Giardia lamblia
Giardia lamblia (Lamblien) ist ein Parasit des oberen Dünndarms. Die Trophozoiten können massenhaft das Darmepithel abdecken und zu Resorptionsstörungen führen, besonders bei Kleinkindern ("Lambliendysenterie"). Die Zysten dieser Flagellaten werden mit dem Stuhl ausgeschieden.
Aufgabe 29: Giardia lamblia
Sie erhalten Stuhlpräparate (Nr. 11) mit Zysten von Giardia, die mit Trichrom oder nach HEIDENHAIN gefärbt sind. Fertigen Sie von den Giardien eine Skizze bei einer
Vergrößerung von 10x100 an.
Toxoplasma gondii - Toxoplasmose
Die Toxoplasmose ist eine kosmopolitische Protozoonose. Latente Infektionen sind häufig (20 - 60 % weltweit, Magdeburg etwa 80%) und werden vorwiegend inapparent erworben, akute Erkrankungen sind selten. Gefährlich für den Feten ist die Erst-Infektion einer Graviden. Die Labordiagnostik der Toxoplasmose erfolgt überwiegend durch den Antikörpernachweis.
Aufgabe 30: Tachyzoiten von Toxoplasma gondii
Mikroskopieren (10x100) eines GIEMSA-Präparates mit Toxoplasma-Tachyzoiten (Präparat Nr. 12) aus der Zellkultur. Fertigen Sie eine Skizze an.
Gerätedemonstration – Axsym: Toxoplasmose-ELISA Entamoeba histolytica - Amöbenruhr
Die Amöbenruhr ist eine tropische Erkrankung. Latente Infektionen ohne Krankheitswert kommen auch in Deutschland zu 1 - 4 % vor. Molekularbiologische Untersuchungen belegen, dass die avirulente Minutaform von E. histolytica eine eigene Spezies
(Entamoeba dispar) gegenüber der pathogenen Magnaform darstellt. Weltweit ist mit 4 x 108 Infizierten und mit 3 x 104 Todesfällen zu rechnen.
Demonstration
Toxoplasmose-IFT, E. histolytica-Zysten
Malaria
Jährlich werden über 1.000 Malariaerkrankungen in Deutschland registriert.
Die Malaria kann durch vier Plasmodium-Arten hervorgerufen werden:
Plasmodium falciparum - Malaria tropica (maligne Malaria tertiana) Plasmodium vivax - Malaria tertiana (3-Tagefieber)
Plasmodium ovale - Malaria tertiana (3-Tagefieber) Plasmodium malariae - Malaria quartana (4-Tagefieber) Die Überträger der Malariaparasiten sind Anophelesmücken.
Aufgabe 32: Plasmodium falciparum
Mikroskopieren (10 x 100) des nach GIEMSA gefärbten Blutausstriches mit Plasmodium falciparum (Präparat Nr. 14).
Fertigen Sie eine Skizze von den intraerythrozytären Parasiten an. Die Präparate werden bereits gefärbt ausgegeben und verbleiben nach dem Mikroskopieren am Arbeitsplatz!
Blutausstrich zur Malariadiagnostik
Das Blut wird aus der Fingerbeere entnommen:
- Fingerspitze des linken Ringfingers mit Alkohol reinigen - Punktion mit einer sterilen Lanzette
- Durch leichten Druck wird das Blut ausgepresst. Der erste Tropfen wird durch Abwischen mit einem sterilen Tupfer verworfen.
- Die nachfolgenden Tropfen werden zur Herstellung eines dünnen und eines dicken Ausstrichs verwendet.
Dünner Ausstrich
Die Objektträger nur am Rand anfassen.
Den Blutstropfen beim Ausstreichen
"ziehen", nicht "schieben".
Dicker Ausstrich („Dicker Tropfen“) Mit der Ecke des Objektträgers einen kleinen Blutstropfen auf eine Fläche von 1 cm2 ausbreiten. Dabei höchstens 5-6 kreisende Bewegungen ausführen.
Korrekt ausgeführter dünner und dicker Der Objektträger muss mit einem
weichen Bleistift oder mit einem Etikett im dicken Teil des Ausstrichs gekennzeichnet werden.
Trichomonas vaginalis - Trichomoniasis
Die Protozoenspezies Trichomonas vaginalis gehört zu den kosmopolitisch verbreiteten Parasiten. In Deutschland ist die Infektion des Urogenitalsystems bei
5 - 10 % der weiblichen und männlichen Bevölkerung anzutreffen. Trichomonas vaginalis gehört zu den Erregern der STD und kommt nur beim Menschen vor. Die Epidemiologie entspricht weitgehend derjenigen von Neisseria gonorrhoeae.
Aufgabe 33: Trichomonas vaginalis
Untersuchung einer Trichomonas vaginalis-Kultur im CACH-Medium.
Fertigen Sie ein Deckglaspräparat an, wozu Sie Kulturmaterial aus der unteren Hälfte des Kulturmediums entnehmen. Die lebhaft beweglichen Flagellaten sind besonders im Phasenkontrastmikroskop gut zu sehen.
Aufgabe 34: Ausstrich mit Trichomonas vaginalis
Mikroskopieren von Trichomonas vaginalis im GIEMSA-Präparat (Präparat Nr. 15). Die bereits gefärbten Präparate sind am Arbeitsplatz vorhanden. Sie sind im
Immersionssystem zu betrachten. Fertigen Sie von den Trichimonaden eine Skizze an.
Helminthen
In Deutschland endemisch sind Ascaris lumbricoides (Spulwurm), Trichuris trichiura (Peitschenwurm), Enterobius vermicularis (Madenwurm), Taenia saginata (Rinder- bandwurm ), Echinococcus multilocularis (Fuchsbandwurm) und einige weitere Helminthen. Die Befallshäufigkeit ist unterschiedlich, aber im allgemeinen gering (Ascaris etwa 1%, Enterobius bei Kindern bis 30 %) . Asiaten und Afrikaner sind häufiger mit kosmopolitischen Geohelminthen, aber auch mit tropischen Helminthen
(Bilharziose, Hakenwürmer u. a.) befallen. Man schätzt, dass 200 Millionen Menschen mit einem Schistosoma-Befall auf der Erde leben. Schistosoma mansoni verursacht hauptsächlich die Darmbilharziose und kommt in Afrika sowie Südamerika vor.
Zwischenwirte sind Schnecken der Gattung Biomphalaria. Ancylostoma duodenale gehört zu den Hakenwürmern. Die Larvenstadien leben im feuchten Erdreich. Nach perkutaner Invasion und Lungenwanderung saugen die Adultes im Dünndarm Blut.
Der Blutverlust beträgt etwa 0,25 ml pro Wurm und Tag. Die Eier gelangen mit den Faeces in den Boden.
Aufgabe 35: Wurmeier im Stuhl
Mikroskopieren Sie das Stuhlpräparat (Präparat Nr. 16) sowie die
Anreicherungs-präparation MJF1 u. MJF2 und bestimmen Sie den beim vorliegenden Wurmbefall nach der Art der aufgefundenen Wurmeier. Zur Ei-Suche verwenden Sie eine mikroskopische Vergrößerung von 10 x 10. Zur sicheren Artdiagnostik kann auf 10 x 40 umgeschaltet werden. Vergleichen Sie die aufgefundenen Wurmeier mit der Abbildung. Fertigen Sie Skizzen der Eier nach Ihren Präparaten bei einer Vergrößerung von 10 x 40 an.
Wurmeier
10. KURSTAG
Praktikumseinführung für folgenden Kurstag
(für alle Studenten gemeinsam im Hörsaal)
Medizinische Virologie
Das Fachgebiet der Medizinischen Virologie befasst sich mit humanpathogenen
ultravisiblen Strukturen ohne zelluläre Organisation. Einfach gebaute Viren bestehen aus Nukleinsäure und Protein. Die Nukleinsäure kann entweder aus DNS oder RNS, ein- oder doppelsträngig aufgebaut sein. Jedes Virion enthält nur einen Typ der Nukleinsäure. Die Proteinhülle ist aus einzelnen Bausteinen, den Kapsomeren, zum sogenannten Kapsid zusammengesetzt. Nukleinsäure und Kapsomere bilden das Nukleokapsid. Durch die Anordnung der Kapsomeren im Kapsid ergeben sich drei Bauprinzipien: Viren mit einem helical symmetrischen oder kubisch symmetrischen Aufbau des Kapsids. Bei Viren mit einem komplexen Aufbau ist das Nukleokapsid noch von einer Hülle umgeben. Diese Membran enthält neben virusspezifischen Bausteinen auch Material aus der Wirtszell-membran. Das infektiöse Virusteilchen wird als Virion bezeichnet. Viren sind obligate Zellparasiten und ohne eine lebende Wirtszelle nicht vermehrungsfähig. Auf künstlichen Medien sind sie nicht züchtbar. Für ihre Vermehrung werden Zellen verschiedener Herkunft verwendet.
Permanente Zell-Linien
Darunter versteht man Zellkulturen, die, von tierischen oder menschlichem Gewebe ausgehend, über lange Zeiten (Jahre) durch ständiges Überimpfen fortzüchtbar sind.
Diese Zellen sind aneuploid.
Primäre Zellkulturen
Diese Zellkulturen werden jeweils direkt aus lebendem Gewebe hergestellt. Sie sind diploid und lassen sich nur über wenige Passagen (etwa 40) weiterführen. In ihnen lässt sich ein breites Spektrum der Viren kultivieren.
Da die Isolierung und Identifizierung der Viren aus Patientenmaterial über die
Kultivierung langwierig und aufwendig ist, wurden in den letzten Jahren Testmethoden auf immunologischer Basis zum Direktnachweis entwickelt. Fluorochrom-markierte monoklonale Antikörper ermöglichen das Auffinden von virusinfizierten Wirtszellen, z. B.
in Rachenabstrichen, Hornhautabstrichen u. a.
Demonstration
Demonstration eines zytopathischen Effektes
Durchführung einer PCR-Analyse: siehe PCR-Protokoll S. 55
• Aufarbeitung der DNA aus EDTA-Blut
• Ansetzen einer PCR zum Nachweis von CMV-DNA
• Gelelektrophorese zum Nachweis der Amplifikate
Rotaviren
Der Zweiseiten-Enzymimmuntest bietet die Möglichkeit, im Untersuchungsmaterial reichlich vorhandene Viren direkt nachzuweisen. Dieses schnelle Verfahren hat bei schlecht anzüchtbaren Viren wie den Rotaviren besondere Bedeutung. Die Viren können schnell in Stuhlproben der Erkrankten erfasst werden. Das Verfahren beruht darauf, dass Antikörper gegen das Gruppenantigen von Rotaviren an Mikrotiterplatten fixiert werden. Danach erfolgt eine Beschickung mit einer Stuhlsuspension. Sind in dieser Rotaviren vorhanden, werden sie gebunden und mit einem Reportersystem
nachgewiesen.
Aufgabe 37: Nachweis von Rotaviren durch einen Enzymimmuntest Untersuchung der vorbereiteten Stuhlproben R, S und T
Vorschrift für EIA (pro Studentengruppe)
1.) Die in den Halterahmen befestigten 3 Näpfchen werden mit 2 Tropfen der Proben R, S oder T beschickt (in jedes Näpfchen nur eine Probe!)
2.) In jedes Näpfchen sind 2 Tropfen aus Fläschchen 1 (enzymkonjugierter Antikörper) zuzugeben
3.) Erste Inkubation: 60 min bei Raumtemperatur 4.) Die Flüssigkeit wird in die Abfallbehälter dekantiert
5.) Die Näpfchen werden auf saugfähigem Papier ausgeklopft und mit dest. H2O aufgefüllt (Plastepipette, Spitze darf nicht in Flüssigkeit des Näpfchens
eintauchen)
6.) Die Waschschritte 4.) und 5.) werden insgesamt 5 x durchgeführt
7.) Aus Fläschchen 2 (Substrat / Chromogen) werden jeweils 2 Tropfen zugefügt.
8.) Zweite Inkubation: 10 min bei Raumtemperatur.
9.) Die Intensität der Farbumschläge in den 3 Näpfchen ist visuell auszuwerten. Eine starke Farbintensität spricht für einen positiven Rotavirusnachweis. Schwache Reaktionen sind als grenzwertig einzuschätzen und müssen durch wiederholte Materialeinsendungen kontrolliert werden. Fertigen Sie über Ihre
Untersuchungen ein Protokoll mit Ihrer Einschätzung der Ergebnisse an.
Orthomyxoviridae
Influenzaviren und die Vertreter der Ortho- bzw. Paramyxoviridae besitzen in ihrer Hülle Hämagglutinine. Diese können in der Zellkultur durch den Hämadsorptionstest oder wie bei Influenza A-Viren nach der Anzucht in Hühnerembryonen durch die
Hämagglutination nachgewiesen werden. Zur Influenza A-Anzucht werden neuntägige Hühnerembryonen mit dem Untersuchungsmaterial beimpft. Nach einer weiteren Bebrütung von 6 bis 7 Tagen wird Flüssigkeit aus der Chorioallantoishöhle gewonnen und die Anwesenheit von Influenza A-Viren mit der Hämagglutination geprüft.
Aufgabe 38: Hämagglutinationstest zum Nachweis von Influenza A-Viren Material
- Probe U, Probe V: Chorioallantoisflüssigkeit aus beimpften Bruteiern - 1,5%ige Suspension humaner Erythrozyten
- Transferpipetten mit 25µl-Eichung - Reaktionskarten
Durchführung
1.) Pro Reaktionsfeld werden je 50 µl (2 Tropfen) Erythrozytensuspension aufgetropft 2.) 50 µl (2 Tropfen) Probe U und Probe V werden
(getrennt für beide Reaktionsfelder) zugefügt und mit den Erythrozyten vermischt 3.) Die Reaktionskarten werden mindestens 5 min geschwenkt
4.) Der Reaktionsausfall (Agglutination) wird visuell beurteilt und protokolliert
Aufgabe 39: Zytopathischer Effekt von Cytomegalie-Virus in permanenten und primären Zellkulturen
Es liegen Mikrotiterplatten mit (fixierten) permanenten und primären Zellkulturen aus, die entweder unbehandelt oder mit Adenoviren (permanente Zellkultur) bzw.
Cytomegalieviren (primäre Zellkultur) infiziert wurden. Betrachten Sie diese unter der schwächsten mikroskopischen Vergrößerung und fertigen Sie jeweils eine Zeichnung an.
Demonstration
• Fluoreszenzmikroskopische Präparate (direkter IFT) zum Nachweis von
virusinfizierten Zellen bei Infektionen mit Cytomegalieviren, Herpes-simplex-Viren, Adenoviren und Parainfluenzaviren
• Virusanzucht im Brutei (siehe S. 56)