Proteinanalytik

2.2.4.1 TCA-Fällung

Eine Möglichkeit Proteine auszufällen, ist sie mit Trichloessigsäure (TCA) zu präzipitieren.

Um die Proteine in einer Lösung auzufällen, betrug die TCA-Endkonzentration 10%. 0,1%

Triton X-100 wurde als Trägersubstanz eingesetzt. Die Proteinlösung wurde mit dem Triton und dem TCA vermischt und anschließend 10 Min auf Eis gestellt. Das Präzipitat wurde bei 20800 g zentrifugiert und der Überstand mit einer Pasteurpipette abgesaugt. Es folgten zwei Waschschritte mit Aceton. Das Proteinpräzipitat wurde anschließend in einfachem Probenpuffer aufgenommen. Der Ansatz wurde weitere 15 Min bei Raumtemperatur geschüttelt, damit sich alle Proteinpräzipitate von der Wand des Eppendorf-Reaktionsgefäßes lösten. Die Proben wurden dann aufgekocht und mittels SDS-Gelelektrophorese analysiert.

2.2.4.2 Fällung mit Ammoniumsulfat

Für die Konzentation von Clathrinmolekülen bewährte sich die Fällung mit einer halbgesättigten Ammoniumsulfatlösung ((NH4)2SO4). Das antichaotrope Salz fördert die Proteinaggregation durch Verstärkung der hydrophoben Wechselwirkungen in der Lösung. Es ist eine sehr schonende Methode, um Proteine auszufällen. Die Clathrinlösung wurde in ein sauberes Becherglas gegeben und unter ständigem langsamen Rühren mit einem Magnetrührkegel wurde das gleiche Volumen einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung zugefügt. Nachdem keine Schlieren mehr zu sehen waren, ließ man die Lösung 15 Min auf Eis stehen, bevor sie bei 4000 UpM (Megafuge 1R, Hareus) für 30 Min in einem 15 - 50 ml

großem Reaktionsgefäß zentrifugiert wurde. Das Pellet wurde in wenig 0,5 M Tris-HCl aufgelöst und anschließend über Nacht gegen 0,5 M Tris-HCl dialysiert. Die Proteinkonzentration wurde im Photometer bestimmt. Man konnte die Pellets auch bei –80°C einfrieren und später verwenden.

2.2.4.3 Differenzielle Ultrazentrifugation

Für einige Experimente konnte man die unterschiedliche Sedimentationsgeschwindigkeit verschiedener Teilchen ausnutzen. Dafür wurde die differentielle Ultrazentrifugation in gekühlten und an ein Vakuum angeschlossenen Zentrifugen angewendet. Es standen mehrere Zentrifugen von Beckman zur Verfügung, mit denen eine relative Zentrifugalbeschleunigung von bis zu 504000 g erreicht wurde. Die Eigenschaft verschiedener Teilchen, unter den Bedingungen des Zentrifugalfeldes unterschiedlich schnell zu sedimentieren, wird in Svedberg-Einheiten (S) angegeben. Je kleiner der S-Wert, desto länger benötigen die Teilchen bei gleicher Umdrehung des Rotors um zu sedimentieren.

Partikel S-Wert angewendeten Membranen bestanden aus Amicon YM^® regenerierter Zellulose und lagen in zwei Versionen mit unterschiedlichen Porengrößen vor (cut-off bis 30 und 50 kDa). Durch den Vorgang konnten Proteine effektiv konzentriert und Salze entfernt werden. Die Flussrate hing dabei von der Zentrifugalkraft ab, wobei im Allgemeinen eine Standzentrifuge mit schrägem Festwinkelrotor verwendet wurde (Beckman, Rotor JA-20), die den Vorteil hatte, dass das eingesetzte Ultrafiltrationsgefäß auch bei Stillstand schräg in der Zentrifuge lag, so dass ein Eintrocknen der Membran ausgeschlossen war. Zum Einsatz kamen zwei unterschiedliche Systeme, die sich im aufzunehmenden Volumen unterschieden – Centricons^ und Centripreps^. Der gesamte Vorgang wurde auf Eis und in der gekühlten Zentrifuge durchgeführt, um die Proteinstabilität nicht zu gefährden.

Material und Methoden 37

2.2.4.5 SDS-PAGE (Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese)

Für die SDS-PAGE wurden lineare Polyacrylamidgradienten von 9 - 19% und 0,0225 – 0,114% Bisacrylamid verwendet. Für die Erstellung des nach Laemmli-modifizierten Systems, wurde ein 2-Kammer-System angewendet, wobei aus dem Reservoir immer so viel in die Mischkammer floss, wie von dort in die Polymerisationskassette einging. Daraus folgte eine kontinuierliche Überschichtung der Lösung mit abnehmender Dichte. Die Probentaschen wurden erzeugt, indem Kämme vor der Polymerisation des Sammelgels in die Kassette eingesetzt wurden.

Bevor die Proben mit Hilfe einer Hamiltonspitze in die Taschen des vertikalen Gelsystems eingebracht werden konnten, mussten sie noch mit 4fach Probenpuffer versehen werden.

Dieser enthielt unter anderem SDS und β-Mercaptoethanol. Das SDS (Sulfatester des Dodekanols) überdeckt die Eigenladungen der Proteine, womit Wechselwirkungen auf-gehoben werden und das Protein sich entfalten kann. Die reduzierende Thiolverbindung β-Mercaptoethanol spaltet die Schwefelbrücken zwischen Cysteinen. In einem Überschuss an SDS wurden die Proben dann für 2 Min auf 95°C erhitzt, womit auch die Sekundär- und Tertiärstrukturen durch Aufspaltung der Wasserstoffbrückenbindungen der Moleküle aufgelöst wurden. Anschließend wurden die Proben kurz abzentrifugiert. Das so entfaltete Proteingemisch wurde dann, beschwert durch das Glycerin im Probenpuffer, in die Taschen des 5%igen Sammelgels eingebracht. Der Laufpuffer als diskontinuierlicher Tris-HCl/Tris-Glycin-Puffer nach U.K. Laemmli sollte eine hohe Auflösung garantieren.

Immer wurde auch ein Molekulargewichtsstandard (MW) aus Carboanhydrase (29 kDa), Ovalbumin (45 kDa), BSA (66 kDa), Phosphorylase b (96 kDa) und β-Galaktosidase (116 kDa) mit aufgetragen.

Die Elektrophoresekammer wurde an das Netzgerät angeschlossen, wobei zunächst eine Spannung von 80 V für 20 Min angelegt wurde und dann die Spannung für 75 Min auf 200 V erhöht wurde. Für die Abführung Joulscher Wärme war die Elektrophoreskammer mit dem Kühlgerät Julabo F12^® verbunden, das das Gel auf 5,8°C herunterkühlte.

Sofern die aufgetrenneten Proteine nicht auf Nitrozellulosemembran transferiert werden sollten, wurde sie mit dem Triphenylmethanfarbstoff Coomassie Brilliant Blue R250 angefärbt. Die Färbung dauerte mindestens eine Stunde. Die Nachweisempfindlichkeit lag bei 100 ng – 1 µg. Zum Entfärben des Gels wurde das Gel zuerst mit VE-Wasser abgewaschen und dann in Entfärberlösung gelegt. Ein Zellulosetuch in der Lösung sollte die überschüssige Farbe aufnehmen.

2.2.4.6 Western Blot

Für den Transfer von Proteinen aus einem SDS-Gel auf eine Nitrozellulosemembran wurde das Semidry-Verfahren verwendet. Sechs in Transferpuffer getränkte Filterpapiere wurden dafür auf eine Graphitplatte geschichtet, die als Anode diente. Dann folgte eine Lage Nitrozellulosemembran und darauf dann das Gel. Auf das Gel kamen dann weitere sechs Lagen Filterpapier. Luftblasen wurden durch vorsichtiges Rollen eines Glasstabes über die Schichten entfernt. Auf die Schichten wurde dann die Graphit-Kathodenplatte gelegt und eine Stromstärke von 0,8 A/cm² Nitrozellulosemembran am Netzgerät eingestellt. Nach diesem Elektroblotting-Vorgang wurde die Nitrozellulosemembran mit den transferierten Proteinen kurz mit Ponceau S angefärbt, um die Banden des MWs anzuzeichnen und die Spuren zu markieren.

Nach dem Western Blot wurden immunologische Techniken zum Nachweis der Proteine angewendet. Die Nitrozellulosemembran wurde komplett in PBS enfärbt und mit Milchpulver unspezifische Bindungen abgesättigt. Der Primärantikörper lag in PBS mit 3%igem BSA vor und hatte eine Konzentration von 2 µg/ml. Der Sekundärantikörper war mit Meerrettich-peroxidase konjugiert und wurde 1:2000 mit der Blockierlösung verdünnt. Der Nachweis der Antikörperreaktion erfolgte durch die ECL (Enhanced Chemiluminescence):

Abb. 2.1: ECL-Reaktion

2.2.4.7 Photometrie

Zur Konzentrationsbestimmung diente ein UV-Spektralphotometer. Nach dem Lambert-Beerschen Gesetzt ist die Absorption A einer Lösung abhängig vom Logarithmus der Intensität einer einfallenden (I0) bzw. aus der Messlösung austretenden Strahlung (I):

A = l o g I₀ I

  

 = ε × c × d

ε ist der molare Extinktionskoeffizient, c ist die Konzentration des absorbierenden Stoffes und d die Schichtdicke der Küvette. Es wird ersichtlich, dass bei Kenntnis der Stoffkonstanten und nach Messung der Absorption, die Konzentration errechnet werden kann. Der Extinktions-koeffizient konnte bei bekannter Proteinstruktur mit dem Programm Protean^® ermittelt

Material und Methoden 39

werden.

Gemessen wurde meistens die Absorption als Funktion der Wellenlänge (Spektrum). Das Absorptionsmaximum für Proteine lag bei 280 nm, für DNA bei 260 nm. Teilweise wurde die Absorption auch bei fester Wellenlänge als Funktion der Zeit gemessen. So zum Beispiel bei kinetischen spektroskopischen Untersuchungen oder bei gelchromatographischen Verfahren.

Vor der Messung wurde die UV-Deuterium-Lampe 15 Min vorgewärmt. Anschließend wurde mit dem Medium, in dem sich das zu untersuchende Material befand eine Nullprobe gemessen und damit die Absorption auf 0 eingestellt. Die zu messende Lösung wurde 1:10 verdünnt und dann gemessen. Ein Spektrum wurde mit einem angeschlossenen Drucker ausgedruckt.

2.2.4.8 Dialyse

Die Dialyse wurde verwendet, um Proteinlösungen zu entsalzen oder umzupuffern. Die Dialysemembranen Spectra/Por^ wurden in Milliporewasser mit 0,02% Azid im Kühlraum aufbewahrt. Sie hatten einen cut-off von 6 - 8000 Da und mussten vor dem Einsatz mit NaHCO3 und EDTA gekocht werden, um Sulfide und Schwermetalle zu entfernen. Sie lagen als Schläuche vor, in die die Proteinlösung eingefüllt wurde. Vorher wurden die Schläuche noch ausgiebig mit Milliporewasser gereinigt. Die Enden waren durch Knoten und handelsüblichen Plastikklammern von Spectrum Medical Industries verschlossen. Der Schlauch mit der Proteinösung wurde dann in einen Messzylinder mit dem Zielpuffer gehängt.

In der Regel wurde das Probenvolumen über Nacht gegen ein 500 – 1000faches Puffervolumen dialysiert. Der Puffer der Proteinlösung im Schlauch und der Puffer im Messzylinder konnten sich dann austauschen.

2.2.4.9 Chromatographische Trennmethoden

Zum Einsatz kamen ausschlusschromatographische Verfahren, Hydroxyapatitchromato-graphie, Ionenaustauschchromatographie und die Affinitätschromatographie mit einem matrixgebundenem Antikörper. Die letzten drei Verfahren sind ausführlich in Abschnitt 2.2.7 beschrieben.

Bei der Ausschlusschromatographie wurden Nap5-, NAP-10- und PD10-Gelfiltrationssäulen verwendet, sowie Superose^- und Superdex^-Säulen verbunden mit einer FPLC^ (Fast Performance Liquid Chromatography). Die Ausschlusschromatograhie basiert auf der Trennung von Molekülen nach ihrer Größe. Je nach Größe können sie besser oder schlechter in ein poröses Trägermaterial mit definierter Porengröße eindringen. Kleine Moleküle dringen in die Poren ein und erfahren eine Verzögerung bei der Elution. Somit werden große Moleküle zuerst eluiert. Einfluss auf die Trennung nehmen Puffer, Probenvolumen, die

Säulenlände und die Flussrate. Nap5- bis PD10-Säulen enthalten ein Sephadex^ G-25 Medium, welches für die Umpufferung von Lösungen verwendet wurde. Die Auswahl der jeweiligen Säule hing vom umzupuffernden Volumen ab. Zunächst wurde das Gelbett mit 3 – 5 Bettvolumen des gewünschten Puffers gewaschen. Dann wurde die Lösung in einem für die jeweilige Säule definierten Volumen auf das Medium gegeben und nach Einsinken der Lösung in die Säulenmatrix mit dem gewünschten Puffer eluiert und aufgefangen.

Die FPLC^ wurde für die Aufreinigung von Proteinen verwendet. Dafür wurden Gelfiltrationssäulen verwendet. Für die FPLC^ benötigt man eine Kontrolleinheit, eine Pumpe, ein UV-Photometer mit Schreiber und einen Fraktionssammler. Die Auswahl der Säule richtete sich nach der Art des Experimentes (analytische oder präparative Auftrennung), der gewünschten Flussrate, der Größe der Proteine und dem Grad der Auftrennung (die Auftrennung von Proteinen mit der Superose 6^ - Säule ist zum Beispiel besser als mit der Superose12^). Bevor man den Probenlauf starten konnte, musste man die Säule mit dem gewünschten Puffer äquilibrieren. Die Puffer wurden frisch angesetzt, mit 0,02% Azid versehen und über eine Fritte mit einem Filter gereinigt. Über ein Äquilibrierungsprogramm wurde er dann auf die Säule gegeben. Die Probe, die auf die Säule gegeben werden sollte, musste vollständig gelöst sein und durfte keine Luftblasen enthalten. Je 500 µl der Probe konnte pro Lauf in ein Injektionsventil mit Hilfe einer Hamiltonspitze gefüllt werden. Die Pumpe erzeugte eine kontinuierliche Flussrate, mit der die Lösung über die Säule gepumpt wurde. Der Fraktionssammler fing das Eluat auf. Ein typisches Programm für die

Für die Visualisierung von Clathrin-Käfigen wurde das Verfahren der Negativkontrastierung mit Transmissionselektronenmikroskopie eingesetzt. Die Bildentstehung bei der