Uncoating mit DPW-J

In Kapitel 3.3.2.1 konnte gezeigt werden, dass DPW-J an die α-Ohrdomäne von AP-2 bindet.

Da auch in Auxilin DPW/F-Motive vorkommen, sollte nun untersucht werden, ob diese Bindung an AP-2 alleine ausreicht, um ein Uncoating durch Hsc70 zu katalysieren (Abb.

3.25). Es stellte sich zunächst kein vermehrtes Uncoating durch DPW-J ein, wenn CCVs verwendet wurden:

Abb. 3.25: Uncoating von trypsinverdauten CCVs mit DPW-J

235 pmol Clathrin (1 HC), GST-Auxilin (547-910) 1:16 zum Clathrin, als Positivkontrolle (Pos) und Hsc70 1:1 zum Clathrin wurden in einem Standard-Uncoating eingesetzt. DPW-J wurde in Stoffmengen zwischen 14,1 – 282 pmol eingesetzt. Es ist kein Uncoating bei Verwendung von DPW-J festzustellen.

Für diesen Versuch wurden CCVs verwendet, die mit Trypsin verdaut waren. Der Antikörper, der die Intaktheit des AP-2 in den CCVs nachwies (mAb 100/1), war gegen die β1 -Ohrdomäne von AP-2 gerichtet. Eine Überprüfung der CCVs mit einem spezifischen Antikörper gegen die α-Ohrdomäne (mAb 100/2) von AP-2 ergab, dass diese durch das Trypsin abgeschnitten werden kann.

Somit musste zur Überprüfung der Uncoating-Fähigkeit von DPW-J ein anderes System verwendet werden. Da der Trypsinverdau von CCVs dazu diente, Auxilin selektiv zu entfernen, damit keine „endogene“ Uncoating-Aktivität mehr von den CCVs selbst ausgehen konnte, wurden zu diesem Zweck gegen Auxilin gerichtete monoklonale Antikörper (mab 100/4) an CNBr-aktivierte Sepharose gekoppelt. 0,5 M Tris extrahierte CCV-Proteine wurden zunächst durch Gelfiltration nach der Größe fraktioniert (Abb. 3.26). Fraktionen, die die Adaptoren und Auxilin enthielten, wurden vereinigt und anschließend mit der Anti-Auxilin-Sepharose inkubiert. Ziel war es letztendlich, aufgereinigtes Clathrin und Adaptorproteine wiederzuvereinigen, die kein Auxilin enthielten. Damit sollte die Uncoating-Fähigkeit von DPW-J ohne Einfluss des Auxilins getestet werden konnte.

Ergebnisse 79

Abb. 3.26: Aufreinigung von Coat-Proteinen

Ca. 3,35 ml CCVs wurden mit 0,5 M Tris-HCl extrahiert. Die Membranen und andere schwere Zellfraktionen wurden bei 340000 g pelletiert und nach Gelfiltration und Fraktionierung SDS-PAGE analysiert. Aufgetragen ist die Extinktion in Abhängigkeit zur Zeit. Die Zeichnung wurde mit Adobe Illustrator^ nach Vorlage des Original-Profils erstellt.

Fraktion 21-24 wurden als Clathrinfraktionen vereinigt. In Fraktion 28 und 29 lagen hauptsächlich sogenannte „Assemblyproteine“ vor (Assemblyproteinfraktion = ASF). Zu diesen gehören auch Auxilin und AP-2. Die Depletierung wurde im Western Blot mit monoklonalen Antikörpern gegen Auxilin und AP-2 überprüft (nicht aufgeführt). Im Western Blot erkannte man in den Eluaten kein Auxilin und reduziertes AP-2 im Gegensatz zur Probe vor Inkubation mit CNBr – mAb 100/4. Die ASF enthielt schon vor Depletierung kein Auxilin. AP-2 ist aber in hoher Konzentration nachzuweisen und durch die Depletierung stark reduziert worden. Aus diesen Gründen entschlossen wir uns, die ASF vor Inkubation mit CNBr – mAb 100/4 einzusetzten.

Für die Uncoating-Assays mit DPW-J (Abb. 3.27) mussten die Clathrin-Triskelia aus der FPLC^ zunächst zusammengelagert werden (Puffer A, pH 6,4 + 2 mM CaCl2). Das Experiment wurde dahingehend modifiziert, dass die ASF zugefügt wurden (∼ 0,125 mg/ml AP-2). Es konnte davon ausgegangen werden, dass AP-2 sofort eine Verbindung mit Clathrin eingeht und somit das Substrat für die Bindung von DPW-J an Clathrin vorhanden ist.

Abb. 3.27: Uncoating von Clathrin-Käfigen mit DPW-J

Standard-Uncoating mit Clathrin-Käfigen (80 pmol; 1 HC) und Hsc70 (1,6:1). Zusätzlich wurde dem Assay noch variierende Mengen ASF (ca. 6,25 – 2,5 µg) und DPW-J 1,5:1 zum Clathrin zugefügt. Als Positivkontrolle wurde GST-Auxilin 1:2 zum Clathrin und 6,25 µg ASF verwendet (Pos). Die Negativkontrolle bestand nur aus Clathrin-Käfigen, Regenerationsmix und Puffer G. Die Proben inkubierten 20 Min bei 25 °C und wurden 20 Min bei 86000 g (Rotor TLA-45) zentrifugiert. Überstand und Pellet wurden dann auf eine SDS-PAGE aufgetragen. Als direkte Negativkontrolle wurde zusätzlich immer noch ein Ansatz ohne DPW-J pipettiert und parallel zum Ansatz mit DPW-J auf das Gel aufgetragen.

Trotz Variierens der DPW-J- und AP-2 Menge konnte kein Uncoating induziert werden.

DPW-J scheint eher stabilisierend zu wirken. Auch eine Veränderung der DPW-J Menge bei konstanter ASF Menge führte zu keinem anderen Ergebnis (Daten hier nicht aufgezeigt). Es liegt die Vermutung nahe, dass, ähnlich wie bei AP180(653-739)-J, die restlichen Adaptorproteine Bindungsstellen besetzen und damit die (schwachen) Wechselwirkungen zwischen DPW-J und der Ohrdomäne AP-2s stören.

Diskussion 81

4 Diskussion 4 Diskussion

Die Existenz eines bedeckten Vesikels endet mit der Dissoziation des Clathrin-Käfiges und konsekutiver Fusion des Membranvesikels mit seinem Zielkompartiment um die Vesikelfracht seinem Bestimmungsort zuzuführen. Strukturelle Analysen und Untersuchungen an Deletionsmutanten haben neue Erkenntnisse über die Interaktionen von Clathrin mit assoziierten Proteinen – insbesondere den Adaptorproteinen – geliefert. Darauf aufbauend entstanden Modelle über den Ablauf der Dissoziation der Clathrinhülle nach Aufnahme von Clathrin-bedeckten Vesikeln in das Innere von Zellen.

Ein wichtiger Schritt war die Verbesserung der Auflösung, mit der Clathrin-Käfige kryoelektronenmikroskopisch dargestellt werden konnten [64]. Die 3D-Kartierung von Clathrin-Triskelia, an die Auxilin bindet, stellte einen Meilenstein im Verständnis um die Reaktionsorte beim Uncoating dar. Es konnten frühere Arbeiten über die Funktion von verschiedenen Auxilin-Fragmenten bestätigt werden [41].

Auxilin spielt als katalytischer Kofaktor bei der Dissoziation der Hülle Clathrin-bedeckter Vesikel eine wesentliche Rolle. Es kann sowohl Clathrin als auch Hsc70 binden und deren ATPase-Aktivität stimulieren und so zum Zerfall der Clathrin-Hülle führen. Ein funktioneller Widerspruch besteht dahingehend, dass Auxilin auch in der Lage ist, freie Clathrin-Triskelia zu Käfigen zusammenzulagern.

Auxilin teilt mit anderen Adaptoren ein gemeinsames Strukturprinzip, in dem kompakt gefaltete Domänen mit langen unstrukturierten Bereichen, die mehrere Domänen Clathrins binden können, gekoppelt sind. Dadurch wird eine deutlich größere Konformationsfreiheit erzeugt. In Auxilins unstrukturiertem Bereich können die AP-2- und Clathrinbindung erfolgen. Dass es sowohl Bindungsstellen für Clathrin und AP-2 besitzt, ist ein weiteres gemeinsames Prinzip vieler akzessorischer Proteine der Endozytosemaschinerie. In zentraler Region, die als Clathrinbindungsdomäne bekannt ist, enthält Auxilin zwei DLL- sowie drei DPF-Motive [60]. Die Bindung an AP-2 erfolgt über die DPF/W-Motive, deren Anzahl die Bindungsstärke beeinflusst. Ziel ist die α-Ohrdomäne. Dabei enthalten AS 548-715 alle DPF- und ein DLL-Motiv und zeigen eine hohe Affinität zu AP-2 und zur TD Clathrins. AS 715-902 vermittelt vor allem die Assoziation zur DD Clathrins (Abb. 4.1).

Abb. 4.1 Bindungsstellen Auxilins an Clathrins schwerer Kette Aus: Edeling et al. 2006.

Man ging lange davon aus, dass eine Bindung an die globuläre terminale Domäne nicht essenziell für das Uncoating sei, da Hsc70 auch Clathrin-Käfige dissoziieren kann, denen durch einen Trypsinverdau die TD fehlten [37]. Um die Rolle der Bindung Auxilins an die TD und an AP-2 näher zu verstehen, wurden Fusionsproteine mit selektiven Bindungseigenschaften an Clathrins TD oder AP-2, gekoppelt mit einer J-Domäne erstellt.

Dabei ist die J-Domäne ein essenzieller Bestandteil Auxilins, um Hsc70 zu rekrutieren. Das Fusionsprotein AP180(653-739)-J enthielt drei funktionell relevante D(I/L)(F/L) Motive und ein NLL-Motiv. AP180 besitzt insgesamt zwölfmal das Tripeptid D(I/L)(F/L). Die Fähigkeit, an die TD Clathrins zu binden, scheint in direktem Zusammenhang mit der Anzahl dieser Motive zu stehen wie Mutationsanalysen ergeben haben [13]. In Einklang mit parallel zur Dissertation veröffentlichten Ergebnissen einer ähnlichen Chimäre, fand sich eine effektive Uncoating-Aktivität [74]. Genauere Funktionsanalysen mit AP180(653-739)-J zeigten aber, dass es nur in einem System mit ´reinen´ rekonstituierten Clathrin-Käfigen eine mit Auxilin vergleichbare Effektivität bei der Dissoziation erzielte, da in CCVs scheinbar ein Teil der TD durch andere akzessorische Proteine belegt ist. Es konnte allerdings keine katalytische Aktivität festgestellt werden. Des Weiteren war die Chimäre nicht in der Lage freie Clathrin-Triskelia zusammenzulagern. Die verschiedenen Clathrinbindungseigenschaften von Auxilin und AP180, welches keine Affinität zur distalen und proximalen Domäne Clathrins besitzt, scheinen den großen funktionellen Unterschied auszumachen. Eine Möglichkeit ist, dass erst die Interaktion an Clathrin zur katalytischen Aktivität Auxilins führt und die Deletion der proximalen Domäne zur stöchiometrischen Reaktionskinetik führt.

Fotin et. al zeigten in strukturellen Analysen, dass die Bindung von Auxilin in einem Clathrin-Käfig sowohl an die terminale, distale und proximale Domäne erfolgt. Die J-Domäne befindet

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sich dann genau in einem Bereich, wo mehrere Triskelia miteinander in Verbindung stehen, so dass die Rekrutierung von Hsc70 in diesem Bereich ein effektives Aufbrechen des Käfiges ermöglichen könnte [74]. Dieser Bereich wird durch eine terminale Domäne einer schweren Kette eines anderen Triskelionbeins kupiert. Das erklärt die Effektivität des Fusionsproteins.

Die Tatsache das TD-freie Clathrin-Käfige ebenso durch Aux (547-910) effektiv dissoziiert werden können, spricht dafür, dass die Affinität zu Clathrin durch mehrere Bindungsorte erhöht wird und die distale Domäne sich näher am o.g. vulnerablen Punkt im Clathrin-Käfig befinden. Auch die Konformationsfreiheit Auxilins erhöht die Chance, dass es freie Bindungsstellen am Triskelion findet.

DPW-J, welches über die Bindung an AP-2 agieren sollte, war funktionell inaktiv und konnte kein Uncoating induzieren. Das ein Dipeptid mit zwei DPW-Motiven fusioniert mit einer J-Domäne nicht zu einer effekiven Clathrin-Käfig-Dissoziation führt, könnte daran liegen, dass die Bindung an AP-2 durch die geringe Anzahl von DPW-Motiven in einem System mit CCVs nicht für eine effiziente Bindung ausreicht. In Epsin, einem akzessorischen Protein, welches eines Rolle bei der Bildung Clathrin-bedeckter Vesikel an der Plasmamembran spielt, finden sich zum Beispiel acht Mal die DPW/F-Sequenz. Unabhängig davon ist es möglich, dass die Bindung des Fusionsproteins von der Lokalisation im Clathrin-Käfig am AP-2 so ungünstig wäre, dass auch wenn es Hsc70 rekrutieren würde, dieses nicht Kontakt zu inter-Triskelion-Kontakten hätte. Außerdem besteht die Möglichkeit, dass gemeinsame oder überlappende Bindungsmotive Auxilins, eine gleichzeitige Bindung von Auxilin an AP-2 und Clathrin ausschließen und somit keine funktionelle Aktivität eintritt. Des Weiteren ist nicht auszuschließen, dass die beiden DPW-Motive innerhalb des Peptides ein zu große räumliche Nähe aufweisen, so dass die Bindung an komplettes AP-2 nicht möglich ist. Dieses wäre mit anderen, in ihrer Sekundärstruktur unterschiedlichen, Peptiden zu überprüfen.

Die Interaktion zwischen Hsc70 und Auxilin führt zur unspezifischen Wirkung von Hsc70 am Clathrin-Käfig. Die eigene Selektivität und Aktivität von Hsc70 ist gering. Erst die Bindung von ATP an der Nukleotid-Bindungs-Domäne (NBD) führt zur Konformationsänderung der Substrat-Bindungs-Domäne (SBD) und fördert die Interaktion mit einem bestimmten Substrat [76]. Die Dissoziation der Clathrinhülle findet unter ATP-Verbrauch statt und setzt die Bindung von Auxilin voraus. Auxilins J-Domäne stimuliert die ATP-Hydrolyse, wobei davon auszugehen ist, dass Auxilin zunächst am Clathrin-Käfig bindet und konsekutiv Hsc70 rekrutiert. Diese durch Auxilin koordinierte Rekrutierung und ATP-Hydrolyse arretiert die SBD von Hsc70 an Clathrin. Man kann annehmen, dass Auxilin nach Hydrolyse wieder vom Clathrin-Käfig abdissoziiert, während Hsc70 die Clathrin-Clathrin-Interaktion destabilisiert

[37]. Der exakte Destabilisierungsprozess ist nicht abschließend geklärt. Eine favorisierte Therorie geht vom „entropischen Ziehen“ (entropic pulling) aus: durch Fixierung des Substrates wird die Entropie reduziert und eine Zugkraft erzeugt, die zu einem Auseinanderbrechen der C-terminalen inter-Triskelia-Verbindung führt [77].

Beim Uncoating wirkt Auxilin katalytisch, während Hsc70 stöchiometrisch in einem Komplex erscheint, der drei Moleküle Hsc70 pro Triskelion enthält [37, 78]. Neben Clathrin, Auxilin und Hsc70 enthält ein Clathrin-bedeckter Vesikel auch Adaptoren, die ebenfalls abdissoziieren müssen, damit das Vesikel mit der Zielmembran fusionieren kann. An diesem Prozess ist ebenfalls Hsc70 beteiligt [79]. Da sich im Verlauf einer Uncoating-Reaktion eine typische biphasische Reaktionskinetik mit einem pre-steady-state und folgendem steady-state einstellt, entstand die Theorie der Ausbildung eines Komplexes aus Clathrin, Hsc70 und Adaptorproteinen, der dafür sorgt, dass Hsc70 nach Auseinanderbrechen des Clathrin-Gerüstes für weitere Reaktionen nicht zur Verfügung steht [80]. Diese Theorie konnte mit einem Experiment wiederlegt werden, in dem Hsc70, eine Uncoating-Reaktion fördern musste, nachdem es bereits einen Zyklus durchlaufen hatte. Es war keine Reduktion der Effektivität festzustellen und somie eine „Vergiftung“ durch Adaptoren unwahrscheinlich.

Des Weiteren sollte sich dieser Komplex in einer Gelfiltration darstellen lassen. Hier zeigte sich unter Verwendung einer hochauflösenden Superose 6^®-Säule sowohl im ATP- als auch im ADP-Zustand keine Assoziation der Proteine. Es ist davon auszugehen, dass die

Dissoziation und Zusammenlagerung von Clathrin-Käfigen sind keine statisch voneinander getrennten Ereignisse. Der Lebenszyklus eines CCVs ist von vielen Proteinen beeinflusst.

Auxilin spielt dabei eine große Rolle, da es zum Einen als Protein entdeckt wurde, das die Zusammenlagerung von Clathrin-Käfigen fördert, zum Anderen aber Hsc70 über seine J-Domäne rekrutiert. Diese Funktion ist konzentrationsabhängig. In einem Stoffmengenverhältnis ab 1:1 zum Clathrin fördert Auxilin die Zusammenlagerung von freien Clathrin-Triskelia. Verändert sich das Verhältnis zu Gunsten Clathrins, stellt sich die katalytische Aktivität mit Rekrutierung von Hsc70 und konsekutivem Uncoating von CCVs ein. Damit wäre es möglich, dass die biphasische Reaktionskinetik aufgrund eines veränderten Clathrin:Auxilin-Verhältnisses entsteht. Das heißt, bei einem Auxilin-Überschuss durch

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Reduktion der Menge an Clathrin-Käfigen findet ein sog. Reassembly statt, also dem Wiederzusammenlagern von bereits dissozziierten Triskelia. Diese Theorie konnte von uns bestätigt werden. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass dieser Effekt nicht mit der Aktivierung - und dementsprechend dem Verbrauch - von Hsc70 durch Auxilins J-Domäne verursacht wird. Konsistent mit dieser Erkenntnis ist auch, dass es kein alles-oder-nichts-Prinzip bei der Dissoziation von Clathrin-Käfigen gibt. Es besteht die Möglichkeit, dass nur Teile des Käfiges herausgetrennt werden. Es ist bereits seit längerem bekannt, dass es Clathrin-Käfige verschiedener Größe gibt. Die Größe reicht von 28 bis 60 Triskelia [81].

Mini-Käfige haben eine tetrahedrale Symmetrie und sind wahrscheinlich zu klein, um Vesikel zu verhüllen. Größere Käfige sind icosahedral symmetrisch aufgebaut und zeigen zum Beispiel eine Fass- oder Kugelform [82].

Abb. 4.2: Clathrin-Käfige verschiedener Größe Adaptiert nach: Pearse 1987.

Damit könnte die zunehmende Konzentration von Mini-Käfigen zu einer Abnahme der Reaktionsgeschwindigkeit führen und würde erklären, warum niemals 100% vom Clathrin im Überstand erscheint.

Ein weiterer zu diskutierender Aspekt bei der Betrachtung der Uncoating-Dynamik ist der Unterschied zwischen CCVs und reinen Clathrin-Käfigen. Die Effektivität einer Uncoating-Reaktion kann zum Einen durch Einbringen von Membranvesikeln gehemmt werden [66].

Zum Anderen fand sich in unseren Untersuchungen generell ein Unterschied der Effektivität von ca. 30%, wenn die von uns erstellte Chimäre CCVs versus reiner Clathrin-Käfige dissoziieren sollte. Hsc70 könnte an dieser Stelle seiner Rolle als Chaperone-Protein gerecht werden, indem es eine frühzeitige Clathrin-Polymerisation im Zytosol verhindert und somit dafür sorgt, dass sich freie Triskelia primär an der Zellmembran anlagern. Dafür sprechen auch FRAP-Experimente in HeLa-Zellen, die zeigen, dass ein Austausch von Clathrin, gekoppelt mit GFP (green fluorescence protein), vermindert ist, sobald sich ein Käfig von der Plasmamembran abspaltet und im Zytosol auftaucht [83].

Die Rolle der leichten Ketten von Clathrin sind ist noch weitgehend unverstanden. Leichte Ketten modulieren die Zusammenlagerung von Clathrin-Triskelia [84, 85] und binden an Huntingtin-interacting protein 1 (HIP1) und HIP1-related protein (HIP1R). Eine gesicherte Erkenntnis ist, dass sie bei der Zusammenlagerung von Clathrin-Triskelia einen negativ regulatorischen Einfluss ausüben [86]. Die Zusammenlagerung freier Triskelia ist pH-abhängig, und findet bei physiologischem pH nur in Zusammenwirkung mit Adaptorproteine statt. Negativ geladene Aminosäuren der leichten Ketten inhibieren die Ausbildung von Salzbrücken, die zur Zusammenlagerung von schweren Ketten notwendig sind. Damit können leichte Ketten Clathrin-Käfige destabilisieren und deren Zusammenlagerung verlangsamen oder verhindern. Ob dieser Effekt auch bei der Dissoziation von Clathrin-Käfigen eine Rolle spielt ist unklar. In der Sequenzanalyse von LCs fallen allerdings N-terminale Bindungsmotive für Hsc70 auf. Des Weiteren besitzen leichte Ketten C-terminale Bindungstellen für Calmodulin. Um zu erörtern, ob LCs direkt mit Hsc70 beim Unocating assoziiert sind, wurden Gelfiltrationsanalysen nach erfolgtem Standard-Unocating und nach Abtrennung der LCs mit Thiocyanat durchgeführt. Zusammenfassend fand sich keine Assoziation von Hsc70 mit LCs beim Uncoating. In einem weiteren Versuch konnte allerdings ein konzentrationsabhängiger Einfluss von LCs beim Uncoating festgestellt werden. In einem Experiment, in dem LC-freie Clathrin-Käfige verwendet wurden, konnte im Vergleich eine höhere Uncoating-Effektivität unter Zugabe von rekombinanten leichten Ketten erzielt werden. LCs scheinen Clathrin-Käfige zu destabilisieren und fördern so deren Dissoziation ohne direkt mit Hsc70 zu interagieren. Die von Ybe et al. durchgeführten Versuche können somit ein auch für das Uncoating geltendes Prinzip darstellen. Das die LCs aber einen direkten regulatorischen Einfluss ausüben ist nach den von uns erhobene Daten unwahrscheinlich.

In einem möglichen Modell, welches im Einklang mit den älteren und den Erkenntnissen aus dieser Arbeit steht, bindet Auxilin in einem Clathrin-Käfig über seinen unstrukturierten Bereich an Domänen verschiedener Triskelionbeine, um Hsc70 in einen Raum zu rekrutieren, wo viele inter-Triskelion-Kontakte bestehen. Hier liegen die Trimerisierungsdomäne und unstrukturierte C-Termini nahe an anderen distalen Domänen von Triskelionbeinen. In einer ATP-abhängigen Reaktion kommt es zu einem Aufbrechen dieser inter-Triskelion-Kontakte.

Durch die Bindung Auxilins über seinen unstrukturierten Bereich an dritten Triskelionbeinen, könnte es flexibel weitere Rekrutierungen initiieren, ohne sich zu lösen. Somit kann es katalytisch wirksam sein, während Hsc70 nur eine Reaktion eingehen kann. Es bleibt danach am Trisklion gebunden und dissoziiert vom Käfig ab. Im Verlauf der Reaktion ändert sich die

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Größe des Käfiges und das Verhältnis von Clathrin zu Auxilin ändert sich zu Gunsten Auxilins. Eine Assembly-/Reassembly-Aktivität setzt ein, so dass sich ein steady-state ausbildet. Es sind somit primär kleine Clathrin-Käfige vorhanden.

A

B

Abb. 4.3 Dynamik eines Uncoatings

Modell zur Dissoziation eines Käfiges. In A) ein möglicher molekularer Zusammenhang zwischen der Clathrin-Struktur, Auxilin und Hsc70. Auxilin, hier in grün dargestellt, zeichnet sich durch flexible mittlere Domänen aus. Ein optimaler Bindungsbereich ist dort, wo drei terminale Domänen überlappen. Die Bindung an der terminale und proximalen Domäne orientiert die J-Domäne in den vulnerablen Bereich des Clathrin-Käfiges, wo Hsc70 rekrutiert werden kann (1). Während die Konformationsfreiheit Auxilins weitere Bindungen am Käfig erlaubt, muss neues Hsc70 rekrutiert werden (2). B) zeichnet den möglichen Zusammenhang zwischen Käfiggröße und biphasischer Reaktionskinetik auf.

Zur Bestätigung des o.g. Modells könnten transelektronenmikroskopische Untersuchungen helfen, um die verschiedenen Käfiggrößen nach definierten Zeitpunkten zu visualisieren. Des Weiteren werden mit Spannung hochauflösende Strukturuntersuchungen von an Clathrin gebundenem Auxilin erwartet, um wieder nähere Erkenntnisse räumlichen Anordung bei der Dissoziation Clathrin-bedeckter Vesikel zu erlangen.

Des Weiteren wird sich in den nächsten Jahren zeigen, wie hoch die klinische Relevanz dieser Ergebnisse einzuordnen sind. Im Bereich neuronaler Dysfunktion und neurodegenerativer Erkrankungen finden sich einige Beispiele, bei denen Störungen in der Clathrin-vermittelten Endozytose ein Rolle spielen. Der Funktionsverlust dieser Systeme führt beispielsweise zu einer gestörter Vesikelaufnahme in synaptischen Vesikeln [87].

Auch bei der familiäre Hypercholesterinämie finden sich Störungen bei der Clathrin-vermittelten Aufnahme des LDL-Rezeptors [88]. Die Folge sind Atherosklerose und frühzeitige koronare Herzkrankheit.

Als ein letztes Beispiel konnte erst kürzlich gezeigt werden, dass neben dem Influenza- oder Herpes simplex-Virus auch Hepatits-C-Viren via Clathrin-vermittelter Endozytose in die Zellen eindringen [89].

Zwar kennt man keine klinisch relevante Mutation im Auxilin-Gen, aber Hsc70 ist ein Protein, welches eine große Rolle bei vielen intrazellulären Prozessen spielt. Im Bereich neurodegenerativer Erkrankungen, wie zum Beispiel die primären und sekundären Parkinson-Erkrankungen oder Amyotropher Lateralsklerose, wirkt Hsc70 antiapoptotisch. Man versucht sich diese Wirkung zu Nutze zu machen, indem man in vitro und zunehmend auch in vivo

Zwar kennt man keine klinisch relevante Mutation im Auxilin-Gen, aber Hsc70 ist ein Protein, welches eine große Rolle bei vielen intrazellulären Prozessen spielt. Im Bereich neurodegenerativer Erkrankungen, wie zum Beispiel die primären und sekundären Parkinson-Erkrankungen oder Amyotropher Lateralsklerose, wirkt Hsc70 antiapoptotisch. Man versucht sich diese Wirkung zu Nutze zu machen, indem man in vitro und zunehmend auch in vivo