindestens fünf Stunden. Je nach Strategie wurde die DNA präpariert und analysiert oder die Expression der Fusionsproteine induziert.

Wenn eine Stammkultur angelegt werden sollte, die bei –80°C eingefroren werden sollte, wurde eine 1:100 Verdünnung der Startkultur angelegt. Dafür nahm man 10 ml LB-Medium mit Ampicillin und fügte 100 µl der Bakteriensuspension aus der Startkultur zu. Anschließend wartete man bis A600nm = 0,5 entsprach und zentrifugierte die Suspension in der Megafuge1R 5 Min bei 4000 UpM. Das Pellet wurde in 2 ml LB-Medium mit 15% Glycol aufgenommen und bei –80°C eingefroren.

2.2.1.8 Klonierung von Oligonukleotiden

Eine Möglichkeit kurze Peptide zu erstellen, war die Anwendung von Oligo-nukleotidsequenzen, die kommerziell erzeugt worden sind (MWG Biotech). Anhand spezieller Computerprogramme (z.B. Mac Vector^®) konnte man zunächst die Klonierungs-strategie simulieren und sich die gewünschte Basensequenz überlegen. Das von mir später angewendete Insert wurde so erzeugt, dass im Gegensatz zum Ursprungsvektor eine weitere Schnittstelle im Insert vorhanden war (Nco1). Damit konnte man den Erfolg der Klonierung später anhand eines analytischen Restriktionsverdaus überprüfen.

Die Bestellung wurde über ein bereitgestelltes Computerprogramm abgewickelt, wobei man die beiden DNA-Stränge einzeln bestellt und geliefert bekommt. Die gelieferte Menge betrug 710 µg bzw. 870 µg.

Damit die DNA als Insert eingesetzt werden konnte, mussten die beiden einzelnen DNA-Stränge zusammengefügt werden. Dafür wurde die DNA in Pulverform in 360 µl bzw. 435 µl Puffer aufgenommen (Puffer EB von Qiagen: 10 mM Tris-Cl, pH 8,5), so dass die Endkonzentration 2 mg/ml ergab. Je 4,5 µl der beiden DNA-Lösungen wurde mit 2 µl des Ligationspuffers von Fermentas vermischt (40 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP, pH 7,8) und mit Milliporewasser auf 20 µl aufgefüllt. Der Ansatz wurde in einem Thermocycler zunächst auf 95°C erwärmt, um vorhandene Sekundärstrukturen aufzulösen und dann langsam abgekühlt. Während der Abkühlungsphase bildete sich doppelsträngige DNA.

a) 95°C für 5 Minuten (Heizdeckel auf 98°C)

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b) abkühlen auf 25°C in 15 Minuten (0,08°C/s) c) 25°C für 5 Minuten halten

d) nach Ende des Programmes noch 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelasssen

Nach kurzem Abzentrifugieren in der Tischzentrifuge, konnte die doppelsträngige DNA direkt in einem Ligationsansatz weiter verwendet werden, um die DNA in einen Vektor zu klonieren.