5 DISKUSSION 5.1 Feldstudien
5.3 Experimentelle Studie
5.3.3 Kritische Anmerkungen zur experimentellen Studie
Die Durchführung der experimentellen Studie beschränkte sich auf wenige Tiere und Zyklen, wobei jedoch jedes Tier seine eigene Kontrolle darstellte. Die Verwendung eines Seminalplasmapools bzw. Ejakulate mehrere Ziegenböcke - für die vorliegende Studie wurde ein Bock genutzt - wäre für weitere Untersuchungen zur Vermeidung eines Bockeffektes bedenkenswert. Eine direkte Markierung von Spermatozoen zusätzlich zur gesamten Lösungsmarkierung könnte in der Ejakulatserie zusätzliche Informationen liefern. Längere Aufnahmezeiten für die einzelnen Szintigramme, wie sie in der Humanmedizin durch aktive Mitarbeit des Patienten möglich sind, wären wünschenswert, hätten aber zu verstärkter Bildverfälschung durch Bewegung geführt. Eine Ruhigstellung der Studientiere durch Sedation wurde aufgrund der systemischen Beeinflussung und des langen Untersuchungsintervalls nicht angewendet.
Die Differenzierung der einzelnen genitalen Kompartimente in Szintigrammen erweist sich stets als schwierig. Für BOCKISCH (1962) ist die Differenzierung der einzelnen genitalen Kompartimente beim Kaninchen schwierig und teilweise anhand der Szintigraphien nicht möglich. KATILA et al. (2000) nutzten als Hilfsmittel eine direkte radioaktive Markierung des präovulatorischen Follikels und konnten trotzdem im latero-lateralen Strahlengang die
Ovarien der Stute nicht ausreichend lokalisieren. Studien in der Humanmedizin nutzen Hysterosalpingoszintigraphien in Kombination mit anderen diagnostischen Verfahren, was die Orientierung auf den Szintigrammen wesentlich erleichterte (ITURRALDE u.
VENTER 1981; MC QUEEN et al. 1993; ÖZGÜR et al. 1997). Die in der vorliegenden Studie teilweise durchgeführte Vulvamarkierung ist sicherlich nicht optimal, da sie auf dem natürlichen Ausscheidungsweg liegt, stellte sich aber als sehr hilfreicher Orientierungs- und Bezugspunkt heraus und wurde bei tatsächlicher Ausscheidung der markierten Lösungen von dieser deutlich überlagert.
6 ZUSAMMENFASSUNG
Mona Schwerhoff
Fruchtbarkeit nach intravaginaler und intrazervikaler Applikation von Seminalplasma bei der artifiziellen Insemination des Rindes sowie bei Embryonenempfängertieren
In zwei Dreifachblind-Feldstudien, durchgeführt im Einzugsgebiet von vier Besamungsstationen in Deutschland, wurden intrazervikale und intravaginale Seminalplasmaapplikationen bei Rindern der Rassen Deutsche Holstein Schwarzbunt und Rotbunt sowie Deutsches Fleckvieh vorgenommen. Die Applikation erfolgte in der einen Studie inseminationsbegleitend (KB-Studie) und in der anderen Studie brunstbegleitend bei Embryonenempfängertieren (ET-Studie). Eine Anzahl von 514 Tieren wurde in die KB-Studie einbezogen (nur Erstbesamungen) und nach dem Zufallsprinzip in drei Gruppen eingeteilt. Zusätzlich zur routinemäßig ausgeführten intrauterinen Samenübertragung mit Kryosperma geprüft fertiler Bullen wurden jeweils 4 ml Seminalplasma (SP) aus einem Seminalplasmapool (SP-Gruppe) bzw. eine entsprechende Menge Placebo-Flüssigkeit (P-Gruppe) in (1/3 der Gesamtmenge) und vor die Portio vaginalis cervicis (2/3 der Gesamtmenge) appliziert (je Gruppe ca. 170 Tiere). Probandinnen der Kontrollgruppe(K-Gruppe) blieben unbehandelt. In die ET-Studie, mit denselben Versuchsgruppen wie in der KB-Studie, wurden 68 Tiere einbezogen. Hier erfolgte die Lösungsapplikation, in gleicher Weise wie bereits beschrieben, in der Brunst (d 0 des Zyklus) bei Embryonenempfängertieren, denen am d 7 ein Embryo eingesetzt wurde. Von allen Studientieren wurden diverse Tier-, Brunst- und Haltungsparameter erhoben, wozu unter anderem die Gewinnung von Zervixzytologien im Östrus (KB-Studie) bzw. d 0 und d 7 (ET-Studie) zählte. Ergänzend wurden Vaginohysteroszintigraphien an Ziegen, wie das Rind ein Scheidenbesamer, durchgeführt. Radioaktiv markiertes Seminalplasma, Placebo oder Ejakulat (je 1 mL) wurde intravaginal im Östrus appliziert. Anschließend wurden statische Szintigramme in dem Zeitraum 0 - 360 min nach der Applikation erstellt.
Ziel beider Feldstudien war die Überprüfung der Hypothese, dass eine Seminalplasmaapplikation in physiologischer Menge und Lokalisation sich positiv auf die Trächtigkeitsrate bei Rindern auswirkt. Die Erhebung diverser Parameter diente der
Charakterisierung der Studientiere, sowie der Identifizierung möglicher signifikanter Einflüsse auf die Trächtigkeitsraten. Ziel der experimentellen Vaginohysteroszintigraphie-Studie war es, per Szintigramm die Verteilung und den Verbleib von markiertem Seminalplasma, Placebo und Ejakulat zu verfolgen.
Der Hauptteil der Arbeit, zwei Dreifachblindstudien zur Untersuchung der Auswirkungen einer intrazervikalen und intravaginalen Seminalplasmaapplikation in der Brunst auf die Trächtigkeitsrate (TR)beim Rind, erbrachte folgende Ergebnisse:
Die Verteilung der Studientiere bezogen auf die Versuchsgruppen (SP/P/K) war für alle erfassten Parameter gleichmäßig und keiner der untersuchten Parameter unterschied sich in Bezug auf die Versuchsgruppen signifikant.
In der Studie zur inseminationsbegleitenden Applikation (KB-Studie, n = 514 Tiere):
1. bewirkte die Seminalplasmaapplikation eine signifikante Steigerung der Trächtigkeitsrate um 25 % im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe (TR 57,56 % zu 46,11 %; P = 0,035).
2. bewirkte die Placeboapplikation eine signifikante Steigerung der Trächtigkeitsrate um 26 % im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe (TR 58,29 % zu 46,11 %;
P = 0,024).
3. zeigte sich kein Unterschied in den Trächtigkeitsraten der Seminalplasma- und der Placebogruppe (TR 57,56 % und 58,29 %; P > 0,05).
4. beeinflusste ein unauffälliger Zervixzytologiestatus im Östrus die Trächtigkeitsraten nicht signifikant positiv (TR< 10 % PMN 54,32 % zu TR≥ 10 % PMN 50,00 %; P > 0,05).
5. zeigte sich ein signifikanter Einfluss von Rastzeit und Brunstintensität auf die Trächtigkeitsraten (PRastzeit = 0,012; PBrunstintensität = 0,048).
In der Studie zur brunstbegleitenden Applikation bei Embryonenempfängertieren (ET-Studie, n = 68 Tiere):
1. bewirkte die Seminalplasmaapplikation eine nicht signifikante Steigerung der Trächtigkeitsrate um 60 % im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe (TR 60,00 % zu 37,50 %; P = 0,12).
2. bewirkte die Placeboapplikation eine nicht signifikante Steigerung der Trächtigkeitsrate um 54 % im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe (TR 57,89 % zu 37,50 %; P = 0,18).
3. zeigte sich kein Unterschied in den Trächtigkeitsraten der Seminalplasma- und der Placebogruppe (TR 60,00 % und 57,89 %; P > 0,05).
4. beeinflusste ein unauffälliger Zervixzytologiestatus sowohl im Östrus (d 0) als auch zum Transferzeitpunkt (d 7) die Trächtigkeitsraten nicht signifikant positiv (d 0:
TR< 10 % PMN 56,00 % zu TR≥ 10 % PMN 40,00 % bzw. d 7: TR< 10 % PMN 54,84 % zu TR≥ 10 % PMN 25,00 %; alle P > 0,05).
5. bewirkte die Seminalplasmaapplikation im Östrus einen signifikanten Anstieg unauffälliger Zervixzytologien zum Transferzeitpunkt (< 10 % PMN: Östrus 66,67 % zu
Transfer 94,74 %; P = 0,046).
6. stieg zwischen d 0 und d 7 sowohl in der Placebogruppe als auch in der unbehandelten Kontrollgruppe der Anteil unauffälliger Zervixzytologien (< 10 % PMN: Östrus 66,67 % zu Transfer 82,35 % bzw. < 10 % PMN: Östrus 70,00 % zu Transfer 86,96 %; alle P > 0,05).
7. zeigte sich ein signifikanter Einfluss von Zyklussynchronisation und Uterusgröße auf die Trächtigkeitsraten (PSynchronisation = 0,01; PUterusgröße = 0,047).
Die ergänzende experimentelle Studie zur Untersuchung von Verteilung und Verbleib einer intravaginalen Seminalplasmaapplikation im Östrus anhand von Vaginohysteroszintigraphien bei Ziegen erbrachte folgende Ergebnisse:
1. radioaktiv markiertes Seminalplasma, Ejakulat und Placebo verbleiben nach Applikation in den Fundus vaginae der Ziege mindestens sechs Stunden in der Scheide.
2. die Szintigramme zeigen keinen Transport von radioaktiv markiertem Seminalplasma, Ejakulat oder Placebo aus der Scheide in die Gebärmutter der Ziege.
3. die retrograde Ausscheidung von markiertem Seminalplasma, Ejakulat und Placebo aus der Vagina über die Vulva beginnt frühestens vier Stunden nach der Applikation.
Zusammenfassend lässt sich anhand der vorliegenden Studien feststellen, dass Seminalplasma genauso wie Placebo, jeweils intrazervikal und intravaginal während der Brunst in einer Menge von 4 mL appliziert, eine Steigerung der Trächtigkeitsraten bei Rindern bewirkt.
Offensichtlich spielen also beim Scheidenbesamer Rind Ort, Menge und/oder der Zeitpunkt der Applikation eine größere fruchtbarkeitsfördernde Rolle als die Art der Lösung selbst. Als Erklärungsansatz der durch die Lösungsapplikation verbesserten Fertilität stehen insbesondere ein Volumen- oder ein Deponierungseffekt zur Diskussion.
Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass Seminalplasma, Ejakulat und auch Placebo mehr als sechs Stunden intravaginal bei Ziegen verbleibt, in vergleichbaren Zeiträumen über die Vulva ausgeschieden wird, und mittels Vaginohysteroszintigraphien kein Transport in den Uterus erkennbar ist. Auch für die vaginale Persistenz bzw. ihre Ausscheidung nach vaginaler Applikation scheint demnach die Art der Lösung beim Scheidenbesamer Ziege nicht von größerer Bedeutung zu sein.
7 SUMMARY
Mona Schwerhoff
Pregnancy rates in cattle after intravaginal and intracervical administration of seminal plasma concurrently with artificial insemination and in embryo transfer recipients
In the area of four German artificial insemination centres two triple blind studies were designed to examine the effects of an intracervical and intravaginal seminal plasma application on dairy and dual purpose cattle under field condition. On the one hand the application was done concurrent with artificial insemination (AI-study), on the other hand at the time of standing oestrus in embryo transfer recipients (ET-study). An amount of 514 animals was included in the AI-study (only cows for first service) and allocated randomly in equal shares into one of the three experimental groups.Immediately after artificial insemination (intrauterine) with deep-frozen semen derived from fertile bulls, 4 mL seminal plasma of a seminal plasma pool (experimental group SP) or sterile placebo (experimental group P) were administered into the caudal cervix canal (one-third of the total amount) as well as into the cranial vagina (two thirds of the total amount). The control group (experimental group K) was inseminated but otherwise left untreated. Each experimental group contained about 170 cows. The ET-study, with the same three experimental groups than the AI-study, consisted of 68 embryo transfer recipients, treated with seminal plasma or placebo in the same way as described above. The application took place at the time of standing oestrus (d 0) in recipients selected for embryo transfer on day seven (d 7). Animals of both studies were classified according to age, time post partum, BCS, lameness and further parameters, including cervix cytology on d 0 (AI-study) as well as d 0 and d 7 (ET-study). In a complementary third experimental study hysteroscintigraphic scans were performed with goats. Radio-labelled seminal plasma, ejaculate or placebo (1 mL) was administered intravaginally at the time of standing oestrus. Scintigraphic scans were performed 0 - 360 min after application of the fluid.
The aim of both studies under field condition was to test the hypothesis that an application of seminal plasma, mimicking the presence of ejaculate during mating, would have a positive effect on the pregnancy rate of cattle. Possible other significant influences on the pregnancy
rates were to be identified by means of a concurrent detailed classification of each animal included in the studies. The objective of the experimental hysteroscintigraphic study was to verify where and how long radio-labelled seminal plasma, ejaculate and placebo persisted in the female genital tract in goats.
The main part of this thesis, two triple blind studies examinating the effects of an intracervical and intravaginal seminal plasma application during standing oestrus on the pregnancy rates (PR) of cows, has led to the following results:
In the study investigating a seminal plasma application concurrent with artificial insemination (AI-Study; n = 514 animals):
1. the application of seminal plasma resulted in a significant increase in the pregnancy rate of 25% in comparison to the untreated control group (PR 57.56 % as opposed to 46.11 %; P = 0.035).
2. the application of placebo led to a significant increase in the pregnancy rate of 26%
compared to the untreated control group (PR 58.29 % versus 46.11 %; P = 0.024).
3. there was no difference in the pregnancy rates of seminal plasma group and placebo group (PR 57.56 % and 58.29 %; P > 0.05).
4. an inconspicuous cytology status of the cervix during oestrus did not influence the pregnancy rates significant positively (PR< 10 % PMN54.32 % as opposed to PR≥ 10 % PMN
50.00 %; P > 0.05).
5. a significant influence of the interval between calving and artificial insemination (days to first service) and intensity of oestrus symptoms on the pregnancy rates was found (PIntervall = 0,012; PSymptoms = 0.048).
In the study examining a seminal plasma application during standing oestrus in embryo recipients (ET-Study; n =68 animals):
1. the application of seminal plasma resulted in an insignificant increase in the pregnancy rate of 60 % in comparison to the untreated control group (PR 60.00 % as opposed to 37.50 %; P = 0.12).
2. the application of placebo led to an insignificant increase in the pregnancy rate of 54 % compared to the untreated control group (PR 57.89 % versus 37.50 %; P = 0.18).
3. there was no difference in the pregnancy rates of seminal plasma and placebo group (PR 60.00 % as opposed to 57.89 %; P > 0.05).
4. an inconspicuous cytology status of the cervix during standing oestrus (d 0) as well as at during transfer (d 7) did influence the pregnancy rates positively but not significantly (d 0: PR< 10 % PMN 56.00 % versus PR≥ 10 % PMN 40.00 % and d 7:
PR< 10 % PMN 54.84 % versus PR≥ 10 % PMN 25.00 %, respectively; all P > 0.05).
5. the application of seminal plasma led to a significant increase of inconspicuous cervix cytologies between d 0 and d 7 (< 10 % PMN: oestrus 66.67 % versus transfer 94.74 %;
P = 0.046).
6. the number of inconspicuous cervix cytologies rose between d 0 and d 7 not only in the placebo group but also in the untreated control group (< 10 % PMN: oestrus 66.67 % versus transfer 82.35 % and < 10 % PMN oestrus 70.00 % versus transfer 86.96 %, respectively; P > 0.05).
7. a significant influence of cycle synchronization and uterus size on the pregnancy rates (PSynchronisation = 0.01; PSize = 0.047).
The additional experimental study to investigate the distribution of an intravaginal application of seminal plasma in goats by means of scintigraphic scans led to the following results:
1. radiolabelled seminal plasma, ejaculate and placebo stay at least six hours in the goat´s vagina after applying them in the fundus vaginae.
2. the scintigraphic scans did not show any transportation of radiolabelled seminal plasma, ejaculate or placebo from the vagina into the uterus of the goats.
3. the excretion of seminal plasma, ejaculate and placebo from the vagina through the vulva begins after four hours after application at the earliest.
In summary, by means of these studies, one comes to the conclusion that seminal plasma as well as placebo has a considerable positive effect on the achievement of pregnancy in cows.
Obviously the place (intravaginally and intracervically), the amount (4 mL) and/or the time of
application (standing oestrus) play a more important role in the achievement of pregnancy in cows than the type of applicated fluid. As possible explanations for the improved pregnancy rates mainly a volume or a site depended effect are discussed.
Apart from this it needs to be emphasized that seminal plasma, ejaculate and placebo as well remain intravaginally in goats more than six hours and vaginohysteroscintigraphy does not show any transportation into the uterus during that time. Neither distribution nor excretion after application into the fundus vaginae in goats seem to be seriously influenced by the type of fluid.
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