Komponenten der Clathrin-vermittelten Endozytose

1.2.2.1 Clathrin

Das Protein Clathrin (griech.: Clathrate = wie ein Käfig) wurde 1976 von Barbara Pearse enteckt [10]. Es besteht in seiner Grundstruktur aus einem Triskelion (griech.: dreibeinig) (Abb. 1.4). Ein Triskelionbein besteht aus einer schweren Kette, der eine leichte Kette angelagert ist. Die schweren Ketten werden von 1675 Aminosäuren (AS) gebildet und haben eine Größe von 192 kDa [11]. Es werden vier Domänen unterschieden. Die C-terminale Domäne (auch Trimerisierungsdomäne genannt; AS 1675-1550) bildet mit den anderen schweren Ketten den Mittelpunkt oder die Nabe des Triskelions. Hier befinden sich auch die Bindungsstellen für die leichten Ketten. Nach außen folgt die proximale Domäne (PD; AS 1552-1074), die vorwiegend aus kurzen α-helikalen Segmenten besteht, die kurze Hohlnadelschleifen bilden. Eine ähnliche Struktur hat auch die distale Domäne der schweren Ketten (DD; AS 1073-495), die durch eine leichte Krümmung von der proximalen Domäne getrennt ist. Insgesamt kommt dieser sogenannte CHC repeat sieben Mal in der gesamten schweren Kette vor und trägt zur Trimerisierung der Triskelia bei [5]. Am Ende eines Triskelionbeines befindet sich die globuläre terminale Domäne (TD; AS 494-1). Sie bildet eine β-Propeller Struktur mit 7 „Blättern“ aus und enthält unter anderem Bindungsstellen für AP-2 [12], AP180 [13, 14] und Auxilin [15]. Die TD ist über einen α-zig-zag linker mit der distalen Domäne verbunden [16].

Abb. 1.4: Clathrin

A) Transelektronenmikroskopische Aufnahme von Clathrin-Triskelia (Ungewickell und Branton 1981). B) Schematische Übersicht über die Komponenten eines Clathrin-Käfiges (Nathke et al., 1992). C) Dreidimensionale Rekonstruktion eines Clathrin-Käfiges (nach Smith et al., 1998).

Die leichten Ketten (LC) von Clathrin liegen in zwei verschiedenen Formen vor: LCa und

LCb. Ein funktioneller Unterschied zwischen LCa und LCb scheint nur in höher organisierten Organismen vorhanden zu sein, da LCa und LCb je nach Gewebeursprung in verschiedenem Maße exprimiert werden. Sie stimmen in 60% der Aminosäuresequenz überein und sind zwischen 25-29 kDa groß. Auffällig ist, dass sie stark negativ geladen sind (in der Gelelektrophorese entspricht ihre Motilität Polypeptiden mit Größen zwischen 30-36 kDa).

Ohne leichte Ketten können die schweren Ketten schon bei physiologischem pH zu Käfigen polymerisieren. Wenn leichte Ketten binden, tritt diese Zusammenlagerung erst bei einem pH unter 6,5 auf. Adaptoren (s. auch 1.2.2.2) können den inhibitorischen Effekt der leichten Ketten wieder aufheben und die Zusammenlagerung der Triskelia bei physiologischem pH stimulieren. Damit könnten die leichten Ketten verhindern, dass Triskelia im Zytosol zu Aggregaten zusammenlagern und so die Zusammenlagerung von Clathrin modulieren [17 - 19]. Die leichten Ketten sollen auch Hsc70 stimulieren, zusammengelagertes Clathrin zu dissoziieren [19, 20] und scheinen für die in vivo Trimerisierung der schweren Ketten nötig zu sein [21].

Fasst man nun schwere Ketten und leichte Ketten zusammen, erreicht ein Triskelion eine Größe von ca. 650 kDa (3 schwere Ketten + 3 leichte Ketten). Wenn sich mehrere Triskelia zusammenlagern, zum Beispiel um einen Membranvesikel, ensteht eine polyhedrale Struktur mit exakt 12 Pentagonen und einer variablen Anzahl an Hexagonen die einen Vesikel umhüllen kann.

1.2.2.2 Adaptoren

Adaptorproteine sind Komponenten von CCVs, die Clathrin mit Membranen verbinden. Sie wurden als clathrin assembly factor 1979 von Keen et al. entdeckt [22]. Man unterscheidet AP-1 und AP-2. Sie verbinden Clathrin mit der Plasmamembran (AP-2) oder den Membranen des trans-Golgi-Netzwerkes (AP-1). Adaptoren induzieren aber nicht nur die Zusammenlagerung von CCVs, sondern sind auch an der Selektion der Vesikelfracht beteiligt und rekrutieren akzessorische Proteine, die die Vesikelform regulieren.

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Abb. 1.5: AP-1 und AP-2

Schematische Darstellung der AP-1- und AP-2-Komplexe (aus Robinson und Bonifacino, 2001).

Die Adaptoren sind Heterotetramere mit zwei großen Untereinheiten von 100-130 kDa (γ und β1 in AP-1; α und β2 in AP-2), einer mittelgroßen Untereinheit von 50 kDa (μ1/μ2) und einer kleinen Untereinheit von 17-20 kDa (σ1/σ2) (Abb. 1.5). Elektronenmikroskopische Aufnahmen konnten eine typische Morphologie der Adaptoren aufzeigen. So weisen Adaptoren nicht nur eine Kernregion aus den oben beschriebenen Untereinheiten auf, sondern noch „Anhängsel“ (eng.: appendage domain). Damit sehen die Adaptoren aus wie ein Kopf mit Ohren. Die Ohrdomänen sind über ein Scharnier (eng.: hinge region) mit dem Kopf verbunden.

Durch Peptidbindungsexperimente und kristallographische Methoden wurden den jeweiligen Untereinheiten verschiedene Domänen und Motive zugewiesen, die mit bestimmten Funktionen verknüpft sind. So haben die α- und γ-Untereinheiten am N-terminalen Ende Bindungsseiten für Phosphoinositide. Bekannt ist auch, dass an die α-Ohrdomäne Proteine binden können, die DΦF/W-, FxbxF- oder WxxW-Motive haben. Das kann zum Beispiel Auxilin, AP180 oder Epsin 1 sein. In der β-Untereinheit wurde ein sogenanntes Clathrin-Box-Motiv charakterisiert, das für die Bindung an Clathrin verantwortlich ist. Das Clathrin-Box-Motiv hat die Sequenz: [L (L,I) (D,E,N) (L,F) (D,E)] [23]. Auch in anderen Proteinen wie AP180, Amphiphysin oder AP-3 kommt ein Clathrin-Box-Motiv vor. Es hat die Sequenz WDPW oder LMDLA [24]. Den Clathrin-Box-Motiven ist gemeinsam, dass sie mit der terminalen Domäne von Clathrin interagieren können. Eine Variante des Clathrin-Box-Motives wurde in der γ-Untereinheit von AP-1 entdeckt: LLDLL [25].

1.2.2.3 AP180

Auch an synaptischen Membranen spielt die Clathrin-vermittelte Endozytose eine wichtige Rolle. Dieser Prozess setzt die Anwesenheit von AP180 voraus. Es wurde zunächst als spezifische Komponente von CCVs in Neuronen entdeckt [26]. AP180 ist ein

Phosphoprotein, das an Serinresten phosphoryliert werden kann. Das ensprechende Homolog in anderen Geweben ist das Protein CALM (clathrin assembly lymphoid myeloid leukemia protein) [27].

AP180 fördert die Zusammenlagerung von Clathrin und bestimmt die Größe der CCVs [28 - 30]. Bei der synaptischen Übertragung ist nicht nur die Freisetzung von Neurotransmittern von entscheidender Bedeutung, sondern auch die Wiederverwertung der Membranen. Die Schlüsselschritte dieses Vorgangs bestehen - ähnlich der Rezeptor-vermittelten Endozytose - aus Abschnürung des Vesikels von der Membran und Clathrin-Dissoziation, damit die Vesikel ins Zytoplasma gelangen können [31].

AP180 ist ein monomeres Protein mit einer Größe von ca. 92 kDa (Abb. 1.6). Es verfügt am N-terminalen Ende über eine ANTH-Domäne, die für die Bindung an PIP2 verantwortlich ist (AP180 N-terminal homology domain). Diese konservierte Domäne, die auch in anderen Proteinen zu finden ist, ist für die Regulation der Vesikelgröße und Bindung an Membranen wichtig [31, 32].

C-terminal befinden sich Motive, die für die Bindung an Clathrin verantwortlich sind. Das wichtigste Motiv ist das DLL-Motiv, welches die Bindung an Clathrin vermittelt und die Zusammenlagerung zu Käfigen fördert [13]. Ein weiteres wichtiges Motiv ist das DΦF/W-Motiv (s.a. 1.3.2), das in Form von DPF- oder DPW-DΦF/W-Motiven die Assoziation mit AP-2 vermittelt.

Abb. 1.6: AP180

Schematische Darstellung von AP180 einschließlich relevanter Bindungsmotive.

AP180 hat einige ungewöhnliche molekulare Eigenschaften. In den meisten SDS-PAGE-Systemen migriert die AP180-Bande wie ein 155-180 kDa großes Polypeptid (eigentliche Größe nach Sequenz 92 kDa, abhängig von der Splice-Variante) [33]. Zusätzlich hat es einen sehr niedrigen Extinktionskoeffizienten und wird nur sehr schwach von Coomassie Brilliant Blau gefärbt. Außerdem kann es leicht durch proteolytische Enzyme angegriffen werden. Der Grund für diese Eigenschaften liegt in der ungewöhnlichen Struktur von AP180. Neben der ANTH-Domäne ist der carboxyterminale Teil von AP180 nur sehr schwach strukturiert und verhält sich wie ein flexibles Polymer. Die Folgen sind ein geringer Sedimentationskoeffizient und eine Resistenz gegen Hitzedenaturierung des C-terminalen Bereiches. Außerdem verhindern die negativ geladenen Aminosäuren in diesem Bereich die Bindung von SDS und

ANTH

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Coomassie, was das besondere Laufverhalten in der SDS-PAGE erklärt. Ein Modell, das die Struktur von AP180 erklärt, geht davon aus, dass AP180 mit der ANTH-Domäne in Regionen an der Plasmamembran bindet, wo hohe Konzentrationen von PIP2 vorkommen. Mit dem flexiblen carboxyterminalen Segment könnte es dann Clathrin und AP-2 „einfangen“ und an der Plasmamembran konzentrieren [32].

1.2.2.4 Auxilin

Auxilin wurde ursprünglich als neuronale Komponente von CCVs entdeckt [34]. Es kommt aber auch eine Form vor, die in allen Säugetierzellen vorhanden ist – Auxilin 2 [35]. Auxilin 2 ist auch als GAK bekannt, weil es eine Cyclin G-assoziierte Kinase ist. Beiden Auxilins ist gemeinsam, dass sie am N-terminalen Ende eine PTEN- und Tensin-Homologie- Domäne besitzen. Die Domäne, die enzymatisch inaktiv ist, bindet an Ptd(4)P [36]. Der PTEN-Domäne folgt in beiden Auxilins ein Clathrinbindungssegment und eine J-PTEN-Domäne. Auxilin 2 unterscheidet sich von Auxilin durch eine aktive Serin/Threonin Proteinkinase-Domäne, die sich N-terminal zwischen AS 40-315 befindet.

Auxilin besteht aus 910 AS und hat eine Größe von ca. 110 kDa (Abb. 1.7). Das Clathrinbindungssegment liegt zwischen AS 547-813. Danach folgt von AS 814-910 die J-Domäne, die als Kofaktor beim Uncoating von CCVs mitwirkt. Die J-Domäne zeigt große Homologien zu anderen eukaryotischen DnaJ-Proteinen und zu bakterieller DnaJ auf [37].

Der Rest von Auxilin ist einzigartig. Das bestätigt, dass DnaJ-Proteine als gemeinsames Strukturprinzip über konservierte Domänen verfügen und über Domänen, die spezifisch für jedes Protein sind [38].

Die AS 1-546 sind für das Uncoating in vitro nicht entscheidend. Die PTEN-Domäne könnte aber eine regulatorische Funktion ausüben [39].

Abb. 1.7: Auxilin

Schematische Darstellung von Auxilin1 (nach Umeda et al., 2000).

Über das Clathrinbindungssegment kann Auxilin 2 auch AP-1 und AP-2 binden [15, 35].

Owen et al. zeigten 1999, dass die beiden DPF/W-Motive im Clathrinbindungssegment eine Rolle bei der Interaktion mit AP-2 spielen. Diese DPF/W-Motive sind auch in AP180 und Epsin 1 vorhanden und die Anzahl dieser Motive scheint mit der Bindungsaffinität zur α-Ohrdomäne von AP-2 zu korrelieren [40]. Scheele et al. zeigten, dass auch Auxilin über diese

Motive an die α-Ohrdomäne bindet, sowie die Bindung mit der β2-Ohrdomäne von AP-2 vermittelt [41].

Die Bindung an Clathrin erfolgt über die bekannten Motive DLL (an die terminale Domäne/proximale Domäne) und DPF (distale Domäne). Neue Motive, die kürzlich entdeckt wurden, sind FS, WDW und NWQ. Damit besitzt Auxilin multiple Motive, um an alle Domänen der schweren Kette von Clathrin binden zu können [41]. Diese Motive gehören nicht zu den bekannten Clathrin-Box-Motiven und erweitern die mögliche Interaktion mit Clathrin.

Die Relevanz der Bindung an die terminale Domäne wurde unterschätzt, weil Ungewickell et al. 1995 zeigten, dass die Bindung von Auxilin an die proximale oder distale Domäne ausreicht, um ein Uncoating zu vermitteln [37]. Die Verwendung von trypsinverdauten Clathrin-Käfigen ohne die TD, weist darauf hin, dass die TD für die Funktion von Auxilin beim Uncoating keine Bedeutung hat.

CD-spektroskopische Daten [41] und ältere NMR-Daten [42, 43] demonstrieren, dass das Clathrinbindungssegment keine Struktur besitzt und die J-Domäne über α-helikale Strukturen verfügt. Das ist vergleichbar mit den Clathrinbindungsdomänen in AP180 oder Epsin 1 [43, 32].

Funktionell wurde Auxilin ursprünglich als Protein beschrieben, das an der Zusammenlagerung von Clathrin zu Käfigen beteiligt ist [34] (auxiliare = lat.: helfend, unterstützend). Diese Funktion tritt bei relativ hohen Konzentrationen von Auxilin auf. Bei niedriger Konzentration kann es die Dissoziation von CCVs und aufgereinigten Clathrin-Käfigen induzieren. Auxilin wirkt dann als katalytischer Kofaktor. Das geschieht im Zusammenspiel mit Hsc70, einem Hitzeschockprotein, wobei der entscheidende Teil von Auxilin, der mit Hsc70 interagiert, die J-Domäne ist [37, 44 - 46]. Über Sequenzanalysen und Mutationsexperimente konnte das HDP-Motiv in der J-Domäne als zentrales Hsc70-Bindungsmotiv identifiziert werden [47].

1.2.2.5 Hsc70

Hsc70 ist ein Protein, welches im Zytosol aller Zellen vorkommt und ursprünglich als Hitzeschockprotein identifiziert wurde. Es zeigt Homologien zu dem Protein BiP und anderen Hitzeschockproteinen vergleichbarer Größe (alle um 70 kDa) auf. Hitzeschockproteine binden an entfaltete Abschnitte denaturierter Proteine und verhindern deren Präzipitation innerhalb der Zelle. Weil sie die Faltung vieler Proteine unterstützen und verhindern, dass Proteine eine falsche Konformation einnehmen, werden sie auch Chaperone („Ammenproteine“) genannt [4].

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Hsc70 (heat shock cognate) ist die konstitutive Form des Hitzeschockproteins Hsp70 (heat shock protein). Es ist somit immer in der Zelle vorhanden und wird nicht nur bei „Stress“

exprimiert. Die Funktionen von Hsc70 sind vielfältig. Es wirkt bei der korrekten Faltung von Proteinen mit, bei der Translokation von Proteinen durch Membranen, bei der Reorganisation von makromolekularen Komplexen und bei der Dissoziation von Proteinkomplexen [48, 49].

Hsc70 hat eine Größe von ca. 70 kDa und besteht aus 3 Abschnitten [50] (Abb. 1.8). N-terminal befindet sich eine ATPase Domäne, die ca. 45 kDa groß ist. Es folgt eine 15-18 kDa große Substratbindungsdomäne, deren Struktur zweigeteilt ist. Die erste Hälfte besteht aus einer β-sandwich-Domäne mit zwei viersträngig antiparallelen β-Faltblättern, dann folgen α-Helices [51]. Die C-terminale Domäne kann enzymatisch abgespalten werden und ergibt dann ein Fragment von 10 kD Größe. Ohne diese 10 kDa-Domäne kommt es zu einer deutlich geringeren Stimulation der ATPase Aktivität durch Auxilin [47]. Der C-Terminus ist auch die Domäne, die am wenigsten konserviert und relativ variabel ist [52].

Abb. 1.8: Hsc70

Schematische Darstellung von Hsc70 modifiziert nach Wakeham et al. 2000.

Hsc70 und andere Proteine dieser Klasse wie z.B. das bakterielle Dank sind dafür bekannt, Interaktionen mit J-Domänen einzugehen. Dabei können die J-Domänen die ATPase-Domäne von DnaK und Hsc70 stimulieren. Die Kombination der Substratbindungsdomäne von Hsc70 mit der J-Domäne von Auxilin erlaubt Hsc70 erst mit seinem spezifischen Substrat zu interagieren.

Die Interaktion von Hsc70 mit seinen Bindungspartnern ist ATP-abhängig. Dabei hat Hsc70 eine hohe Affinität zu Polypeptiden, wenn es im ADP-Zustand ist. Im ATP-Zustand ist es

„aktiviert“. Das heißt, dass es sofort eine Bindung eingeht, wenn ein Partner angeboten wird [53, 54]. Hier kommt die Struktur von Hsc70 zum Tragen. Die Substrate können in einem Kanal gebunden werden, der durch die β-sandwich-Struktur der Substratbindungsdomäne

erzeugt wird. Die α-Helices sind flexibel und können den Kanal wie ein Deckel verschließen [47]. Mit seinem Kanal und dem flexiblen Deckel kann es zu Wechselwirkungen zwischen dem gebundenen Protein und Hsc70 kommen – zum Beispiel um Bindungen aufzubrechen.

Man könnte Hsc70 auch mit einer Schachtel vergleichen, deren Deckel schließt, sobald Hsc70 im ADP-Zustand ist. Wenn Hsc70 im ATP-Zustand ist, geht der Deckel auf und es erfolgt die Freisetzung bzw. Bindung neuer Peptide oder Proteine.