Die Funktion der leichten Ketten beim Uncoating ist noch nicht vollständig geklärt. Sicher scheint, dass die leichten Ketten einen regulatorischen Einfluss auf die Zusammenlagerung von Clathrin-Käfigen haben [17 – 19 , 72]. So können sich Clathrin-Käfige ohne leichte Ketten bereits bei physiologischem pH zusammenlagern, während sie mit leichten Ketten von Kofaktoren (z.B. AP-2) oder Calcium abhängig sind [18]. Kontrovers wird die Rolle der leichten Ketten in Bezug zu Hsc70 diskutiert [18, 20].
Ein Gegenstand dieser Arbeit ist die Frage, ob die leichten Ketten einen regulatorischen Einfluss auf das Uncoating ausüben und ob sie mit Hsc70 interagieren. Dafür wurde zunächst untersucht, ob Hsc70 beim Uncoating mit den leichten Ketten assoziiert ist. Es folgte dann der Vergleich der Uncoating-Effektivität wenn man Clathrin-Käfige mit oder ohne leichte Ketten einsetzt.
3.2.1 Assoziation von Hsc70 mit leichten Ketten
Es hat zunächst interessiert, ob die leichten Ketten bei der Uncoating-Reaktion mit Hsc70 assoziiert sind. Dafür wurde aufgereinigtes Clathrin aus Schweinehirn unter Verwendung des chaotropen Na-Thiozyanat in schwere und leichte Ketten dissoziiert. Auch ohne leichte Ketten lagern sich die schweren Ketten wieder zu polygonalen Käfigstrukturen zusammen [73]. Für das Abtrennen der leichten Ketten wurde der Überstand einer Uncoating-Reaktion über eine Nap5-Säule gegeben, die mit einem Puffer aus Na-Thiozyanat äquilibriert war. Die konzentrierten Fraktionen (detektiert durch einen spot assay) wurden anschließend auf eine Säule gegeben und nach TCA-Fällung durch SDS-PAGE und Western Blot analysiert (Abb.
3.8). Die Gelfiltration über eine Superose 6−Säule wurde mit verschiedenen Ansätzen gemacht. Es wurde der Überstand aus einer Uncoating-Reaktion aufgetragen. Als Kontrollen dienten ein Ansatz ohne CCVs, um das Laufverhalten von Hsc70 zu detektieren (nach Versuch ohne CCV) und einer mit CCVs, die mit Tris-HCl in ihre Untereinheiten zerlegt wurden wodurch die leichten Ketten isoliert gelfiltriert werden konnten.
Ergebnisse 63
Abb. 3.8: Assoziation von Hsc70 mit leichten Ketten beim Uncoating
Nach Uncoating mit 1,06 nmol aufgereinigtem Clathrin, Hsc70 (1,8:1) und Auxilin (547-910) 1:4 zum Clathrin (1 HC) wurde der Überstand über eine Nap5-Säule, die mit Thiocyanatpuffer equilibriert wurde gegeben. Das Eluat wurde fraktioniert und ein spot assay angeschlossen. Die konzentrierten Fraktionen wurden vereinigt und insgesamt 500 µl über eine Superose 6®-Säule gelfiltriert. Nach Säulenlauf und Fraktionierung des Eluates schloss sich eine TCA-Fällung und SDS-PAGE, sowie ein Western Blot mit R460 gegen die leichten Ketten an. Freie LC wurde durch eine Gelfiltration eines CCV Trisextraktes über eine Superose 6®-Säule nachgewiesen (CCV-Trisextrakt). Außerdem wurde die oben beschriebene Uncoating-Reaktion ohne Clathrin durchgeführt. Damit sollte isoliert Hsc70s dargestellt werden (nach Versuch ohne Clathrin). Die Auswertung der Gele und Western Blots erfolgte densitometrisch. Nach Uncoating lässt sich keine Assoziation von Hsc70 mit LC feststellen.
Zu erkennen ist, dass Hsc70 mit Clathrins schwerer Kette assoziiert ist und sich das vordere Hsc70-Maximum mit dem der Clathrin schweren Kette deckt. Ein weiteres Maximum lässt sich in späteren Fraktionen ausmachen, die freies Hsc70 enthalten. Nach Uncoating sind die leichten Ketten durch Na-Thiocyanat abgetrennt worden. Ähnlich wie zerlegtes Clathrin durch Tris-HCl, zeigen die kleineren leichten Ketten ein Maximum in den hinteren Fraktionen. Man würde bei Assoziation von Hsc70 mit den leichten Ketten ein verändertes Laufverhalten erwarten. Hsc70 wäre nicht mit den schweren Ketten assoziiert und würde kein Maximum in den vorderen Fraktionen zeigen. Es sollte eine Verschiebung der leichten Ketten zu den Fraktionen des Hsc70 geben. Allerdings ist nicht auszuschließen, dass das Na-Thiocyanat eine Bindung von Hsc70 mit LC stört, so dass dieser Komplex in der Gelfiltration nicht mehr nachzuweisen ist. Dann wäre allerdings trotzdem kein vorderes Hsc70 Maximum zu erwarten.
Zusammenfassend konnte also keine Assoziation von leichten Ketten und Hsc70 detektiert werden.
3.2.2 Vergleich der Uncoating-Effektivität mit und ohne leichte Ketten
Falls die leichten Ketten eine regulatorische Funktion besitzen, sollte die
Uncoating-Effektivität verändert sein, wenn man Clathrin-Käfige verwendet, denen die leichten Ketten fehlen. Um diese Käfige zu erstellen, wurde gereinigtes Clathrin und über eine NAP-10-Säule, die mit einem Thiozyanat-Puffer äquilibriert war gegeben. Die leichten Ketten wurden anschließend über eine Superdex 500®-Säule abgetrennt. Clathrin-Käfige konnten sich im Anschluss in Puffer A mit 2M CaCl2 ausbilden. Die so erstellten Clathrin-Käfige ohne leichte Ketten wurden in Uncoating-Experimente eingesetzt (Abb. 3.9 und 3.10). Als Vergleich wurden diese Käfige noch mit verschiedenen Mengen rekombinanter leichten Ketten versehen. Da leichte Ketten sofort mit den schweren Ketten assoziieren, konnte man so beide Käfigarten im Uncoating miteinander vergleichen.
Abb. 3.9: Uncoating-Aktivität in Abhängigkeit von den leichten Ketten
17 pmol Clathrin (1 HC; ohne LC), GST-Auxilin (547-910) 1:400, Hsc70 2,8:1 und Regenerationsmix wurden mit verschiedenen Mengen aufgereinigten leichten Ketten versehen (25 – 156 pmol) und 5 Min bei 25 °C inkubiert. Die Reaktion wurde mit 10fach Hexokinase/Glukose gestoppt und sofort bei 86000 g zentrifugiert. Überstand und Pellet wurden in der SDS-PAGE analysiert.
Das Ergebnis wurde densitometrisch ausgewertet und eine Grafik mit dem Programm Excel erstellt. Die Negativkontrolle ist abgezogen (ca. 8%). Man erkennt gut die Abhängigkeit des Uncoatings vom zugefügten LC-Volumen.
Man erkennt eine Zunahme der Uncoating-Aktivität bei Erhöhung der Konzentration an leichten Ketten.
Um das Ergebnis zu verifizieren, wurde eine weitere Kinetik durchgeführt. Dabei wurden wieder Clathrin-Käfige ohne und mit Zugabe von leichten Ketten verglichen (Abb. 3.10).
Ergebnisse 65
Abb. 3.10: Kinetik einer Uncoating-Reaktion mit und ohne leichte Ketten
Clathrin-Käfige ohne LC (ca. 50 pmol) wurden mit Hsc70 (2,3:1), GST-Auxilin (547-910) (1:7) und mit oder ohne Zugabe von aufgereinigten leichten Ketten untersucht. Die Reaktion wurde mit Zugabe von Hsc70 gestartet und mit Hexokinase/Glucose (1:4) gestoppt. Die SDS-PAGE wurde densitometrisch ausgewertet. Die exemplarische Auswertung beruht sich auf zwei verschiedene Experimente, in dene jeweils Doppelbestimmungen vorlagen. Man erkennt das verbesserte Uncoating unter Zugabe leichter Ketten.
Die Auswertung zeigt, dass bei Zugabe von leichten Ketten eine höhere Uncoating-Aktivität vorliegt. Das Uncoating hat nach 3 Minuten 20 % erreicht im Gegensatz zu einer fehlenden Dissoziation von Clathrin-Käfigen ohne leichte Ketten mit einer realtiven Menge zerfallener Käfige von 3%. Insbesondere nach 20 Minuten kann man einen deutlichen Unterschied erkennen. Die Clathrin-Käfige mit leichten Ketten sind zu 70 % zerfallen, die Clathrin-Käfige ohne leichte Ketten nur zu 38 %.
Zusammenfassend kann man feststellen, dass leichte Ketten einen Einfluss auf das Uncoating haben. Dabei scheint dieser Einfluss nicht mit einer Assoziation zu Hsc70 zusammen-zuhängen. Auffällig war die Veränderung der Käfigstabilität. Man konnte nach eigenen Beobachtungen die LC-freien Käfige wesentlich länger bei +4 °C aufbewahren, ohne dass ein großer Teil schon eigenständig zerfallen war.