Medizinische Fakultät. der Universität Duisburg-Essen. Aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie

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Medizinische Fakultät Universität Duisburg-Essen der

Aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie

Prävalenz und Charakterisierung Azol-resistenter Aspergillus fumigatus-Isolate bei Mukoviszidose-PatientInnen

I n a u g u r a l - D i s s e r t a t i o n zur

Erlangung des Doktorgrades der Medizin durch die Medizinische Fakultät

der Universität Duisburg-Essen

Vorgelegt von Raphael Stauf, geb. Seufert

aus Recklinghausen

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Dekan: Herr Univ.-Prof. Dr. med. J. Buer

1. Gutachter: Herr Univ.-Prof. Dr. med. J. H. Steinmann 2. Gutachter: Herr Priv.-Doz. Dr. rer. nat. D. Brockmann 3. Gutachter: Frau Univ.-Prof. Dr. rer. nat. K. A. Becker-Flegler

Tag der mündlichen Prüfung: 27. April 2021

Diese Dissertation wird via DuEPublico, dem Dokumenten- und Publikationsserver der Universität Duisburg-Essen, zur Verfügung gestellt und liegt auch als Print-Version vor.

DOI:

URN:

10.17185/duepublico/74457

urn:nbn:de:hbz:464-20210702-072805-2

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Ein Teil der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit wurde im Rahmen der Tagung der European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID) vom 22.04.

–25.04.2017 in Wien und der 51. Jahrestagung der Deutschsprachigen Mykologischen Gesellschaft (DMykG) vom 31.08.–02.09.2017 in Münster vorgestellt.

Ergebnisse dieser Arbeit wurden im Journal of Antimicrobial Chemotherapy im März 2018 veröffentlicht:

Seufert R., Sedlacek L., Kahl B., Hogardt M., Hamprecht A., Haase G., Gunzer F., Haas A., Grauling-Halama S., MacKenzie C. R., Essig A., Stehling F., Sutharsan S., Dittmer S., Killengray D., Schmidt D., Eskandarian N., Steinmann E., Buer J., Hagen F., Meis J. F., Rath P.-M., Steinmann J. (2018)

Prevalence and characterization of azole-resistant Aspergillus fumigatus in patients with cystic fibrosis: a prospective multicentre study in Germany

J Antimicrob Chemother, 2018 Aug 1;73(8):2047-2053

(4)

Meinen Eltern und meiner Frau

–

Felix, qui potuit rerum cognoscere causas

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Inhaltsverzeichnis

INHALTSVERZEICHNIS ... 5

1 EINLEITUNG ... 7

1.1. A^LLGEMEINEE^INFÜHRUNG ... 7

1.2. ZYSTISCHE FIBROSE ... 7

1.3. POLYMIKROBIELLES ERREGERSPEKTRUM BEI ZYSTISCHER FIBROSE ... 10

1.4. ASPERGILLUS FUMIGATUS BEI ZYSTISCHER FIBROSE ... 13

1.5. KLINISCH GENUTZTE THERAPEUTIKA ... 15

1.5.1. Triazole ... 15

1.5.2. Andere Therapeutika ... 17

1.6. A^ZOL-RESISTENZ BEI ASPERGILLUS FUMIGATUS SENSU STRICTO (ARAF) ... 17

1.6.1. Epidemiologie der Azol-Resistenz ... 17

1.6.2. Epidemiologie der Azol-Resistenz bei Zystische Fibrose-PatientInnen ... 18

1.7. RESISTENZENTWICKLUNGSHYPOTHESEN ... 18

1.7.1. Umwelthypothese ... 18

1.7.2. Klinikhypothese ... 18

1.8. MOLEKULARE MECHANISMEN DER AZOL-RESISTENZ BEI A. FUMIGATUS ... 19

1.8.1. cyp51A-Mutation ... 19

1.8.2. Andere bekannte Mutationen ... 20

2 FRAGESTELLUNG UND ZIELSETZUNG ... 20

3 MATERIAL UND METHODEN ... 22

3.1. MATERIAL ... 22

3.1.1. Reagenzien und Antimykotika ... 22

3.1.2. Verbrauchsmaterialien ... 23

3.1.3. Nährmedien ... 26

3.1.4. Geräte und Pipettierhilfen ... 27

3.3. M^ETHODEN ... 30

3.3.1. Überblick ... 30

3.3.2. Erstkultivierung und Screening auf Azol-Resistenz ... 31

3.3.3. Identifikation von Aspergillus fumigatus sensu stricto ... 32

3.3.4. Itraconazol-Agar Screening ... 33

3.3.5. Kryokulturen der Pilzisolate ... 34

3.3.6. Standardisierte Mikrobouillondilution ... 34

3.3.7. DNA-Extraktion ... 38

3.3.8. DNA-Amplifikation mittels Polymerase-Kettenreaktion ... 38

3.3.9. Quantitative Real-Time-PCR ... 39

3.3.10. TR34 – Real-Time-PCR ... 40

3.3.11. cyp51A-Sequenzierung und Auswertung ... 42

3.3.13. Mikrosatelliten-PCR zur Genotypisierung ... 44

3.3.15. Erstellung der phylogenetischen Bäume ... 51

3.3.16. Klinische Datenauswertung und statistische Analyse ... 52

3.3.17. Ethik-Votum ... 52

5 ERGEBNISSE ... 53

5.1. EPIDEMIOLOGIE ... 53

5.1.1. Prävalenz von ARAF in Deutschland ... 53

5.1.2. Alters- und Geschlechtsverteilung (ARAF vs. Non-ARAF) ... 54

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5.2.1. Resistenztestungen aller ARAF-Isolate und MHK-Verteilung ... 55

5.3. GENOTYPISIERUNG ... 59

5.3.1. Verwandtschaftsverhältnisse der Isolate ... 59

5.3.2. Übereinstimmung von Genotypen ... 63

5.3.3. Phylogenie und graphische Darstellung: Minimum Spanning Tree und hierarchisches Clustering ... 64

5.4. CYP51A-MUTATIONEN ... 67

5.4.1. TR34/L98H-Mutation des cyp51A-Gens ... 67

5.4.2. Mutationen des cyp51A-Gens bei nicht TR34/L98H-Mutanten ... 67

5.4.3. Q166S-Mutation und non-cyp51A-Mutante ... 68

7 DISKUSSION ... 69

7.1. RELEVANZ DIESER ARBEIT ... 69

7.2. VARIIERENDE PRÄVALENZ VON ARAF IN DEUTSCHLAND ... 69

7.3. STATISTISCHE ALTERSVERTEILUNG DER PATIENTENKOHORTEN UND RISIKOFAKTOREN FÜR DIE BESIEDLUNG MIT ARAF ... 70

7.4. DIVERSITÄT DER GENOTYPEN GETESTETER A. FUMIGATUS-ISOLATE ... 70

7.4.1. Simpson-Index ... 72

7.4.2. Unterschiedliche Möglichkeiten der phylogenetischen Analyse ... 72

7.5. C^YP51A-MUTATIONEN IM V^ERGLEICH ... 73

7.6. BEDEUTUNGEN DER RESISTENZGENOTYPEN FÜR ARAF-ENTSTEHUNGSHYPOTHESEN UND AGRIKULTURELLE NUTZUNG VON T^RIAZOLEN ... 74

7.7. NICHT ERKANNTE RESISTENTE ISOLATE ... 75

7.7.1. Alternative Testmethoden ... 75

7.8. THERAPIEMÖGLICHKEITEN UND EINFLUSS DER RESISTENZ AUF DEN THERAPEUTISCHEN ERFOLG ... 76

7.9. AUSBLICK VORHANDENER UND NEUER THERAPEUTIKA ... 76

7.9.1. Klinisch genutzte Triazole und Kreuzresistenzen ... 76

7.10. S^CREENING-EMPFEHLUNGEN,ERFASSUNG DER LOKALEN PRÄVALENZ UND THERAPEUTISCHE KONSEQUENZ FÜR P^ATIENTI^{NNEN MIT}ARAF-N^ACHWEIS ... 78

8 ZUSAMMENFASSUNG ... 80

10 LITERATURVERZEICHNIS ... 81

11 ANHANG ... 92

11.1. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ... 92

11.2. ABBILDUNGSVERZEICHNIS ... 94

11.3. TABELLENVERZEICHNIS ... 95

12 DANKSAGUNG ... 96

13 LEBENSLAUF ... 97

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1 Einleitung

1.1. Allgemeine Einführung

Geschätzte 1,2 Milliarden Menschen der Welt leiden nach aktuellen Daten an einer Pilzerkrankung. Ungefähr 2 Millionen der tödlich verlaufenden Infektionen werden von vier Gattungen verursacht: Aspergillus, Candida, Cryptococcus und Pneumocystis (Denning et al., 2015). Obwohl die Bedeutung von Pilzen als Erreger opportunistischer Infektionen in den letzten Jahrzehnten durch eine gestiegene Zahl von Transplantationen und längeres Überleben immunsupprimierter PatientInnen durch neue Therapeutika deutlich zugenommen hat, steht die pathophysiologische Forschung in diesem Bereich hinter anderen Krankheitserregern zurück (Brown et al., 2012). Besonders immunsupprimierte PatientInnen sind bedroht durch Infektionen mit Pilzen. Eine hereditäre Erkrankung, die besonders für solche Infektionen prädisponiert, ist die Mukoviszidose respektive Zystische Fibrose.

Diese Arbeit setzt sich im Besonderen mit der bisher unbekannten Auftretenshäufigkeit einer Besiedelung mit Stämmen von Aspergillus fumigatus sensu stricto auseinander, die gegen die gebräuchlichen Azol-Antimykotika eine Resistenz aufweisen.

1.2. Zystische Fibrose

Die Zystische Fibrose oder Mukoviszidose (im Englischen Cystic Fibrosis, CF) stellt eine der häufigsten autosomal-rezessiv vererbten Erkrankungen der hellhäutigen europäischen Bevölkerung mit einer Prävalenz von 1 von 2500 Neugeborenen dar. Die Zahl der Genträger in der entsprechenden Bevölkerungsgruppe wird auf 1:20 bis 1:30 geschätzt (Dockter et al., 2000). PatientInnen mit dieser Erkrankung haben derzeit eine mittlere Lebenserwartung von knapp über 40 Jahren (Marshall et al., 2018).

Ursächlich sind eine oder mehrere Alterationen im codierenden Genabschnitt des Chloridionen-Kanals Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) (Ratjen et al., 2003). Von den bislang über 1600 entdeckten Mutationen (Lynch et al., 2013) ist die häufigste in Mittel- und Nordeuropa die Deletion von 3 Basenpaaren an Position 508 des Gens (ΔF508-cftr), das auf Chromosom 7 liegt. Die bekannten Mutationen werden in ihren Auswirkungen in sechs Klassen unterteilt, wobei die Gruppen I–III schwere klinische Erscheinungen vorweisen und Fehler der Gruppen IV–VI eher zu milden Symptomen führen, da der CFTR eine Restaktivität aufweist. Tabelle 1 gibt hier einen Überblick nach (Rafeeq et al., 2017). Die Deletion an Position 508 führt zum Nichteinbau der Aminosäure

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bedingt ein Fehlen des Proteins an der Zelloberfläche. Bei geringer Restmenge des Proteins an der Zelloberfläche bedingt die Mutation durch ihre Stellung an der Nucleotide binding domain 1 eine verringerte Leitfähigkeit, da diese die Aktivität des Kanals reguliert (Welsh et al., 1993). Da der Kanal den Chloridionentransport entscheidend reguliert, wird in den exokrinen Schweißdrüsen Natriumchlorid nicht anhand des entsprechenden Konzentrationsgradienten rückresorbiert, da die Zellmembran ohne Kanalaktivität nicht für Chloridionen durchlässig ist. Die Erkrankung kann daher anhand des Pilocarpin- Iontophroese-Schweißtests nach Gibson und Cooke diagnostiziert werden, der hohe Chloridwerte über 60 mmol/l im Schweiß der PatientInnen nachweist. Sollte dieser grenzwertig oder positiv ausfallen, wird eine CFTR-Genetik aus Patientenserum durchgeführt (Naehrlich et al., 2013).

In anderen Organen produzieren die exokrinen Drüsen des Körpers ein visköses Sekret, welches diese obstruiert und zu persistierenden Entzündungen führt. Die Krankheit zeigt daher klinisch ein syndromales Erscheinungsbild, das je nach Art der Mutation verschiedene Schweregrade aufweist. Die phänotypischen Erscheinungen werden in drei Kategorien zusammengefasst. Kategorie A gehört obligat zum Erkrankungsbild und beinhaltet erhöhte Elektrolytkonzentrationen im Schweiß sowie Infertilität bei Patienten männlichen Geschlechts. Kategorie B (konkordant) bezeichnet den Grad der Pankreasinsuffizienz (PI), der mit homozygoten Trägern der Mutationen der Gruppen I–III einhergeht. PatientInnen mit Mutationen der Gruppe IV und V weisen eine suffiziente Pankreasfunktion auf. In der Kategorie C (variabel) werden Diabetes mellitus, pulmonaler sowie hepatobiliärer Befall zusammengefasst, die unterschiedlich stark ausgeprägt sein können. Zu den betroffenen Organen, die entscheidend Morbidität und Mortalität der CF bedingen, zählen heutzutage besonders die Atemwege, deren submukosale Drüsen eine hohe Expression des CFTR-Kanals aufweisen.

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Tabelle 1: Fehlerklassifikation und Auswirkungen nach Rafeeq et al. (2017)

Mutationsart Defekt Ergebnis Häufigste

Mutationen

I Proteinproduktion

Komplettes Fehlen des CFTR- Proteins aufgrund von Missense-

Mutationen und vorzeitigem mRNA-Abbruch

G542X, W1282X,

R553X, 621+G>T

II Proteinprozessierung Fehlerhafte posttranslationale Modifikationen führen zum Nichteinbau in die Zellmembran

F508del, N1303K, A455E

III Proteinregulation

Verringerte Kanalaktivität in Reaktion auf ATP-Aktivierung

durch veränderte Bindungsregionen

G551D

IV Proteindurchlässigkeit Kanalöffnungszeit und -frequenz

vermindert R117H

V

Verminderte Menge an funktionellem

CFTR

Stabilität der mRNA oder des

Proteins beeinträchtigt A455E VI Normale Menge an

funktionellem CFTR Verstärkter Umsatz durch c-

terminale Veränderungen Q1412X Pathophysiologisch erfolgt bei einer CFTR-Defizienz eine verminderte Chloridionen- sowie Bicarbonatsekretion. Dies führt zu einer gesteigerten Natriumresorption über den epithelialen Natriumkanal ENaC und einem konsekutiven Einstrom von H2O und Cl^- in die Epithelzellen und das Interstitium. Dadurch trocknet der Schleimfilm des perizilliären Raums der Atemwege aus und behindert die mukoziliäre Clearance. Dadurch werden die Atemwege obstruiert und Erreger schlechter aus den tiefen Atemwegen abtransportiert. Es bildet sich eine polymikrobielle Besiedlung aus, die infolge frustraner angeborener Immunabwehr Gewebeschäden auslöst. Diese äußern sich in Bronchiektasen, reaktiver Wandverdickung und rezidivierenden Atemwegsinfekten (Boucher, 2007). An zweiter Stelle ist besonders das Pankreas oft von einer Insuffizienz betroffen, die sich ebenfalls aus der Gangobstruktion und folgender chronisch-obstruktiver Pankreatitis herleitet. Als Folge stehen hier Gedeihstörung durch Maldigestion sowie Diabetes mellitus im Vordergrund, die vor allem im Säuglings- und Kindesalter zur Diagnosestellung führen können.

Seit 2015 ist daher in Deutschland ein etabliertes Screening aller Neugeborenen in den Leistungskatalog der gesetzlichen Krankenkassen durch den Gemeinsamen Bundesausschuss integriert (Gemeinsamer Bundesausschuss, 2015). Das Screening beruht

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Zu Beginn steht der sogenannte IRT-Test (= Immunreaktives Trypsinogen), der eine Vorstufe des Pankreasenzyms Trypsin detektiert. Übersteigen die Werte im Blut den Grenzwert von 60 ng/ml (99,0. Perzentile), spricht dies für eine Pankreasgangobstruktion durch visköses Sekret. Wird bei einer zweiten Messung ein Wert über der 99,9. Perzentile gemessen, gilt die Diagnose im Protokoll des G-BA als bestätigt. Ansonsten erfolgt die Messung des Pankreas-assoziierten Proteins (PAP), für das ebenfalls erhöhte Werte ≥ 1,6µg/l als positiv gelten. Als letzte Stufe wird die Erkrankung dann anhand der oben genannten genetischen Analyse von 31 Mutationen im CFTR-Gen bestätigt, wobei einige Autoren die DNA-Analytik für obligat halten (Sommerburg et al., 2017). Auf andere, seltenere Manifestationsorte soll hier nicht näher eingegangen werden. Eine Übersicht findet sich in Tabelle 2.

Tabelle 2: Organmanifestationen der Zystischen Fibrose nach Dockter et al. (2000)

Manifestationsort Ausprägung

Lunge Retention von Mukus, chronische Infektionen, verminderte Lungenfunktion, allergische Reaktionen

Pankreas Fehlende Ableitung des Sekretes, Selbstverdau, chronische Pankreatitis

Hoden Fertilitätsstörungen

Leber Hepatische Dekompensation, Varizenblutung

1.3. Polymikrobielles Erregerspektrum bei Zystischer Fibrose

PatientInnen mit CF sind meist in den oberen und tiefen Atemwegen mit einem polymikrobiellen Erregerspektrum besiedelt. Diese Besiedlung wird vor allem durch eine chronische Entzündung des Gewebes sowie krankheitsbedingte Schleimaggregate in den bronchiektatischen Atemwegen begünstigt (Stoltz et al., 2015). Die isolierten bakteriellen Pathogene mit der höchsten Prävalenz sind in Tabelle 3 aufgeführt.

Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenzae und Staphylococcus aureus sind hierbei die häufigsten isolierten prokaryotischen Erreger. Dabei ist auffällig, dass die Prävalenz von Pseudomonas aeruginosa von 1991 bis 2017 stetig abnimmt, während Nachweise von Staphylococcus aureus zunehmen (Marshall et al., 2018). Als Problemkeime aufgrund ihrer Resistenz gegenüber Antibiotika werden Burkholderia cepacia complex sowie Stenotrophomonas maltophilia und methicillin-resistenter Staphylococcus aureus (MRSA) angesehen. Zu beachten ist allerdings, dass aktuelle Mikrobiomdaten, die auf molekularbiologischen Nachweisen beruhen, ein deutlich breiteres Spektrum an

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Pilze spielen eine zunehmende Rolle im Mikrobiom von CF-PatientInnen und stehen immer häufiger im Fokus als fakultative Pathogene (Abbildung 1 nach Chmiel et al., 2014).

Dies beruht neben den prädisponierenden Atemwegspathologien wahrscheinlich auch zum Teil auf der prophylaktischen und häufigeren therapeutischen Gabe von Antibiotika (Ziesing et al., 2016). Hefepilze sind folglich ein häufiger Kolonisationskeim der Atemwege von CF-PatientInnen. Candida spp., dabei hauptsächlich Candida albicans, können mit einer Häufigkeit von ca. 75% nachgewiesen werden (Ziesing et al., 2016).

Aspergillus fumigatus sensu stricto ist bei weitem der häufigste isolierte Fadenpilz bei Zystische Fibrose-PatientInnen mit Nachweisraten schwankend von 6% bis 60% (Lipuma, 2010). Der Erstnachweis von A. fumigatus gelingt meist in einem Alter von durchschnittlich 12,3 bis 14,1 Jahren und nach erfolgten bakteriellen Infektionen, Kleinkinder sind selten betroffen (Pihet et al., 2009). Bei 17% der PatientInnen ist über viele Jahre hinweg derselbe Genotyp wiederholt zu isolieren (de Valk et al., 2009). Bereits Rath et al. (1997) konnten an Isolaten von sechs PatientInnen gleiche Genotypen teils über den gesamten Beobachtungszeitraum von elf Monaten nachweisen.

Mit sehr unterschiedlichen Nachweisraten von 3,7% (Ziesing et al., 2016) bis 14% (Lipuma, 2010) werden Scedosporium spp. isoliert. Spezies wie Exophiala dermatitidis und Rasamsonia argillacea können mit Nachweisraten von 0,2% bis 1,2% noch seltener kulturell isoliert werden. Abbildung 1 zeigt nach eine nach Chmiel et al. (2014) sowie Ziesing et al. (2016) modifizierte graphische Darstellung der Häufigkeit der Isolierung, pathogenen Relevanz und Dauerhaftigkeit der Besiedlung. Beispielsweise besteht die Gefahr der Unterdiagnose für Sceodosporium spp. aufgrund der schwierigen mikrobiologischen Anzucht.

Infolgedessen kann es durch die klinisch-radiologisch ähnlichen Veränderungen wie bei einer Infektion mit Aspergillus spp. zu einer unwirksamen Fehltherapie mit Amphotericin B kommen. Scedosporium spp. sind gegen dieses Pharmazeutikum resistent und können so zu schwerwiegenden klinischen Bildern führen, die nicht gezielt therapiert werden (Chmiel et al. 2014). Daher ist eine frühzeitige adäquate mykologische Diagnostik für vulnerable Patientenklientel imperativ.

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Tabelle 3: Mikrobielles Spektrum bei Zystischer Fibrose in 2017 (Kulturpositivität) nach Marshall et al. (2018)

Kulturpositivität für bakterielle Erreger bei CF-PatientInnen in 2017 in den USA

Bakterium

Patientenanteil mit Infektion

(in %)

Mittleres Alter bei Erstinfektion

(in Jahren)

Besondere Eigenschaften bei CF

Pseudomonas

aeruginosa 44,6 5,2

• Führender Erreger bei Atemwegsinfektionen • Assoziiert mit Abnahme der Lungenfunktion • 17,9% der Stämme sind multiresistent

gegenüber Antibiotika Burkholderia

cepacia complex 2,4 19,4

• Kann zu schneller Abnahme der Lungenfunktion • Multiresistent gegenüber

Antibiotika

MRSA 25,2 11,1

• Vorkommen bei CF- PatientInnen und der Allgemeinbevölkerung • Multiresistet gegenüber Antibiotika • Health care- und

community-assoziierte Stämme

Stenotrophomonas

maltophilia 12,6 9,4

• In Wasser, Erde, auf Pflanzen, Tieren und in der Krankenhausumgebung zu finden • Oft multiresistent gegenüber Antibiotika (im Besonderen Carbapeneme) Achromobacter

xylosoxidans 5,8 13,8

• Feuchtkeim (Erde, Wasser) • Oft multiresistent gegenüber

Antibiotika

Nicht-tuberkulöse

Mykobakterien 12,6 20,7

• Zu finden in Wasser und Erde  • Vereinzelte Berichte über interindividuelle Verbreitung • Behandlung ist langwierig und

oft schlecht toleriert

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Abbildung 1: Spektrum der isolierten Pilzspezies und die zugehörige pathogene Relevanz, vereinfacht nach Chmiel et al. (2014) Legende: A. = Aspergillus; C. = Candida; E. = Emericella; L. = Lomentospora; N. = Neosartorya;

R. = Rasamsonia; S. = Scedosporium. Relevantere Spezies sind durch Schriftgröße, Fettdruck und Einfärbung hervorgehoben.

1.4. Aspergillus fumigatus bei Zystischer Fibrose

A. fumigatus ist ein sporenbildender, saprophytischer Fadenpilz der Gattung Aspergillus der Familie Trichocomaceae der Klasse Eurotiomycetes. Der Organismus ist durch meist grüne, selten pigmentlose, stachelig konfigurierte Konidien mit einem Durchmesser von 2–3 µm charakterisiert, die von 6–8 µm mal 2–3 µm messenden Phialiden produziert werden. Seine aerogenen Konidien sind klein genug, um in die Alveolen der Lunge zu gelangen. Daher gilt A. fumigatus als wichtiger Erreger opportunistischer Infektionen der tiefen Atemwege.

Als thermophile Spezies wächst A. fumigatus bei bis zu 55°C und überlebt bei Temperaturen von bis zu 70°C (Latge, 1999).

A. fumigatus kann bei Zystischer Fibrose Auslöser von insbesondere assoziiertem Asthma, Aspergillus-Bronchitis oder Aspergillomen sein. Invasive Aspergillosen betreffen vor allem immunologisch kompromittierte PatientInnen. Dies umfasst im speziellen lungentransplantierte und stammzelltransplantierte PatientInnen mit hämatologischen Erkrankungsbildern (Pihet et al., 2009).

Die Allergische bronchopulmonale Aspergillose (ABPA) steht im Gegensatz zur Manifestation des Aspergilloms fast ausschließlich bei Zystische Fibrose- und Asthma- PatientInnen im Vordergrund und tritt bei CF-PatientInnen mit einer Prävalenz von bis zu 15% auf (Kousha et al., 2011). Die Kriterien zur Diagnostik wurden seit der Erstbeschreibung 1952 von Hinson et al. mehrfach überarbeitet und sind noch immer

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als ein komplexes Syndrom aus klinischen Beschwerden, Auffälligkeiten in der radiographischen Abbildung sowie laborchemischen Veränderungen in der Serologie.

Ätiopathogenetisch spielten Typ-I und Typ-III Reaktionen mit Bildungen von IgE, IgG und IgA-Antikörpern gegenüber Allergenen verschiedener Aspergillus spp. die größte Rolle.

Dabei sind korrespondierend die lokale Entzündungsreaktion fördernde Interleukine durch spezifisch aktivierte CD4⁺ TH2-Zellen erhöht (Huttegger et al., 2006). In Tabelle 4 sind die Minimal-Kriterien zur Diagnose der ABPA nach Knutsen et al. von 2012 im Journal of Allergy and Clinical Immunology aufgelistet, um einen Überblick über den derzeitigen Konsens abzubilden. Trotz dieser Bemühungen ist allerdings der klinische Befund meist schwer von infektiösen Exazerbationen der Zystischen Fibrose zu unterscheiden. Dieser Unterschied spielt in der Behandlung jedoch eine entscheidende Rolle (Chmiel et al., 2014).

Bei Kindern werden in den meisten Fällen die Nelson-Kriterien zur Diagnostik der ABPA angewandt (Nelson et al., 1979).

Tabelle 4: Minimal-Diagnosekriterien der ABPA nach Stevens et al. (2003)

Asthma oder bei Zystischer Fibrose: abnehmende Lungenfunktion (Husten, Giemen, verschlechterte Lungenfunktionsparameter)

Sofortige Hautreaktion gegenüber Aspergillus species Totales Serum IgE ≥ 1000 ng/ml (417 IU/ml)

Erhöhte Aspergillus spp.-spezifisches IgE und IgG Antikörper Neue Veränderungen im Röntgen-Thorax und / oder CT Zusatzkriterien für die klassische ABPA:

Bluteosinophilie; Aspergillus spp. präzipitierende Antikörper; zentrale Bronchiektasen im Thorax-CT; Aspergillus spp. enthaltende Schleimaggregate

Ein Staging der Erkrankung wurde nur bei PatientInnen mit Asthma bronchiale vorgeschlagen (Patterson et al. 1982). PatientInnen mit Mutationen im CFTR-Gen haben auch bei lediglich heterozygoter Ausprägung ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung einer ABPA, selbst wenn sie keine klinische Symptomatik der Zystischen Fibrose entwickeln (Miller et al., 1996).

Die meisten PatientInnen mit diagnostizierter ABPA benötigen in der akuten Erkrankungs- phase eine Therapie mit systemischen Kortikosteroiden. Ziel einer Behandlung ist die Verhinderung einer konsekutiven Lungenfibrose und Verringerung der Lungenfunktion.

Grundsätzlich werden dafür eine Verringerung der Last mit A. fumigatus sowie eine Stabilisierung der Immunantwort und Entzündung angestrebt. Es werden initial 2mg/kg/Tag Prednisonäquivalente für ein bis zwei Wochen empfohlen (Stevens et al.,

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2003). Die Therapiedauer ist sehr variabel und liegt in der Regel je nach Schwere der ABPA bei drei bis neun Monaten und soll sich am klinischen Verlauf orientieren.

Bei PatientInnen, die schlecht auf Kortikosteroide ansprechen oder Kortikoid-assoziierte Nebenwirkungen zeigen, sollte eine Azoltherapie erwogen werden. Dadurch wird die Entzündungsantwort durch die Reduktion der A.fumigatus-Last in den Atemwegen abgeschwächt und eine klinische Verbesserung erreicht, obwohl Itraconazol keine antiinflammatorische oder immunmodulatorische Wirkung besitzt (Wark et al., 2003). Bei Verwendung von Itraconazol liegt die übliche Dosis bei 5 mg/kg/Tag für drei bis sechs Monate, kombiniert mit Serumspiegelkontrollen.

Neuere Therapieansätze beinhalten auch monoklonale Antikörper. Omalizumab zeigt als anti-IgE-Antikörper zur Verhinderung von Exazerbationen und Einsparung von Kortikosteroiden gutes klinisches Ansprechen sowie deutliche Reduktion des Aspergillus- spezifischen Serum-IgE (Tillie-Leblond et al., 2011; Voskamp et al., 2015). Trotzdem wird aufgrund der geringen Evidenz der Effektivität und Sicherheit durch fehlende groß angelegte randomisierte kontrollierte Studien keine generelle Empfehlung durch die Cochrane Library vergeben (Jat et al., 2018). Ein 2018 erschienener Fallbericht zeigte ebenfalls ein positives klinisches Ergebnis unter Therapie mit Mepolizumab, einem anti-IL- 5-Antikörper (Terashima et al., 2018). Zusätzlich können zur Verbesserung der klinischen Asthmasymptomatik Bronchodilatatoren infrage kommen.

1.5. Klinisch genutzte Therapeutika 1.5.1. Triazole

Die Gruppe der Triazolmykotika umfasst derzeit vier klinisch gebräuchliche Therapeutika.

Gemeinsamer Strukturbestandteil ist entweder ein Imidazol- oder Triazolring mit komplexen Seitenketten, die mindestens eine halogenierte Phenylgruppe enthalten. Ihr fungistatischer Wirkmechanismus beruht auf der Hemmung der Cytochrom P450 14-α- Lanosterol-Demythelase, die zur verminderten Synthese und schließlich dem verminderten Einbau von Ergosterol in die fungale Zellmembran führt. Zusätzlich wirkt die konsekutive Akkumulation von Lanosterol als Edukt der Reaktion zu Ergosterol im Zytoplasma zytotoxisch (Yoshida, 1988). Der Abbau aller Azole erfolgt über Cytochrom- P450-Oxidasen 3A4 sowie zusätzlich 3A5 für Isavuconazol (Townsend et al., 2017).

Fluconazol ist als einziges klinisch genutztes Antimykotikum aus der Azolgruppe nicht gegen A. fumigatus wirksam.

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Azole sind trotz guter Toleranz vor allem bei prolongierter Gabe mit einer hohen Rate an unerwünschten Arzneimittelwirkungen assoziiert. Dazu zählen besonders gastro- intestinale, hepatotoxische und, bei gleichzeitiger systemischer oder inhalativer Gabe von Steroiden, endokrine Nebenwirkungen (Burgel et al., 2016).

Abbildung 2: Schema der Hemmung der Lanosterol-Demethylase (CYP51A), einem Schlüsselenzym der Zellwandsynthese u.a. bei A. fumigatus

Verschiedene Wirkstoffe gehören zur Gruppe der medizinisch genutzten Azole:

Itraconazol ist ein 1980 erstmals unter dem Namen Sempera^Ò patentiertes Antimykotikum aus der Gruppe der Triazole mit struktureller Ähnlichkeit zu Fluconazol bzw. Ketoconazol, das im Gegensatz zu diesen Substanzen eine Wirksamkeit gegen Aspergillus-Arten aufweist. Das Therapeutikum lässt sich sowohl oral als auch lokal applizieren. Derzeit ist es in Deutschland als Therapeutikum kaum mehr in Benutzung.

Voriconazol wird als gleich gut verträgliches und gleich wirkstarkes sowie teils überlegenes Antimykotikum im Vergleich zu Itraconazol in der Wirkstoffklasse der Triazole angesehen. Eine orale Applikation des Präparates ist möglich. Heute wird Voriconazol bevorzugt in der Erstlinientherapihe invasiver Aspergillosen genutzt (Ullmann et al., 2018).

Posaconazol ist ein vorwiegend zur Prophylaxe von invasiven Pilzinfektionen genutztes Azol, welches aufgrund seiner guten Verträglichkeit als orale Dauertherapie gerade bei PatientInnen mit ABPA oder nach Stammzelltransplantation zum Einsatz kommt (Maertens et al., 2018).

Isavuconazol wurde als neues Azol im Jahre 2014 von Basilea Pharmaceutica (Basel, Schweiz) unter dem Namen Cresemba^Ò als gleich wirkstarkes Antimykotikum wie Voriconazol nach einer Nichtunterlegenheitsstudie (NUS) eingeführt. Als Vorteile werden eine geringere Häufigkeit unerwünschter Arzneimittelwirkungen sowie eine längere

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Halbwertszeit beschrieben, sodass Isavuconazol potentiell auf eine einmal tägliche Gabe ohne therapeutisches Dosismonitoring beschränkt werden kann (Maertens et al., 2016).

1.5.2. Andere Therapeutika

Zwei andere humanmedizinisch relevante Wirkstoffgruppen sind Echinocandine und Polyene. Echinocandine wirken über die Inhibition der Synthese von 1-3-b-D-Glucan, einem integralen Bestandteil vieler Pilzmembranen und beeinträchtigen so deren Integrität (Denning, 2003; Morris et al., 2006).

Der Wirkmechanismus der Polyene ist nicht vollständig aufgeklärt, beruht aber vermutlich auf der Bindung an Sterole und der folgenden Minderintegration in die fungale Zellmembran.

Weiterführende Abwägungen zu den Therapieoptionen bei Infektionen mit Azol- resistenem Aspergillus fumigatus (ARAF) werden in der Diskussion dieser Arbeit erläutert.

1.6. Azol-Resistenz bei Aspergillus fumigatus sensu stricto (ARAF)

Eine Azol-Resistenz bei A. fumigatus besteht, wenn ein getesteter Pilzstamm gegenüber mindestens einem klinisch genutzten Triazol als resistent getestet wird. Die Bewertung richtet sich hierbei in den meisten Ländern nach der klinischen Grenzwerttabelle des Europäischen Kommitees für antimikrobielle Sensibilitätstestung (EUCAST). Diese berücksichtigt zusätzlich zu in vitro Empfindlichkeit die klinisch erreichbaren Konzentrationen der entsprechenden Therapeutika.

1.6.1. Epidemiologie der Azol-Resistenz

Als ubiquitär verbreiteter filamentöser Pilz in der Umwelt ist A. fumigatus einer der häufigsten Erreger invasiver Pilzinfektionen, die vorwiegend mit Azoltherapeutika behandelt werden (Ullmann et al., 2018). Auch Azol-Resistenzen konnten weltweit identifiziert werden (Verweij et al., 2016). Eine Beobachtungsstudie zeigte in einer Sammlung von 1789 Isolaten aus 63 Zentren im Zeitraum von 2001-2009 weltweit eine Prävalenz von 5,8% (Pfaller et al., 2011). Retrospektive Arbeiten aus den Niederlanden haben gezeigt, dass erste Isolate schon 1998 aufgefunden werden konnten (Snelders et al., 2008). In Deutschland wurden Azol-resistente Stämme von Aspergillus fumigatus sensu stricto erstmals im Jahr 2012 beschrieben (Hamprecht et al., 2012; Rath et al., 2012).

Eventuell stellt die 2009 entdeckte sexuelle Vermehrungsform einen Grund für das vermehrte Auftreten von Ausweichmechanismen gegenüber einer Azoltherapie durch A.

(18)

1.6.2. Epidemiologie der Azol-Resistenz bei Zystische Fibrose-PatientInnen

Bis zum Zeitpunkt der Untersuchung in dieser Arbeit hat es noch keine multizentrische Arbeit zur Prävalenz von ARAF bei deutschen Mukoviszidose-PatientInnen gegeben.

Lediglich einige wenige Arbeiten, vorwiegend anderer europäischer Länder, stehen zur Verfügung. Dabei variiert die Prävalenz bei unterschiedlicher Methodik der Erfassung und Bewertung von Azol-resistenten Stämmen zwischen 1,0% und 20,0% (Amorim et al., 2010;

Burgel et al., 2012; Fischer et al., 2014; Morio et al., 2012; Mortensen et al., 2011; Prigitano et al., 2017). Dabei beschrieb die einzige Arbeit über CF-PatientInnen eines Zentrums in Deutschland eine Prävalenz von 1,0% (Fischer et al., 2014).

1.7. Resistenzentwicklungshypothesen

Derzeit existieren zwei Haupthypothesen zur Resistenzentwicklung bei A. fumigatus, die durch epidemiologische Daten gestützt werden (Verweij et al., 2016):

1.7.1. Umwelthypothese

Bei PatientInnen, bei denen zu zwei Dritteln keine Azolvortherapie zu eruieren ist, finden sich Azol-resistente Stämme von A. fumigatus zum größten Teil mit der zuvor beschriebenen TR34/L98H-Mutation (Snelders et al., 2009; Verweij et al., 2016). Diese Mutationskombination weißt in der Regel eine Panresistenz gegenüber klinisch gebräuchlichen Triazolen auf. Die Stämme weisen oft auch bei PatientInnen ohne bekannten Bezug zueinander eine geringe genetische Variation auf. Es konnte gezeigt werden, dass 5,8% von gewonnenen Erdproben aus Bereichen mit hoher Azolexposition Resistenzen gegenüber medizinischen Azolen aufweisen (Ren et al., 2017). Daher ist eine Hypothese, dass Kreuzresistenzen zu klinisch angewandten Triazol-Therapeutika durch die Verwendung von landwirtschaftlichen Triazolen ausgelöst werden (Snelders et al., 2012).

1.7.2. Klinikhypothese

Vorwiegend wird unter langzeitiger Azoltherapie oder -prophylaxe bei ABPA oder chronischer pulmonaler Aspergillose eine Resistenzentwicklung beobachtet. Festgemacht wird dies daran, dass bei diesen Krankheitsbildern häufiger isolierte Punktmutationen bei den ARAF-Stämmen gefunden werden. Diese gehen teilweise auch mit einer Einzelresistenz gegenüber beispielsweise Itraconazol oder Voriconazol einher. Außerdem konnte bei PatientInnen mit chronischer Aspergillose gezeigt werden, dass vormals sensible und später resistente Isolate einen identischen Genotyp in Mikrosatelliten-

(19)

Typisierungen aufwiesen und lediglich Mutationen im Rahmen von Resistenzmechanismen akquirierten (Howard et al., 2009).

1.8. Molekulare Mechanismen der Azol-Resistenz bei A. fumigatus

Eine Azol-Resistenz bei A. fumigatus kann durch mehrere zum Teil bekannte Mechanismen vermittelt werden:

1.8.1.

cyp51A-Mutation

Der wichtigste molekulare Mechanismus einer Azol-Resistenz besteht in nichtsynonymen Basenmutationen des entsprechenden, für die Lanosterol-Demythelase codierenden Genabschnittes cyp51. Dieser besteht aus zwei sehr ähnlichen Abschnitten cyp51A und cyp51B (Mellado et al., 2001). Hierbei wirken sich insbesondere Mutationen im cyp51A-Gen auf eine phänotypische Azol-Resistenz aus. Ein folglicher Aminosäuren-Austausch kann zu einem alterierten Ziel für die in Gebrauch stehenden Azoltherapeutika führen (Snelders et al., 2010). Bekannte Hotspots für Basenmutationen, die eine Azol-Resistenz auslösen, sind dabei zum Beispiel in den Codons M220 (Mellado et al., 2004), G54 (Diaz-Guerra et al., 2003) oder G138 (Howard et al., 2006) zu finden (Abbildung 3).

Am häufigsten jedoch ist eine Kombination aus Mutationen vorzufinden: Diese besteht aus der Kombination einer Basensubstitution, die zu einem Austausch von Leucin durch Histidin im Codon 98 des cyp51A-Gens und zwei Kopien einer 34 Basenpaare langen Sequenz, einem sogenannten Tandem Repeat (Snelders et al., 2008), das in der Promotorregion eingefügt ist und zu einer bis zu achtfachen Genexpression führt (Lelievre et al., 2013).

Abbildung 3: Überblick der häufigsten reletanven Mutationen im cyp51A-Gen und deren beschriebene phänotypischen Resistenzmuster (Verweij et al., 2009)

(20)

1.8.2. Andere bekannte Mutationen

Dabei gibt es jedoch auch Isolate, die keine bekannte cyp51A-Mutation aufweisen. Im Jahr 2012 wurde eine Mutation des CCAT-Bindungs-Transkriptionsfaktors-Komplexes der HapE-Untereinheit entdeckt, die an Position 88 eine Substitution von Prolin durch Leucin aufwies, die wahrscheinlich durch Überexpression von cyp51A phänotypisch zu einer Azol- Resistenz führte (Camps et al., 2012). Im Jahr 2013 wurde außerdem eine Überexpression des cdr1B-Effluxtransporters ebenfalls als verantwortlich für nicht-cyp51A-vermittelte Azol-Resistenz erkannt (Fraczek et al., 2013). Weiterhin wurde 2018 von Hagiwara et al.

erklärt, dass Mutationen im hmg1- und erg6-Gen, welches für Enzyme der Ergosterol- Biosynthese codieren, mit Multi-Azol-Resistenz assoziiert sind.

2 Fragestellung und Zielsetzung

Bis zu 60% der CF-PatientInnen sind mit A. fumigatus besiedelt. Hierbei erfahren circa 40%

eine allergische Sensibilisierung, die zu einer schlechteren Lungenfunktion, Exazerbationen und damit verminderten Lebensqualität führen kann. Ebenfalls sind Raten von fast 90% Therapieversagen bei invasiven Aspergillosen bei stammzelltransplantierten PatientInnen mit Azol-resistenten Isolaten beschrieben (Steinmann et al., 2015).

Da auch lungentransplantierte CF-PatientInnen einem erheblichen Risiko invasiver Aspergillosen ausgesetzt sind, stehen Azoltherapien aufgrund fehlender Bewertungskriterien zur Vorhersage und anschließend schwieriger Diagnose einer Erkrankung mit ARAF-Stämmen in der Diskussion (Verweij et al., 2016). Auch die bisher wenig geklärte Frage nach der Möglichkeit einer Übertragung von resistenten Isolaten zwischen PatientInnen steht in Bezug auf mögliche Aussbruchsszenarien und Umkehrisoliermaßnahmen im Fokus (Engel et al., 2019).

In dieser Arbeit wurde daher im Zeitraum von 2012 bis 2016 eine Anzahl von 2888 Isolaten der Spezies A. fumigatus von 961 PatientInnen aus zwölf spezialisierten deutschen Zentren zur Behandlung Zystischer Fibrose gesammelt.

Alle Isolate wurden mittels Agar-Selektivnährböden auf eine phänotypische Azol- Resistenz geprüft. Anschließend wurde die Resistenz molekularbiologisch mittels PCR und Sequenzierung bestätigt. Zusätzlich wurde für jedes Isolat ein Resistogramm nach Standards des Europäischen Kommitees für antimikrobielle Sensibilitätstestung mittels Mikrobouillondilution erstellt.

(21)

Alle phänotypisch Azol-resistenten Isolate wurden dann mittels einer Mikrosatelliten-PCR für neun verschiedene Gen-Loci typisiert und deutschlandweit sowie mit anderen Studiendaten abgeglichen.

Die experimentell gewonnen Daten wurden mit verfügbaren klinischen Parametern zu Alter, Geschlecht, stattgehabter Lungentransplantation und vorangegangenen Azol- Therapien kontextualisiert und mögliche Risikofaktoren für eine Besiedlung mit Azol- resistenten Stämmen vorgeschlagen.

Vorrangiges Ziel dieser Arbeit war es, erstmalig die Prävalenz von Azol-resistenten Aspergillus fumigatus-Isolaten bei CF-PatientInnen in Deutschland zu erfassen. Weiterhin sollte eine molekulare Charakterisierung der Resistenzmechanismen sowie der genetischen Verwandtschaft durchgeführt werden. Die erhobenen Daten sollten mit den verfügbaren klinischen Angaben zu einer epidemiologischen Übersicht führen, die mögliche Risikofaktoren identifiziert.

(22)

3 Material und Methoden

3.1. Material

3.1.1. Reagenzien und Antimykotika

Reagenz Bezugsadresse

Applied Biosystems™ Hi-Di™ Formamid Kat.-Nr. 4440753

ThermoFisher Scientific, Wesel, Deutschland

Aqua dest. Aqua ad iniectabilia, B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland

Dimethyl-Sulfoxid (DMSO) ≥ 99% Kat.-Nr.

276855

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland

Ethanol absolut Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland

GeneScan™ 1200 Liz™ Size Standard Kat.-Nr. 4379950

Isavuconazol Cresemba® (Basilea Pharmaceutica) 200mg

Basilea Pharmaceutica, Lörrach,

Deutschland; Pfizer Pharma PFE GmbH, Berlin, Deutschland

Isopropanol Mallinckrodt Baker B.V. Deventer, Holland Itraconazol ≥98% Kat.-Nr. I6657 100mg Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen,

Deutschland

Itraconazol Sempera® 10 mg/ml Janssen-Cilag GmbH, Neuss, Deutschland Lactophenolblau Art.-Nr. 3097 Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe,

Deutschland LightCycler® 480 SYBR Green Prod.-Nr.

04707516001

Roche Diagnostics Deutschland GmbH, Mannheim, Deutschland

Maxwell® 16 LEV RNA FFPE Purification

Kit Kat.-Nr. AS1260 ProMega, Madison, WI, USA (Mannheim, Deutschland)

MOPS-Medium Kat.-Nr. M1254 Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland

NaCl 0,9% DeltaSelect GmbH, Pfuhlingen,

Deutschland

NanoPOP-7™ Polymer NP7-101 MCLAB, South San Francisco, CA, USA NanoPOP™ 10x Running buffer (mit EDTA) MCLAB, South San Francisco, CA, USA Nuclease free water (LEV Kit) Kat.-Nr.

P1193

ProMega, Madison, WI, USA (Mannheim, Deutschland)

(23)

Posaconazol ≥98% Kat.-Nr. SML2287 5mg Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland

Primer MWG Biotech AG, Ebersberg, Deutschland

QIAGEN Fast Cycling PCR Kit (200) Cat No./ID: 203743; inklusive: Master Mix, 10x CoralLoad Dye, 5x Q-Solution, RNase-Free Water

QIAGEN GmbH, Hilden, Deutschland

RPMI 1640 Medium mit 2% L-Glut Kat.-Nr.

R6504

Taq PCR Core Kit Cat No./ID: 201223 (250 U); inklusive: Taq-Polymerase, Taq-Puffer 10x, dNTP-Lösung

QIAGEN GmbH, Hilden, Deutschland

TWEEN 20 Kat.-Nr. 00-3005 ThermoFisher Scientific, Wesel, Deutschland

Voriconazol ≥98% Kat.-Nr. PZ0005 5mg Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland

3.1.2. Verbrauchsmaterialien

Verbrauchsmaterialien und Glaswaren Bezugsadresse

Desderman® pure Best.-Nr. 116802 Schülke & Mayr GmbH, Norderstadt, Deutschland

Pipettenspitzen epT.I.P.S, 50μl-1000μl

Kat.-Nr. 0030000919 Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland Pipettenspitzen epT.I.P.S, 0,1μl-10μl Kat.-

Nr. 0030000811 Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland

Pipettenspitzen epT.I.P.S, 2μl-200μl Kat.-

Nr. 0030000870 Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland

Parafilm® M 340150 Bemis Company Inc., WI, USA Sorenson™ MultiGuard low binding aerosol

barrier tips 100μl

Sorenson BioScience Inc., Salt Lake City, USA

Sorenson™ MultiGuard low binding aerosol barrier tips 1000μl

Sorenson BioScience Inc., Salt Lake City, USA

Eppendorf Safe lock Tubes 1,5ml Kat.-Nr.

0030120086 Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland

Eppendorf Safe lock Tubes 2ml Kat.-Nr.

0030120094 Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland

Eppendorf Safe lock Tubes 0,5ml Kat.-Nr. Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland

(24)

Eppendorf Tubes® 3810X, 1,5 mL, g-

Safe® Kat.-Nr. 0030125150 Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland Reaktionsgefäße-Ständer, Top-Rack Best.-

Nr. 5426544 Köhler-Technik, Neulußheim, Deutschland

neoLab Combi-Rack Art. Nr.: 2-2571 neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Deutschland

Wattetupfer

im Nährmedienlabor des Instituts für Medizinische Mikrobiologie am

Universitätsklinikum Essen hergestellt Petrischalen ohne Nocken 92x26mm Art.-

Nr. 370-580 Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland

Impfschlinge 10μl Art.-Nr. 68.1562.050 Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland Impfschlinge 1μl Art.-Nr. 86.1567.050 Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland Czapek Dox-Agar Prod.-Nr. CM0097 Art.-

Nr. Oxoid GmbH, Wesel, Deutschland

Malz-Agar Prod.-Nr. CM0059 Art.-Nr.

PO5055A Oxoid GmbH, Wesel, Deutschland

Erlenmeyerkolben Schott Duran®, Mainz, Deutschland DURAN® Laborflasche mit DIN Gewinde,

GL 45 500ml Schott Duran®, Mainz, Deutschland

Eppendorf Combitips® advanced 10ml Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland Eppendorf Combitips® advanced 5ml Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland LightCycler® Capillaries (20 μl) Prod.-Nr.

04929292001

Hirschmann Messpipette 10ml Klasse B Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co. KG, Eberstedt, Deutschland

Röhre 13ml, Polypropylen Best.-Nr.

60.541.545

Sarstedt AG & Co. KG, Nürmbrecht, Deutschland

Roti®-Store Cryoröhrchen Best.-Nr. P730.2 Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland

DURAN® Messzylinder Klasse B 500ml Schott Duran®, Mainz, Deutschland DURAN® Messzylinder Klasse B 50ml Schott Duran®, Mainz, Deutschland Gummiseptamatten 96-Well P/N 4315933 ThermoFisher Scientific, Wesel,

Deutschland Applied Biosystems™ MicroAmp™ Optical

96-Well Reaction Plate Kat.-Nr. N8010560

(25)

Mikrotiterplatten pureGrade™ klar, 96 well flat bottom Kat.-Nr. 781602

Brand GmbH und Co KG, Wertheim, Deutschland

Amies Agar Gel Rayon Transport Swabs Kat.-Nr. TS0001A

Nalgene® Kryoboxen 100, 1,5ml Kat.-Nr.

5026-1010

Cellstar® konische Zentrifugenröhrchen 50ml Kat.-Nr. 227270

Greiner Bio-One International GmbH, Frickenhausen, Deutschland

RPMI Agar Ref. AEB122180 BioMérieux SA, Marcy-l’Étoile, Frankreich Etest® Itraconazol BioMérieux SA, Marcy-l’Étoile, Frankreich PCR SingleCap 8er Softstrips 0,2 ml

farblos, Art.-Nr 710970

Biozym Scientific GmbH, Hessisch Oldendorf, Deutschland

NCPF 2140 Positiv-Kontrollstamm Aspergillus fumigatus

National Collection of Pathogenic Fungi, Salisbury, Vereinigtes Königreich

ATCC 204305 Negativ-Kontrollstamm

Aspergillus fumigatus LGC Standards, Teddington, Vereinigtes Königreich

M224 Negativ-Kontrollstamm (intern) Aspergillus fumigatus

Interne Stammsammlung des Instituts für Medizinische Mikrobiologie am

Universitätsklinikum Essen

Pipettier-Reservoir 25ml Art.-Nr. 675032 Biozym Scientific GmbH, Hessisch Oldendorf, Deutschland

Corning® bottle-top vacuum filter system Prod.-Nr. CLS431154

Injekt® 5 ml Spritze steril, Luer-Ansatz, exzentrisch

B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland

Mikro-Schraubröhre 2ml, Polypropylen Best.-Nr. 72.693.005

0,5ml Mikroröhre PCR-PT Best.-Nr.

72.730.406

Objektträger 76x26mm Engelbrecht Medizin- und Labortechnik GmbH, Edermünde, Deutschland

Tesa®-Film Tesa SE, Norderstedt, Deutschland

Sartorius Minisart® Spritzenvorsatzfilter

11µm Porengröße Sartorius AG, Göttingen, Deutschland

(26)

3.1.3. Nährmedien 3.1.3.1. Malz-Agar

Malz-Agar ist ein universelles Medium für die gezielte Anzucht von Spross- und insbesondere Schimmelpilzen (Galloway et al., 1952). Da Pilze als azidophile Mikroorganismen unter sauren Kulturbedingungen ihr Wachstumsoptimum erreichen, liegt der pH-Wert des Mediums bei 5,4 ± 0,2, wobei gleichzeitig das bakterielle Wachstum gehemmt wird. Laut Firmenangaben besteht das Fertigmedium aus:

Zutat g/l

Malzextrakt 30,00

Mykologisches Pepton 5,00

Agar 15,00

pH 5,4 ± 0,2 bei 25°C

3.1.3.2. Czapek Dox Agar

Da Czapek-Dox Agar als einzige Stickstoffquelle Natriumnitrat enthält, ist er sehr gut zur selektiven Kultivierung von Pilzen geeignet. Der Agar wird in sehr vielen Publikationen zu taxonomischen Studien zur Beschreibung von Makro- und Mikromorphologie von Pilzen genutzt. Die modifizierte Zusammensetzung des genutzten Mediums besteht laut Hersteller aus:

Zutat g/l

Natriumnitrat 2,00

Kaliumchlorid 0,50

Magnesium-

Glycerophosphat 15,00

Eisensulfat 0,01

Kaliumsulfat 0,35

Sucrose 30,00

Agar 12,00

pH 6,8 ± 0,2 bei 25°C

(27)

3.1.3.3. Sabouraud-Agar

Sabouraud-Agar ist ein allgemeines Anzuchtmedium für Pilze, das von Raymond Sabouraud im Jahre 1910 entwickelt wurde (Sabouraud, 1910). Die Zusammensetzung enthält hohe Mengen an Zucker und besitzt einen niedrigen pH-Wert. Die modifizierte Zusammensetzung des Herstellers besteht aus:

Zutat g/l

Mykologisches Pepton 10,00

Glucose (Dextrose) 40,00

Agar 15,00

pH 5,6 ± 0.2 bei 25°C

3.1.4. Geräte und Pipettierhilfen

Gerätename Bezugsadresse

Ablesespiegel Titertek Microtitration Equipment

Flow Laboratories GmbH, Bonn, Deutschland

Aluminiumfolie Meterware, Alujet Alujet Universal, Düsseldorf, Deutschland AnalytikJena Flexcycler T30 Kat.-Nr. 29406 Analytik Jena AG, Jena, Deutschland Applied Biosystems™ 3130 Genetic

Analyzer Kat.-Nr. 313001R

Applied Biosystems™ Dell® 3130 Computer Kit (Windows™) OS

Binder Brutschrank Classic Line, Typ BD 23 Best.-Nr. 90100187

Fa. BINDER GmbH, Tuttlingen, Deutschland

Biometra T1 Thermocycler Analytik Jena AG, Jena, Deutschland Eppendorf Dispenser Multipette M4 E-2605 Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland Eppendorf Research® Plus Mehrkanal-

Pipette 30µl-300µl Kat.-Nr. 613-0887 Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland Eppendorf Research® Plus Pipette 0,5µl-

10µl Kat.-Nr. 613-0862 Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland Eppendorf Research® Plus Pipette 100µl-

1000µl Kat.-Nr. 613-0866 Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland

(28)

Eppendorf Research® Plus Pipette 10µl-

100µl Kat.-Nr. 613-0864 Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland Eppendorf Research® Plus Pipette 20µl-

200µl Kat.-Nr. 613-0865 Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland Eppendorf Zentrifuge Typ 5415C Kat.-Nr.

5415B 68729 Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland

Eppendorf Zentrifuge Typ 5425 Art.-Nr.

5424 000.410 Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland

Fisherbrand™ MS 3 Basic Vortexer, Art.- Nr. 10492342

Flaschenaufsatz-Dispenser Dispensette®

S, Analog Kat.-Nr. 4600140

Brand GmbH und Co KG, Wertheim, Deutschland

Gilson PIPETMAN® G Pipette 1 – 10 µl Kat.-Nr. P10G

Gilson Germany, Limburg-Offheim, Deutschland

Grant Bio™ Densitometer, Prod.-Nr.

11441078

Grant Instruments, Cambridge, Vereinigtes Königreich

HERAEUS Brutschrank Typ B6120 Fa. Heraeus, Düseldorf, Deutschland Heraeus HERAfreeze™ HFU 586

Ultratiefkühlschrank

KNF Neuberger Vakuumpumpe Typ NK25 Kurt Neuberger KG, Freiburg, Deutschland Kühlschrank LCv 4010 MediLine Liebherr, Biberbach an der Riß,

Deutschland

Labormikroskop Zeiss Axioscope 2 Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Deutschland

Laborwaage KERN ABT 120-5DNM KERN & SOHN GmbH, Balingen- Frommern, Deutschland

LightCycler® Capping Tool Prod.-Nr.

03357317001

Maxwell® 16 Tissue and Cell Total RNA LEV Systems Art.-Nr. AS1002

ProMega, Madison, WI, USA (Mannheim, Deutschland)

Mikrobiologische Sicherheitswerkbank

Klasse II Silver Line Art.-Nr. 17201 Kojair Tech Oy, Vilpulla, Finnland NanoDrop 1000 Mikrovolumen-

Spektralphotometer

(29)

Pipetus® Akku Code-Nr. 9907200 Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co. KG, Eberstedt, Deutschland

PTC-100® Thermal Cycler BioRad Laboratories Inc., Hercules, California, USA

Roche LC Carousel Centrifuge 2.0 Prod.- Nr. 03709582001

Roche LightCycler® 2.0 Instrument Prod.- Nr. 03531414001

Roche LightCycler® 2.0 Sample Carousel (20 μl) Prod.-Nr. 03603962001

Roche LightCycler® Centrifuge Adapters Prod.-Nr. 11909312001

Roche MagNA Lyser® Instrument Roche Diagnostics Deutschland GmbH, Mannheim, Deutschland

Rocker 300 Oil free Vacuum Pump Rocker Scientific Co., Ltd., , Vereinigtes Königreich

Rotilabo®-Mikroliterpipette 0,5-10µl Best.- Nr. TA21.1

Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland

Sicherheitswerkbank Klasse II Heraeus HERAsafe HSP 12

SI™ Vortex-Genie™ 2 Scientific Industries SI™, Inc. New York, USA

Verschlussfolie, Axygen® AxySeal Corning Life Sciences, Kaiserslautern, Deutschland

(30)

3.3. Methoden 3.3.1. Überblick

Abbildung 4: Ablaufdiagramm der Experimentalmethodik vom Probeneingang bis zur Sequenzierung der Resistenzgene

Probeneingang + Kultivierung

2890/2986

Screening-positiveStämme

101

DNA-Extraktion

101/101

Molekularbiologische Speziesidentifikation

101/101 RT-PCR TR34-Mutation in Cyp51A (+)

101 (89)

Cyp51A-Sequenzierung +FunResDB12/101 Mikrosatelliten-Genotypisierung

101/101 Mikrobouillondilution nach EUCAST 9.3

101/101 Klinische Patientendaten

781/961

Azol-resistent vs.Azol-sensibel

49(51)/781(961) Itraconazol-Agar 4mg/L Screening

101/2888 MorphologischeSpeziesidentifikation

2888/2890 Erstanlage 24-72h Bebrütung auf Malzagarbei 35°C2890/2986

(31)

Im Studienaufbau wurden die zwölf universitären Versorgungseinrichtungen in Aachen, Dresden, Düsseldorf, Essen, Hannover, Heidelberg, Homburg/Saarbrücken, Köln, München, Münster sowie Ulm (alphabetische Reihenfolge) als Zentren für die Versorgung von CF-PatientInnen mit Zystischer Fibrose rekrutiert. Von diesen wurden im Zeitraum von Januar 2012 bis April 2016 insgesamt 2986 klinische Isolate gesammelt. Es ließen sich 2890 erfolgreich anzüchten und 2888 Isolate der Spezies Aspergillus fumigatus sensu stricto identifizieren (Abbildung 4).

Aufgrund einer abweichenden Diagnose (CF-like disease, COPD) mussten vier Isolate, wegen fehlendem Wachstum nach mehreren Kultivierungsversuchen 92 Isolate und aufgrund der Identifikation einer anderen Pilzspezies zwei Isolate exkludiert werden.

Nach erfolgreicher Kultivierung wurde das nachfolgend beschriebene Screeningverfahren auf Azol-Resistenz durchgeführt. Anschließend wurden von den als resistent gewerteten Isolaten standardisierte phänotypische Empfindlichkeitstestungen, der molekularbiologische Resistenzgennachweis sowie die molekulargenetische Typisierung mittels Mikrosatelliten-Typisierung durchgeführt.

3.3.2. Erstkultivierung und Screening auf Azol-Resistenz

In den einsendenden Zentren wurden zunächst die klinischen Isolate auf Malzagar 24–48h bei 35°C kultiviert und anschließend auf primär sterile Rayon Transport Swabs überführt und an das Institut für Medizinische Mikrobiologie des Universitätsklinikums Essen innerhalb von 48h versandt.

a) b)

Abbildung 5: a) Wachstum von azolsensiblem A. fumigatus auf Malzextrakt-Agar nach 48h Bebrütungszeit bei 35°C b) Wachstum von Azol-resistentem A. fumigatus (Probe 1976, Essen) auf Malzextrakt-Agar nach 48h Bebrütungszeit bei 35°C. Kein makroskopisch erkennbarer phänotypischer Unterschied.

(32)

Nach Eingang des Probenmaterials wurden die Abstriche auf Malzextrakt-Agar-Platten angelegt und für 24-72h bei 35°C unter Raumluftbedingungen im Brutschrank inkubiert.

Bei positivem Wachstum wurden von der bewachsenen Agar-Kultur Kulturanteile auf den Itraconazol-Screening Agar beimpft, wie im Folgenden beschrieben.

3.3.3. Identifikation von Aspergillus fumigatus sensu stricto

Zur eindeutigen Identifikation der Zugehörigkeit aller klinischen Isolate zur Spezies Aspergillus fumigatus sensu stricto wurde eine Kultur auf Malz-Agar angelegt und bei 50°C für 24–48h unter aeroben Bedingungen bebrütet. Bei dieser Temperatur kann innerhalb der Gattung Aspergillus lediglich die thermophile Spezies A. fumigatus wachsen. Anschließend wurde anhand der Makro- und Mikromorphologie die Spezies anhand typischer Eigenschaften, beschrieben im Atlas of Clinical Fungi (DeHoog et al., 2001), bestimmt (siehe Abbildung 6). Bei allen phänotypisch als Azol-resistent getesteten Isolaten wurde zusätzlich eine molekularbiologische Identifikation mittels einer ß-Tubulin-Sequenzierung durchgeführt, die den derzeitigen molekularbiologische Goldstandard zur eindeutigen Identifizierung bei bekannten Schimmelpilzen darstellt.

Dafür wurden die benA-Region, die in Ascomyzeten für β-Tubulin des Zytoskeletts codiert nach (Balajee et al., 2005) amplifiziert und sequenziert. Die Sequenzen waren bei allen Isolaten mittels BLAST 100% homolog zu A. fumigatus, sodass von einer sicheren Speziesidentifikation ausgegangen wurde.

Tabelle 5: Primersequenzen zur Sequenzierung des für β-Tubulin codierenden benA-Genabschnittes in A. fumigatus nach Balajee et al. (2005)

benA-Primer-Sequenzen

Vorwärts 5′-AATTGGTGCCGCTTTCTGG-3′

Rückwärts 5′-AGTTGTCGGGACGGAATAG-3′

Abbildung 6: Mikrophotographien eines A. fumigatus-Isolates im Lactophenolblau-Präparat. Konidienköpfe zeigen uniseriate Reihen von Phialiden in den oberen 2/3 der Vesikel. Eigene Abbildungen, 400x Vergrößerung

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3.3.4. Itraconazol-Agar Screening

Der im Institut für Medizinische Mikrobiologie des Universitätsklinikums Essen entwickelte und hergestellte Itraconazol-Screening-Agar wurde auf der Grundlage des Czapek-Dox-Agars erstellt. Der Grundzusammensetzung wird Itraconazol Sempera® (10 mg/ml, Janssen-Cilag GmbH, Neuss) in einer Konzentration von 4 mg/L hinzugefügt.

Diese Konzentration erfasst alle laut EUCAST-Definition klinisch resistenten Isolate, die über eine minimale Hemmkonzentration (MHK) > 2mg/l definiert sind. Da in einer zweifach Verdünnungsreihe 4 mg/l der nächsten Verdünnungsstufe entspricht, ist hiermit der Grenzwert abgebildet.

Der Screening-Agar wurde für die Studie wie folgt hergestellt:

45,4g Czapek-Dox Agar ad 1 l Aqua dest.

15min autoklavieren bei 121°C Abkühlen lassen auf 50°C

Zusatz von 500µl Itraconazol Sempera® (10mg/ml)

Gießen des Agars in 80mm-Durchmesser-Petrischalen mit 15ml Volumen

Mittels Wattetupfer wurden jeweils fünf einzelne Spots auf der Itraconazol-Screening- Agarplatte im Abstand von jeweils ca. 3cm von den 48h lang bebrüteten Malzextrakt-Agar- Platten überimpft (Abbildung 7). Bei Verdacht auf eine Itraconazol-Resistenz zeigte sich Wachstum am Beimpfungsort sowie durch Sporulation gebildete Satellitenkolonien

a) b)

Abbildung 7: a) Wachstum von azolsensiblem A. fumigatus auf Itraconazol-Screening-Agar nach 48h Bebrütungszeit bei 35°C b) Wachstum von Azol-resistentem A. fumigatus (Probe 1976, Essen) auf Itraconazol- Screening-Agar nach 48h Bebrütungszeit bei 35°C

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sehr schwaches Wachstum an den Beimpfungsstellen (Abbildung 7a). Jedes positiv getestete Isolat wurde mittels phänotypischer Resistenztestung sowie molekularbiologischer Methoden als resistent bestätigt.

3.3.5. Kryokulturen der Pilzisolate

Alle gesammelten A. fumigatus-Isolate wurden zur späteren Rekultivierung mittels Kryokultur asserviert. Dazu wurde mittels 10µl–Ösen reichlich Kulturmaterial von Malzextrakt-Agarplatten in ein Roti-Store–Kryoröhrchen überimpft und ca. 15 Sekunden in der Lösung resuspendiert. Der Überstand wurde abpipettiert und verworfen.

Anschließend wurden alle Kryokulturen bei -80°C verwahrt. Zusätzlich wurden Kryokulturen aller als resistent getesteten Isolate zur schnellen Verfügbarkeit bei -20°C verwahrt.

3.3.6. Standardisierte Mikrobouillondilution

Die Sensibilitätstestung der klinischen Isolate wurde mittels einer sogenannten Mikrobouillondilution nach dem europäischen Standard-Protokoll 9.3 für Schimmelpilz- testung des EUCAST durchgeführt (Subcommittee on Antifungal Susceptibility Testing of the, 2008).

Zuerst wurde das Medium für aliquotierte Mengen von 1l wie folgt präpariert:

Destilliertes Wasser 900 ml

RPMI 1640 20,8 g

MOPS 69,06 g

Glukose 36 g

Pulver in 900ml destilliertem Wasser unter Rühren auflösen Auf pH 7,0 bei 25°C mittels NaOH einstellen

Sterilfiltration durch Filter der Porengröße 0,22µm

Aufbewahrung des Mediums bei 4°C für maximal 6 Monate

Die enthaltene Glukose wurde zum besseren Wachstum der Pilzkulturen dem RPMI 1640 hinzugesetzt, sodass eine Endkonzentration von 2% erreicht wurde. Als Puffer wurde 3- (N-morpholino)propansulfonsäure in einer Endkonzentration von 0,165 mol/l genutzt.

Das Medium wurde in doppelter Stärke vorbereitet, um eine 1:2-Verdünnung bei hinzugesetztem Pilz-Inokulum zu erlauben.

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Die für die Empfindlichkeitsprüfung vorgesehenen Testsubstanzen Itraconazol, Voriconazol, Posaconazol und Isavuconazol wurden in Stock-Lösungen überführt und suspendiert, die 200x der höchsten Testkonzentration entsprachen. Als Lösungsmittel diente Dimethylsulfoxid (DMSO). Gelöste Testsubstanzen wurden bei -80°C für maximal sechs Monate gelagert.

Präparation der Testplatten und Arbeitslösungen:

Für die Empfindlichkeitsprüfung der A. fumigatus-Isolate wurden die in Tabelle 6 aufgeführten Testbereiche genutzt.

Tabelle 6 Testbereiche der getesteten Antimykotika gegenüber Azol-resistenten A. fumigatus-Isolaten

Antimykotikum Lösungsmittel Testbereich (mg/l)

Itraconazol DMSO 0,0156-8

Voriconazol DMSO 0,0312-16

Posaconazol DMSO 0,0156-8

Isavuconazol DMSO 0,0312-16

Als absteigende Konzentrationsreihe wurde eine 1:2 Reihenverdünnung durchgeführt und beinhaltete folgende Verdünnungsstufen (jeweilige minimale/maximale Stufen in Klammern):

(16) 8 4 2 1 0,5 0,25 0,125 0,0625 0,03125 (0,015625) mg/l

Für die Resistenztestung wurden sterile Kunststoff-Mikrotiterplatten mit 96 flachen Vertiefungen genutzt. Die korrekte Konzentration der antifungalen Testsubstanzen wurde aus den Stock-Lösungen der Antimykotika und RPMI 1640 (2% Glukose) hergestellt. Die Mikrotiterplatten wurden dann nach dem Schema in Abbildung 8 in absteigender Konzentration mit jeweils 100µl einer 2x konzentrierten Antimykotikalösung beimpft. Die in Abbildung 8 aufgeführten Werte beziehen sich jeweils auf die bereits mit 100µl Pilzinokulum beimpften Platten. Spalte 11 (Positivkontrolle) und 12 (Negativkontrolle) wurden mit jeweils 100µl RPMI 1640 (2% Glukose)-Medium ohne Antimykotikum beimpft.

Die vorbereiteten Testplatten wurden bei -80°C für maximal sechs Monate aufbewahrt.

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Abbildung 8: Mikrotiterplattenlayout mit Beispielbeimpfung für Verdünnungsreihe 8-0,0156 mg/l (Endkonzentrationen nach Pilzinokulum angegeben). Rundung auf zweite Dezimalstelle, außer bei minimaler Konzentration. Alle Resistenztestungen in Doppelbestimmung. Spalte 11 = Positivkontrolle, Spalte 12 = Negativkontrolle, Reihe G+H = Negativ-Kontrollstamm = ATCC 203405

Präparation des Pilzinokulums

Für das Pilzinokulum wurden die zu testenden Isolate auf Sabouraud-Dextrose-Agar flächig ausgestrichen und für 48h bei 35°C für eine ausreichende Sporulation inkubiert.

Schlecht wachsende Isolate wurden maximal 120h inkubiert.

Zur Sammlung einer ausreichenden Menge von Konidien wurden jeweils 5ml steriles Wasser mit 0,1% Tween (Polysorbat) 20 als nichtionischem Tensid auf die Oberfläche des Koloniewachstums gegeben und mit einem sterilen Wattetupfer abgerieben. Die so entstandene Suspension wurde mittels steriler 10ml Spritzen aufgezogen und durch einen Spritzenfilter mit 11µm Porendurchmesser in ein steriles Gefäß gegeben. Die Suspension wurde mittels destilliertem Wasser für ein standardisiertes Inokulum auf eine spektrophotometrisch gemessene McFarland-Trübung von 0,5 eingestellt. Diese Suspension wurde dann 1:10 mit sterilem destillierten Wasser verdünnt, um eine Konzentration von 2-5 Konidien/ml zu erreichen.