Tierärztliche Hochschule Hannover
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Fruchtbarkeit nach intravaginaler und intrazervikaler Applikation von Seminalplasma bei der artifiziellen Insemination des Rindes sowie bei Embryonenempfängertieren
INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Mona Schwerhoff
aus Borken
Hannover 2012
Wissenschaftliche Betreuung: Apl. Prof. Dr. Dr. S. Meinecke-Tillmann Institut für Reproduktionsbiologie
1. Gutachterin: Apl. Prof. Dr. Dr. S. Meinecke-Tillmann 2. Gutachterin: Apl. Prof. Dr. Dr. D. Waberski
Tag der mündlichen Prüfung: 6. August 2012
Eine Arbeit aus dem Virtuellen Zentrum für Reproduktionsmedizin Niedersachsen an der Tierärztlichen Hochschule Hannover
gefördert durch:
Förderverein Biotechnologieforschung e.V. (FBF) Stiftung der Deutschen Wirtschaft (sdw)
Meinen Eltern
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
VERZEICHNIS DER ABKÜRZUNGEN
1 EINLEITUNG 13
2 LITERATURÜBERSICHT 15
2.1 Reproduktionsrelevante Grundlagen 15
2.1.1 Reproduktionszyklus und Anatomie des weiblichen Rindes 15
2.1.3 Das Ejakulat des Bullen 16
2.1.4 Reproduktionszyklus und Anatomie der weiblichen Ziege 16
2.1.5 Das Ejakulat des Ziegenbockes 17
2.2 Mechanismen der Interaktion im weiblichen Genitale 17
2.2.1 Blutgefäßsystem 18
Arterielles System 18
Venöses System 19
Austausch nach dem Gegenstromprinzip 19
2.2.2 Lokales Lymphsystem 21
2.2.3 „First uterine pass effect“ 21
2.2.4 Vaginale Clearance 23
2.3 Seminalplasma 24
2.3.1 Produktion von Seminalplasma 24
2.3.2 Bestandteile des Seminalplasmas 25
2.3.3 Methoden zur Seminalplasmagewinnung und -aufbewahrung 26
2.4 Seminalplasmaeffekte auf das weibliche Genitale und die Fruchtbarkeit 27
2.4.1 Überblick über die Funktionen im weiblichen Genitale 27
2.4.2 Evolutionäre Aspekte 27
2.4.3 Immunmodulatorische Effekte 28
2.4.4 Systemische Effekte 30
2.4.5 Effekte auf die Uterusmotilität und Samenretention 31
2.4.6 Effekte auf das Ovar und den Gelbkörper 32
2.4.7 Effekte auf Implantation, embryonale Mortalität und Trächtigkeit 34
2.4.8 Psychobiologische Effekte 36
2.4.9 Effekte nach Entfernung der akzessorischen Geschlechtsdrüsen 37
2.5 Relevante reproduktionsmedizinische Techniken 38
2.5.1 Artifizielle Insemination 38
2.5.2 Embryotransfer 39
2.5.3 Seminalplasma im Kontext der artifiziellen Insemination und des Embryotransfers 40
2.6 Zytologische Präparate des weiblichen Genitale 40
2.6.1 Zytobrush-Methode 40
2.6.2 Subklinische Endometritis 41
2.6.3 Zytologieauswertung 42
2.6.4 Einordnung von Zytologien des Genitaltraktes 43
2.7 Szintigraphien des weiblichen Genitale 44
2.7.1 Methode 44
2.7.2 Radioaktiver Marker 45
2.7.3 Lösungsmarkierung 45
2.7.4 Radioaktivität und Einheiten 46
2.7.5 Experimentelle Szintigraphie-Studien 47
Zu genitalem Transport und Lösungsverbleib 47
Zu Uteruskontraktion und Selbstreinigungsmechanismen 49
3 MATERIAL UND METHODEN 51
3.1 Feldstudien zur Seminalplasmaapplikation 51
3.1.1 Studientiere 51
3.1.2 Lösungsgewinnung und -herstellung 51
3.1.3 Durchführung der Lösungsapplikation 52
Lösungsapplikation begleitend zur artifiziellen Insemination 53
Lösungsapplikation begleitend zum Embryotransfer 53
3.1.4 Erfasste Parameter je Studientier (Feldstudien I + II) 54
Lösungsapplikation 55
Betriebliche Daten 55
Tierdaten 55
Brunstparameter und Besamung 55
Trächtigkeit 56
3.1.5 Zusätzliche Datenerfassung bei Embryonenempfängertieren 56
Empfängertier 56
Spendertiere 56
Embryo 56
3.1.6 Zervixzytologien 56
3.1.7 Statistische Analyse 57
3.2 Experimentelle Studie: Vaginohysteroszintigraphien 57
3.2.1 Studientiere 57
3.2.2 Versuchsdurchführung 58
3.2.3 Bildauswertung 59
4 ERGEBNISSE 61
4.1 Inseminationsbegleitende SP-Applikation (Feldstudie I) 61
4.1.1 Versuchsgruppen und Trächtigkeitsergebnisse 61
4.1.2 Charakterisierung der Studientiere und ihre Verteilung hinsichtlich der erfassten Parameter 61
Rassen 62
Laktation 63
Rastzeit 64
Störungen post partum 65
Milchmenge 67
Milchprobe 68
Körperkondition 69
Lahmheit 70
Hygiene 72
Letzte beobachtete Brunst 73
Dauer der Brunst und Brunstfeststellung 73
Brunstschleim 74
Intensität der äußeren Brunstsymptomatik 74
Kontraktion der Gebärmutter 76
Zervixzytologiestatus 77
Haltungssystem 79
Betriebe und Betriebsgröße 79
Gruppengröße und Liegeplätze 80
Eingesetztes Sperma 81
Untersuchungen auf Trächtigkeit 81
4.1.3 Auswertung nach Besamungsbeauftragten 82
Trächtigkeitsraten je Besamungsbeauftragten und Versuchsgruppe 82
4.1.4 Weitere Auswertung nach Rassen 84
Trächtigkeitsrate je Rasse und Versuchsgruppe 84
4.1.5 Weitere Auswertung nach Zervixzytologiestatus 84
Zervixzytologiestatus und Intensität der äußeren Brunstsymptome 84
Zervixzytologiestatus und Brunstschleim 85
Zervixzytologiestatus und Uteruskontraktion 85
Zervixzytologiestatus und Laktation 85
Zervixzytologiestatus und Lahmheit 85
4.2 Transferbegleitende Seminalplasmaapplikation bei Embryonen-empfängertieren (Feldstudie II) 88
4.2.1 Versuchsgruppen und Trächtigkeitsergebnisse 88
4.2.2 Charakterisierung der Studientiere 89
Rasse 90
Laktationsnummer 90
Haltungssystem und Betriebsgröße 90
Zyklussynchronisation 90
Brunstfeststellung und Intensität der äußeren Brunstsymptomatik 90
Zervixzytologiestatus 92
ET-Durchführung und Uterusgröße 93
Embryoqualität und Art ihrer Lagerung 95
4.2.3 Weitere Auswertung der Zervixzytologien 95
4.3 Zusammengefasste Ergebnisse der Feldstudien I + II 98
4.3.1 Signifikante Einflüsse in der KB-Studie 98
Auf die Trächtigkeitsraten 98
Weitere Signifikanzen 99
4.3.2 Signifikante Einflüsse in der ET-Studie 99
Auf die Trächtigkeitsraten 99
Weitere Signifikanzen 99
4.4 Vaginohysteroszintigraphien im Östrus (Experimentelle Studie) 99
4.4.1 Szintigraphieserien im Vergleich 99
4.4.2 Szintigraphieserien je Tier 100
4.4.3 Szintigraphieserien des Seminalplasmas 107
4.4.4 Szintigraphieserien des Ejakulates 108
4.4.5 Szintigraphieserien des Placebos 108
5 DISKUSSION 110
5.1 Feldstudien 110
5.1.1 Überprüfung der Arbeitshypothese 110
5.1.2 Allgemeine Einordnung der erzielten Trächtigkeitsraten 110
5.1.3 Effekt der Seminalplasmaapplikation 110
Resorption von Seminalplasma-Bestandteilen 112
Veränderung der Uterusmotilität, Immunmodulation und Volumeneffekt 113
Deponierungseffekt 114
Zeitpunkt der Applikation 114
5.1.4 Diskussion weiterer signifikanter Parameter 114
KB-Studie 115
ET-Studie 116
5.1.5 Kritische Anmerkungen zu den Feldstudien 116
Durchführung der Studien 116
Verblindung der Daten 117
Zeitraum der Studiendurchführung 117
5.2 Zervixzytologien 117
5.2.1 Überprüfung der Arbeitshypothese 117
5.2.2 Allgemeine Einordnung der gewonnenen Zytologien 118
5.2.3 Aussagekraft für die Reproduktion 120
5.2.4 Effekt der Seminalplasmaapplikation 121
5.2.5 Kritische Anmerkungen zum Einsatz der Zervixzytologie 122
5.3 Experimentelle Studie 122
5.3.1 Überprüfung der Arbeitshypothese 122
5.3.2 Einordnung der Szintigramme 123
5.3.3 Kritische Anmerkungen zur experimentellen Studie 125
6 ZUSAMMENFASSUNG 127
7 SUMMARY 131
8 LITERATURVERZEICHNIS 135
9 DANKSAGUNG 154
VERZEICHNIS DER ABKÜRZUNGEN
A. = Arteria
Acp = Accessory gland protein, Protein der akzessorischen Geschlechtsdrüsen AI = Artifizielle Insemination
BCS = Body Condition Score (Skala 1 - 5)
BDI = Beck depression inventory, Erfassung von Depressions- symptomen nach Beck
BS1-5 = Intensität der Brunstsymptomatik (auf einer Skala von 1 - 5) bzw. = beziehungsweise
°C = Grad Celsius
COX-2 = Cyclooxygenase-2
d = Tag/Tage
d 0 = Tag 0, Brunst bzw. Zeitpunkt der künstlichen Besamung d 7 = Tag 7 des Zyklus, ausgehend von d 0/Brunstzeitpunkt
ET = Embryotransfer
FES = fecundity-enhancing substances, trächtigkeitsfördernde Substanzen FSH = Follikelstimulierendes Hormon
FV = Deutsches Fleckvieh
g = Erdbeschleunigung
GM-CSF = Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor
h = Stunde
hCG = humanes Choriongonadotropin HSS/HSSG = Hysterosalpingoszintigraphie HYG = Hygiene-Score (Skala 1 - 4)
ICSI = Intracytoplasmic sperm injection, intrazytoplasmatische Spermieninjektion
IETS = International Embryo Transfer Society
IL = Interleukin
IL-2R = Rezeptor des Interleukin-2 i.m. = intramuskulär
i.v. = intravenös
IVF = in vitro Fertilisation
K = Kontrollgruppe
K1-3 = Uteruskontraktion (auf einer Skala von 1 - 3)
KB = Künstliche Besamung
kBq = Kilobecquerel
kg = Kilogramm
Lakt. = Laktation
LH = Luteinisierendes Hormon LIF = Leukemia inhibitory factor LPS = Lipopolysaccharide
LS = Lahmheits-Score (Skala 1 - 5)
Lsg. = Lösung
MBq = Megabecquerel
min = Minute
MHC = Major histocompatibility complex, Haupthistokompatibilitätskomplex
Mio = Million
mL = Milliliter
µL = Microliter
MS = Doktorandin M. Schwerhoff
n = Anzahl
nGES = Gesamtanzahl
NK- = Natürliche Killerzellen
Nl, Nll. = Nodus lymphaticus, Lymphknoten nX = Anzahl in der Gruppe X
OE = Östrus
P = Probabilität, Irrtumswahrscheinlichkeit
P = Placebo (-gruppe)
PBS = Phosphate buffered saline, phosphatgepufferte Salzlösung
p.c. = post coitum
PG = Prostaglandin
PGF2α = Prostaglandin F2alpha
PGE2 = Prostaglandin E2
p.i. = post inseminationem
PMN = Polymorphkernige neutrophile Granulozyten
p.p. = post partum
PR = Pregnancy rate
R. = Ramus, Zweig
RB = Deutsche Holstein Rotbunt
ROI = Regions of interest, definierter Bereich des Interesses in der Auswertung von Szintigrammen
s = Standardabweichung
SB = Deutsche Holstein Schwarzbunt SP = Seminalplasma (-gruppe)
Tc = Technetium
TGF ß = Transforming growth factor ß TierSchG = Tierschutzgesetz
TR = Trächtigkeitsrate
u. = und
V. = Vena, Vene
z.B. = zum Beispiel
Zykl.syn. = Zyklussynchronisation
1 EINLEITUNG
Seminalplasma, produziert überwiegend von den akzessorischen Geschlechtsdrüsen des männlichen Tieres, macht ca. 90 % eines Ejakulates aus und dient unter anderem dem Transport und Schutz der Spermien. Für die weiblichen Individuen verschiedener Spezies sind darüber hinaus Seminalplasma-Effekte auf das Immunsystem, den Uterus und die Ovarien nachgewiesen. Auch systemische und psychobiologische Auswirkungen nach einer Seminalplasmaapplikation im weiblichen Genitale sind in diversen Untersuchungen beispielsweise an Insekten, Ratten, Trampeltieren und dem Menschen belegt. Sogar die Beeinflussung von Implantation und embryonaler Mortalität wird dem Seminalplasma unter anderem bei den Spezies Maus und Schwein zugeschrieben.
Für das Rind liegen keine Untersuchungen zu den Auswirkungen einer Seminalplasmaapplikation in physiologischer Menge und Lokalisation vor und die Berichte über Seminalplasma-Effekte bei anderen Spezies führten zur Konzeption der vorliegenden Arbeit. Hat das Seminalplasma auch beim Rind eine trächtigkeitsfördernde Wirkung und, wenn ja, lässt sich diese unter Praxisbedingungen belegen?
Im Hauptteil der Arbeit, zwei Feldstudien, sollte die Auswirkung einer Seminalplasmaapplikation auf die Fruchtbarkeit bei Rindern untersucht werden. Zugrunde lag die Hypothese, dass eine Seminalplasmaapplikation die Trächtigkeitsraten positiv beeinflusst.
Die durchgeführten Feldstudien waren dreifachblind und mit randomisierter Zuordnung der Studientiere konzipiert. Umfangreiche Datenerhebungen je Studientier wurden vorgenommen, um Effekte anderer Einflussgrößen wie Körperkondition, Rasse und Alter auf die Fruchtbarkeit auszuschließen. Die durchgeführte Seminalplasmapplikation, orientiert an der Physiologie des Rindes, erfolgte in einem Umfang von 4 mL intrazervikal und intravaginal zum Zeitpunkt der künstlichen Besamung beziehungsweise brunstbegleitend bei Embryonenempfängertieren. Zur Auswertung wurden die Trächtigkeitsraten in den drei Versuchsgruppen „Seminalplasma“, „Placebo“ und „Kontrolle“ berechnet.
Im Rahmen beider Feldstudien wurden exfoliative Zervixzytologien erstellt, um den zervikalen Zytologiestatus der Studientiere in der Brunst zu dokumentieren. Aufgrund der gewonnenen umfassenden Probenanzahl konnte daher eine weitere Hypothese überprüft
werden: Hat der zervikale Zytologiestatus des Rindes, genauer gesagt ein Anteil von weniger als 10 % polymorphkernige Granulozyten, einen positiven Einfluss auf den Besamungserfolg? Eine Berechnung der Trächtigkeitsraten nach Zellstatus-Gruppe wurde zur Überprüfung dieser Hypothese durchgeführt. Zusätzlich konnte anhand der ET-Studie untersucht werden, ob sich die brunstbegleitende Applikation von Seminalplasma auf den Zervixzytologiestatus zum Transferzeitpunkt auswirkt.
Weitere Fragenstellten sich bei der Betrachtung der vielfältigen Seminalplasma-Effekte im weiblichen Individuum: Was geschieht mit dem Seminalplasma nach der Applikation? Wie lange verbleibt das Seminalplasma im weiblichen Genitale? Und ist die Szintigraphie eine geeignete Methode zur visuellen Verfolgung applizierter Lösungen?
Zur Beantwortung dieser Fragen wurde eine ergänzende, experimentelle Studie bei Ziegen, ebenfalls Scheidenbesamer wie das Rind, jedoch aufgrund der Größe besser zur Szintigraphie geeignet, konzipiert. Radioaktiv markiertes Seminalplasma wurde nach intravaginaler Applikation per Hysterovaginoszintigraphie über einen Zeitraum von 6 h verfolgt. Zur Auswertung wurden die Szintigramme in den drei Versuchsgruppen „Seminalplasma“,
„Ejakulat“ und „Placebo“ verglichen.
2 LITERATURÜBERSICHT
2.1 Reproduktionsrelevante Grundlagen
2.1.1 Reproduktionszyklus und Anatomie des weiblichen Rindes
Das domestizierte europäische Rind ist asaisonal polyöstrisch, mit einem 21 (18 - 24)-tägigen Zyklus (GRUNERT u. BERCHTOLD 1999). Die Brunst dauert in der Regel 18 (12 - 24) h, wobei diese, mit steigender Milchleistung zunehmend kürzer beobachtet wird. So stellten DOBSON et al. (2008) in Großbritannien eine von 15 auf 5 h verkürzte Brunstdauer innerhalb der letzten 30 - 50 Jahre fest. Die spontane Ovulation findet in der Regel erst nach dem Abklingen der äußeren Brunstsymptome statt: 30 - 35 h nach Brunstbeginn und 7,3 (0 - 16) h nach Brunstende (GRUNERT u. BERCHTOLD 1999). Als optimaler Besamungszeitpunkt wird 12 - 18 h nach Brunstbeginn angesehen (GRUNERT u. BERCHTOLD 1999;
BUSCH 2007).
Das weibliche Genitale des Rindes wird unterschieden in Scham (Vulva), Scheide (Vagina), Gebärmutter (Uterus) mit Gebärmutterhals (Cervix uteri), -körper (Corpus uteri) und -hörnern (Cornua uteri), sowie Eileiter (Tubae uterinae) und Eierstöcke (Ovarii; siehe auch Abb. 4).
Die weiblichen Genitalorgane unterliegen erheblichen zyklusabhängigen Strukturveränderungen und im Folgenden wird nun kurz auf Scheide und Zervix eingegangen.
Die Scheide reicht vom äußeren Muttermund bis zur Harnröhrenmündung und weist mit einem pH von 6,2 - 6,9 ein saures Milieu auf (WEHREND et al. 2003). Sie stellt ein häutig- muskulöses, schlauchförmiges Organ dar, dessen Lumen, außer während der Begattung und der Austreibungsphase der Frucht, auf einen kapillaren Spaltraum verjüngt ist. Der Wandbau der Vagina besteht aus drei Schichten: einer mehrschichtigen Schleimhaut (Tunica mucosa), der kollagenelastischen Bindegewebsschicht (Lamina propria) und einer Muskelschicht (Tunica muscularis) aus glatten Muskelzellen (LIEBICH 2004). Der Autor berichtet außerdem beim Rind über hochprismatische, schleimproduzierende Zellen, die in den Schleimhautfalten, insbesondere in der Nähe der Zervix eingelagert sind. Der Gebärmutterhals bildet den Übergang zwischen Scheide und Gebärmutterkörper und kann aufgrund seiner derben Beschaffenheit beim Rind bei der transrektalen Untersuchung von diesen abgegrenzt werden. Die Cervix uteri ist in der Lage sich temporär
(Östrus/Austreibungsphase) zu öffnen und zu schließen (LEISER 1999). Auch die Wand des Gebärmutterhalses ist in drei Schichten aufgebaut: Eine tierartlich unterschiedlich stark gefaltete, einschichtige, hochprismatische Tunica mucosa, die Lamina propria, welche unter Einfluss von Östrogenen stark ödematisiert wird und die Tunica muscularis mit zirkulären und longitudinalen Fasern (LIEBICH 2004).
Die Schleimhautzellen der Zervix synthetisieren in Abhängigkeit vom Zyklus den aus sauren und neutralen Proteoglykanen bestehenden Schleim: dünnflüssigen Brunstschleim unter Östrogeneinfluss oder dickflüssigen Schleim zur Bildung eines Pfropfes, der die Zervix während der Gelbkörperphase verschließt (LEISER 1999; LIEBICH 2004). Ebenfalls abhängig vom Zyklus ist auch die Permeabilität der Vaginalschleimhaut. WINTERHAGER u.
KÜHNEL (1985) resümierten aus ihren Versuchen an Meerschweinchen, dass die Zell-Zell- Verbindungen (tight junctions) ursächlich beteiligt sind an der Restriktion parazellulärer Diffusion durch die Vaginalschleimhaut in der Brunst. Im Metöstrus bemerkten die Autoren dagegen eine Durchlässigkeit für Markermoleküle, und führten dies auf veränderte Zell-Zell- Verbindungen zurück.
2.1.3 Das Ejakulat des Bullen
Mittlere Werte für frisches Bullenejakulat sind: 5 (2 - 8) mL Ejakulatvolumen, 1,2 x 106/µL Spermienkonzentration, gute Massenbewegung und 65 % vorwärtsbewegliche Spermien (MANN u. LUTWAK-MANN 1981; GASSE 1999; SCHMIDT 2000).Die Mindestanforderungen der Arbeitsgemeinschaft Deutscher Rinderzüchter (ADR 2006) für die Güte von Bullensperma für Zuchtbullen für den Einsatz in der KB und für Deckbullen lauten:
Zwei bzw. 4 mL Ejakulatvolumen (altersabhängig für Bullen < 2 bzw. > 2 Jahre), Spermienkonzentration 0,6 x 106/µL, ungestörte Massenbewegung und 70 % vorwärtsbewegliche Spermien.
2.1.4 Reproduktionszyklus und Anatomie der weiblichen Ziege
Die Ziege ist ein saisonal polyöstrischer Scheidenbesamer mit einem knapp 3-wöchigen Zyklus. Das Tag-Nacht-Lichtverhältnis ist der Regulator für den Beginn der Brunstsaison, die zyklische Aktivität wird von kürzer werdenden Tagen gefördert (KÜST u. SCHAETZ 1983).
Die Brunst dauert 1-2 Tage und äußert sich in typischem Verhalten, wie Lebhaftigkeit,
Unruhe, Neugierde und Duldung.
Tiere eingesetzt (KÜST u. SCHAETZ 1983 Allein auf anatomische Auffälligkeit
dieser Stelle hingewiesen. Der äußere Muttermund (Ostium uteri externu
Vagina hineinragende Teil der Zervix (Portio vaginalis cervicis) liegt bei der Ziege auf dem Boden der Scheide. Die Portio wird speziestypisch von dem kaudalsten der konzentrischen Faltenkränze, die die Verschlusseinrichtung der Zervix b
1). Des Weiteren beschreibt LEISER querstehende Schleimhautfalte auf de diese in eine Mulde einbettet.
Hinweis auf eine abgegrenzte Mulde unmittelbar vor der Portio.
Abb. 1: Cervix uteri der Ziege, dorsal eröffnet (aus: NICKEL et al. 1999)
2.1.5 Das Ejakulat des Ziegenbockes
Mittlere Werte für frisches Ziegenejakulat sind: 0,5 Spermienkonzentration und 65
SCHMIDT 2000).
2.2 Mechanismen der Interaktion im weiblichen Genitale
Beim Scheidenbesamer Rind mit einer geringe davon ausgegangen werden, dass
physiologische Barriere im weiblichen Genital
Uterus, abgesehen von den direkt an die Spermien gebundenen Bestandteilen, verhindert a
a´´
b b´´
c
Unruhe, Neugierde und Duldung. Üblicherweise werden Suchböcke zur Erkennung brünstiger KÜST u. SCHAETZ 1983).
anatomische Auffälligkeiten von Scheide und Gebärmutterhals dieser Stelle hingewiesen. Der äußere Muttermund (Ostium uteri externu
Vagina hineinragende Teil der Zervix (Portio vaginalis cervicis) liegt bei der Ziege auf dem Boden der Scheide. Die Portio wird speziestypisch von dem kaudalsten der konzentrischen Faltenkränze, die die Verschlusseinrichtung der Zervix bilden, umfasst (LEISER 1999
beschreibt LEISER (1999) bei der Ziege, ähnlich dem Schaf, eine querstehende Schleimhautfalte auf dem Scheidenboden, die der Portio vorgelagert ist und diese in eine Mulde einbettet. In der Literatur zur Anatomie des Rindes gibt es keinen Hinweis auf eine abgegrenzte Mulde unmittelbar vor der Portio.
: Cervix uteri der Ziege, dorsal eröffnet (aus: NICKEL et al. 1999)
Das Ejakulat des Ziegenbockes
Mittlere Werte für frisches Ziegenejakulat sind: 0,5 - 1 mL Ejakulatvolumen, Spermienkonzentration und 65 % vorwärtsbewegliche Spermien
Mechanismen der Interaktion im weiblichen Genitale
Beim Scheidenbesamer Rind mit einer geringen Ejakulatmenge von sehr großer Dichte kann gen werden, dass der Zervixmukus schon unmittelbar nach Insemination als physiologische Barriere im weiblichen Genitale den Übergang von Seminalplasma in den Uterus, abgesehen von den direkt an die Spermien gebundenen Bestandteilen, verhindert
a Corpus uteri
a´´ Ostium uteri internum b Cervix uteri
b´´ Ostium uteri externum c Vagina
Üblicherweise werden Suchböcke zur Erkennung brünstiger
en von Scheide und Gebärmutterhals der Ziege sei an dieser Stelle hingewiesen. Der äußere Muttermund (Ostium uteri externum) bzw. der in die Vagina hineinragende Teil der Zervix (Portio vaginalis cervicis) liegt bei der Ziege auf dem Boden der Scheide. Die Portio wird speziestypisch von dem kaudalsten der konzentrischen ilden, umfasst (LEISER 1999; Abb.
bei der Ziege, ähnlich dem Schaf, eine m Scheidenboden, die der Portio vorgelagert ist und In der Literatur zur Anatomie des Rindes gibt es keinen
mL Ejakulatvolumen, 2,5 x 106/µL
% vorwärtsbewegliche Spermien (GASSE 1999;
Mechanismen der Interaktion im weiblichen Genitale
Ejakulatmenge von sehr großer Dichte kann schon unmittelbar nach Insemination als den Übergang von Seminalplasma in den Uterus, abgesehen von den direkt an die Spermien gebundenen Bestandteilen, verhindert
(ROGDER 1975). Seminalplasma-Effekte, die lokal am Inseminationsort Vagina auftreten bzw. Mechanismen zur Weitervermittlung vom Inseminationsort aus sind also besonders in Betracht zu ziehen. ROBERTSON formulierte 2005, dass Effekte der Samenexposition über den unmittelbaren Deponierungsort hinausreichen und Veränderungen in anderen Organen und Systemen des weiblichen Körpers bewirken können.
Verschiedene Transportwege können an der Effektvermittlung nach vaginaler Substanzapplikation im weiblichen Genitale beteiligt sein. CICINELLI u.
DE ZIEGLER (1999) nennen bei der Frau: die Passage via Zervikalkanal (intrazervikale Aspiration), die Absorption in das venöse bzw. lymphatische Zirkulationssystem inklusive des Austausches von Substanzen nach dem Gegenstromprinzip und die direkte Gewebediffusion. Neben der vaskulären Versorgung sowie auf das lokale lymphatische System des weiblichen Genitale wird im Folgenden auch auf den sogenannten „first uterine pass effect“ kurz eingegangen. Des Weiteren finden in diesem Abschnitt die Mechanismen der physiologischen Selbstreinigung des Genitaltraktes (insbesondere die vaginale Clearance) Beachtung.
2.2.1 Blutgefäßsystem
Arterielles SystemDie arterielle Versorgung des weiblichen Genitale beim Rind ist in Abb. 2 veranschaulicht.
Die arterielle Versorgung der Beckenhöhlenorgane erfolgt über die A. iliaca interna, die als paariges Endgefäß aus der Aorta abdominalis hervorgeht (WAIBL u. WILKENS 1996).
Das Gefäßsystem des weiblichen Genitale ist komplex. So besteht beispielsweise eine Verbindung der A. vaginalis, die aus der A. iliaca interna zur Scheide zieht, über ihren R. uterinus mit der A. uterina im Bereich der Zervix (WAIBL u. WILKENS 1996). Die A. uterina versorgt den Uterus und anastomosiert mit ihren eigenen Ästen im Bereich der Uterushörner, um zusätzlich auch im Mesometrium mit der A. ovarica über deren R. uterinus in Verbindung zu stehen (WAIBL u. WILKENS 1996). Die vielfältigen Gefäßverbindungen gerade auf lokaler Ebene sind möglicherweise Voraussetzungen für Informationsaustausch und Wechselwirkungen zwischen den einzelnen Abschnitten des Genitals.
Venöses System
Die venöse Blutgefäßversorgung des weiblichen Genitals beim Rind begleitet im Wesentlichen das arterielle System. Eine Besonderheit ist die venöse Versorgung des Uterus.
Die Hauptvenen des Uterus sind die Rr. uterini der V. ovarica und der V. vaginalis sowie die V. vaginalis accessoria beim Rind, wohingegen die V. uterina, das Begleitgefäß der A. uterina, funktionell unbedeutend sein soll (WAIBL u. WILKENS 1996). Des Weiteren beschreiben WAIBL u. WILKENS (1996) beim Rind ein starkes längsgerichtetes Venengeflecht der genannten Gefäße an der Ventralwand des Geschlechtstraktes. Auch im Bereich des venösen Systems scheinen also physiologische Voraussetzungen zur lokalen Vermittlung von Stimuli im weiblichen Genitale gegeben.
Abb. 2: Ausgewählte Arterien am weiblichen Genitale des Rindes (modifiziert nach Bild- und Textangaben aus: NICKEL et al. 1996)
Austausch nach dem Gegenstromprinzip
Im weiblichen Genitale ist ein lokaler, vaskulärer Austausch von Substanzen nach dem Gegenstromprinzip (“counter-current exchange”) möglich. So ist beispielsweise für das Schaf ein Übergang von biologisch wirksamen Substanzen wie PGF2α von der V. uterina in die
A. ovarica bekannt (McCRACKEN 1980). Durch diesen Mechanismus kann PGF2α vom Uterus direkt zum Ovar geführt werden und dort einen luteolytischen Effekt ausüben (GINTHER 1974; BAIRD 1987). Über den Gegenstromaustausch verschiedener weiterer Substanzen wie Testosteron, Östradiol, Progesteron und Oxytozin wird bei Schwein und Schaf berichtet (KRZYMOWSKI et al. 1981; KOTWICA et al. 1982; SCHRAMM et al. 1986).
Auch in Bezug auf die Effekte des Seminalplasmas wird dieser Gegenstromaustausch diskutiert. So vermutet ROBERTSON (2005) unter anderem die Vermittlung des counter- current Mechanismus bei einer, nach genitalem Seminalplasmastimulus beobachteten, erhöhten Makrophagenpopulation in den Corpora lutea der Maus (GANGNUSS et al. 2004) bzw. dem von WABERSKI et al. (1997) bei östrischen Sauen festgestellten verkürzten Intervall zwischen LH-Peak und Ovulation.
Schematisch zeigt Abb. 3, wie die Exposition des Uterus mit Seminalplasma die Entwicklung des Corpus luteum am Ovar beeinflussen kann. Seminalplasma induziert über seinen Östrogenbestandteil die Prostaglandinsynthese des porcinen Endometriums (CLAUS 1990), welche gleichzeitig über eine erhöhte Transkription der Cyclooxygenase-2-mRNA gefördert wird (O´LEARY et al. 2004). Das synthetisierte PGF2α gelangt per Gegenstromaustausch zwischen den Gefäßen zum Ovar, ist in der Follikelflüssigkeit nachweisbar und beeinflusst dort den Gelbkörper (CLAUS 1990; ROBERTSON 2007).
Abb. 3: Substanzaustausch nach dem Gegenstromprinzip am weiblichen Genitale nach Exposition mit Seminalplasma (COX-2 = Cyclooxygenase-2; PGE2 = Prostaglandin E2; Schematische Darstellungaus: ROBERTSON 2007)
2.2.2 Lokales Lymphsystem
Das Lymphgefäßsystem des weiblichen Genitale beim Rind ist in Abb. 4 dargestellt. Lymphe aus Uterus, Vagina und Vulva fließt zu den Nll. sacrales und Nll. hypogastrici, welche als Gruppe in den Anfangsabschnitten der Aa. iliacae internae lokalisiert sind. Auch gelangt Lymphe vom Uterus zum Nl. iliofemoralis, dem großen inneren Darmbeinlymphknoten, der am vorderen Rand der A. iliaca externa gelegen ist (VOLLMERHAUS 1996). Der weitere Lymphabfluss erfolgt vom Nl. iliofemoralis Richtung Nll. iliaci mediales und Truncus lumbalis. Zum Drainagegebiet der Nll. iliaci mediales, direkt vor der Aufteilung der Aorta in die Aa. iliacae externae, gehören unter anderem die Eierstöcke des Rindes. Die Nll. inguinales superficiales nehmen unter anderem Lymphzuflüsse aus dem Bereich Euter, Scham, Scheidenvorhof und Klitoris auf, welche dann Richtung Nl. iliofemoralis weitergeleitet wird (VOLLMERHAUS 1996).
Die physiologischen Voraussetzungen zur lokalen Kommunikation über die Lymphgefäße im weiblichen Genitale sind gegeben und so vermuten CICINELLI u. DE ZIEGLER (1999) auch eine Beteiligung des humanen lymphatischen Systems als Transportweg für vaginal applizierte Substanzen. Konkreter hält ROBERTSON (2005) nach ihren Erkenntnissen beim Menschen und bei der Maus das lokale Lymphsystem mit wandernden inflammatorischen Zellen für eine mögliche Route zur Vermittlung von Seminalplasmaeffekten im weiblichen Genitale.
2.2.3 „First uterine pass effect“
Die in der Literatur als „first uterine pass effect“ beschriebene Beobachtung kennzeichnet eine selektive Anreicherung von vaginal applizierten Substanzen in der Gebärmutter. Ein lokaler und direkter Transportmechanismus von Vagina zu Uterus wird hinter diesem Phänomen der selektiven Anreicherung vermutet (DE ZIEGLER et al. 1997). Einen lokalen Kommunikationsweg zwischen Uterushorn und angrenzendem Ovar legen auch Studien mit unilateral ligiertem Uterushorn („Mariensee-Modell“) beim Schwein nahe (WABERSKI et al. 1995). Für das Rind liegen derzeit keine Untersuchungen zum „first uterine pass effect“
vor, weshalb nachfolgend auf Untersuchungen aus der Humanmedizin eingegangen wird.
Voraussetzung für einen lokalen Transportmechanismus im weiblichen Genitale ist die vaginale Absorption. In ihrem Übersichtsartikel nennen BENZINGER u. EDELSON (1983)
diverse Substanzgruppen für die eine vaginale Absorption bei der Frau bekannt ist:
Prostaglandine, Steroide, Antibiotika, Proteine, Antigene und auch anorganische Komponenten.
Abb. 4: Übersicht der Lymphdrainage am weiblichen Genitale des Rindes (modifiziert nach Bild- und Textangaben aus: NICKEL et al. 1996)
Konkreter verglichen CICINELLI et al. (1993) die Auswirkungen der vaginalen mit der nasalen (Spray) Administration von Progesteron bei Frauen. Beide Applikationsrouten führten zu vergleichbaren Serumleveln, die sekretorische Transformation des Endometriums war jedoch unterschiedlich stark ausgeprägt. Nach vaginaler Applikation zeigte sich eine stärkere funktionelle Beeinflussung des Uterus. Ursache hierfür scheint eine erhöhte lokale Gewebekonzentration bestimmter Substanzen im Uterus nach vaginaler Applikation zu sein.
Beispielsweise maßen DE ZIEGLER et al. (1997) zehnfach höhere Gewebskonzentrationen für Progesteron nach vaginaler Applikation im Vergleich zur systemischen Applikation.
MILES et al. (1994) verglichen, ebenfalls bei Frauen, die vaginale mit der intramuskulären Progesterongabe und vermerkten dabei ebenfalls einen erheblichen Unterschied in der Gewebskonzentration im Endometrium (11,5 ± 2,6 ng/ml nach vaginaler und 1,4 ± 0,4 ng/ml nach i.m. Aplikation), während die Serumkonzentrationen sich gegenteilig verhielten (11,9 ± 1,2 ng/ml nach vaginaler und 69,8 ± 5,9 ng/ml nach i.m. Applikation).
Der „first uterine pass effect“ beim Menschen ist auch für andere Substanzen beschrieben. So untersuchten MIZUTANI et al. (1995) die orale und vaginale Gabe von Danazol, eines Testosteronderivats. Durch die vaginale Administration wurden zur vierfachen oralen Dosis (400 mg/Tag oral zu 100 mg/Tag) vergleichbare Uterusgewebskonzentrationen erreicht.
2.2.4 Vaginale Clearance
Über die (zeitlichen) Abläufe der physiologischen Selbstreinigung der Vagina, der sogenannten vaginalen Clearance, ist nicht viel bekannt. Es kommen allgemein verschiedene Eliminationswege für in der Vagina deponierte Substanzen beim Scheidenbesamer in Frage:
Der Ausfluss bzw. die Ausstoßung über die Vulva, insbesondere im Zusammenhang mit der Miktion, macht vermutlich einen wesentlichen Anteil an der vaginalen Clearance aus.
Abhängig vom Zyklusstadium und damit vom Öffnungsgrad der Zervix sowie der Myometriumsaktivität kann ein Teil der vaginal deponierten Substanz über den sich anschließenden Genitaltrakt bis in die Bauchhöhle (Cavum abdominis) gelangen (ITURRALDE u. VENTER 1981). Außerdem ist ein Übergang in das umliegende Gewebe der Vagina, je nach Permeabilität des Gewebes (siehe auch Kapitel 2.1.1.
„Reproduktionszyklus und Anatomie des weiblichen Rindes) und den Eigenschaften der deponierten Substanz, möglich.
Als beeinflussende Faktoren der uterinen Clearance werden die Aufweitung der Zervix, die Aktivität des Myometriums und die lymphatische Drainage beim Uterusbesamer Pferd identifiziert (KATILA 1996). Beim Scheidenbesamer Mensch konzentrieren sich Untersuchungen zur Persistenz von Ejakulatbestandteilen in der Scheide vor allem auf die forensischen Aspekte des Spermiennachweises (SILVERMAN u. SILVERMAN 1978;
WILLOTT u. ALLARD 1982; HAIMOVICI u. ANDERSON 1995). Neben den Spermatozoen haben DAVIES u. WILSON (1974) aber auch die Nachweisbarkeit der Sauren Phosphatase (AP) sowie Blutgruppen-Antigene des Seminalplasmas in der humanen Vagina
untersucht und konnten beide innerhalb von 48 h p.c. sicher nachweisen. Den Test auf Saure Phosphatase sehen HAIMOVICI u. ANDERSON (1995) allerdings als nur eingeschränkt aussagekräftig an, da diese auch in vaginalen Sekreten enthalten sein kann.
Für das Rind ist ein Maximum an Spermatozoen in der Vagina 1 - 2 h p.i. bzw. p.c.
(DOBROWOLSKI u. HAFEZ 1970; HAWK 1983) beschrieben. DOBROWOLSKI u.
HAFEZ (1970) vermerken bei ihren Untersuchungen an geschlachteten Rindern zudem einen deutlichen Abfall der Spermienzahlen innerhalb von 24 h nach der künstlichen Insemination im Bereich der Vagina. HAWK (1983) hält in seinem Übersichtsartikel zum Spermientransport im weiblichen Genitale fest, dass, obgleich ein kleiner Teil des Spermien bereits innerhalb von Minuten die Ovidukte erreicht, ein Großteil des Inseminates bei Rindern, Schafen, Ziegen und Kaninchen zunächst benachbart zum Ort der Insemination (Vagina und Zervix) verbleibt. Der Autor benennt den Spermienrückfluss von der Zervix in die Vagina als wahrscheinlich größten Abgang des zervikalen Spermienpools.
2.3 Seminalplasma
2.3.1 Produktion von Seminalplasma
Der Begriff Seminalplasma kennzeichnet die Sekrete der akzessorischen Geschlechtsdrüsen und damit die Flüssigphase des Ejakulats. Synonyme sind Samenplasma, Spermaplasma und Samenflüssigkeit (SCHMIDT 2000; LIEBICH 2004). Bei den akzessorischen Geschlechtsdrüsen (Glandulae genitales accessoriae) handelt es sich um eine Gruppe exokriner Drüsen, die ihr Sekret dorsal in das Beckenstück der Harnröhre abgeben (GASSE 1999).
Der Bulle hat vier akzessorische Geschlechtsdrüsen, von kranial nach kaudal: die beiden Samenleiterampullen (Ampulla ductus deferentis), die paarige Samenblasendrüse (Glandula vesicularis), die Vorsteherdrüse (Prostata) und die paarige Harnröhrenzwiebeldrüse (Glandula bulbourethralis; GASSE 1999; BERG 2000; Abb. 5). Diese Geschlechtsdrüsen liefern die größte Komponente des Spermas, bestimmen das Volumen des Ejakulats und schaffen für die Spermien das optimale Stoffwechselmilieu (GASSE 1999).
Scheidenbesamer, wie Bulle und Ziegenbock, haben kleinere Ejakulatvolumina als Uterusbesamer (MANN u. LUTWAK-MANN 1981; WABERSKI 2007). Die Sekretanteile
1 Vesica urinaria 2 Ureter
3 Plica genitalis 4 Ductus deferens mit
Ampulla ductus deferentis 5 Glandula vesicularis
6 Glandula prostatica (Corpus) 7 M. urethralis
8 Glandula bulbourethralis 9 Bulbus penis
der einzelnen Drüsen im Gesamtejakulat wechseln innerhalb der Ejakulatfraktionen und die Abgabe der akzessorischen Geschlechtsdrüsen verläuft nicht simultan (GASSE 1999). Für die Samenblasendrüse gibt BERG (2000) einen Sekretanteil am Gesamtejakulat von 25 - 30 % beim Bullen und 7 - 8 % beim Ziegenbock an.
Abb. 5: Akzessorische Geschlechtsdrüsen des männlichen Rindes (aus: NICKEL et al. 1999)
2.3.2 Bestandteile des Seminalplasmas
Das Seminalplasma zeigt sowohl im Volumen als auch in den Inhaltsstoffen, abhängig von der tierartlichen Ausprägung der akzessorischen Geschlechtsdrüsen, deutliche Unterschiede (WABERSKI 2007). MANN u. LUTWAK-MANN (1981) geben eine Übersicht von im Seminalplasma enthaltenen Substanzen, wovon Tab. 1 einen Auszug zeigt. Im Seminalplasma sind darüber hinaus Östrogene, Androgene, FSH, LH, Prolaktin, hCG und diverse Prostaglandine enthalten(VENTURA u. FREUND 1973; NEY 1986; WABERSKI 2007).
Wie es jedoch RODGER bereits 1975 formulierte: „The proceeding discussion suggests that in any approach to the question of the role of a seminal plasma constituent the answer probably lies within the female tract, for it is after all within this tract that the spermatozoa fulfill the function for which they were produced.” beschäftigt sich die vorliegende Arbeit mit den Auswirkungen einer Seminalplasmaapplikation im weiblichen Genitale auf die
Fruchtbarkeit, so dass bezüglich der weiteren Bestandsaufnahme und Charakterisierung von Seminalplasmabestandteilen an dieser Stelle auf vorhandene Literatur (MANJUNATH u.
SAIRAM 1987; WEHRLE 2000; CALVETE u. SANZ 2007; MANJUNATH et al. 2007;
RODRIGUEZ-MARTINEZ et al. 2011) verwiesen wird.
Tab. 1: Zusammensetzung des Seminalplasmas (Auszug aus: MANN u. LUTWAK-MANN 1981) Menge in mg/100ml Bulle Schafsbock
Gesamt-Stickstoff 440 - 1170 900
Natrium 150 - 370 180
Kalium 50 - 380 90
Kalzium 24 - 60 9
Magnesium 8 6
Chlorid 150 - 390 180
Fruktose 300 - 1000 150 - 660
Sorbitol 10 - 136 26 - 120
Inositol 24 - 46 10 - 15
Ergothionein Spuren Spuren
Glycerylphosphorylcholin 110 - 500 1 600 - 2 000 Zitronensäure 350 - 1 000 300 - 800
Milchsäure 20 - 50 35
Brenztraubensäure 5 10
Ascorbinsäure 6 5
Kreatin 12 15
Bicarbonat(ml CO2/100ml) 16 16
2.3.3 Methoden zur Seminalplasmagewinnung und -aufbewahrung
Die Zentrifugation von Ejakulat ist das Mittel der Wahl um Seminalplasma zu gewinnen. Eine weitere Option zur Seminalplasmagewinnung ist die Nutzung vasektomierter Tiere, wie unter anderem von GARNER et al. (2001) und ODHIAMBO et al. (2009) für Bullen angeführt.
Eine Übersicht durchgeführter Ejakulatzentrifugationen zur Seminalplasmagewinnung von Wiederkäuern sowie der genutzten Aufbewahrungstemperatur zeigt Tab. 2.
Tab. 2: Übersicht zur Seminalplasmagewinnung und -aufbewahrung Tierart Beschleunigung
(g) Dauer
(min) Aufbe- wahrung
(°C)
Quelle
Rind 1000
10.000 20
30 4
-20 STRZEMIENSKI 1989
Rind 10.000 30 -100 WOLFE et al. 1993
Rind 3000 30 -70 GILBERT u. FALES 1996
Rind 1000 10 -196 ODHIAMBO et al. 2009
Schaf 1400 10 -30 BELIBASAKI et al. 2000
2.4 Seminalplasmaeffekte auf das weibliche Genitale und die Fruchtbarkeit
2.4.1 Überblick über die Funktionen im weiblichen Genitale
Speziesübergreifend gehören zu den wesentlichen Funktionen des Seminalplasmas im weiblichen Genitale laut eines Übersichtsartikels von ROBERTSON (2005):
• Die Förderung der Überlebensfähigkeit der Spermien,
• die Induktion einer Immunantwort zur Ausbildung der Konzeptustoleranz und
• das Organisieren der Endometriumsveränderungen zur Unterstützung der embryonalen Entwicklung und Implantation.
Das Vorhandensein von Seminalplasma im weiblichen Genitale bei der Paarung scheint nach heutiger Sicht unmittelbar verknüpft mit dem Zustandekommen einer Trächtigkeit bei diversen Spezies. Seminalplasma ist nicht nur Transportmedium für Spermien, sondern wird als Kommunikationsmittel zwischen männlichem und weiblichem Reproduktionsgewebe gesehen. Es beeinflusst den weiblichen Genitaltrakt auf vielfältige Weise zur Bereitstellung eines optimalen Milieus für die nachfolgende Trächtigkeit (ROBERTSON 2005). Auf die Funktionen des Seminalplasmas wird in den folgenden Kapiteln im Detail eingegangen.
Eingangs erfolgt eine Erörterung aus evolutionärer Sicht. Anschließend sind die Auswirkungen folgendermaßen gegliedert: immunmodulatorische, psychobiologische, systemische Effekte, Effekte auf Uterusmotilität und Samenretention, auf das Ovar, auf die Trächtigkeit und beobachtete Auswirkungen nach Entfernung der akzessorischen Geschlechtsdrüsen.
2.4.2 Evolutionäre Aspekte
Seminalplasma-Effekte auf das weibliche Tier können nicht nur bei Säugetieren, sondern auch bei Insekten beobachtet werden (GILLOTT 2003). Die bei vielen Spezies belegten Auswirkungen des Seminalplasmas sprechen dafür, dass dieses ein wichtiges Hilfsmittel bei der Interaktion zwischen männlichem und weiblichem Individuum darstellt (ROLDAN et al. 1992; ROBERTSON 2005).
Das männliche Tier soll über die Applikation der Sekrete seiner akzessorischen Geschlechtsdrüsen im weiblichen Genitale weitreichende Effekte bei der Paarungspartnerin bewirken und so die Wahrscheinlichkeit des Zustandekommens einer Trächtigkeit nach
erfolgter Paarung erhöhen (ROBERTSON 2005). Da unter den Säugetieren bei über 90 % der Spezies pro Männchen Paarungen mit mehreren Weibchen erfolgen, ist der Selektionsdruck hoch, jede Paarung mit größtmöglichem Erfolg zu versehen (ROLDAN et al. 1992). Eine Varianz seitens des männlichen Individuums in der Reaktionsauslösung im weiblichen Genital ist die Voraussetzung für postkopulatorische Fortpflanzungsstrategien (ZEH u.
ZEH 2001).
Das Sekret der akzessorischen Geschlechtsdrüsen kann vor diesem Hintergrund als äußerst erfolgreiche männliche postkopulatorische Reproduktionsstrategie gesehen werden (ROLDAN et al. 1992), da dieses durch Interaktion mit dem weiblichen Genitaltrakt die Trächtigkeit über den Zeitpunkt der Paarung hinaus beeinflussen kann. Gleichzeitig soll die Seminalplasmaapplikation dem weiblichen Organismus eine Abschätzung der Fitness und der Kompatibilität des Männchens mit den Entscheidungsmöglichkeiten Toleranz oder Abstoßung erlauben, bevor eigene Ressourcen eingesetzt werden (ZEH u. ZEH 2001).
2.4.3 Immunmodulatorische Effekte
Die immunmodulatorischen Effekte des Seminalplasmas lassen sich in stimulierende und supprimierende Effekte einteilen. Sie beruhen zum einen auf Mediatorsubstanzen, die im Seminalplasma enthalten sind und direkt und eigenständig immunmodulatorisch wirken sollen. Zum anderen induziert Seminalplasma lokal im weiblichen Genitale die Exprimierung immunmodulatorischer Mediatoren und beeinflusst so indirekt das weibliche Immunsystem.
Immunmodulatorische Mediatorsubstanzen des Seminalplasmas, wie TGF-ß, Zytokine und Prostaglandine, interagieren mit Epithelzellen von Zervix und Uterus zur Induktion von zellulären und molekularen Veränderungen, die der klassischen Entzündungskaskade ähneln und benannt werden als „post-inseminationem inflammatory response“ (TROEDSSON et al. 2000; TÖPFER-PETERSEN 2007). Bei dieser immunologischen Signalkaskade handelt es sich um inflammatorische, nichtadaptive Reaktionen. Die Aktivierung der angeborenen Immunität führt bei Stuten, Sauen und Mäuseweibchen innerhalb von wenigen Stunden zu lokalem Leukozyteneinstrom, Ödematisierung und Hyperämie (TUNON et al. 2000;
JOHANSSON et al. 2004; O´LEARY et al. 2004, 2006). So stimuliert seminaler TGFß1 die GM-CSF-Produktion des Mäuseuterus und die Infiltration mit inflammatorischen Zellen (TREMELLEN et al. 1998). Die postinseminatorische Entzündungsreaktion führt in der Regel
nicht zur Embryoabstoßung, sondern scheint den Uterus sogar auf die Implantation des Embryos vorzubereiten und Voraussetzung für eine erfolgreiche Implantation zu sein (JOHANSSON et al. 2004; O´LEARY et al. 2004, 2006; TÖPFER-PETERSEN 2007).
Seminalplasma hat neben den immunstimulierenden auch immunsuppressive Wirkungen, indem es die Funktionsfähigkeit einzelner Komponenten des Immunsystems hemmt.
Supprimiert werden in ihrer Funktion T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen, Makrophagen und das Komplementsystem (LORD et al. 1977; JAMES u. HARGREAVE 1984; QUAYLE et al. 1987). So wurde beispielsweise von QUAYLE et al. (1987) an humanen T-Lymphozyten eine reduzierte Expression des IL-2R, welcher an der Aktivierung der ruhenden T-Zellen beteiligt ist, beobachtet. TROEDSSON et al. (2000) und ROZEBOOM et al. (2001) benennen und zeigten anhand von in vitro Experimenten eine durch Seminalplasma ausgelöste Suppression von Komplement-Aktivierung, PMN-Chemotaxis und Phagozytose für die Spezies Pferd und Schwein. Außerdem wurde ein durch Seminalplasma verkürzter, nicht jedoch reduzierter Leukozyteneinstrom in den Uterus registriert (TROEDSSON et al. 2001).
ROBERTSON et al. (1997) beobachteten nach Seminalplasmaapplikation bei weiblichen Mäusen eine herabgesetzte Empfindlichkeit der Typ-1 Immunität gegenüber männlichem MHC-Antigen und sehen darin die Induktion einer Immuntoleranz gegenüber spezifischen männlichen Antigenen durch Seminalplasma.
Die immunregulatorischen Wirkungen des Seminalplasmas gehen über eine direkte Stimulierung bzw. Supprimierung durch eigene Inhaltsstoffe hinaus. Aufgrund einer Seminalplasmaexposition werden auch die uterinen Epithelzellen selbst zur Expression von proinflammatorischen Zytokinen und Chemokinen wie IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, Interferon-γ, CXCL-8, LIF und GM-CSF anregt (Mensch: GUTSCHE et al. 2003; ROBERTSON et al.
2003; Maus: JOHANSSON et al. 2004; Schwein: O´LEARY et al. 2004).ROBERTSON (2005) zeigt hierzu eine Übersicht der Signalwege (Abb. 6) und nennt neben der Immunregulierung auch die Modellierung des Endometriumgewebes als eine Auswirkung der Seminalplasmaexposition.
Das Zytokin GM-CSF beispielsweise zählt zu den embryotropen Zytokinen und wirkt durch Inhibition der Apoptose sowie eine erleichterte Glukoseaufnahme der Blastomeren auf die Blastozystenformation des präimplantierten Mäuseembryos (ROBERTSON u. SHARKEY
2001). Auch SJÖBLOM et al. (1999) berichten über positive Auswirkungen von GM-CSF auf die Entwicklung humaner Blastozysten in vitro. CLARKE (1984) nennt sogar immunmodulatorische Auswirkungen der Samenexposition auch außerhalb des Reproduktionstraktes am weiblichen Tier und stellt fest, dass diese von zentraler Bedeutung für den Ablauf der Thymusveränderungen ist, die mit einer Trächtigkeit einhergehen.
Abb. 6: Signalwege im weiblichen Genital nach Seminalplasmaexposition (GM-CSF = Granulocyte- macrophage colony-stimulating factor; IL-6 = Interleukin 6; LIF = Leukemia inhibitory factor;
aus: ROBERTSON 2005)
2.4.4 Systemische Effekte
Der Übergang von vaginal applizierten Substanzen bzw. Bestandteilen des Seminalplasmas in den peripheren Blutkreislauf ist bekannt (KELLER et al. 1981; BENZINGER u. EDELSON 1983; JACOBSEN et al. 1984; NEY 1986; CLAUS 1990). Eine förderliche Rolle bei der Absorption von vaginal applizierten Substanzen spielen möglicherweise sogenannte Permeabilitätsenhancer, Substanzen zur Beeinflussung der Gewebedurchlässigkeit.
Beispielsweise ist das im Seminalplasma enthaltene Citrat ein Permeabilitätsenhancer, der geeignet ist die Barriereeigenschaften von Zell-Zell-Verbindungen der Vaginalschleimhaut zu beeinflussen und parazelluläre Diffusion zu zulassen. (MANN u. LUTWAK-MANN 1981;
OKADA et al. 1982, 1983;CHO et al. 1989). Die Voraussetzungen für systemische Effekte
des Seminalplasmas sind gegeben und insbesondere sind die Auswirkungen auf die Hormonsekretion der Hypophyse untersucht.
In einem Bioassay aus Hypophysenzellen der Ratte konnten PAOLICCHI et al. (1999) durch Zugabe von Seminalplasma des Alpakas eine signifikant gesteigerte LH-Sezernierung erzielen, was die Autoren als Hinweis sehen, dass Seminalplasmafaktoren an der LH- Sekretion und damit an der induzierten Ovulation des Alpaka beteiligt sind.LI et al. (2002) maßen die Konzentrationen von LH, FSH, Oestradiol-17ß und Progesteron im Blutplasma von Trampeltieren (Camelus bactrianus, induzierter Ovulator) vor und nach intramuskulärer Seminalplasmaapplikation. Fünf Stunden nach intramuskulärer Applikation waren die LH- Konzentrationen in der Seminalplasmagruppe signifikant erhöht, auf die anderen Hormonkonzentrationen zeigte sich kein Effekt.
ADAMS et al. (2005) identifizierten einen ovulationsauslösenden Faktor (OIF) im Seminalplasma von Lama und Alpaka, welchen RATTO et al. (2006) auch für das Seminalplasma des Bullen belegten. Im Ejakulat des Lamas (Lama glama) sind circa 3 mg enthalten (TANCO 2008). Der OIF wirkt speziesübergreifend und ist sowohl bei Reflex- als auch Spontanovulatoren konserviert, wie RATTO et al. (2006) anhand der ovulationsauslösenden Wirkung einer intramuskulären Applikation von Bullen- Seminalplasma bei weiblichen Lamas beweisen konnten.
2.4.5 Effekte auf die Uterusmotilität und Samenretention
Aus Untersuchungen zur Uterusmotilität ist bekannt, dass diese nicht nur durch den Akt der Bedeckung sondern auch durch die Deponierung des Samens beeinflusst wird. Verschiedenen Bestandteilen des Seminalplasmas wird eine motilitätsstimulierende Wirkung zugeschrieben und die zyklusabhängige Richtung der Kontraktionswellen bestimmt Verweildauer und -ort des Ejakulates.
Die Uterusmotilität des Rindes unterliegt, in Abhängigkeit vom Sexualzyklus, Schwankungen, deren Kontraktionskurven insbesondere für den Östrus weitestgehend typisch sind. Im Östrus und frühen Postöstrus verlaufen die Kontraktionswellen von der Zervix zu den Tuben (DÖCKE 1962). Neben kurzzeitigen Motilitätspeaks bereits bei Sichtkontakt mit dem Bullen sowie beim Beriechen der Vulva, beim Aufsprung und bei der Kopulation,
konnten VAN DEMARK u. HAYS (1952) deutlich verstärkte Uteruskontraktionen bei der Ejakulation feststellen. Die Aktivierung der Uterusmotilität, mittels Ballonkymograph gemessen, war im Östrus stärker ausgeprägt als im Postöstrus. Der Deckakt bewirkt laut DÖCKE (1962) in allen Zyklusphasen beim weiblichen Rind eine wesentlich stärkere Uteruskontraktion als die Künstliche Besamung.
In seinen Versuchen zur Reaktion des porcinen Uterus auf Infusion mit eberspermaähnlichen Östrogenmengen wies CLAUS (1990) eine erhöhte Myometriumsaktivität nach. Das im Seminalplasma enthaltene Prostaglandin hat einen stimulatorischen Effekt auf die uterinen glatten Muskelzellen bei Mensch und Schaf (EULER 1936, BYGDEMAN u.
ELIASSON 1963). VENTURA (1969) wies eine Aktivierung der Uterusmuskulatur durch Samen bzw. Sekrete der seitlichen und hinteren Anteile der Prostata der Ratte in vitro nach. In einer weiteren Untersuchung des Autors am isolierten Rattenuterus zeigte sich 1 mL Rattenejakulat hinsichtlich der spasmogenen Eigenschaften äquivalent zu 200 ng PGE1
(VENTURA u. FREUND 1973). Allerdings sehen VENTURA u. FREUND (1973) nicht allein die Prostaglandine als Urheber der Uterusaktivierung, sondern vielmehr spasmogene Substanzen, die chemisch und physikalisch den Gangliosiden ähneln.
Die intrakorporale und endoskopisch intrauterine Besamung auf die Papille löst, im Vergleich zur unbesamten Kontrollgruppe, eine signifikant stärkere mittlere Kontraktionsaktivität der Gebärmutter aus, stellte KÖLLMANN (2004) in ihren ultrasonographischen Untersuchungen an Stuten fest. Ein Zusatz von 4 mL Verdünnermedium führte nicht zu einer, der Spermadosis vergleichbaren, Kontraktionsaktivität. Der Zusatz von 3,5 mL Seminalplasma zur Inseminationsdosis dagegen verursachte bei Stuten eine signifikant höhere Kontraktionsfrequenz, wie PORTUS et al. (2005) ebenfalls per Ultrasonographie 10 min und 6 h post inseminationem ermittelten.
2.4.6 Effekte auf das Ovar und den Gelbkörper
Die beschriebenen Seminalplasmaeffekte am Ovar reichen von der Vorverlegung bzw.
Auslösung der Ovulation über die Atresie des dominanten Follikels bzw. größeren präovulatorischen Follikeln bis hin zu erhöhter Progesteronproduktion und vergrößerter Makrophagenpopulation in den Corpora lutea.
Vorangestellt einige Erkenntnisse bei Insekten: Bei Melanoplus sanguinipes (Grashüpferart) üben Komponenten der akzessorischen Geschlechtsdrüsen eine Triggerfunktion für die Oviposition aus. Dadurch sind die Weibchen der Spezies in der Lage, ovulierte Eier in den lateralen Eileitern für kurze Zeit aufzubewahren, bis die Umstände zur Eiablage günstig sind (YI u. GILLOTT 2000). Sogenannte „fecundity-enhancing substances“ (FES) der männlichen akzessorischen Geschlechtsdrüsen der Fruchtfliegen (Drosophila) stimulieren die Ovulation und/oder die Oviposition (Eileiterperistaltik zum Eitransport) und bewirken so eine Erhöhung der Fruchtbarkeit. Auch gibt es Hinweise zur beschleunigten Eientwicklung bei Anwesenheit der Drüsensekrete (GILLOTT u. FRIEDEL 1977, GILLOTT 2003).
Bei Sauen fanden WABERSKI et al. (1997) ebenfalls eine Vorverlegung der Ovulation nachdem eine Seminalplasmainfusion in den Uterus (Modell Mariensee) durchgeführt wurde.
Hier betrug die Vorverlegung durchschnittlich 10,7 (8 - 14) h. Außerdem konnte bei den östrischen Sauen dieser Studie ein verkürztes Intervall zwischen LH-Anstieg und Ovulation nach der Seminalplasmaapplikation festgestellt werden.
In einer Studie beim Trampeltier (Camelus bactrianus) induzierte durch Zentrifugation gewonnenes, vaginal appliziertes Seminalplasma die Ovulation bei 75 % der Kamelstuten.
Das Sekret vasektomierter Kamelhengste, teils mittels künstlicher Vagina gewonnen und teils durch natürliche Bedeckung appliziert, führte bei 100 % der Stuten zur Ovulation. Dagegen hatte die vaginale Applikation einer konzentrierten Spermiendosis keinen ovulationsinduzierenden Effekt (CHEN et al. 1985). Nach intramuskulärer Applikation von Seminalplasma, ebenfalls an Trampeltieren durchgeführt, erfolgt die Ovulation 30 - 40 h später, was demselben Zeitraum wie nach Koitus oder artifizieller Insemination entspricht (LI et al. 2002).
Bei Koalas (Phascolarctos cinereus) wurde ein signifikanter Effekt der Samenexposition des weiblichen Genitals auf die Induktion der Lutealphase festgestellt (JOHNSTON et al. 2004).
Die genitale Stimulation ohne Anwesenheit von Samen reichte nicht aus.
Für das Rind beschrieb MARION (1950) eine signifikante Vorverlegung des Ovulationszeitpunktes um 2,2 h, wenn die Färsen innerhalb der ersten 6 - 8 h der klinischen Brunst durch einen vasektomierten Bullen gedeckt wurden. TANCO (2008) führte Studien zu
Auswirkungen des ovulationsauslösenden Faktors (OIF) beim Rind sowie zur Beeinflussung der OIF-Dosis beim Lama durch. Die intramuskuläre Applikation von aufgereinigtem Ovulationsauslösenden Faktor aus dem Ejakulat von Lamas (Lama glama) induzierte beim Rind die Atresie des dominanten Follikels und eine Vorverlegung der nächsten Follikelwelle, jedoch keine Ovulation. Weiterhin stellte die Autorin eine dosisabhängige Beeinflussung der Ovulation durch den OIF bei Lamas fest: Je höher die OIF-Dosis (60 - 500 µg), desto höher Ovulationsinzidenz, desto größer der maximale Corpus luteum Durchmesser und desto höher die Progesteron- und LH-Konzentrationen im Plasma.
Bei Sauen wurden die Auswirkungen einer transzervikalen, intrauterinen Seminalplasmaexposition auf die Ovarien anhand von Ovulationsrate, Anzahl und Größe der Corpora lutea, ovarieller Leukozytenpopulation und Progesteronproduktion untersucht. Hier fanden sich eine verstärkte Rekrutierung von Leukozyten (vornehmlich Makrophagen) im Eierstocksgewebe, Zunahmen der Gelbkörpergröße und erhöhte Progesteronkonzentrationen im Plasma, wohingegen die Anzahl der Ovulationen nicht beeinflusst war (O´LEARY et al. 2006). GANGNUSS et al. (2004) untersuchten den Makrophagenanteil in den Gelbkörpern von Mäusen nach Paarung der Weibchen mit vasektomierten Männchen. Die Autoren stellten bei Abwesenheit von Seminalplasma in den ersten vier Tagen nach der Paarung eine reduzierte Rekrutierung der Makrophagenpopulation fest, die nicht von Auswirkungen auf die Progesteronkonzentration im Serum der Weibchen begleitet wurde.
2.4.7 Effekte auf Implantation, embryonale Mortalität und Trächtigkeit
Untersuchungen an Schweinen zeigen, dass eine Seminalplasmaapplikation zu erhöhten Embryonenzahlen sowie verbesserten Konzeptions- und Abferkelraten führt. An Mäusen wurden nach Paarung mit Männchen ohne Seminalvesikel verminderte Implantationsraten festgestellt. In der Humanmedizin steht vor allem die Seminalplasmaapplikation zur Verbesserung der assistierten Reproduktion im Fokus der Untersuchungen. An Rindern wurde eine Studie durchgeführt, die eine geringe Menge von 0,5 mL Seminalplasma der Inseminationsdosis hinzufügte (ODHIAMBO et al. 2009).ROZEBOOM et al. (2000) erzielten bei Sauen nach vorangegangenem inflammatorischem Stimulus (tote Spermatozoen oder LPS, intrauterin) durch Zugabe von 100 mL Seminalplasma zur Inseminationsdosis signifikant höhere Konzeptions- und Abferkelraten im
Vergleich zur Insemination mit Verdünnermedium. O´LEARY et al. (2004) beobachteten nach intrauteriner Infusion von 100 mL Seminalplasma bei Sauen signifikant erhöhte Embryonenzahlen und eine verbesserte Embryoentwicklung, gemessen anhand der mittleren Anzahl der Blastomeren bzw. des Embryonendurchmessers an den Tagen 5 bzw. 9 d p.i. im Vergleich zur Kontrollgruppe (Infusion mit PBS). Außerdem waren die 34 h post inseminationem isolierten Genitaltrakte nach Seminalplasmaexposition im Durchschnitt 68 % schwerer und die Autoren beurteilten die Organe subjektiv als stärker vaskularisiert (O´LEARY et al.2004).
BROMFIELD (2006) führte Studien zur physiologischen Bedeutung der uterinen Seminalplasmaexposition mit männlichen Mäusen, deren Seminalvesikel entfernt worden waren, durch. Der Autor beschreibt eine reduzierte Implantation sowie Nachwuchs, der vermehrt übermäßiges Wachstum nach der Geburt bzw. Adipositas im ausgewachsenen Zustand zeigt, wenn keine Seminalplasmaexposition stattgefunden hat.
Die Förderung der Implantation des Embryos erfolgt über Mediatoren, die im Rahmen der durch Seminalplasma ausgelösten, inflammatorischen Signalkaskade freigesetzt werden.
Diese Mediatoren beeinflussen die Zelladhäsion der murinen uterinen Epithelzellen, welche zum Zeitpunkt der Implantation von entscheidender Bedeutung für die Verbindung von Blastozyste und Uterusepithel ist, hält ROBERTSON (2005) in ihrem Übersichtsartikel fest.
Außerdem nennt die Autorinden Einfluss der Zytokine auf die Entwicklung des Embryos, nachdem Seminalplasma deren Abgabe aus dem Endometriumsepithel induziert hat (Abb. 6;
ohne Speziesangabe; ROBERTSON 2007).
Durch zusätzliche Deponierung von Sperma im kranialen Abschnitt der Vagina konnten BELLINGE et al. (1986) eine mehr als verdoppelte Implantationsrate, gemessen am Anstieg des humanen Gonadotropin (hCG), bei Frauen eines in vitro-Fertilisationsprogrammes erzielen. COULAM u. STERN (1995) setzten Seminalplasma in Form von Vaginalkapseln bei Frauen ein, die aus unbekannter Ursache infertil waren und/oder spontane Aborte erlitten hatten. Gesteigerte Implantationsraten von 80 % verglichen mit 67 % in der Placebogruppe wurden mittels Ultraschalluntersuchung in der sechsten Woche p.i. festgestellt. Ebenfalls am Menschen untersuchten TREMELLEN et al. (2000) die Auswirkungen von Geschlechtsverkehr auf die Schwangerschaftsrate nach assistierter Reproduktion (IVF, ET).
Im Vergleich zur enthaltsamen Gruppe zeigte sich 6 - 8 Wochen nach dem Embryotransfer eine signifikant höhere Anzahl an lebensfähigen Embryonen bei den Frauen mit Ejakulatexposition. Die Schwangerschaftsraten unterschieden sich mit 23,6 und 21,2 % nicht signifikant. Die intravaginale und intrazervikale Seminalplasmaapplikation begleitend zu IVF und ICSI war Gegenstand einer Pilotstudie von WOLFF et al. (2009). Die Autoren nehmen die nicht signifikanten, verbesserten Schwangerschaftsraten durch Seminalplasma als Grundlage zur Kalkulation der Patientenzahlen einer weiteren Studie.
ODHIAMBO et al. (2009) untersuchten die Konzeptionsraten von synchronisierten Fleisch- und Milchrindern nach einem Zusatz von 0,5 mL Seminalplasma, rekombinantem humanem transforming growth factor (40 ng rhTGF-ß1 in BSA) oder 0,5 mL bovinem Serumalbumin (BSA) zur Besamungsdosis. Die Applikation des Zusatzes erfolgte intrauterin 12 h vor der Insemination (bei den Tieren der Versuchsreihen in den Jahren 2003 und 2004, Fleischrinder) und unmittelbar vor der Insemination (bei den Tieren der Versuchsreihen in den Jahren 2005 und 2006, Fleisch- und Milchrinder). Die Kontrollgruppe bestand teilweise aus BSA- behandelten Tieren (2003-2005, Fleischrinder) und teilweise aus unbehandelten Tieren (2005:
Fleischrinder, 2005-2006: Milchrinder).Die Autoren bemerkten große Unterschieden innerhalb der Versuchsgruppen zwischen den Versuchsjahren, so variierten beispielsweise die Trächtigkeitsraten in der SP-Gruppe zwischen 37,8 % und 67 % (2003-2006, Fleisch- und Milchrinder). In den Versuchsjahren mit SP-Applikation unmittelbar vor der Insemination und unbehandelter Kontrollgruppe zeigte die Seminalplasmagruppe verbesserte Trächtigkeitsraten von 37,8 % (Milchrinder) bzw. 61,4 % (Fleischrinder) gegenüber 33,2 % bzw. 52,4 % in den Kontrollgruppen (2005-2006, nicht signifikant).
2.4.8 Psychobiologische Effekte
Unter psychobiologischen Seminalplasmaeffekten sind diejenigen aufgeführt, die Auswirkungen auf das Verhalten bzw. die Stimmung des weiblichen Individuums beschreiben. Hierzu gibt es in der Literatur vor allem Hinweise bei Insekten, aber auch aus dem Bereich der Humanmedizin.
Das Sekret der männlichen akzessorischen Drüsen beeinflusst das Reproduktionsverhalten der weiblichen Fruchtfliegen (Drosophila). So schließt sich nach der Paarung bei einigen Drosophila-Arten für die Weibchen eine Phase ohne Paarungsbereitschaft an. Ob es sich um
