Universitätsklinikum Otto-von-Guericke-Universität Magdeburg Institut für Medizinische Mikrobiologie Direktor: Prof. Dr. med. W. König Praktikum der Medizinischen Mikrobiologie

(1)

Universitätsklinikum

Otto-von-Guericke-Universität Magdeburg

Institut für Medizinische Mikrobiologie

Direktor: Prof. Dr. med. W. König

Praktikum der

Medizinischen Mikrobiologie

Sommersemester 2010

(2)

Arbeitsunterlagen

für den mikrobiologischen Kurs

Grundsätzliches zum Praktikum

Die Lehrveranstaltungen beinhalten neben Hauptvorlesungen auch praktische Übungen im Institut für Medizinische Mikrobiologie, Haus 44.

Die Teilnahme am mikrobiologischen Kurs ist Pflicht!

Nur in Ausnahmefällen ist eine Entschuldigung beim Institutsleiter möglich.

Bei mehreren Versäumnissen wird die Kursteilnahme nicht bescheinigt.

Der Kursteilnehmer ist verpflichtet, zu den praktischen Übungen Protokolle und Zeichnungen anzufertigen. Die Ergebnisse werden von den betreuenden Kurs- assistenten kontrolliert.

Die Platzverteilung in den Kursräumen erfolgt nach ausgehängtem Plan. Es finden sich jeweils 3 Studenten zu einer Gruppe zusammen. Pro Reihe können max. 9 Studenten ( 3 Gruppen ) arbeiten.

Beachte:

1. Die meisten praktischen Übungen werden in Studentengruppen durchgeführt.

Eine Gruppe sind 3 Studenten. Es wird meistens alternierend gearbeitet, d.h.

von 3 Studenten führen zwei die praktischen Übungen durch. Der dritte Student achtet auf ordentliches, sauberes und steriles Arbeiten am Platz !!!

2. Für das Praktikum werden Ihnen vom Institut eine Reihe wertvoller Geräte zur Verfügung gestellt. Bitte gehen Sie damit schonend um!

Nach Benutzung der Mikroskope müssen die Immersionsobjektive von an- haftendem Immersionsöl sorgfältig mit Rotihistol (nichttoxischer Ersatz für Xylol) und einem bereitgelegten Tupfer gereinigt werden.

3. Wenn Sie im Kurs Platten (Petrischalen) und Reagenzröhrchen mit Keimen beimpfen, bitte unbedingt auf jedes Schalenunterteil (nicht auf den Deckel!) und jedes Röhrchen Ihren Namen und Seminargruppe schreiben. Bei fehlender Beschriftung besteht keine Gewähr, dass jeder Student seine Platten und Röhrchen zur Auswertung wieder bekommt.

4. Alle zu bebrütenden Materialien am Ende des Kurstages in die dafür

beschrifteten Kisten am Kopf des Labortisches stellen (beschriftet siehe 2.!!)

(3)

Arbeitsschutz

Bei allen Arbeiten sind die in einem bakteriologischen Laboratorium zur Infektions- verhütung geltenden Schutzvorschriften zu beachten! Zu Beginn des Kurses erfolgt eine Arbeitsschutzbelehrung, die durch Unterschrift zu bestätigen ist.

Folgende Fakten sind besonders zu beachten:

• Fingerschmuck, Armbänder sowie lange, lackierte oder künstliche Fingernägel sind strengstens verboten !

• Das Tragen von Schutzmänteln ist Pflicht! (Diese Schutzmäntel - Einmalkittel werden vom Universitätsklinikum gestellt.)

• Am Arbeitsplatz sind Sauberkeit und Ordnung einzuhalten.

• Rauchen, Essen und Trinken im Kursraum sind streng verboten!

• Mäntel, Jacken etc. werden in der Garderobe abgelegt.

• Bei versehentlichem Kontakt mit infektiösem Material ist Meldung an den Kurs- Assistenten sowie sofortige Desinfektion erforderlich! (siehe „Allgemeine Schutzmaßnahmen“!)

• Bei Arbeiten mit der Gasflamme (Bunsenbrenner) den Brenner nur kurzzeitig öffnen, dann sofort wieder abstellen. ACHTUNG! Die Sparflamme ist schlecht sichtbar und kann daher leicht zu Verbrennungen führen. Gasfeuerzeug ist selbst mitzubringen!

Selbst mitzubringen sind ebenfalls Lineal, Buntstifte und wasserfeste Faserstifte zum Beschriften der Glaswaren.

Nach Abschluss der Arbeiten ist der Kittel in bereitgestellte Behälter abzulegen.

Die Hände werden anschließend erst desinfiziert und dann gewaschen!

(= Hygienische Händedesinfektion)

(4)

Allgemeine Schutzmaßnahmen

Laborinfektionen sind sofort dem Kursassistenten zu melden, und es ist so bald wie möglich ärztliche Hilfe in Anspruch zu nehmen. Die nachstehenden Anordnungen sind daher nur als erste Schutzmaßnahmen aufzufassen.

Mund: Nicht schlucken! Ausspeien! Spülen!

1. Infektiöses Material ist in den Mund gelangt, aber noch nicht geschluckt worden:

Nicht schlucken! Sofort ausspeien! Wiederholt gründlich Mund ausspülen und gurgeln mit frisch angesetzter 0,1 %iger Kaliumpermanganatlösung;

D-Arzt aufsuchen.

2. Infektiöses Material ist geschluckt worden:

Kurze kräftige Mundspülung und Gurgeln mit 0,1 %iger frischer Kalium- permanganatlösung; D-Arzt aufsuchen:

Auge: Nicht reiben!

Infektiöses Material ist in das Auge gelangt:

Bindehautsack mit Augenspülflasche gründlich ausspülen; D-Arzt aufsuchen.

Nase: Kräftig schnäuzen!

Einatmen durch den Mund, ausatmen durch die Nase!

Infektiöses Material ist in die Nase gelangt:

Wiederholtes energisches Ausschnäuzen in Zellstoff unter Vermeidung von Einatmen durch die Nase. Gründlich mit Leitungswasser spülen; D-Arzt aufsuchen.

Haut: Wunden ausbluten lassen!

Verletzungen der Haut durch infizierte Instrumente, Glasbruch, Beschmutzung mit infektiösem Material:

Oberflächliche Schürfwunden sofort mit Betaisadonalösung überpinseln, darauf die Umgebung der Wunde abspülen, abtupfen mit Zellstoff und nochmals mit

Betaisadonalösung überpinseln.

Stark blutende Schnittwunden und dergl. erst ausbluten lassen, dann Wundumgebung (nicht Wunde) mit Betaisadonalösung desinfizieren.

Anschließend Schutzverband! D-Arzt aufsuchen.

(5)

Einführung in den mikrobiologischen Kurs

Bei Stichwörtern, die aus dem Griechischen oder Lateinischen stammen, ist zur

Erleichterung der Aussprache die Betonung angegeben. Die Betonung wird durch ein

"_" unter dem betonten Vokal oder Diphthong kenntlich gemacht.

1. Mikroskopische Darstellungsmöglichkeiten

1.1 Hellfeld: Durchfallendes Licht, heller Untergrund.

Kontrastarme Objekte müssen angefärbt werden. Regulierung der Beleuchtungsstärke durch Kondensor-Irisblende:

Bei stark gefärbten Präparaten Blende offen, bei ungefärbten und kontrast- armen Präparaten Blende geschlossen.

Optimale Auflösung von Objekteinzelheiten bei mäßig geöffneter Blende und voller Ausnutzung der Objektivapertur.

1.2 Dunkelfeld: Strahlengang im Kondensor wird so geführt, dass die Objekte seitlich angestrahlt werden und sich hell gegen den dunklen Untergrund abheben. Durch Beugungserscheinungen oft Überstrahlung und Unschärfe, besonders bei kleinen Objekten; Regulierung teilweise durch Kondensor- Irisblende möglich.

1.3 Phasenkontrast: Durch spezielle Phasenfilter im Strahlengang (Kondensor und Objektiv) werden die Phasenverschiebungen in Absorptionsunterschiede (hell/dunkel) umgewandelt, so dass auch ungefärbte Präparate abstufungs- reiche Bilder ergeben (Lebendpräparate). Untergrund erscheint halb

abgedunkelt, Objekte je nach Dicke heller oder dunkler.

1.4 Fluoreszenz: Präparate werden durch UV-Licht oder kurzwellige Blaulicht (= Primär- oder Erregerlicht) angestrahlt. Bei Eigenfluoreszenz oder nach Anfärbung mit geeigneten Farbstoffen (Fluorochrome) leuchten die Objekte durch Abstrahlung von Sekundärlicht längerer Wellenlänge im sichtbaren Bereich. Nach Ausfiltern der Primärstrahlung erscheinen die Objekte hell (blau, grün, gelb, orange, rot – je nach verwendetem Flurochrom) auf dunklem Untergrund.

1.5 Elektronenmikroskop: Darstellung durch extrem kurzwellige

Elektronenstrahlen, daher Auflösung bis zum makromolekularen Bereich.

Präparate müssen in besonderer Weise vorbereitet werden (Ultradünn- schnitte, Schrägbedampfung, Untersuchung im Hochvakuum usw.).

Beobachtungen nur über Leuchtschirm oder auf fotografischem Wege.

(6)

2. Anfertigung von Präparaten zur mikroskopischen Untersuchung

2.1 Färbepräparate für die bakteriologische Untersuchung

Mit einem Fett- bzw. Alkoholfesten Stift ein pfenniggroßes Feld auf der Unterseite des Objektträgers markieren.

• Verreiben Sie mit der Impföse eine kleine Menge einer Bakterienkolonie in 1 Tropfen physiologische NaCl-Lösung oder geben Sie 1 Tropfen einer Flüssig-kultur mit der Öse vorsichtig auf den Objektträger.

• Lassen Sie das Präparat an der Luft trocknen, fassen Sie es mit der Färbe- pinzette an und ziehen Sie die Unterseite des Objektträgers danach dreimal durch die nicht leuchtende Bunsenbrennerflamme (=fixieren).

Danach kann das Präparat gefärbt werden.

2.2

Nativpräparat

Für die Untersuchung von lebenden Mikroorganismen werden

„Nativpräparate“ benötigt. Geben Sie 1 Tropfen des Materials auf den Objektträger und bedecken Sie ihn mit einem Deckglas. Das anschließende Mikroskopieren erfolgt nicht mit dem Immersionsobjektiv.

Hinweise zum Mikroskopieren mit Immersionsobjektiv:

Zum Mikroskopieren gefärbter bakteriologischer Präparate benutzt man gewöhnlich Immersionsobjektive mit 100facher Eigenvergrößerung. Bei derartigen Objektiven wird die optische Verbindung zwischen Präparateoberfläche und Objektiv-Frontlinse durch eine Flüssigkeit hergestellt, die ein annähernd gleiches Lichtbrechungsvermögen wie Glas hat. So wird das Auflösungsvermögen gewahrt und die vorgesehene optische Leistung des Mikroskopes erreicht.

Vorgehen:

Das gefärbte, luftgetrocknete Präparat auf den Objektträgertisch legen; Lichtquelle auf maximale Helligkeit einstellen; Kondensorblende öffnen.

Auf das Präparat einen Tropfen Immersionsöl aufbringen.

Nun das Immersionsobjektiv in den Strahlengang einschwenken; mittels Grobtrieb den Objektträgertisch dem Objektiv so weit nähern, dass die Frontlinse in den Öltropfen eintaucht, aber die Oberfläche des Präparates nicht berührt (seitliche Kontrolle!);

mittels Feintrieb unter Beobachtung durch das Okular die Objektebene scharf einstellen.

(7)

Beachte:

Vorsicht bei der Betätigung des Grobtriebes während des Mikroskopierens mit dem Immersionsobjektiv: Es kann durch Druck auf den Objektträger beschädigt werden.

Die Trockenobjektive (Eigenvergrößerung < 100) dürfen nicht mit Immersionsöl benetzt werden.

Zur Reinigung des Mikroskopes am Ende des Kurstages siehe Seite 2.

Hinweise zum Protokoll über die mikroskopischen Präparate, für die laut „Aufgabe“ eine Skizze anzufertigen ist:

1. Art des Präparates: (z. B. Direktpräparat = D, Kulturpräparat = K) 2. Färbung: (z. B. GRAM, Methylenblau u. a.)

3. Vergrößerung: (Eigenvergrößerung Objektiv X Eigenvergrößerung Okular) 4. Zeichnung: (Farbstifte erforderlich)

5. Befund: (Beschreibung des mikroskopischen Bildes:

Form, Lagerung, Färbeverhalten)

6. Verdachtsdiagnose: (ergibt sich aus dem mikroskopischen Bild)

3. Färbungen

Beachte: Färbebänke benutzen!

1. Färbung mit Methylenblau (monochromatische Bakterienfärbung) - Präparat lufttrocknen und hitzefixieren

- Färben mit alkalischer Methylenblaulösung nach LÖFFLER 30 sec - Abspülen mit Wasser

- Trocknung vorsichtig zwischen Filterpapier

Ergebnis: Bakterien und umgebendes Material: blau

2. Färbung nach GRAM (Standardfärbung in der Bakteriologie)

- Präparat lufttrocknen und hitzefixieren

- Färben mit Kristallviolettlösung 2 min

- Abspülen der Farbe mit Wasser

- Überschichten mit Lugolscher Lösung 2 min

- Abspülen mit Wasser

- Entfärben mit Alkohol (96 %) in der Küvette durch vertikale Bewe-

gung der Objektträger bis keine Farbwolken mehr abgehen ca. 20 sec - Abspülen mit Wasser

- Gegenfärbung mit verdünnter Fuchsinlösung 20 sec - Abspülen mit Wasser

- Trocknung zwischen Filterpapier

Ergebnis: Grampositive Bakterien: blau-schwarz Gramnegative Bakterien: rot

Umgebendes Material: rot

(8)

3. Färbung nach NEISSER (Diphtherie) - Präparat lufttrocknen und hitzefixieren - Färbung mit NEISSER I

(NEISSER I ist eine unmittelbar vor Gebrauch herzustellende Mischung der Farblösungen Methylenblau/Eisessig und Kristallviolett)

1 min

- Abtropfen, nicht abspülen!

- Färbung mit NEISSER II

(NEISSER II ist eine Lösung von Chrysoidin = braun) 5 sec - Abtropfen, nicht abspülen!

- zwischen Filterpapier trocknen

Ergebnis: Polkörperchen: blauschwarz

Bakterien: gelb / braun

4. Färbung nach ZIEHL-NEELSEN (Standardfärbung zum Nachweis säurefester Stäbchen)

- auf die schon hitzefixierten Präparate konz. Karbolfuchsinlösung auftragen, Objektträger mit Bunsenbrenner-Flamme von unten vorsichtig erhitzen, bis zur Dampfbildung, Vorgang dreimal wiederholen

- Präparat entfärben mit Salzsäure-Alkohol bis sich keine Farbwolken mehr lösen

- Spülen mit Leitungswasser

- Gegenfärbung mit Methylenblaulösung 30 sec - Spülen mit Leitungswasser

- Trocknung zwischen Filterpapier

Ergebnis: säurefeste Stäbchen: rot umgebendes Material: blau

5. GIEMSA-Färbung (zur Darstellung von Blut- bzw. Gewebeprotozoen)

- Fixieren mit Methylalkohol 5 min

- Lufttrocknen

- verdünnte GIEMSA-Farbe 40-50 min

20 min Plasmodien - Abspülen mit gepuffertem Aqua dest

- Lufttrocknen

(9)

6. Trichromfärbung für Protozoen

- Sublimatalkohol nach Schaudin 30 min

- Iodalkohol 2 min bei

Stuhlausstrichen

- 70 % Ethanol 1 min

- Trichromfärbelösung 8 min

- Entfärber 2 x kurz eintauchen

- 95 % Ethanol 1 min

- abs. Ethanol 1 min

- Rotihistol 2 – 3 min

- Eindecken mit Merckoglas

- Mikroskopieren mit Immersionsobjektiv

Ergebnis: Protozoenzytoplasma: blau-grün

Kerne: rot

4. Kulturelle Anzüchtung von Bakterien

Voraussetzungen: - ausreichendes Angebot an Nährstoffen und Wachstumsfaktoren

- optimale pH-Werte

- bestimmte Salzkonzentration - optimale Wachstumstemperatur

Ziele: - biologische Anreicherung von Bakterien aus dem Untersuchungsmaterial (= Kollektivnährböden) - Isolierung pathogener Bakterien aus Gemischen z. B. Stuhl (= Selektivnährböden)

- Identifizierung durch Prüfung von Wachstumseigenschaften und Enzymausrüstung (= Diffenzierungsnährböden)

feste Nährböden flüssige Nährböden

Zusätze

aerob anaerob

(Anzucht mit O2) (Anzucht ohne O2) fest

a) Blutagar a) GasPak-Verfahren

b) Kochblutagar b) FORTNER-Platte

(Schokoladenagar) (Serratia marcescens)

c) MacConkey-Agar c) Kerzenflammentopf

d) Spezial-Agar (mikroaerophil, capnophil) z. B. C.L.E.D.-Agar d) Hochschicht-Agar

XLD-Agar

flüssig

e) Traubenzucker-Bouillon e) Thioglykolat-Bouillon f) Leber-Hirnbrei-Bouillon (mit Paraffinüberschichtung)

(10)

Beurteilungskriterien für das Bakterienwachstum:

feste Nährböden:

Größe, Form, Farbe und Oberflächenbeschaffenheit der Kolonie Nährbodenveränderungen (Hämolyse, Indikatorumschlag) flüssige Nährböden:

Trübung, Flockung

Oberflächenhäutchen (Kahmhaut) Bodensatz

Indikatorumschlag Beimpfung:

1. Beimpfung einer flüssigen Nährbouillon (mit dem Ziel einer Anreicherung):

Entnehmen Sie mit der Öse eine kleine Menge des Materials. Verreiben Sie die Materialprobe an der Röhrcheninnenwand in der Höhe des Flüssig- keitsspiegels. Spülen Sie das Material durch leichtes Hin- und Herbewegen in das Nährmedium ein.

2. Beimpfen einer festen Nähragar-Platte: (fraktionierte Ausimpfung mit dem Ziel der Gewinnung von Einzelkolonien und damit Reinkulturen)

Materialentnahme wie unter 1. Das Material wie in Abb. 1 auf eine kleine Stelle des Nährbodens vorsichtig aufbringen ohne in den Agar einzu- stechen. Mit der Öse wie unter Abb. 2 dargestellt auf der halben Agar- Platte verteilen. Öse verwerfen. Mit einer neuen Öse wie in Abb. 3 unter II dargestellt das Material weiter verdünnen. Öse verwerfen. Mit einer neuen Öse wie in Abb. 4 unter III weiter verfahren. Die Kulturen werden etwa 18 h bei 37 °C bebrütet und am nächsten Kurstag wieder auf Ihren Platz gestellt.

Beschriften Sie die Platte (Boden, nicht den Deckel) mit Ihrer Platznummer!

Abb. 1 Abb. 2

I

II

I

II

III

Abb.3 Abb.4

Technik des fraktionierten Ausstreichens

„3-Ösenausstrich“

(11)

5. Entnahme und Versand von Untersuchungsmaterial

Der Aussagewert mikrobiologischer sowie serologischer Untersuchungsergeb- nisse ist stark abhängig von der Auswahl des Untersuchungsmaterials, dem Entnahmezeitpunkt und den Transportbedingungen (Zeit, Temperatur).

Untersuchungsmaterial, Entnahmezeitpunkt und Transportbedingungen sollen dem klinischen Bild und dem zu erwartenden Erreger (z. B. Anaerobier,

Gonokokken) entsprechen.

Das Material ist gezielt zu entnehmen und in sterilen (!) Gefäßen unverzüglich zum Labor zu transportieren. Bei dringenden Fällen ist der Mikrobiologe tele- fonisch vorher zu verständigen. Das Material darf nicht mit Desinfektionsmitteln oder Formalin versetzt sein. Es muss eindeutig gekennzeichnet (beschriftet) und mit einem vollständig ausgefüllten Begleitschein versehen werden.

Die Einsendegefäße sind in der Regel in den entsprechenden Untersuchungs- laboratorien erhältlich.

Für den postalischen Versand gelten folgende Vorschriften:

1. Regelungen für die Beförderung von ansteckungsgefährlichen Stoffen – Brief National (Post) -

2. Epidemiologisches Bulletin Nr. 43, RKI, vom 24.10.2003

Mittelstrahlurin-Gewinnung

Möglichst Morgenurin zur Untersuchung verwenden, oder Urin, der mindestens 3 h nach dem letzten Wasserlassen gewonnen wurde.

- Zum Auffangen des Urins nur sterile Gefäße benutzen! Urin für mikrobiologische Untersuchungen nie aus Sammelurin-Gefäßen entnehmen!

- Uringewinnung bei Frauen:

Große Schamlippen spreizen, Harnröhrenmündung sorgfältig und mehrmals mit feuchtem Tupfer von vorn nach hinten säubern, etwas Urin zum Spülen der Harnröhre ablassen, Harnstrahl stoppen, Auffangen des Mittelstrahlurins in sterilem Gefäß, restlichen Urin ins Becken lassen.

- Uringewinnung bei Männern:

Vorhaut zurückstreifen, Glans penis sorgfältig mit feuchtem Tupfer säubern, etwas Urin zum Spülen der Harnröhre ablassen, Harnstrahl stoppen, Auffangen des Mittelstrahlurins in sterilem Gefäß, restlichen Urin ins Becken lassen.

Transport:

Innerhalb von 2 h nach Gewinnung muss der Urin im Labor verarbeitet werden, da er ein idealer Nährboden für Bakterien ist. Bei längeren Standzeiten kommt es zu einer Verfälschung des Ergebnisses!

(Falls keine Einhaltung der 2h-Frist möglich ist, kann der Urin 18 h bei 4 °C gelagert oder eine Urintauchkultur verwendet werden.

(12)

6. Resistenzbestimmung

Agar-Diffusionstest Prinzip:

Eine Suspension des zu untersuchenden Bakterienstammes, die einer Trübung nach McFARLAND von 0,5 entspricht (= 1,5 x 10⁷ koloniebildende Einheiten), wird mit einem Wattetupfer gleichmäßig auf der Nährbodenoberfläche verteilt. Nach dem Antrocknen werden Antibiotika-getränkte Träger (Papierblättchen, auf denen der Name des

jeweiligen Antibiotikums als Code aufgedruckt ist) aufgelegt, aus denen die Wirkstoffe diffundieren, wobei sich in der Umgebung des Blättchens ein Konzen-trationsgefälle einstellt. Empfindliche Keime weisen einen deutlichen Hemmhof um das Blättchen auf, mehr oder weniger resistente Keime wachsen bis an die Blättchen heran. Der Durch- messer des Hemmhofes ist ein direktes Maß für die Empfindlichkeit eines Bakterien- stammes. Er ist von verschiedenen Parametern abhängig, so dass einer standardisierten Durchführung des Agar-Diffusionstestes entscheidende Bedeutung zukommt.

Technik:

Keimaufschwemmung mittels Stieltupfer gleichmäßig auf einer MUELLER-HINTON-AGAR- Platte (sulfonamidantagonistenfreies Nährmedium) verteilen, einige Minuten

antrocknen lassen; die mit den einzelnen Antibiotika beschickten, standardisierten Filterpapierblättchen mit einer sterilen Kanüle auf die Platte legen und anschließend 18 h bei 37 °C bebrüten. Pro Platte 6 Testblättchen radiär in gleichem Abstand

anordnen, damit die entstehenden Hemmhöfe nicht konfluieren. Die Testblättchen (siehe Tabelle) stehen einzeln in Petrischalen I / II jeder Tischreihe zur Verfügung.

Hemmhofdurchmesser für die Bewertungsstufen: „sensibel“ bzw. „resistent“ nach DIN- Vorschriften („intermediär“ entspricht den Zwischenwerten):

Hemmhofdurchmesser in mm

Antibiotikum Code resistent

(r) sensibel

(s) Penicillin für Staphylokokken

Penicillin übrige Keime P 10 < 28

< 12 > 29

> 24

Ceftriaxon CRO 30 < 16 > 21

Erythromycin E 10 < 16 > 21

Oxacillin OX 5 < 15 > 16

Gentamicin CN 10 < 14 > 21

Ceftazidim CAZ 30 < 10 > 16

Voraussetzung: genormte Blättchengröße, Papierqualität und Beschickungsmenge sowie standardisierte Methodik

(13)

Auswertung:

Nach der Bebrütung werden die Hemmhofdurchmesser vom Boden der Platte aus in mm ermittelt. Bitte hierzu ein eigenes Lineal bereithalten! Bei resistenten Stämmen ist kein oder nur ein geringer Hemmhof zu erkennen. Das Koloniewachstum kann bis an das Filterpapierblättchen heranreichen.

Beachte:

1. Gezielte Antibiotikatherapie nur nach Resistenzbestimmung bei:

. Staphylokokken

. Pseudomonas aeruginosa

. Enterobacteriaceae (insbes. E. coli, Klebsiella, Proteus, Providencia) 2. Bei Notwendigkeit der Soforttherapie (schwere Krankheitsbilder):

a) Materialentnahme zur mikrobiologischen Untersuchung und Resistenz- Bestimmung vor Therapiebeginn (Rücksprache mit dem Mikrobiologen empfehlenswert)

b) Therapie ohne Erregernachweis: Breitbandantibiotika, gegebenenfalls Kombinationstherapie

c) Therapie nach Vorliegen der Erreger und der Ergebnisse der Resistenz- bestimmung optimieren.

3. Antibiotikatherapie ohne Resistenzbestimmung bei:

Penicillin A-Streptokokken

Meningokokken Leptospiren Bacillus anthracis Treponema pallidum Diphtheriebakterien Pneumokokken (!) Gonokokken (!)

Ampicillin / Amoxicillin Aktinomyzeten

Haemophilus influenzae (!) B-Streptokokken

Enterokokken (!) Listerien

Tetracycline Brucellen

Yersinien Chlamydien

Mykoplasmen

Legionellen Erythromycin (Rifampicin) (!) Erste Resistenzen bekannt!

(14)

1. KURSTAG

Praktikumseinführung für folgenden Kurstag

(für alle Studenten gemeinsam im Hörsaal)

Aufgabe 1: Luftkeime

Auf der Tischreihe werden 3 Blutplatten (Columbia-Agar) für die Zeiten von 5, 20 bzw.

60 min offen stehen gelassen. Je 3 Studenten sind für eine Zeit und eine Platte zu- ständig. Nach der Luftexposition wird die Petrischale geschlossen und am Boden beschriftet. Die Bebrütung erfolgt bei 37 °C.

Aufgabe 2: Zahnabstrich

Abstrich vom Zahnhals/Zahnfleischrand mit einem sterilen Wattetupfer vornehmen.

Mit dem Tupfer Ausstriche auf 2 Objektträgern herstellen. Nach Hitzefixierung ein Präparat nach GRAM und das zweite mit Methylenblau färben. Durchführung der Färbungen siehe S. 7 Mikroskopische Untersuchung der Präparate mit dem

Immersionsobjektiv (siehe S. 6).

Fertigen Sie eine Skizze der Bakterien (Standortflora) nach dem GRAM-Präparat an.

Infektionen des Respirationstraktes

Die Standortflora des Nasen-Rachen-Raumes ist aus zahlreichen Mikroorganismen-Arten zusammengesetzt. Sie besteht aus apathogenen Keimen, wie Korynebakterien,

Streptokokken, Neisserien, Branhamellen, Treponemen, Fusobakterien u. a. Die der Nase sich anschließenden Nebenhöhlen sind genauso wie Trachea, Bronchien und Lunge normalerweise keimfrei. In den Respirationstrakt eindringende Keime werden durch den Schleimfilm festgehalten und durch das Flimmerepithel der Nase und der Trachea als schleimiges Exkret beseitigt (ausgehustet).

In die Lunge eingedrungene Keime bzw. Staubpartikel werden von den Alveolar- makrophagen aufgenommen und intrazellulär von diesen professionellen Phagozyten zum „Transportband“ des Flimmerepithels gebracht. Virusinfektionen (z. B. Ortho- und Paramyxoviren) zerstören das Flimmerepithel und ermöglichen pyogenen Bakterien eine Superinfektion des Wirtes. Aus dem Oro- und Nasopharynx können bei Gesunden neben den erwähnten apathogenen Bakterien auch Streptokokken der Gruppe A (bei 5 – 8 %), Pneumokokken (bei 20 – 40 %), Neisseria meningitidis (bei 5 – 20 %), Hämophilus influenzae (< 60 %) und aus den Nares (vorderer Nasenanteil) Staphylo- coccus aureus (bei 10 – 20 %) isoliert werden. Im Nasen-Rachen-Raum finden wir weiterhin Keime aus der Umwelt und Nahrung, wie Enterobakterien, Enterokokken, Hefen und Schimmelpilze. Die beiden Protozoen-Arten Trichomonas tenax und Entamoeba gingivalis gehören ebenfalls zur Standortflora.

(15)

Aufgabe 3: Mikroskopisches Bild einer Rachenflora ( Fertigpräp. liegen aus )

Fertigen Sie mit einem Wattetupfer von Ihrem Praktikumspartner einen Abstrich vom Rachen und den Tonsillen an. Es ist darauf zu achten, dass die Tonsillen und die hintere Pharynxwand gut sichtbar sind. Verwenden Sie dafür einen Spatel. Das mit dem Tupfer gewonnene Material verwenden Sie zur Herstellung eines Objektträgerpräparates, das nach Trocknung und Fixierung nach GRAM gefärbt wird. Fertigen Sie nach dem

mikroskopischen Bild eine Skizze der Standortflora an.

Aufgabe 4: Kulturelle Anzucht der physiologischen Rachenflora

Mit einem 2. Wattetupfer beimpft jeder von Ihnen je eine Blut-, Kochblut-,

MacConkey- und Kaliumtellurit-Agarplatte. Dabei wird der Tupfer auf dem oberen Drittel der Platte einige Male abgerollt. Mit sterilen Ösen (Ösenwechsel!) wird das Material fraktioniert ausgestrichen (S. 10). Plattenboden beschriften und Nährmedium bei 37 °C bebrüten.

Identifizierung von Str. pneumoniae (Pneumokokken) innerhalb der Gruppe der oralen Streptokokken

Pneumokokken ähneln in ihrem Wachstum auf einer Blutagar-Platte den anderen vergrünend wachsenden Streptokokken. Sie lassen sich von diesen durch ihre Optochin-Empfindlichkeit abgrenzen.

Aufgabe 5: Optochin-Empfindlichkeit (wird von jedem Kursteilnehmer durchgeführt!)

Verwenden Sie die Platten E bzw. F zur dichten Beimpfung. Mit dem Wattetupfer mehrere Kolonien von der Platte nehmen und je eine halbe Blutagar-Platte beimpfen.

Verfahren Sie weiter, wie Sie es bereits bei der Resistenzbestimmung kennen gelernt haben. Legen Sie auf beide Plattenhälften je ein Optochin- Testblättchen auf.

Bebrütung bei 37 °C.

Ammenphänomen bei H. influenzae

Hämophilus influenzae ist für sein Gedeihen von den Wachstumsfaktoren X (Hämin) und V (NAD = Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid) abhängig. Freies Hämin ist in Blutagar

genügend vorhanden, der V-Faktor wird von Staphylococcus aureus durch Hämolyse aus den Erythrozyten freigesetzt. Hämolysine diffundieren mehrere mm von einer Staphylokokkenkolonie aus in den Agar. Auf einer Blutplatte können daher Keime von H. influenzae in der Nähe von Staphylococcus aureus („Amme“) zur Kolonie

auswachsen.

Aufgabe 6: „Ammenphänomen“

Beimpfen Sie eine Blutplatte mit mehreren Impfstrichen von Rand zu Rand mit H.

influenzae. H. influenzae sind von der bereitgestellten Kochblutagar-Platte zu entnehmen. Entnehmen Sie mit einer sterilen Öse von der Blutplatte 1 – 2 Kolonien von Staphylococcus aureus und tragen Sie dieses Material um 90 °versetzt zu den Impf- strichen mit H. influenzae in einem einzigen Impfstrich auf. „Ammenplatte“ bei 37 °C bebrüten.

(16)

Aufgabe 7: Hautflora / Desinfektion

Die Spitzen von drei Fingern auf ½ Blutplatte (Columbia-Agar) abrollen. Danach die Hände über dem Waschbecken für 2 min unter Durchführung von Wasch-

bewegungen mit der im Wandspender enthaltenen Desinfektionsmittellösung be- handeln, danach mit Seife und Wasser waschen, anschließend an der Luft trocknen.

Jetzt werden die gleichen Finger wie vorher nochmals auf die andere ½ Blutplatte aufgedrückt. Petrischalenboden beschriften und Blutplatte bei 37 °C bebrüten.

Aufgabe 8: Überprüfung der hygienischen Händedesinfektion (siehe ausliegende Anleitung)

Protokoll siehe Bewertungsbogen

Aufgabe 9: Abklatschversuch

Ausliegende Nährböden werden vorsichtig aus der Umverpackung genommen.

Mit der Agaroberfläche ( glatte Seite ) wird eine beliebige Stelle (Türklinke, Stirn etc.) berührt (abgeklatscht). Die Agarnährböden sind flexibel. Anschließend zurück in die Umverpackung und 18 h bei 37 °C bebrüten.

Umverpackung beschriften: Name, SG - Beurteilung am folgenden Tag -

Keimisolierung aus einem Bakteriengemisch

Das Erzielen von Reinkulturen ist ein simpler, jedoch äußerst notwendiger Schritt in der bakteriologischen Diagnostik. Dafür sind Agarnährmedien entwickelt worden. Nur von Reinkulturen sind biochemische, serologische und Resistenzbestimmungen möglich.

Man geht davon aus, dass durch die besondere Ausstrichtechnik (siehe Skizze auf S. 10) eine fortlaufende Keimverdünnung erfolgt, bis die Organismen soweit räumlich getrennt sind, dass bei der anschließenden Bebrütung einzelne Kolonien heranwachsen

(aus einem Bakterium oder einer so genannten „koloniebildenden Einheit“ – denken Sie an Streptokokken, Neisserien u. a.) – und identifiziert werden können.

Aufgabe 10: Gewinnung von Einzelkolonien

Von der Bakteriensuspension wird mit der sterilen Öse auf einer Blutplatte (Columbia- Agar) ein fraktionierter Ausstrich hergestellt (siehe S. 10). Plattenboden beschriften und Blutplatte bei 37 °C bebrüten. Fertigen Sie ein Grampräparat von der Suspension und eine Skizze an.

(17)

2. KURSTAG

Praktikumseinführung für folgenden Kurstag

(für alle Studenten gemeinsam im Hörsaal

)

Auswertung der Aufgaben vom Vortag Aufgabe 1:

Zählen Sie die Kolonien je Platte und Expositionszeit.

Protokoll: Koloniezahl pro Expositionszeit, Keimarten Aufgabe 4:

Inspektion der Nährmedien mit dem Rachenabstrich auf typische Kolonien von Staphylokokken, vergrünend und hämolysierend wachsenden Streptokokken, auf Klebsiellen und Korynebakterien. Fertigen Sie ein GRAM-Präparat an bzw. von schwarzen Kolonien auf der Kaliumtellurit-Platte eine NEISSER-Färbung. (S. 8 )

Aufgabe 5:

Ausmessung der Hemmhofdurchmesser bei den Optochin-Testblättchen in mm:

Hemmhof > 10 mm = empfindlich = Streptococcus pneumoniae Hemmhof < 10 mm = resistent = andere orale Streptokokken

Aufgabe 6:

Kontrolle der „Ammenplatte“ auf Wachstum von H. influenzae in der Hämolysezone

Aufgabe 7:

Zählen Sie die Kolonien vor und nach der Händedesinfektion.

Bestimmen Sie die Keimabtötung als %-Wert der Ausgangszahl (vor Desinfektion).

Protokoll: %-Wert der Keimabtötung Aufgabe 9:

Beurteilung der Abklatschpräparate Aufgabe 10:

Untersuchung der Blutplatte auf das Vorhandensein von Einzelkolonien

(18)

Pyogene Infektionen durch aerobe und anaerobe Bakterien

Pyogene Infektionen werden durch Bakterien hervorgerufen, die aerobe

(z. B. Pseudomonas aeruginosa), fakultativ anaerobe (z. B. Staphylokokken, Entero- kokken und Streptokokken) oder anaerobe Lebensbedingungen benötigen

(z. B. Bacteroides fragilis). In der Regel sind es Lokalinfektionen, aus denen sich aber systemische Infektionen (Sepsis) entwickeln können. Die Infektabwehr beruht

maßgeblich auf der Opsonierung der Bakterien mit der anschließenden Phagozytose und Mikrobizidie durch professionelle Phagozyten.

Aufgabe 11: Untersuchung einer Eiterprobe A und einer Eiterprobe B

Aus den Eiterproben A bzw. B wurden jeweils 2 Objektträgerpräparate hergestellt.

Diese werden von Ihnen mit Methylenblau sowie nach GRAM gefärbt. Fertigen Sie jeweils eine Skizze nach dem mikroskopischen Bild des GRAM-Präparates an. Für die Protokollierung Ihrer Ergebnisse verwenden Sie den Bogen auf Seite 49.

Die Proben A bzw. B sind alternierend durch die Studenten einer Gruppe zu untersuchen, so dass ein Student Probe A und der andere Probe B verarbeitet. Beimpfen Sie mit der Eiterprobe A bzw. B eine Blutagar-Platte (Columbia-Agar), eine

MacConkey-Agar-Platte und eine Nährbouillon. Auf die festen Nährmedien sind die Proben nach der auf S. 10 beschriebenen Technik zur Erzielung von Einzelkolonien fraktioniert auszustreichen. In die Nährbouillon werden 2 bis 3 Ösen Eiter eingebracht.

Danach erfolgt eine Bebrütung bei 37 °C.

Identifizierung von Staphylokokken

Für die Speziesbestimmung wird ein kommerzielles Testsystem (api bio Mérieux) verwendet. Bei der Variabilität verschiedener biochemischer Merkmale innerhalb einer Bakterienspezies hat die numerische Taxonomie wesentlich zur Entwicklung derartiger Teste beigetragen.

Aufgabe 12: Staphylokokken – Identifizierung mit dem api STAPH

Verwenden Sie wiederum alternierend zum Beimpfen der api-Streifen die

Staphylokokken C bzw. D von den Blutplatten. Verfahren Sie genau nach der Vor- schrift auf dieser Seite unten: Je Gruppe ( drei Studenten) werden zwei api-STAPH- Streifen angesetzt.

Beachten Sie, dass Aufgabe 12 Sie mit der Möglichkeit einer biochemischen Differenzierung von Staphylokokken bekannt macht, aber nicht im unmittelbaren Zusammenhang mit Aufgabe 11 steht!

Arbeitsvorschrift „api STAPH„

1. Prinzip

Der api STAPH-Streifen besteht aus 20 Mikroröhrchen, in denen sich die de- hydrierten Substrate für die biochemischen Reaktionen befinden. Die Röhr- chen werden mit der Bakteriensuspension beimpft. Die biochemischen Reaktionen werden nach 18 – 24stündiger Inkubation anhand der Farb- umschläge, die entweder spontan oder nach Zugabe der Mediatoren ent- stehen, abgelesen.

(19)

2. Vorbereitung des Streifens

- Buchstabe des zu untersuchenden Bakterienstammes sowie Platznummer auf dem unteren Teil der Inkubationswanne – in der sich einige Tropfen Wasser befinden – notieren

- api-Streifen aus der Verpackung nehmen und in die Inkubationswanne legen (Prinzip: feuchte Kammer)

3. Vorbereitung der Bakteriensuspension - eine Ampulle api-STAPH-Medium öffnen

- mit Hilfe einer Pipette Material von 2 – 3 Kolonien der Bakterienkultur (C oder D) teilweise entnehmen und in den Medium durch mehrmaliges Hochziehen in der Pipette suspendieren

- Die Dichte der Suspension soll dem McFarland-Standard 0,5 entsprechen - Vergleich mit dem Standardröhrchen!

4. Beimpfen des Streifens

- Suspension mit derselben Pipette in die Mikroröhrchen pipettieren, dabei Pipette am Rand des Röhrchens ansetzen, um Blasenbildung zu vermeiden.

Jedes Mikroröhrchen beschicken, auch wenn es kein Substrat enthält.

- Die unterstrichenen Reaktionen ADH und URE mit Paraffinöl überschichten.

- Inkubationswanne schließen und 18 – 24 h bei 37 °C bebrüten.

5. Ablesen des Streifens (am nächsten Kurstag) - je 1 Tropfen NIT 1 und NIT 2 in Mikroröhrchen NIT - je 1 Tropfen ZYM A und ZYM B in Mikroröhrchen PAL - je 1 Tropfen VP 1 und VP 2 in Mikroröhrchen VP

nach ca. 3 – 5 min Ablesen der Reaktionen entsprechend der Ablese- tabelle (S. 18)

- Die Ergebnisse (+ oder -) auf dem Ergebnisblatt vermerken (siehe Beispiel unten).

Auswertung der Ergebnisse

Identifizierung mit dem Analytischen-Profil-Index:

Die binären Informationen (+ oder -) werden in numerische Werte umgewandelt.

Auf dem Ergebnisblatt sind die biochemischen Reaktionen in Dreiergruppen einge- teilt. Jede positive Reaktion erhält den Wert 1, 2 oder 4, je nach Position des Testes innerhalb der Gruppe. Die Zahlenwerte jeder Gruppe werden addiert (negative Reaktion = 0), somit erhält man 7 Ziffern, welche das numerische Profil darstellen.

Die Lysostaphinreaktion (LSTR) wird als negativ gewertet.

Mit der 7stelligen Codezahl wird mittels der Auszüge aus dem Codebuch (S. 19 und 20) die Identifizierung der Keime durchgeführt.

(20)

Beispiel:

api Staph Ablesetabelle

Tests Substrate Reaktionen/Enzyme Ergebnisse negativ positiv

O Keine negative Kontrolle rot -

GLU FRU MNE MAL LAC TRE MAN

XLT MEL

D-Glukose D-Fruktose D-Mannose Maltose Laktose D-Trehalose D-Mannit Xylit

D-Melibiose

(positive Kontrolle)

Säuerung aus

Kohlenhydraten rot gelb

NIT Kaliumnitrat Nitratreduktion

zu Nitrit NIT 1 + NIT 2 10 min farblos rot

PAL β-naphtyl

Phosphat Alkalische Phosphatase ZYM A + ZYM β 10 min gelb violett

VP Natriumpyruvat Bildung von Acetyl-

Methylcarbinol VP 1 + VP 2 10 min farblos violett-rosa RAF

XYL SAC MDG NAG

Raffinose Xylose Saccharose

γ-Methyl-D-Glukosid N-Acetyl-Glukosamin

Säuerung aus

Kohlenhydraten rot gelb ADH

URE Arginin Harnstoff

Arginin-Dihydrolase

Urease gelb

gelb rot

rot-violett

(21)

6 706 110

Staph.epidermidis

94,3 % I = 0,79 (URE 88 %)

gute Identifizierung 6 706 111

Staph.epidermidis

93,5 % I = 0,86 (URE 00 %)

Staph.epidermidis

98,5 % I = 0,93 gute Identifizierung

6 706 113

Staph.epidermidis

99,1 % I = 1,00 sehr gute Identifizierung

6 706 131

Staph.epidermidis

99,3 % I = 0,63

(MDG 4 %) (URE 00 %)

sehr gute Identifizierung 6 706 132

Staph.epidermidis

98,8 % I = 0,70 (MDG 4 %)

Staph.epidermidis

99,6 % I = 0,77 (MDG 4 %)

sehr gute Identifizierung 6 706 143

Staph.epidermidis

85,9 % I = 0,66

(SAC 97 %) (NAG 10 %)

akzeptierbare Identifizierung 6 706 151

Staph.epidermidis

86,7 % I = 0,75

(NAG 10 %) (URE 08 %)

Staph.epidermidis

87,4 % I = 0,82 (NAG 10 %)

Staph.epidermidis

90,7 % I = 0,89 (NAG 10 %)

Staph.epidermidis

92,2 % I = 0,59

(MDG 4 %) (NAG 10 %)

Staph.epidermidis

96,4 % I = 0,66

(MDG 4 %) (NAG 10 %)

Staph.caprae Staph.epidermidis

66,2% I=0,71(HAL 10%)St.caprae 31,7 I=0,66 (MNE 81%)

(SAC 97 %) Staph.epidermidis

ungenügende Selektivitätsid.

TURac - +(-) 6 606 110

Staph.epidermidis

89,5 % I = 0,69 (MNE 81 %) (URE 80 %)

Staph.epidermidis

93,0 % I = 0,76 (MNE 81 %) (URE 88 %)

Staph.epidermidis Staph.hoxinis

93,7 % I = 0,83 (MNE 81 %) 6,1 % I = 0,79 (IRE 87 %)

6 606 113

Staph.epidermidis

97,9 % I = 0,90 (MNE 81 %) gute Identifizierung 6 606 132

Staph.epidermidis Staph.hoxinis

93,9% I=0,60 (MNE 81%)(MDG 4 %) 6,1 % I= 0,57 (IRE 87 %)(MDG 4 %)

6 606 133

Staph.epidermidis

98,2 % I=0,67 (MNE 81%) (MDG 4 %)

Staph.aureus Staph.xylosus

59,6 % I = 0,67 (SAC 97 %) Staph.aureus

38,0 % I = 0,76 (XYL 82 %) Staph.intermedius

Staph.xylosus

KOAGULASE NOVO R + - + - - + -S.intermedius MÖGLICH:

TIER.URSPRUNG 6 736 143

Staph.aureus

98,0 % I = 0,77 (SAC 97 %) gute Identifizierung -S.intermedius MÖGLICH:

Staph.sciuri Staph.aureus

73,3 % I=0,94 Staph.sciuri 23,0 % I=0,79 (ADH80 %) (URE 83 %) Staph.aureus Staph.intermedius

OX KOAGULASE + -

- + - +

-S.intermedius MÖGLICH:

Staph.aureus 98,6 % I=0,89 (URE 83%)

gute Identifizierung -S.intermedius MÖGLICH:

TIER.URSPRUNG

(22)

6 736 152 Staph.aureus

Staph.xylosus

Staph.hominis

84,1 I=0,90 (ADH 80 %) Staph.aureus

13,8 I=0,89 (XYL 82 %) Staph.intermedius

1,7 % I=0,83 staph.xylosus

KOAGULASE DNAse H.

+ + + + - - - - -S.intermedius MÖGLICH:

Staph.aureus 98,6 % I =1,00

gute Identifizierung .S.intermedius MÖGLICH:

Staph. sciuri

91,2 % I=0,75 (MDG 7 %) gute Identifizierung 6 736 171

Staph.aureus

93,8 % I=0,56 (MDG 1 %) (URE 83 %)

gute Identifizierung -S.intermedius MÖGLICH:

Staph.xylosus Staph.aureus Staph.hominis

60,4 % I=0,74 (XYL 82 %) (MDG 10 %) Staph.xylosus 36,5 % I=0,58 (MDG 1%) (AHD 80%) Staph.aureus 2,9 % I=0,61 (MDG 4 %) Staph.intermedius Staph.hominis

KOAGULASE DNAse H.

- -

+ + + + - - -S.intermedius MÖGLICH:

Staph.aureus 95,1 % I=0,68 (MDG 1 %)

gute Identifizieruhng -S.intermedius MÖGLICH:

Staph.xylosus

97,9 % I=0,69 (EAF 11 %) (XYL 82 %)

gute Identifizierung

(23)

Wundinfektionen durch Anaerobier

( wird von jedem Kursteilnehmer durchgeführt! )

Aufgabe 13: Anlegen einer Fortner-Platte zur Anzucht von anaeroben Bakterien Eine SCHAEDLER-Agar-Platte wird durch das Ausheben eines „Grabens“ in zwei gleiche Teile getrennt. Auf die eine Hälfte wird eine stark O2-zehrende Bakterienart (z. B. Serratia marcescens) dicht, auf die andere Hälfte das Material aus der Bouillon- kultur mit Bacteroides fragilis fraktioniert ausgestrichen. Die Petrischale wird umge- dreht auf eine sterile Glasplatte gelegt und mit Plastilin luftdicht verschlossen.

Beimpfen Sie parallel dazu eine Blutagar-Platte ( ebenfalls mit Graben ) als Kontrolle unter aeroben Kultur-bedingungen. Die Nährmedien werden bei 37 °C bebrütet.

Aufgabe 14: Clostridium perfringens

Zu den häufigsten und gefährlichsten Infektionen mit anaeroben Sporenbildnern kommt es durch Clostridium perfringens, dem bedeutendsten unter den Erregern des Gasödems. Ihnen werden bereits vorgefertigte GRAM-Präparate vom Gewebe- material mit Clostridium perfringens (Präparat Nr. 1) zum Mikroskopieren zur Ver- fügung gestellt. Fertigen Sie eine Skizze der Bakterien nach dem mikroskopischen Bild an.

Demonstration

1. SCHAEDLER-Agar mit Clostridium perfringens, Thioglykolatbouillon

Eigelb-Agar nach McCLUNG-TOABE zur Prüfung auf Lezithinase und Lipase, Lackmusmilch (Identifizierung von Cl. perfringens siehe S. 21 unten)

2. Nachweis einer Sepsis durch die Blutkultur

Von einer lokalen Infektion ausgehend, kann sich durch das Eindringen von Bakterien in die Blutbahn das Krankheitsbild einer Sepsis entwickeln. Z. B. kann ein Staphylo- kokkenkarbunkel eine Sepsis nach sich ziehen. Weiterhin ist durch die Blutkultur auch die septikämische Phase einer zyklischen (systemischen) Infektionskrankheit

(z. B. Abdominaltyphus) zu erfassen. Zur Sepsisdiagnostik sind stets mehrere zeitlich gestaffelte Blutkulturen notwendig. Zur Routinediagnostik sollten bewährte kommer- zielle Systeme zur Anzucht aerober und anaerober Keime eingesetzt werden.

Ihnen werden Blutagar-, Kochblutagar- und MacConkey-Agar-Platten mit ver- grünend wachsenden Streptokokken und Bacteroides fragilis vorgestellt sowie die Handhabung kommerzieller Blutkulturflaschen erläutert.

Identifizierung von Clostridium perfringens

Nährboden Enzymnachweis Merkmale der positiven Cl. perfringens-Reaktion

Ergebnis Eigelb-Agar Eigelb-Agar Lezithinase Abbau des Lezithins im Eigelb.

Entmischung der Protein-Fett-Emulsion und dadurch helle undurchsichtige Höfe um

die Kolonien.

+

Lipase Kleine perlmuttartige, opaleszierende Höfe

um die Kolonien.

-

Lackmusmilch Proteasen Gerinnung durch Säuerung, Peptonisierung, Ausflockung des

Milcheiweißes.

+

(24)

3. KURSTAG

Praktikumseinführung für folgenden Kurstag

Auswertungen der Aufgaben vom Vortag

Aufgabe 11:

Schauen Sie ihre angesetzten Blut- und MacConkey-Agar-Platten mit Ausstrichen von Eiter A bzw. B an.

Beobachten Sie vergleichend das Keimwachstum auf dem Kollektivnährmedium

„Blutagar“ und dem besonders für Enterobacteriaceen geeigneten Selektivmedium

„MacConkey-Agar“. Prüfen Sie die Kolonien auf Hämolysehöfe.

1. Prüfen Sie auf Vorhandensein von Katalase. Katalase ist ein eisenporphyrinhaltiges Enzym, das Wasserstoffperoxid in Wasser und molekularen Sauerstoff umsetzt. Es ist – mit Ausnahme der Streptokokken und Enterokokken – in fast allen oxidasenegativen

aeroben und fakultativ anaeroben Bakterien vorhanden. Tropfen Sie Katalasereagenz (H2O2) auf Objektträger und halten Sie eine Öse Material von einer Blutagar-Platte hinein.

2. Prüfen Sie weiterhin die Einzelkolonien von Eiter A bzw. B auf das Vorhandensein der zellwandgebundenen Plasmakoagulase (clumping factor = Fibrinogenrezeptor) durch den Koagulase-Objektträgertest:

Auf einem Objektträger werden mit ca. 2 – 3 cm Abstand voneinander 1 Tropfen Zitrat- Plasma vom Kaninchen bzw. 1 Tropfen physiologische Kochsalz-Lösung aufgetragen.

Von der zu prüfenden Einzelkolonie wird ½ Öse Material in die Kontrollflüssigkeit (NaCl) und mit einer neuen Öse die gleiche Menge in das Plasma eingerieben. Bei

Vorhandensein von Koagulase kommt es zur scholligen Verklumpung des Plasmas, die Kontrolle bleibt milchig trüb.

Die Einzelkolonien von dem Eiter B auf der Blutplatte sind durch den Streptokokken- Identifizierungstest auf Gruppenantigen A und B zu untersuchen. Der Latextest wird entsprechend der Vorschrift auf S. 23 durchgeführt. Beim Latextest werden antikörper- beladene Trägerpartikel verwendet. Im positiven Fall binden sich die bekannten Antikörper an die Antigenepitope der Streptokokken und es kommt zur Agglutination.

Fertigen Sie ein Protokoll zur Diagnostik der Eiterprobe A bzw. B an (siehe S. 49).

Aufgabe 12:

Auswertung des api STAPH-Streifens nach der Vorschrift auf S. 17f.

Geben Sie in Ihrem Protokoll die Spezies und den %Wert der Übereinstimmung an.

(25)

Latex-Agglutinationstest zur Identifizierung der Streptokokken ( wird von jedem Kursteilnehmer durchgeführt )

Jede zu klassifizierende Kultur ist wie folgt vorzubereiten:

1. Freisetzung der gruppenspezifischen Antigene (C-Substanz) aus der Zellwand der Streptokokken: In die vorbereiteten Teströhrchen mit je 0,4 ml Extraktionsenzym (muralytische Enzymmischung zur Extraktion der C-Antigene) werden jeweils 2 – 5 Einzelkolonien der zu prüfenden Bakterien eingebracht und suspendiert.

2. Röhrchen 15 min bei 22 °C belassen. Bereits nach 5 min die Röhrchen 2 – 3 sec kräftig schütteln und danach die Inkubation fortsetzen. Der Extrakt ist anschließend gebrauchsfertig.

Testmethode

1. Die Latex-Reagenzien auf Raumtemperatur bringen. Die Latex-Suspensionen kräftig schütteln.

2. Von jedem Latex-Reagenz einen Tropfen in je einen Kreis auf die Reaktionskarte geben.

3. Jeweils einen Tropfen Extrakt mit einer Plastepipette in die Kreise pipettieren.

4. Mit den mitgelieferten Rührstäbchen die Mischung über die gesamte Fläche des jeweiligen Kreises verteilen; dabei für jeden Kreis ein anderes Stäbchen verwenden.

5. Vorsichtig die Reaktionskarte hin- und herbewegen. Die Agglutination in einem oder mehreren Kreisen tritt normalerweise innerhalb von 30 sec auf. Für die Auswertung nicht länger als 1 min bewegen, kein Vergrößerungsglas zu Hilfe nehmen.

6. Die Reaktionskarte sorgfältig entsorgen.

Interpretation der Ergebnisse

Der Test wird als positiv betrachtet, wenn mit einem Gruppen-Reagenz eine Aggluti- nation auftritt. Als negativ wird ein Ergebnis angesehen, wenn keine Agglutination sichtbar wird. Schwache Spuren von gekörntem Material können in negativen Reaktionen erscheinen, sollten aber ignoriert werden.

Empfindlichkeitsprüfung gegen Chemotherapeutika (Resistenzbestimmung)

Bei zahlreichen pathogenen Bakterien und Pilzen ist die Empfindlichkeit gegenüber den Chemotherapeutika (Antibiotika) innerhalb einer Spezies von Stamm zu Stamm ver- schieden. Für die Einleitung einer effektiven Therapie ist daher die Resistenzbestimmung von vordergründiger Bedeutung. Dafür werden die identifizierten Bakterien u. a. nach der Agardiffusionsmethode geprüft. Hierbei diffundieren die Chemotherapeutika aus einem Filterpapierblättchen in das Nährmedium (Agar), so dass nach 18 – 20 h

Bebrütung bei empfindlichen Bakterien deutliche Hemmhöfe um die Blättchen zu erkennen sind. In diesen Bereichen wurden die Bakterien durch die vorliegenden Antibiotikakonzentrationen im Koloniewachstum gehemmt (Hemmhöfe). Resistente Bakterien wachsen bis an das Blättchen heran (vergleiche auch S. 12).

(26)

Aufgabe 15: Durchführung einer Resistenzbestimmung

Es verwenden zwei Studenten pro Gruppe für die Testung die Einzelkolonien auf der Blutplatte von den Eiterproben A bzw. B. Entnehmen Sie eine Kolonie mit dem Stieltupfer und tragen Sie das Material in ein Röhrchen mit physiologischer Kochsalz- Lösung ein. Durch schnelles Drehen des Tupfers zwischen Daumen und Zeigefinger wird eine gleichmäßige Suspension hergestellt. Tragen Sie mittels des Stieltupfers die Keimsuspension A gleichmäßig auf eine MUELLER-HINTON-Agar-Platte auf. Die Keimsuspension B wird in gleicher Art auf eine Blutplatte aufgebracht. Verfahren Sie entsprechend den Angaben auf S. 12 („Technik“) weiter.

Demonstration

Entnahme- und Transportsysteme für mikrobiologische Untersuchungen auf aerobe und anaerobe Erreger (Transportmedien, Röhrchen für parasitologische Stuhlunter- suchungen u. a.)

Gefäße zur Kultivierung von Anaerobiern

Bestimmung der Minimalen Hemmkonzentration (MHK) von Antibiotika

4. Kurstag

Praktikumseinführung für folgenden Kurstag

Auswertungen der Aufgaben vom Vortag

Aufgabe 13:

Untersuchung der Blut- und FORTNER-Platte auf Bakterienwachstum.

Fertigen Sie GRAM-Präparate von B. fragilis und eine Skizze an.

Kontrollpräparate liegen jeweils an den Mikroskopen.

Aufgabe 15:

Ausmessung der Hemmhöfe: Führen Sie in Ihrem Protokoll auf, gegen welche Anti- biotika die Bakterien aus dem Eiter A bzw. B „empfindlich“, „resistent“ bzw.

„intermediär“ reagieren (Antibiogramm). Benutzen Sie dafür die in der Tabelle auf S. 12 aufgeführten Hemmhofdurchmesser. Vervollständigen Sie das Protokoll über

„Pyogene Infektionen“ auf Seite 49 und geben Sie es ab.

(27)

Aufgabe 16: Mikroskopieren diverser Präparate und Protokollanfertigung

- Sputum mit Streptococcus pneumoniae, gefärbt nach GRAM (Präparat Nr. 2) und mit Methylenblau (Präparat Nr. 3)

- Sputum mit Klebsiella pneumoniae gefärbt nach GRAM (Präparat Nr. 4) - Liquor mit Haemophilus influenzae, gefärbt nach GRAM (Präparat Nr. 5) - Mycobacterium tuberculosis, aus der Kultur, gefärbt nach ZIEHL-NEELSEN (Präparat Nr. 6)

- Corynebacterium diphtheriae, aus der Kultur, gefärbt nach NEISSER (Präparat Nr. 7)

Demonstration

Kulturen von Mycobacterium kansasii (Gr. I), Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium scrofulaceum (Gr. II) und Mycobacterium avium (Gr. III) auf entsprechenden Nährmedien. Hinweise zur Mykobakterien- und Diphtheriediagnostik.

Hinweise auf die Resistenztestung von Mykobakterien.

Einteilung der MOTT-Mycobakterien nach RUNYON (Auszug)

Gruppe I (photochromogen): M. marinum, M. kansasii, M. simile

Gruppe II (skotochromogen): M. scrofulaceum, M. szulgai, M. gordonae, M. flavescens, M. xenopii

Gruppe III (nicht chromogen): M. avium-intracellulare, M. gastri, M. haemophilum, M. malmoense, M. terrae Gruppe IV (schnell wachsend): M. chelonae, M. fortuitum, M. phlei, M. smegmatis, M. vaccae

Infektionen des zentralen Nervensystems

Die Infektionen des ZNS kommen am häufigsten durch hämatogene Keimstreuungen zustande. Bei Allgemeininfektionen können Mikroorganismen im Generalisations- stadium sich auch im ZNS ansiedeln (Organmanifestation), wie z. B. bei Tuberkulose, Toxoplasmose und vielen Virusinfektionen (Poliomyelitis, Echo-, Coxsackie-Viren u. a.) Durch eine Reihe von Bakterien, wie Streptococcus pneumoniae, H. influenzae Typ b, N.

meningitidis, E. coli (Neugeborene!), Streptokokken der Gruppe B (Neugeborene), selten Staphylococcus aureus u. a. wird das Krankheitsbild der akuten eitrigen Meningitis hervorgerufen. Die Meningitiserreger führen meist über Kolonisation des Nasen-Rachen-Raumes, Bakteriämie und Absiedlung im ZNS zu einer Infektion.

Sie verfügen über Virulenzmechanismen, die ihnen das Eindringen in tiefere Gewebe- schichten und letztlich in die Blutbahn erlauben. Derartige Virulenzfaktoren sind Kapsel und Pili. Eine eitrige Meningitis bedarf einer unverzüglichen Behandlung!

Nach der Materialgewinnung für die mikrobiologische und klinisch-chemische

Untersuchung (Liquor, für den Mikrobiologen auch Blutkulturen) ist mit einer adäquaten antibiotischen Initialtherapie zu beginnen. Nach der Erregeranzucht wird die Therapie entsprechend dem Resistogramm optimiert. Die Resistenzbestimmung kann direkt aus dem Liquor erfolgen, da hier nicht mit einem Keimgemisch zu rechnen ist.

(28)

Untersuchung einer Liquorprobe G und einer Liquorprobe H Klinische Angaben zum Liquor G (Normwerte in Klammern):

- männliches Neugeborenes, 2 Tage alt

- hormonell eingeleitete Entbindung nach vorzeitigem Blasensprung - Fieber bis 38 °C, Trinkunlust, vorgewölbte Fontanelle

- Liquor: Zellen = 1500 / µl (< 32) (> 90 % PMN) erhöht

Eiweiß = 1500 mg/l (250 – 720) Laktat = 7,5 mmol/l (1,1 – 1,8) Klinische Angaben zum Liquor H (Normwerte in Klammern) :

- weibliche Patientin, 23 Jahre alt

- plötzliches hohes Fieber bis 40 °C, Bewusstseinsstörungen, starker Meningismus

- Liquor: Zellen = 3000 / µl (bis 4) (95 % PMN, erhöht)

Eiweiß = 4000 mg/l (300 – 45) Laktat = 10,0 mmol/l (1,2 – 2,1)

Aufgabe 17: Bakterielle Meningitis

Färben Sie alternierend den Liquor G bzw. H jeweils nach GRAM und Methylenblau und fertigen Sie eine Skizze nach dem mikroskopischen Bild an.

( Fertigpräparate liegen zur Kontrolle an den Mikroskopen. )

Verwenden Sie wiederum alternierend den Liquor G bzw. H. Beimpfen Sie mit dem Liquor je eine Blut-, Kochblut- und MacConkey Agarplatte sowie eine Nähr- und eine Thioglykolat-Bouillon. Auf den festen Nährmedien Material in einem langen zickzack- förmigen Impfstrich ausstreichen. Beurteilen Sie makroskopisch die Beschaffenheit des Liquors.

Verwenden Sie das Protokoll auf S. 50 Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes ist der Erreger der Listeriose. Die Erreger werden aus der Umwelt oder von Tieren auf den Menschen übertragen. Häufig erfolgt die Infektion über

kontaminierte Lebensmittel und verläuft inapparent. Bei schweren Verläufen kommt es zu lokalen und systemischen (Bakteriämie, Meningitis) Infektionskrankheiten.

Durch die Bakteriämie kann es zur Infektion des mütterlichen Genitaltraktes und zu konnatalen Infektionen kommen.

Aufgabe 17a: Blutagar-Platte mit Listeria monocytogenes und Enterokokken

Nachweis der Katalase bei L. monocytogenes bzw. Enterokokken von einer Blutagar- Platte: Katalasereagenz (H2O2) auf Objektträger tropfen und eine Öse Material hineinhalten. ( Nicht rühren ! )

Fertigen Sie von den Listerien ein GRAM-Präparat und eine Skizze an.

(29)

Cryptococcus neoformans

Cryptococcus neoformans ist ein fakultativ pathogener, in vivo bekapselter Sprosspilz. Er kommt bei Vögeln, insbesondere bei Tauben vor und wird auf den Menschen durch Inhalation von mit Taubenkot kontaminiertem Staub übertragen. Am häufigsten mani- festiert sich die Kryptokokkeninfektion bei immunsupprimierten Patienten, hauptsächlich AIDS-Patienten, in Form einer subakuten Meningoenzephalitis, die unbehandelt immer zum Tode führt. Die Kapsel als bedeutendster Pathogenitätsfaktor schützt den Pilz vor Phagozytose und ermöglicht eine schnelle Diagnose der Kryptokokkose. Die Darstellung der Kapsel kann in einem Tuschepräparat erfolgen. Sensitiver ist jedoch der immunolo- gische Nachweis von Kapselantigen.

Aufgabe 18: Tuschepräparat mit Cryptococcus neoformans

Mikroskopieren Sie einen Liquor mit Cryptococcus neoformans, im Tuschepräparat (PräparatNr.17) und fertigen Sie eine Skizze an. Achten Sie dabei besonders auf die Kapsel.

Nachweis von Antikörpern gegen Borrelia burgdorferi

Borrelia burgdorferi ist der Erreger der Lyme-Borreliose, die im II. Stadium der Erkrankung zu etwa 13% der Fälle als lymphozytäre Meningitis verläuft. Die Diagnostik dieser von Zecken übertragenen Infektionskrankheit erfolgt fast ausschließlich durch den

Antikörpernachweis im Immunfluoreszenz-Test (I FT), Enzymimmunassay (EIA), Hämagglutinationstest (HAT) bzw. in ausgesuchten Fällen durch den Immunoblot.

Die Antikörper zeigen zahlreiche Kreuzreaktionen mit Treponema pallidum und anderen Borrelien. Der CMT-Test reagiert bei der Lyme-Borreliose jedoch negativ.

Demonstration

Western-Blot zum Nachweis von B. burgdorferi-Antikörpern

Ausgabe der Gefäße für die Urinproben!

Bei der Uringewinnung achten Sie bitte auf die Hinweise auf S. 11.

Rücknahme:

Mit Namen und Platz-Nr. gekennzeichnete Urinproben müssen von 07:00 bis 08:00 am 5. Kurstag bei der Annahme des Institutes für Medizinische Mikrobiologie abgegeben werden (nach Uringewinnung Kühlschrankaufbewahrung! ).

(30)

5. KURSTAG

Praktikumseinführung für folgenden Kurstag

Auswertungen der Aufgaben vom Vortag Aufgabe 17:

Kontrolle der mit dem Liquor G bzw. H beimpften Nährmedien. Fertigen Sie ein GRAM- Präparat von den Kolonien auf der Blutagar-Platte an. Führen Sie den Nachweis der Oxidasereaktion auf den bereitgestellten Papierstreifen. Verwenden Sie dazu die Kochblutagar- Platte. Vervollständigen Sie das Protokoll S. 50 und geben Sie es ab.

Verwenden Sie für den Therapievorschlag das Resistogramm von E. coli auf S. 51.

Oxidasereaktion

Eine Einzelkolonie wird mit einer sterilen Öse auf dem Papierstreifen verrieben. Im positiven Fall erfolgt ein Indikatorumschlag nach violett. Durch den Oxidase-Test werden Cytochrome in der Atmung derjenigen Bakterien nachgewiesen, die als Elektronen- akzeptor den freien Sauerstoff verwenden. Der Papierstreifen ist mit Tetramethyl-

phenylendiamin (nach KOVÁCS) getränkt, das als künstliches Substrat anstelle natürlicher Elektronen-Akzeptoren die Reduktion des Cytochromoxidase-Systems vollbringt.

Neisserien reagieren im Oxidasetest positiv, E. coli negativ.

Infektionen des Urogenitalsystems

Das Urogenitalsystem besitzt in Harnröhre und Vagina eine Standortflora. Die Blase und die aufsteigenden Harnwege sind gewöhnlich steril ebenso wie Cervix uteri und die höher gelegenen Teile des Genitalsystems. Beim Mann ist das Genitalsystem frei von einer physiologischen Keimbesiedlung. Die im Urogenitaltrakt auftretenden Infektionen können zu unspezifischen Harnwegsinfektionen oder spezifischen Genitalinfektionen STD (sexually transmitted diseases) führen.

Das Spektrum der Infektionserreger umfasst Bakterien, Pilze, Protozoen und zahlreiche Viren (z. B. Herpes-, Zytomegalieviren, HIV, Papillomaviren).

Aufgabe 19: Nachweis einer Harnwegsinfektion

Auf jeder Bankreihe werden alternierend die Eigenurinprobe (Urin X) und die bereitgestellten Urinproben L, M, N verarbeitet. Eine Arbeitsgruppe (2 Studenten) hat dem- nach eine Eigenurinprobe und den Urin L oder M bzw. N zu untersuchen. Beimpfen Sie jeweils eine MacCONKEY-Agarplatte (siehe S. 35) und Blutagar-Platte mit der Urinprobe X bzw. L, M, N unter Verwendung einer kalibrierten Öse (0,001 ml weiße Öse) mit einem langen zickzackförmigen Impfstrich. Die Platten werden beschriftet und bei 37 °C bebrütet.

(31)

Geschlechtskrankheiten

Gonorrhoe

Aufgabe 20: Neisseria gonorrhoeae

Mikroskopische Betrachtung von bereits nach GRAM (Präparat Nr.8) bzw. mit Methylen- blau (Präparat Nr. 9) gefärbten Cervix-Abstrichen. Erstellen Sie eine Skizze der

Gonokokken. Berücksichtigen Sie die typische Morphologie und intrazelluläre Lagerung in den Granulozyten.

Aufgabe 21: Neisseria gonorrhoeae, Oxidasereaktion

Prüfen Sie von der Gonokokkenkultur die Oxidasereaktion mit dem relativ

unspezifischen Reagenz Dimethyl-p-phenylendiamin nach GORDON und MC LEODS, indem Sie einen Tropfen des Reagenz auf eine Neisseriakultur auftropfen. Bei positiver Reaktion verfärben sich die Kolonien dunkel.

Syphilis

Der Erreger Treponema pallidum subsp. pallidum ist auf künstlichen Medien nicht züchtbar.

Daher stehen die Antikörpernachweisverfahren im Vordergrund der mikrobiologischen Diagnostik zur Beantwortung der Fragen:

- Liegt eine Infektion vor?

- In welchem Stadium (Früh-/Spätstadium) befindet sich die Infektion?

- War die durchgeführte Therapie ausreichend?

Zur Klärung der Situation wird ein serologisches Testprogramm eingesetzt. Als Suchtest wird der TPPA-Test (Treponema pallidum-Partikelagglutinationstest) empfohlen.

Ist dieser positiv, wird als eine Bestätigungsreaktion der FTA-ABS-Test

(Fluoreszenz-Treponema-Antikörper-Absorptions-Test) eingesetzt. Die Therapie- bedürftigkeit wird durch den Venereal Disease Research Laboratories-Test (VDRL-Test) ermittelt. Mit dem VDRL-Test werden die Treponema-unspezifischen Lipidantikörper erfasst.

(32)

Aufgabe 22: Indirekter Partikelagglutinationstest zum Nachweis von Antikörpern gegen Treponema pallidum (TPPA-Test)

Arbeitsvorschrift

Ein Student pro Gruppe setzt einen TPPA -Test als Suchtest an. Verfahren Sie dabei bitte nach folgender Vorschrift:

Bereitgestellte Materialien:

1. Tropfpipetten : 1 Tropfen = 25 µl 2. Mikrotiterplatte (U-Form)

3. Patientenserum (S) 4. Serum Diluent (D)

5. Positives Kontrollserum (Kp, 1 : 20 und 1 : 40) 6. Negatives Kontrollserum (Kn, 1 : 20 und 1 : 40)

7. Partikelsuspensionen: Gelatinepartikel mit Treponema pallidum-Antigenen sensibilisierte Partikel (sP) und unsensibilisierte Partikel (uP)

Testdurchführung:

1. Arbeitsgang

. Rahmen für Strips beschriften

. Vorlegen von 100 µl Serum Diluent in Vertiefung 1 und je 25 µl in Vertiefungen 2 - 4 (siehe Pipettierschema, 25 µl = 1 Tropfen )

. 25 µl Kp (1: 20) in Vertiefung 5 und 25 µl Kp (1:40) in Vertiefung 6 pipettieren . 25 µl Kn (1: 20) in Vertiefung 7 und 25 µl Kn (1:40) in Vertiefung 8 pipettieren 2. Arbeitsgang

. Zugabe von 25 µl Patientenserum zu Vertiefung 1, gut mit Serum Diluent mischen und 25 µl in Vertiefung 2 übertragen, wiederum gut mischen und 25 µl in Vertiefung 3 übertragen, gut mischen und 25 µl in Vertiefung 4 übertragen, nach Mischen 25 µl verwerfen (siehe Pipettierschema)

3. Arbeitsgang

. Partikelsuspension gut mischen.

. je 25 µl (= 1 Tropfen) unsensibilisierter Partikel (uP) in Vertiefungen 3, 5, 7 geben . Zugabe von 25 µl sensibilisierter Partikel (sP) in Vertiefungen 4, 6, 8

4. Arbeitsgang

. Platteninhalt durch Klopfen gegen den Rahmen (30 sec) gut mischen

. Platte abdecken, erschütterungsfrei bei Zimmertemperatur für ca. 2 h stehen lassen 5. Auswertung des TPPA-Testes

. Reaktion nach dem unten aufgeführten Reaktionsschema beurteilen.

. Der Testausfall ist als positiv einzuschätzen, wenn durch die Vernetzung der

antigenbeladenen Partikel (Antikörperwirkung) ein flächiger Niederschlag entsteht.

Die Reaktion ist negativ, wenn sich die Partikel in der tiefsten Stelle der Kavität ansammeln („Knopfbildung“).