Die Infektionen des ZNS kommen am häufigsten durch hämatogene Keimstreuungen zustande. Bei Allgemeininfektionen können Mikroorganismen im Generalisations-stadium sich auch im ZNS ansiedeln (Organmanifestation), wie z. B. bei Tuberkulose, Toxoplasmose und vielen Virusinfektionen (Poliomyelitis, Echo-, Coxsackie-Viren u. a.) Durch eine Reihe von Bakterien, wie Streptococcus pneumoniae, H. influenzae Typ b, N.
meningitidis, E. coli (Neugeborene!), Streptokokken der Gruppe B (Neugeborene), selten Staphylococcus aureus u. a. wird das Krankheitsbild der akuten eitrigen Meningitis hervorgerufen. Die Meningitiserreger führen meist über Kolonisation des Nasen-Rachen-Raumes, Bakteriämie und Absiedlung im ZNS zu einer Infektion.
Sie verfügen über Virulenzmechanismen, die ihnen das Eindringen in tiefere Gewebe-schichten und letztlich in die Blutbahn erlauben. Derartige Virulenzfaktoren sind Kapsel und Pili. Eine eitrige Meningitis bedarf einer unverzüglichen Behandlung!
Nach der Materialgewinnung für die mikrobiologische und klinisch-chemische
Untersuchung (Liquor, für den Mikrobiologen auch Blutkulturen) ist mit einer adäquaten antibiotischen Initialtherapie zu beginnen. Nach der Erregeranzucht wird die Therapie entsprechend dem Resistogramm optimiert. Die Resistenzbestimmung kann direkt aus dem Liquor erfolgen, da hier nicht mit einem Keimgemisch zu rechnen ist.
Untersuchung einer Liquorprobe G und einer Liquorprobe H Klinische Angaben zum Liquor G (Normwerte in Klammern):
- männliches Neugeborenes, 2 Tage alt
- hormonell eingeleitete Entbindung nach vorzeitigem Blasensprung - Fieber bis 38 °C, Trinkunlust, vorgewölbte Fontanelle
- Liquor: Zellen = 1500 / µl (< 32) (> 90 % PMN) erhöht
Eiweiß = 1500 mg/l (250 – 720) Laktat = 7,5 mmol/l (1,1 – 1,8) Klinische Angaben zum Liquor H (Normwerte in Klammern) :
- weibliche Patientin, 23 Jahre alt
- plötzliches hohes Fieber bis 40 °C, Bewusstseinsstörungen, starker Meningismus
- Liquor: Zellen = 3000 / µl (bis 4) (95 % PMN, erhöht)
Eiweiß = 4000 mg/l (300 – 45) Laktat = 10,0 mmol/l (1,2 – 2,1)
Aufgabe 17: Bakterielle Meningitis
Färben Sie alternierend den Liquor G bzw. H jeweils nach GRAM und Methylenblau und fertigen Sie eine Skizze nach dem mikroskopischen Bild an.
( Fertigpräparate liegen zur Kontrolle an den Mikroskopen. )
Verwenden Sie wiederum alternierend den Liquor G bzw. H. Beimpfen Sie mit dem Liquor je eine Blut-, Kochblut- und MacConkey Agarplatte sowie eine Nähr- und eine Thioglykolat-Bouillon. Auf den festen Nährmedien Material in einem langen zickzack-förmigen Impfstrich ausstreichen. Beurteilen Sie makroskopisch die Beschaffenheit des Liquors.
Verwenden Sie das Protokoll auf S. 50 Listeria monocytogenes
Listeria monocytogenes ist der Erreger der Listeriose. Die Erreger werden aus der Umwelt oder von Tieren auf den Menschen übertragen. Häufig erfolgt die Infektion über
kontaminierte Lebensmittel und verläuft inapparent. Bei schweren Verläufen kommt es zu lokalen und systemischen (Bakteriämie, Meningitis) Infektionskrankheiten.
Durch die Bakteriämie kann es zur Infektion des mütterlichen Genitaltraktes und zu konnatalen Infektionen kommen.
Aufgabe 17a: Blutagar-Platte mit Listeria monocytogenes und Enterokokken
Nachweis der Katalase bei L. monocytogenes bzw. Enterokokken von einer Blutagar-Platte: Katalasereagenz (H2O2) auf Objektträger tropfen und eine Öse Material hineinhalten. ( Nicht rühren ! )
Fertigen Sie von den Listerien ein GRAM-Präparat und eine Skizze an.
Cryptococcus neoformans
Cryptococcus neoformans ist ein fakultativ pathogener, in vivo bekapselter Sprosspilz. Er kommt bei Vögeln, insbesondere bei Tauben vor und wird auf den Menschen durch Inhalation von mit Taubenkot kontaminiertem Staub übertragen. Am häufigsten mani-festiert sich die Kryptokokkeninfektion bei immunsupprimierten Patienten, hauptsächlich AIDS-Patienten, in Form einer subakuten Meningoenzephalitis, die unbehandelt immer zum Tode führt. Die Kapsel als bedeutendster Pathogenitätsfaktor schützt den Pilz vor Phagozytose und ermöglicht eine schnelle Diagnose der Kryptokokkose. Die Darstellung der Kapsel kann in einem Tuschepräparat erfolgen. Sensitiver ist jedoch der immunolo-gische Nachweis von Kapselantigen.
Aufgabe 18: Tuschepräparat mit Cryptococcus neoformans
Mikroskopieren Sie einen Liquor mit Cryptococcus neoformans, im Tuschepräparat (PräparatNr.17) und fertigen Sie eine Skizze an. Achten Sie dabei besonders auf die Kapsel.
Nachweis von Antikörpern gegen Borrelia burgdorferi
Borrelia burgdorferi ist der Erreger der Lyme-Borreliose, die im II. Stadium der Erkrankung zu etwa 13% der Fälle als lymphozytäre Meningitis verläuft. Die Diagnostik dieser von Zecken übertragenen Infektionskrankheit erfolgt fast ausschließlich durch den
Antikörpernachweis im Immunfluoreszenz-Test (I FT), Enzymimmunassay (EIA), Hämagglutinationstest (HAT) bzw. in ausgesuchten Fällen durch den Immunoblot.
Die Antikörper zeigen zahlreiche Kreuzreaktionen mit Treponema pallidum und anderen Borrelien. Der CMT-Test reagiert bei der Lyme-Borreliose jedoch negativ.
Demonstration
Western-Blot zum Nachweis von B. burgdorferi-Antikörpern
Ausgabe der Gefäße für die Urinproben!
Bei der Uringewinnung achten Sie bitte auf die Hinweise auf S. 11.
Rücknahme:
Mit Namen und Platz-Nr. gekennzeichnete Urinproben müssen von 07:00 bis 08:00 am 5. Kurstag bei der Annahme des Institutes für Medizinische Mikrobiologie abgegeben werden (nach Uringewinnung Kühlschrankaufbewahrung! ).
5. KURSTAG
Praktikumseinführung für folgenden Kurstag
(für alle Studenten gemeinsam im Hörsaal)
Auswertungen der Aufgaben vom Vortag Aufgabe 17:
Kontrolle der mit dem Liquor G bzw. H beimpften Nährmedien. Fertigen Sie ein GRAM -Präparat von den Kolonien auf der Blutagar-Platte an. Führen Sie den Nachweis der Oxidasereaktion auf den bereitgestellten Papierstreifen. Verwenden Sie dazu die Kochblutagar- Platte. Vervollständigen Sie das Protokoll S. 50 und geben Sie es ab.
Verwenden Sie für den Therapievorschlag das Resistogramm von E. coli auf S. 51.
Oxidasereaktion
Eine Einzelkolonie wird mit einer sterilen Öse auf dem Papierstreifen verrieben. Im posi-tiven Fall erfolgt ein Indikatorumschlag nach violett. Durch den Oxidase-Test werden Cytochrome in der Atmung derjenigen Bakterien nachgewiesen, die als Elektronen-akzeptor den freien Sauerstoff verwenden. Der Papierstreifen ist mit
Tetramethyl-phenylendiamin (nach KOVÁCS) getränkt, das als künstliches Substrat anstelle natürlicher Elektronen-Akzeptoren die Reduktion des Cytochromoxidase-Systems vollbringt.
Neisserien reagieren im Oxidasetest positiv, E. coli negativ.
Infektionen des Urogenitalsystems
Das Urogenitalsystem besitzt in Harnröhre und Vagina eine Standortflora. Die Blase und die aufsteigenden Harnwege sind gewöhnlich steril ebenso wie Cervix uteri und die höher gelegenen Teile des Genitalsystems. Beim Mann ist das Genitalsystem frei von einer physiologischen Keimbesiedlung. Die im Urogenitaltrakt auftretenden Infektionen können zu unspezifischen Harnwegsinfektionen oder spezifischen Genitalinfektionen STD (sexually transmitted diseases) führen.
Das Spektrum der Infektionserreger umfasst Bakterien, Pilze, Protozoen und zahlreiche Viren (z. B. Herpes-, Zytomegalieviren, HIV, Papillomaviren).
Aufgabe 19: Nachweis einer Harnwegsinfektion
Auf jeder Bankreihe werden alternierend die Eigenurinprobe (Urin X) und die bereit-gestellten Urinproben L, M, N verarbeitet. Eine Arbeitsgruppe (2 Studenten) hat dem-nach eine Eigenurinprobe und den Urin L oder M bzw. N zu untersuchen. Beimpfen Sie jeweils eine MacCONKEY-Agarplatte (siehe S. 35) und Blutagar-Platte mit der Urinprobe X bzw. L, M, N unter Verwendung einer kalibrierten Öse (0,001 ml weiße Öse) mit einem langen zickzackförmigen Impfstrich. Die Platten werden beschriftet und bei 37 °C bebrütet.
Geschlechtskrankheiten
Gonorrhoe
Aufgabe 20: Neisseria gonorrhoeae
Mikroskopische Betrachtung von bereits nach GRAM (Präparat Nr.8) bzw. mit Methylen-blau (Präparat Nr. 9) gefärbten Cervix-Abstrichen. Erstellen Sie eine Skizze der
Gonokokken. Berücksichtigen Sie die typische Morphologie und intrazelluläre Lagerung in den Granulozyten.
Aufgabe 21: Neisseria gonorrhoeae, Oxidasereaktion
Prüfen Sie von der Gonokokkenkultur die Oxidasereaktion mit dem relativ
unspezifischen Reagenz Dimethyl-p-phenylendiamin nach GORDON und MC LEODS, indem Sie einen Tropfen des Reagenz auf eine Neisseriakultur auftropfen. Bei positiver Reaktion verfärben sich die Kolonien dunkel.
Syphilis
Der Erreger Treponema pallidum subsp. pallidum ist auf künstlichen Medien nicht züchtbar.
Daher stehen die Antikörpernachweisverfahren im Vordergrund der mikrobiologischen Diagnostik zur Beantwortung der Fragen:
- Liegt eine Infektion vor?
- In welchem Stadium (Früh-/Spätstadium) befindet sich die Infektion?
- War die durchgeführte Therapie ausreichend?
Zur Klärung der Situation wird ein serologisches Testprogramm eingesetzt. Als Suchtest wird der TPPA-Test (Treponema pallidum-Partikelagglutinationstest) empfohlen.
Ist dieser positiv, wird als eine Bestätigungsreaktion der FTA-ABS-Test
(Fluoreszenz-Treponema-Antikörper-Absorptions-Test) eingesetzt. Die Therapie-bedürftigkeit wird durch den Venereal Disease Research Laboratories-Test (VDRL-Test) ermittelt. Mit dem VDRL-Test werden die Treponema-unspezifischen Lipidantikörper erfasst.
Aufgabe 22: Indirekter Partikelagglutinationstest zum Nachweis von Antikörpern gegen Treponema pallidum (TPPA-Test)
Arbeitsvorschrift
Ein Student pro Gruppe setzt einen TPPA -Test als Suchtest an. Verfahren Sie dabei bitte nach folgender Vorschrift:
Bereitgestellte Materialien:
1. Tropfpipetten : 1 Tropfen = 25 µl 2. Mikrotiterplatte (U-Form)
3. Patientenserum (S) 4. Serum Diluent (D)
5. Positives Kontrollserum (Kp, 1 : 20 und 1 : 40) 6. Negatives Kontrollserum (Kn, 1 : 20 und 1 : 40)
7. Partikelsuspensionen: Gelatinepartikel mit Treponema pallidum-Antigenen sensibilisierte Partikel (sP) und unsensibilisierte Partikel (uP)
Testdurchführung:
1. Arbeitsgang
. Rahmen für Strips beschriften
. Vorlegen von 100 µl Serum Diluent in Vertiefung 1 und je 25 µl in Vertiefungen 2 - 4 (siehe Pipettierschema, 25 µl = 1 Tropfen )
. 25 µl Kp (1: 20) in Vertiefung 5 und 25 µl Kp (1:40) in Vertiefung 6 pipettieren . 25 µl Kn (1: 20) in Vertiefung 7 und 25 µl Kn (1:40) in Vertiefung 8 pipettieren 2. Arbeitsgang
. Zugabe von 25 µl Patientenserum zu Vertiefung 1, gut mit Serum Diluent mischen und 25 µl in Vertiefung 2 übertragen, wiederum gut mischen und 25 µl in Vertiefung 3 übertragen, gut mischen und 25 µl in Vertiefung 4 übertragen, nach Mischen 25 µl verwerfen (siehe Pipettierschema)
3. Arbeitsgang
. Partikelsuspension gut mischen.
. je 25 µl (= 1 Tropfen) unsensibilisierter Partikel (uP) in Vertiefungen 3, 5, 7 geben . Zugabe von 25 µl sensibilisierter Partikel (sP) in Vertiefungen 4, 6, 8
4. Arbeitsgang
. Platteninhalt durch Klopfen gegen den Rahmen (30 sec) gut mischen
. Platte abdecken, erschütterungsfrei bei Zimmertemperatur für ca. 2 h stehen lassen 5. Auswertung des TPPA-Testes
. Reaktion nach dem unten aufgeführten Reaktionsschema beurteilen.
. Der Testausfall ist als positiv einzuschätzen, wenn durch die Vernetzung der
antigenbeladenen Partikel (Antikörperwirkung) ein flächiger Niederschlag entsteht.
Die Reaktion ist negativ, wenn sich die Partikel in der tiefsten Stelle der Kavität ansammeln („Knopfbildung“).