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Infektionen des Gastrointestinaltraktes

Die Keime der normalen Stuhlflora verursachen Schwierigkeiten bei der Isolierung der pathogenen Bakterien. Faeces im Dickdarm enthält durchschnittlich 109 - 1010 Keime/g Stuhlmasse. Die pathogenen, fakultativ anaeroben Keime sind meistens in so geringer Zahl vorhanden, dass Selektivnährmedien zur Isolierung eingesetzt werden müssen.

Diese Nährmedien enthalten Zusätze, die das Wachstum der normalen Stuhlflora unterdrücken, die pathogenen Keime jedoch nicht beeinträchtigen, sondern z. T.

sogar fördern (z. B. Gallensalze, Farbstoffe u.ä.).

Ein Differenzierungsprinzip für pathogene Keime ist die Laktosespaltung: Salmonellen und Shigellen können Laktose nicht bzw. verzögert (48 h) spalten, die meisten

apathogenen Enterobacteriaceen können Laktose spalten. Der Laktoseabbau führt zu einem Umschlag des Indikators.

Selektivnährmedien:

a) feste Nährmedien

XLD-Agar (Xylose-Lysin-Desoxycholat-Agar)

Der Abbau von Xylose, Laktose und Saccharose wird durch Farbumschlag des Indikators Phenolrot nach gelb angezeigt.

Die Decarboxylierung von Lysin wird durch Farbumschlag des Indikators Phenolrot nach dunkelrot angezeigt.

Die Bildung von H2S führt zu schwarzen Zentren der Kolonien.

Hemmstoff: Natriumdesoxycholat MacConkey Agar

Der Abbau von Laktose wird durch Farbumschlag des Indikators Neutralrot nach rot angezeigt.

Hemmstoffe: Gallensalze und Kristallviolett b) flüssige Nährmedien

Selenitbouillon

Natriumselenit hemmt das Wachstum der meisten Enterobacteriaceae, jedoch nicht das von Salmonellen und Shigellen.

Aufgabe 24: Stuhlausstrich

Fertigen Sie von den Stuhlsuspensionen O, P sowie der eigenen Probe GRAM-Präparate an. Dafür wird eine Öse der Suspension auf dem Objektträger ausgebreitet, getrocknet, hitzefixiert und nach GRAM gefärbt. Machen Sie eine Skizze der Standortflora.

Merke: Das Grampräparat gehört nicht zur Routinestuhldiagnostik!

Aufgabe 25: Anzucht von pathogenen Bakterien aus einer Stuhlsuspension

Verwenden Sie alternierend die Stuhlproben O bzw. P. (jede Gruppe prüft O und P) Streichen Sie die Suspension fraktioniert auf jeweils eine Platte mit MacConkey-Agar und XLD-Agar aus.

Die Nährböden werden bei 37 °C bebrütet.

Biochemische Differenzierung von Enterobacteriaceae

Erscheint bei der Diagnostik von Salmonellen / Shigellen auf den Selektivmedien eine Bakterienkolonie als verdächtig, so wird durch eine Probeagglutination und das Anlegen einer "Bunten Reihe" zur Prüfung der biochemischen Leistung die

Verdachtsdiagnose bestätigt. In dieser kurzen "Bunten Reihe" werden der KLIGLER -Agar, HIB--Agar, Malophen-Medium und ein Schrägagar beimpft.

Der KLIGLER-Agar ist ein komplexer Nährboden, der die Überprüfung folgender Reaktionen ermöglicht: Glukose- und Laktoseabbau, H2S - sowie Gasbildung.

Wird nur Glukose gespalten, erfordert der geringe Glukoseanteil 0,1% nach einiger Zeit auch die Verwertung von Pepton. Dadurch erfolgt eine Realkalisierung

(Rötung) des Mediums. Pepton kann jedoch nur in Anwesenheit von Sauerstoff verwertet werden, so dass sich nur der Schrägteil des Agars rot färbt, der Hoch-schichtanteil bleibt gelb. Der Laktoseabbau (1% Laktose im Agar) ist durch die Gelbfärbung von Schräg- und Hochschicht erkennbar.

Die H2S-Bildung wird durch die Umwandlung von Eisen-II-Sulfat in schwarzes Eisensulfit angezeigt.

HIB-Agar:

H = Harnstoff. Harnstoff wird durch Urease zu Ammoniak und CO2 hydrolysiert. Das Medium wird durch den Ammoniak alkalisch (blau).

I = Indolbildung aus Tryptophan (= Indolalanin). Der Nachweis des Indols erfolgt durch Zugabe von KOVÁCS-Indolreagenz (p-Dimethylaminobenzaldehyd). Eine Rotfärbung zeigt die Indolbildung an.

B = Beweglichkeit Die Beweglichkeit ist durch eine Trübung ("Gläserbürste") um den Stichkanal gekennzeichnet.

Malophen-Test

Malonat-Phenylalanin-Medium

Na-Malonat wird unter Bildung alkalischer Stoffwechselprodukte verwertet. Die pH-Erhöhung lässt den Indikator Bromthymolblau nach blau umschlagen.

Phenylalanin wird durch das bei der Gruppe Proteus - Providencia vorkommende Enzym Phenylalanindesaminase unter Bildung von Phenylbrenztraubensäure gespalten.

Diese ist mit Eisen-III-Salzen nachweisbar (FeCl3 ⇒ Grünfärbung).

Candida albicans

Die zu den Hefepilzen gehörenden Candida-Arten kommen im Orogastrointestinaltrakt vor. Auch bei immunkompetenten gesunden Personen können diese Sprosspilze durch Persorption in die Blutbahn gelangen und im Urin ausgeschieden werden. Bei intakter körpereigener Abwehr ist mit dieser Fungämie aber keine Organansiedlung verbunden.

Bei immunsupprimierten Personen kann sich aber eine disseminierte Candidose (Sepsis), als Organmanifestation eine Meningitis, Endokarditis oder Pyelonephritis entwickeln.

Aufgabe 26: Candida albicans auf Chrom-Agar

Fertigen Sie von einer Kolonie ein GRAM-Präparat und eine Skizze an.

Demonstration

Nährmedium mit Proteus vulgaris

Nährmedium mit Mykoplasma und Ureaplasma

Staphylococcus saprophyticus / Staphylococcus epidermidis mit Novobiocinblättchen Urintauchkultur - beimpft, unbeimpft

Hemmstofftest

MACCONKEY-undXLD-Agar mit Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Shigella sonnei

7. KURSTAG

Praktikumseinführung für folgenden Kurstag

(für alle Studenten gemeinsam im Hörsaal)

Auswertungen der Aufgaben vom Vortag

Aufgabe 25:

25.1: Kontrolle der mit der Stuhlprobe O bzw. P beimpften Medien

Suchen Sie nach verdächtigen Kolonien pathogener Darmbakterien. Beachten Sie die auf den Seiten 35 und 36 gegebenen Hinweise für die Nährmedien.

Verwenden Sie den Protokollbogen von Seite 52.

25.2: Probeagglutination:

Auf einem sauberen Objektträger werden ein kleiner Tropfen Suchserum "Salmonellen", Suchserum "Shigellen" und physiologischer Kochsalz-Lösung nebeneinander

aufgebracht. Mit der Öse wird von einer verdächtigen Kolonie etwas Material entnommen und dicht neben dem Tropfen mit der Öse auf dem Glas verrieben.

Sodann wird der Tropfen mit der Öse auf das Bakterienmaterial gezogen und dieses zur Suspension verrieben. Für jedes Suchserum und die Kontrolle muss eine neue Öse

verwendet werden.

25.3 "Bunte Reihe"

Verwenden Sie zur Beurteilung des Reaktionsausfalls positiv/negativ die bei den Medien gegebenen Erläuterungen und zur Identifizierung die Angaben in unten stehender Tabelle.

Die "Bunte Reihe" ist für Sie vorbereitet und mit Reinkulturen (Einzelkolonien) beimpft, die auf dem XLD-Agar aus der Stuhlprobe O bzw. P gewachsen sind.

Tragen Sie die ermittelte Spezies in das Protokoll ein.

Auswertung der "Bunten Reihe" anhand der Tabelle:

1) Indolbildung durch KOVACS-Indolreagens nachweisbar

2) Phenylalanindesaminierung durch FeCl3 nachweisbar

Bewertung

a) KLIGLER-Agar: Dextrose-Spaltung (unten) - Agarsäule (unten) gelb, Schrägfläche rot Laktose-Spaltung (oben) - Agarsäule und Schrägfläche gelb

Gasbildung - Gasblasen im Agar

H2S-Bildung - Schwarzfärbung

b) HIB-Agar Harnstoffspaltung - Farbumschlag nach blau (Bromthymolblau)

Indolproduktion - KOVÁCS-Indolreagenz tropfen Rotfärbung

Beweglichkeit - Trübung des Agars

Keine Beweglichkeit - Wachstum im Stichkanal

c) Malophen-Medium: Malonatabbau - Farbumschlag nach blau

Phenylalanindesaminierung - FeCl3 tropfen Grünfärbung

d) Schrägagar für Objektträgeragglutination

25.4 Serologische Differenzierung von Salmonellen und Shigellen

Bei positiver Agglutination mit dem Shigella-Suchserum erfolgt die serologische

Differenzierung der Spezies Shigella sonnei, Shigella flexneri, Shigella boydii und Shigella dysenteriae. Verwenden Sie für die Objektträgeragglutination den Schrägagar von der entsprechenden "Bunten Reihe". Entnehmen Sie das Material für die Agglutination möglichst von der Schrägfläche des Agars.

Prüfen Sie den Bakterienstamm mit Anti-Shigella-sonnei- und Anti-Shigella-flexneri- Serum.

Bei positiver Agglutination mit dem Salmonella-Suchserum erfolgt die Bestimmung der Salmonella-Serovare. Verwenden Sie für die Objektträgeragglutination w. o. den Schrägagar von der entsprechenden "Bunten Reihe". Entnehmen Sie möglichst das Material für die O-Agglutination von der Schrägfläche des Agars und für die

H-Agglutination eine Öse Material aus dem Kondenswasserbereich. Prüfen Sie zunächst mit den Anti-Salmonella-Gruppenseren die vorhandenen O-Antigene (A, B, D).

Dann prüfen Sie mit den Anti-Salmonella-H-Seren die vorhandenen H-Antigene.

Mit den O-Seren erfassen Sie die O-Antigene (Lipopolysaccharide der Zellwand), mit den H-Seren die Proteinsubstanzen der Geißeln. Bestimmen Sie den Salmonella-Typ unter Verwendung des Auszugs aus dem KAUFFMANN-WHITE-Schema.

Durch das KAUFFMANN-WHITE-Schema ist ein Ordnungsprinzip für alle Salmonella-Spezies geschaffen worden, das auf der Erstellung der Antigenformel durch die Agglutination beruht.

Zur Bestimmung der Salmonellen-Antigenformel stehen Ihnen folgende Seren zur Verfügung:

Anti-Salmonella-O-Gruppenseren: A, B, D

Anti-Salmonella-H-Seren: Hb, Hi, H1,2, Hg,m

Geben Sie in Ihrem Protokoll den ermittelten Serovar und die Antigenformel an!

Auszug aus dem Antigenschema nach KAUFFMANN-WHITE

H - Antigen Spezies Gruppe O-Antigen 1.Phase 2. Phase

S. Paratyphi A A 1, 2, 12 a -

S. Paratyphi B B 1, 4, 5, 12 b 1,2

S. Typhimurium B 1, 4, 5, 12 i 1,2

S. Infantis C 6, 7 r 1,5

S. Typhi D 1, 9, 12, (Vi) d -

S. Enteritidis D 1, 9, 12 g,m -

S. Anatum E 3, 10 e,h 1,6

8./ 9. KURSTAG