Aus der Klinik für Neurologie und Klinische Neurophysiologie (Direktor: Prof. Dr. med. R. Dengler)
Zentrum Neurologische Medizin
der Medizinischen Hochschule Hannover
Untersuchungen zum Ammoniak-Stoffwechsel des Gehirns bei Leberfibrose
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Annemarie Goldbecker aus Trier
Hannover, 2009
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 18.11.2009
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover Präsident: Professor Dr. med. Dieter Bitter-Suermann
Betreuerin der Arbeit: Prof. Dr. med. Karin Weißenborn Referentin: PD Dr. rer. biol. hum Lilli Geworski
Korreferent: Prof. Dr. med. Christian Straßburg Tag der mündlichen Prüfung: 18.11.2009 Promotionsausschussmitglieder:
Prof. Dr. med. Heinrich Lanfermann Prof. Dr. med. Klaus Friedrich Gratz Prof. Dr. med. Michael Gebel
INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG UND FRAGESTELLUNG ... 5
1.1. Zerebraler Ammoniak-Stoffwechsel ... 5
1.2. Übersicht der publizierten Vorstudien und Fragestellung... 7
1.3. Fibrogenese ... 10
2. METHODIK ... 13
2.1. Studienprotokoll ... 13
2.1.1. Einschlusskriterien und Studienpopulation ... 13
2.1.2. Ausschlusskriterien ... 14
2.2. Untersuchungen ... 14
2.2.1. Neurologisch-körperliche Untersuchung... 14
2.2.2. PSE-Syndrom-Test ... 15
2.2.3. Positronen-Emissionstomographie ... 18
2.2.3.1. 15O-Wasser-PET...19
2.2.3.2. 13N-Ammoniak-PET...20
2.2.4. Magnetresonanztomographie und 1H-Magnetresonanzspektroskopie... 20
2.2.5. Labor ... 22
2.3. PET-Tracer-Modelle... 23
2.3.1. Wasserkinetik... 24
2.3.2. Ammoniakkinetik ... 25
2.4. Statistische Analyse... 29
3. ERGEBNISSE ... 31
3.1. PSE-Syndrom-Test ... 31
3.2. Positronen-Emmissionstomographie ... 31
3.3. Magnetresonanztomographie und -spektroskopie... 35
3.3. Labor... 37
4. DISKUSSION ... 38
4.1. Zusammenfassung... 38
4.2. Labor... 40
4.3. Magnetresonanzspektroskopie... 41
4.4. Zerebraler Blutfluss... 43
4.5. Zerebraler Ammoniak-Stoffwechsel ... 45
4.6. Schlussfolgerung ... 51
5. ZUSAMMENFASSUNG ... 53
6. LITERATURVERZEICHNIS ... 56
7. DANKSAGUNG ... 64
8. ERKLÄRUNG NACH § 2 ABS. 2 NRN. 5 UND 6 ... 69
1. Einleitung und Fragestellung
1.1. Zerebraler Ammoniak-Stoffwechsel
Die ersten Untersuchungen des zerebralen Ammoniak-Stoffwechsels im Tierversuch führten Cooper et. al durch (1, 2). Sie stellten bei der Infusion von 13N-markiertem Ammoniak über die A. carotis interna von Ratten fest, dass bei insgesamt geringer Aufnahme die überwiegende Menge des Ammoniaks intrazerebral in metabolisierter Form vorliegt, davon 95 % als Glutamin. Aus Metabolitenanalysen mittels HPLC (high pressure liquid chromatography) schlossen sie, dass es zwei Formen von Glutamatspeichern im Gehirn geben muss: Einen kleineren, in dem Ammoniak in Form von Glutamin schnell gebunden wird und einen größeren mit einer geringeren Umsatzrate. Lockwood et al. (3) kamen bei ihren Untersuchungen zum gleichen Ergebnis. Ebenso wie Phelps et al. (4) fanden sie einen Aufnahmeindex in das Gehirn für Ammoniak, der deutlich unter 100 % lag. Die Aufnahme war in einem weiten Bereich unabhängig von der infundierten Menge. Beide Gruppen kamen zu dem Schluss, dass der einzige Mechanismus für den Ammoniakeinstrom die Diffusion ist. Dies wurde durch weitere Untersuchungen widerlegt, es existieren durchaus Transporter für das Ammonium-Ion (5), der weitaus größte Anteil des Ammoniaks gelangt jedoch tatsächlich per diffusionem ins Hirngewebe.
Fünf Sekunden nach Aufnahme des Ammoniaks war bei einer Analyse von Stickstoff-gefrorenen Hirnen bereits über die Hälfte zu Glutamin umgesetzt, so dass Cooper et al. auf eine Halbwertszeit von 1 - 3 s für die Reaktion von Glutamat zu Glutamin schlossen (1, 2). Glutamat ist einer der wichtigsten exzitatorischen Neurotransmitter. Es wird im präsynaptischen Neuron durch das Enzym Glutaminase
gebildet, in den synaptischen Spalt ausgeschüttet und bindet an das postsynaptische Neuron (N-methyl-D-aspartat- und alpha-Amino-3-Hydro-Methyl-4-isoxasole- propionic acid Rezeptoren) und benachbarte Astrozyten. Es kommt zur Interaktion mit Kalzium-Kanälen. Glutamat wird schließlich über Natrium-gesteuerte Kanäle in die Neuronen und Astrozyten aufgenommen. In den Astrozyten wird über das Enzym Glutaminsynthetase Ammoniak an Glutamat gebunden und es entsteht wieder Glutamin. Dieses wird zurücktransportiert in das präsynaptische Neuron und dort durch Glutaminase wieder zu Glutamat umgesetzt. Der Kreislauf beginnt von neuem (6). Erhöhte Ammoniakkonzentrationen scheinen in den Kreislauf durch Hemmung der AMPA-Rezeptoren oder Verringerung ihrer Depolarisation einzugreifen. Die beschriebene Metabolisierung von Ammoniak zu Glutamin in Astrozyten ist die einzige Möglichkeit zur Detoxifikation von Ammoniak im Gehirn, da es hier keine Enzyme des Harnstoff-Zyklus gibt (7, 8).
Verschiedene physiologische Faktoren beeinflussen die zerebrale Ammoniak- Aufnahme. Zum Zusammenhang von zerebralem Blutfluss und Ammoniak-Extraktion im Gehirn schlossen Phelps et al. (4) aus ihren Studien mit dem Radionuklid 13-N an Rhesus-Affen auf eine entgegengesetzte Relation von Extraktion und Blutfluss.
Lockwood et al. (3, 10) gingen nach an Menschen erhobenen Daten sogar von einem linearen, reziproken Zusammenhang zwischen Extraktion und zerebraler Durchblutung aus. Da der Anteil des gasförmig vorliegenden Ammoniaks im Blut nach Hendersson-Hasselbalch vom pH-Wert abhängt, beeinflusst dieser natürlich auch die Aufnahme. Lockwood et al. (3, 9) postulierten allerdings für den Bereich von pH 7,2 - 7,6 eine pH-unabhängige Extraktion, ebenso eine fehlende Abhängigkeit von der Ammoniak-Konzentration in weiten Bereichen. In den Studien von Phelps et
al. an Rhesus-Affen kam es unter Hypoglykämie zu einem Absinken der Extraktion, wohingegen eine Erhöhung der Ammoniak-Konzentration zu einer Steigerung des zerebralen Glukose-Metabolismus führte (4).
1.2. Übersicht der publizierten Vorstudien und Fragestellung
Zur Frage des humanen zerebralen Ammoniak-Stoffwechsels bei Gesunden und leberkranken Menschen und dessen Quantifizierung mittels Ammoniak-Positronen- Emmisionstomographie existieren Vorarbeiten aus drei Arbeitsgruppen (s. auch Tab. 9). Zum Zeitpunkt des Beginns dieser Studie (2003) waren die Daten von Keiding et al. (11) noch nicht publiziert.
Basierend auf den Vorarbeiten von Lockwood et al. (12), die eine erhöhte Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke für Ammoniak in ihrer Gruppe enzephalopathischer Patienten verglichen zu Gesunden fanden, herrschte lange die Meinung vor, dass eine der Hauptursachen der hepatischen Enzephalopathie bei Patienten mit Leberzirrhose in eben dieser Veränderung der Blut-Hirn-Schranken- Permeabilität für Ammoniak besteht. Bei der hepatischen Enzephalopathie handelt es sich um neuropsychiatrische Störungen, die als Komplikation eines akuten, subakuten oder chronischen Leberversagens auftreten. Unter der Voraussetzung einer erhöhten Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke für Ammoniak ließ sich gut erklären, dass, wie bereits vor Jahrzehnten (13) beobachtet, Patienten mit einer normwertigen Ammoniak-Konzentration im Serum enzephalopatisch sein können.
Ahl et al. (14) führten ihre Studie ohne eine Kontrollgruppe durch. Sie untersuchten Patienten mit Leberzirrhose ohne hepatische Enzephalopathie und solche mit einer
frühen Form der hepatischen Enzephalopathie (minimal oder Grad I nach West Haven-Kriterien). Die Werte für beide Gruppen lagen über den von Lockwood et al. publizierten Kontrolldaten und wurden daher als Bestätigung der Hypothese von Lockwood interpretiert. Tendenziell wies die Gruppe der nicht enzephalopathischen Patienten eine höhere Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke für Ammoniak auf, signifikant war der Unterschied im Bereich des Thalamus. Der Einstrom k1 war in der Gruppe der enzephalopathischen Patienten geringer als bei den nicht-enzephalopathischen Patienten mit signifikanten Unterschieden im Bereich des Nucleus lentiformis und des Vermis. Im Rahmen weiterer Studien der Arbeitsgruppe um Frau Prof. Dr. med. K. Weißenborn wurde schließlich bei MR- spektroskopischen Untersuchungen des Gehirns von Patienten mit chronischer Hepatitis ohne Leberzirrhose eine erhöhte Konzentration von Glutamat/Glutamin in der weißen Substanz und den Basalganglien im Vergleich zu Gesunden gemessen.
Der Glutamat/Glutamin-Peak bei der Protonen-Spektroskopie resultiert im Wesentlichen aus dem Gehalt von Glutamin, welches als Korrelat des zerebralen Ammoniak-Stoffwechsels gilt. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die Einschränkung der Hirnfunktion bei Patienten mit Leberzirrhose nicht von der aktuellen Ammoniak-Aufnahme und metabolischen Rate für Ammoniak abhängt, sondern eine engere Beziehung zum Ausmaß vorliegender spektroskopischer Veränderungen zeigt (15). Dieser scheinbare Widerspruch wurde dadurch erklärt, dass die PET-Untersuchungen des Ammoniak-Stoffwechsels lediglich eine Momentaufnahme darstellen, die spektroskopischen Veränderungen jedoch neben akuten Metabolit-Konzentrationsveränderungen auch die Folgen chronischer Stoffwechselbelastungen. So entstand schließlich die zu dieser Arbeit führenden Hypothese, dass bereits bei Patienten mit verschiedenen fibrotischen Vorstufen der
Leberzirrhose eine veränderte Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke für Ammoniak existiert und dass die Dekompensation der Hirnfunktion im Rahmen der hepatischen Enzephalopathie nicht auf der aktuellen Ammoniakkonzentration, sondern auf der gesamten, vorhergegangenen Ammoniak-Belastung beruht, die sich in den spektroskopischen Veränderungen widerspiegelt. Gestützt wurde die Hypothese durch verschiedene Untersuchungen zur Veränderung der Glutaminsynthetase- Aktivität unter erhöhter Ammoniak-Belastung. Butterworth et al. (16) untersuchten Ratten nach portokavaler Anastomose und fanden vier Wochen nach dem Eingriff eine erniedrigte Aktivität der Glutaminsynthetase im zerebralen Kortex, der Glutamin- Gehalt war nicht, der von Ammoniak dagegen erhöht. Desjardins et al. (17) führten bei Ratten durch Anlage eines portokavalen Shunt eine chronische Hyperammoniämie herbei und fanden nach vier Wochen eine signifikant niedrigere Glutamatsynthetase-Aktivität im Gehirn und in der Leber, eine Steigerung dagegen in der Muskulatur. Zu ähnlichen Ergebnissen kamen auch Girard et al. (18), die bei Versuchstieren eine erniedrigte Glutaminsynthetase-Aktivität im Hippocampus, Cerebellum und Kortex nachweisen konnten.
Vor Abschluss dieser Arbeit wurde die Hypothese bereits durch die Ergebnisse von Keiding et al. (11) in Frage gestellt, die zwischen Gesunden, Patienten mit Leberzirrhose ohne und in verschiedenen Stadien der hepatischen Enzephalopathie keine Unterschiede hinsichtlich der Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke für Ammoniak fanden. Es unterschieden sich lediglich signifikant die Clearance-Rate kmet zwischen der Gruppe der nicht-enzephalopatischen Patienten und den Kontrollen im Bereich des Cortex und der Basalganglien und die
Metabolisierungsraten der Patienten in allen Regionen verglichen zu Gesunden, welches auf die erhöhten Plasma-Ammoniak-Spiegel zurückzuführen ist.
1.3. Fibrogenese
Zur Leberfibrose kommt es durch eine Steigerung der Bindegewebssynthese und veränderten Bindegewebsabbau. Ätiologisch liegt dieser weltweit gesehen am häufigsten eine virale Hepatitis zugrunde, in westlichen Ländern steht Alkoholtoxizität an erster Stelle (19). Durch die Zellschädigung kommt es zur Aktivierung des Gerinnungssystems, von Lebermakrophagen und weiteren Entzündungszellen wie Monozyten und Granulozyten. Dabei werden verschiedene Zytokine wie transforming growth factor-1 (TGF-1), platelet derived growth factor (PDGF), Tumor-Nekrose-Faktor- (TNF-) und insulin like growth factor-1 (IGF-1) freigesetzt.
Dies führt vor allem zur Aktivierung und Proliferation von hepatischen Sternzellen, die damit mehr und qualitativ veränderte extrazelluläre Matrix synthetisieren.
Gleichzeitig ist deren Abbau durch Matrixmetalloproteinasen (MMP) vermindert.
Deren Regulation erfolgt durch Steuerung der Aktivierung von Prometalloproteinasen durch Proteasen und durch Inhibition aktiver MMPs und Stabilisierung der inaktiven Vorstufen durch tissue inhibitors of MMPs (TIMP) (19, 20). Die drei wichtigsten Metalloproteinasen sind MMP2 (Gelatinase A, 72 kDa), MMP9 (Gelatinase B, 92 kDa) und MMP3 (Stromelysin) (20), wobei letztere nicht im Serum nachweisbar ist, sondern nur matrixassoziiert vorliegt. Die Zink enthaltenden MMPs sind im Blut meist als Proenzyme vorhanden (21). Die Aufgabe der MMPs besteht nicht nur im Abbau der extrazellulären Matrix (19), sondern auch in der Regulation der Interaktionen zwischen Zellen und Umgebung durch Beeinflussung der Signaltransduktion und Interaktion mit Zytokinen und anderen bioaktiven Moleküle
(21). MMP1 ist ein Transmembranmolekül. Es reguliert die Bildung und Aktivierung von MMP2. Die beiden Typ IV-Kollagenasen MMP2 und MMP9 sind verantwortlich für den Abbau von Typ IV-Kollagen, einem Bestandteil der Basalmembran, und damit maßgeblich an den frühen Stufen des Gewebsumbaus beteiligt (22, 23).
Progelatinase A wird in Zellkultur von aktivierten hepatischen Sternzellen gebildet und wird an der Oberfläche von Zellen unter Mitwirkung MMP1 und TIMP2 aktiviert.
Diese Aktivierung wird durch die Anwesenheit von Kollagen Typ 1, einem Haupt- Matrixprotein in der fibrotischen Leber, gefördert (20). Boeker et al. (24) fanden einen Anstieg von MMP2 im peripheren Blut bei Patienten mit Leberzirrhose durch chronische Hepatitis C. MMP9 wird von Kupffer Zellen (residente Leber- makrophagen) und auch Leukozyten gebildet und aktiviert durch Plasmin und MMP3 (20, 23). MMP9 konnte bei verschiedenen Erkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS) oder deren Modellen nachgewiesen werden, die mit einer Störung der Blut-Hirn-Schranke einhergehen. Im Tiermodell mit MMP9-Knock out- Mäusen entwickelten diese bei ZNS-Schädigung weniger Ödem oder neurologische Ausfälle. Ähnliches konnte bei Verwendung von Inhibitoren oder monoklonalen Antikörpern von MMP-9 nachgewiesen werden. Induzierte man bei Mäusen ein akutes Leberversagen durch intraperitoneale Injektion von Azoxymethan kam es im Stadium des Präkomas und Komas kam es zu einem Anstieg von Pro-MMP9, im Koma auch von aktiviertem MMP9 im Serum. Unterschiedliche Inhibition von MMP9 bei den komatösen Tieren führten zu einem Rückgang des zerebralen Ödems und der Extravasate. MMP9 und MMP2 konnten bei Mäusen mit akutem Leberversagen im Gehirn selbst nicht nachgewiesen werden. In den Lebern war jedoch ein Anstieg besonders von MMP9 zu verzeichnen (25).
Diese Untersuchungen veranlassten zu der Frage, ob zwischen der Freisetzung von Zytokinen und Proteasen im Rahmen der Fibrogenese und der vermuteten vermehrten Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke für Ammoniak ein Zusammenhang besteht.
2. Methodik
2.1. Studienprotokoll
Die Studiengenehmigungen der Ethikkommission der Medizinischen Hochschule Hannover, sowie des Bundesamtes für Strahlenschutz, lagen vor. Alle Studienteilnehmer wurden über Nutzen und Risiken der Untersuchungen sowie ihr ständiges Widerrufsrecht aufgeklärt und erteilten ihre schriftliche Einwilligung.
2.1.1. Einschlusskriterien und Studienpopulation
Eingeschlossen wurden Patienten mit chronischer viraler Hepatitis. Bei den Patienten mit Leberfibrose lag die letzte Biopsie zur Beurteilung des Fibrosegrades maximal zwei Jahre zurück. Die Bestimmung des Fibrosegrades erfolgte nach dem durch Ishak et al. (26) modifizierten Histological Activity Score (HAI) Score nach Knodell.
Bei den Patienten mit Leberzirrhose war in fünf Fällen die Diagnose mittels Biopsie gesichert, in einem Fall war sie mittels Abdomensonographie erfolgt. Die Indikation zur Leberbiopsie stand in keinem Zusammenhang mit dieser Studie. Die Patienten wurden über die Leberambulanz der Abteilung für Gastroenterologie, Hepatologie und Endokrinologie gewonnen. Der Kontakt wurde über die dort tätigen Ärzte hergestellt. Menschen ohne eine Erkrankung der Leber oder eine die Hirnfunktion beeinflussende Erkrankung oder Medikation wurden als Kontrollgruppe gewonnen.
Diese rekrutierten sich alters- und geschlechtsadaptiert aus Personen, die sich infolge eines Rundschreibens, das der Gehaltsmitteilung aller MHH-Mitarbeiter beilag, als Interessenten meldeten.
Insgesamt nahmen 18 Patienten (9 weiblich, Durchschnittsalter 55 ± 10 Jahre) und 6 gesunde Kontrollen (3 weiblich, Durchschnittsalter 55 ± 7 Jahre) an der Studie teil.
Von den Patienten litten 17 an chronischer Hepatitis C, einer an einer chronischen Hepatitis B. Die Patienten wurden in drei gleich große Untergruppen nach dem Ishak Fibrose Score unterteilt, Fibrose Grad F2 (leichtgradig), F4 (mittelgradig) und F6 (entspricht Zirrhose).
2.1.2. Ausschlusskriterien
Ausgeschlossen waren Patienten und gesunde Probanden mit einer vorausgegangenen oder begleitenden Erkrankung des zentralen Nervensystems oder der Einnahme ZNS-wirksamer Medikamente. Wegen der Applikation schwach radioaktiven Materials wurden keine Schwangeren oder Personen unter 35 Jahren untersucht. Personen mit Herzschrittmacher oder festsitzenden, magnetisierbaren Metallimplantaten konnten ebenso wie Patienten mit einer Klaustrophobie nicht eingeschlossen werden, da bei diesen die Durchführung einer Kernspintomographie nicht möglich gewesen wäre.
2.2. Untersuchungen
2.2.1. Neurologisch-körperliche Untersuchung
Alle Teilnehmer wurden von einem Arzt der Neurologischen Klinik der Medizinischen Hochschule Hannover untersucht. Vorrangiges Ziel war das Erkennen von Veränderungen im Sinne einer hepatischen Enzephalopathie wie z. B. Asterixis sowie der Ausschluss anderer, das Gehirn beeinflussender Grunderkrankungen.
Letztere hätten zum Studienausschluss geführt.
2.2.2. PSE-Syndrom-Test
Zur Anwendung kam der PSE-Syndrom-Test von Schomerus et al. in der Fassung von 1999 (Swets Test Services, Frankfurt). Dabei handelt es sich um ein psychodiagnostisches Verfahren zur quantitativen Erfassung der (minimalen) portosystemischen Enzephalopathie (PSE). Der Papier-Bleistift-Test umfasst fünf Untertests, bei deren Durchführung die benötigte Zeit oder die Zahl richtig gelöster Aufgaben, beim Untertest 5 „Linien nachfahren“ Zeit und Fehlerzahl, bestimmt werden. Insgesamt erhält man so bei jeder Durchführung sechs Werte, die für jeden Untertest mit einer alterspezifischen Normwerttabelle verglichen werden. Im Bereich
± einer Standardabweichung (SD) erhält der Proband 0 Wertpunkte (WP), darüber +1 WP, zwischen -1 und -2 SD -1 WP, zwischen -2 und -3 SD -2 WP und darunter -3 WP. Maximal sind damit +6 WP, minimal -18 WP zu erreichen. Als pathologisch gilt ein Score unterhalb von -4 WP. Die Anleitung der Probanden geschieht durch einen vorgegebenen Anweisungstext. Die Untertests stellen sich wie folgt dar:
Zahlensymboltest (ZS)
Bei diesem Test ist jeder Zahl von 1 bis 9 ein bestimmtes geometrisches Symbol zugeordnet. Der zu Testende erhält zunächst Zeit, den Zahlen in der Übungszeile das passende Symbol zuzuordnen.
Dies wird kontrolliert und er wird auf eventuelle Fehler aufmerksam gemacht.
Abb. 1: Zahlensymboltest
Anschließend soll der Proband innerhalb von 90 Sekunden vier Zeilen à 20 Zahlen möglichst viele Symbole zuordnen. Dabei ist die Reihenfolge einzuhalten, auf Fehler wird nicht hingewiesen. Die Definitionszeile ist die ganze Zeit sichtbar. Nach Testende wird die Zahl der zugeordneten Symbole abzüglich der Fehlzuordnungen bestimmt und dieser Wert mit dem alterspezifischen Normwert verglichen.
Zahlen verbinden A (ZV A)
Auf dem Aufgabenblatt sind die Zahlen von 1 bis 25 verteilt. Die Aufgabe besteht darin, diese in der korrekten Reihenfolge auf dem kürzesten Weg zu verbinden. Der Proband bearbeitet erst ein Übungsblatt, dann die eigentliche Aufgabe mit einer anderen Verteilung der Zahlen. Die dafür benötigte Zeit wird gestoppt. Auf Fehler wird in beiden Durchgängen aufmerksam gemacht, die Korrektur geht in die Bearbeitungszeit ein.
Abb. 2: Zahlen verbinden A
Zahlen verbinden B (ZV B)
Hierbei sind auf dem Blatt die Zahlen von 1 bis 13 und die Buchstaben von A bis L verteilt.
Diese müssen in alternierender Reihenfolge, bei 1 beginnend, verbunden werden.
Abb. 3: Zahlen verbinden B
Wieder wird eventuell korrigierend eingegriffen und die benötigte Zeit genommen.
Ein Übungsblatt zu dieser Aufgabe gibt es nicht.
Kreise punktieren (KP)
Der Proband soll möglichst genau in die Mitte eines Kreises von 1,3 cm Durchmesser einen Punkt setzen. Zunächst bearbeitet er zwei Übungsreihen. Dann wird die Zeit gestoppt, die zum Punktieren von insgesamt 100 Kreisen aufgeteilt in 10 Reihen benötigt wird. Dabei soll er strikt von links nach rechts vorgehen.
Abb. 4: Kreise punktieren
Linien nachfahren (LN)
Hier soll ein Strich innerhalb eines Doppellinienmusters gezogen werden, ohne eine der Linien zu berühren oder den Stift abzusetzen.
Dies wird zunächst geübt. Dann wird die Zeit zur Bearbeitung der eigentlichen Aufgabe genommen.
Abb. 5: Linien nachfahren
Außerdem werden das Muster mit Hilfe einer Schablone in 3 mm-Abschnitte unterteilt und innerhalb eines jeden Abschnitts Fehlerpunkte vergeben (1 für Berühren, 2 für Überschreiten der Linien und 3 für das Überschreiten einer zusätzlichen Linie auf der Schablone). Die Zeit und die Fehlerzahl gehen getrennt in die Bewertung ein.
2.2.3. Positronen-Emissionstomographie
Bei der Positronen-Emissionstomographie (PET) handelt es sich um ein funktionell bildgebendes Verfahren, das die Untersuchung von Blutfluss, Stoffwechsel- vorgängen und Transmittersystemen erlaubt. Dem zu Untersuchenden werden instabile radioaktive Isotope, erzeugt in einem Teilchenbeschleuniger (Zyklotron) injiziert, die bei ihrem Zerfall Positronen freisetzen. Diese reagieren mit Elektronen und setzen dabei Energie in Form von Photonen (511 keV Gammastrahlung) frei. Es entsteht immer ein Photonenpaar, das im Winkel von 180° auseinander läuft. Dieses wird durch ein Ringdetektorsystem, in welchem der Patient liegt, aufgezeichnet.
Verbindet man gegenüberliegende Detektoren, die jeweils ein Photonenpaar registriert haben, mit einer Geraden, so kreuzen sich diese im Ursprungsort der Photonenquelle. Mittels einer solchen Rückprojektion werden, unter der Berücksichtigung der Schwächung, Schichtbilder erzeugt (27, 28, 29).
Die PET-Untersuchungen erfolgten in der Klinik für Nuklearmedizin der Medizinischen Hochschule Hannover mit einem Siemens ECAT EXACT 951/31- Scanner (räumliche Auflösung ca. 6,5 mm). Zur Applikation der Tracer und Blutentnahmen vor und während der Datenerhebung waren ein arterieller Zugang im Bereich einer A. radialis und ein venöser Zugang am gegenseitigen Unterarm erforderlich. Die Anlage des arteriellen Zugangs erfolgte nach Überprüfung der
arteriellen Versorgung der Hand mittels Allen-Test durch einen Arzt der Klinik für Anästhesiologie und Intensivmedizin unter lokaler Betäubung mit Xylocain® 2 % (Wirkstoff Lidocain). Beide Zugänge wurden unmittelbar nach Abschluss der PET- Untersuchung entfernt. Alle verwendeten Radiopharmaka wurden in der oben genannten Abteilung produziert (Zyklotron MC 35, Scanditronix, Uppsala, Schweden). Die Untersuchung selbst wurde in einem ruhigen Raum mit gedimmtem Licht durchgeführt. Die Probanden lagen dabei entsprechend der klinischen Routine von Hirnuntersuchungen auf dem Rücken mit dem Kopf in einer gepolsterten Schale und einer leichten Fixierung im Stirnbereich und wurden aufgefordert, sich möglichst wenig zu bewegen.
Zunächst war zur Korrektur der Strahlenschwächung durch Photonenabsorption im Gewebe eine Transmissionsmessung mit einer externen Strahlenquelle (Germanium- 68) von 10 min vor der eigentlichen Tracerapplikation erforderlich. Dann erfolgte das
15O-Wasser-, nach einer technisch bedingten Pause von vierzig Minuten (benötigte Zeit zur Produktion des instabilen 13N-Isotops) das 13N-Ammoniak-PET.
2.2.3.1. 15O-Wasser-PET
Die Applikation von 3,7 GBq [15O]H2O (Halbwertszeit 2 min) erfolgte automatisiert mit einer speziellen Apparatur als 7 - 10 s dauernder Bolus intravenös über eine Verweilkanüle (30). Die Aufnahmesequenz wurde simultan mit der Injektion gestartet.
Die zur Quantifizierung der regionalen cerebralen Perfusion erforderlichen arteriellen Blutproben wurden über eine Verweilkanüle im Bereich einer A. radialis entnommen.
Die Blutproben wurden automatisiert mit einem Sampler (ca. 10 ml/min für 2 min, danach 1,5 ml/min, insgesamt ca. 25 ml) entnommen (31). Die emittierten
Gammaquanten wurden in 20 Frames (12 x 5 s, 4 x 15 s, 2 x 30 s und 2 x 60 s, Dauer) registriert. Die Gesamtaufnahmedauer der Perfusionsmessung betrug fünf Minuten.
2.2.3.2. 13N-Ammoniak-PET
Die Messung begann mit der manuellen intravenösen Injektion von 740 MBq [13N]NH (Halbwertszeit 10 min). Die dynamische Registrierung erfolgte in 20 Frames (12 x 10 s, 5 x 30 s, 2 x 120 s, 1 x 900 s) mit einer Gesamtdauer von 23,5 min. Im gleichen zeitlichen Abstand wurden manuell arterielle Blutproben (jeweils 1 ml) entnommen, um die individuelle Verteilungskurve für Ammoniak im Blut zu erstellen.
Diese wurden zeitnah in einem Bohrlochzähler, der zuvor mit dem PET-System crosskalibriert wurde, gemessen.
2.2.4. Magnetresonanztomographie und 1H-Magnetresonanzspektroskopie Die Rotation von Protonen im Zellkern bezeichnet man als Kernspin. Die sich bewegende Ladung erzeugt wie elektrischer Strom ein Magnetfeld. In Kernen mit einer geraden Anzahl Nukleonen heben sich die einzelnen Kernspins in der Summe auf. Bei einer ungeraden Anzahl ergibt sich jedoch eine Nettomagnetisierung nach außen. Diese kann sich in einem externen Magnetfeld, wie es durch den Magnetresonanztomographen erzeugt wird, parallel oder antiparallel ausrichten. Der energieärmere parallele Zustand ist etwas häufiger, d.h. es ergibt sich eine geringe Nettomagnetisierung parallel zum äußeren Magnetfeld. Durch Zufuhr von Energie in Form von elektromagnetischen Radiowellen ist ein Wechsel der Ausrichtung in den energiereicheren antiparallelen Zustand möglich. Wird die Energiezufuhr beendet, kehren die angeregten Kerne wieder in die ursprüngliche Ausrichtung zurück und
setzen dabei Energiequanten frei. Diese werden mittels einer Spule registriert. Die zur Anregung benötigte Resonanzfrequenz und die freigesetzte Signalfrequenz unterscheiden sich für die jeweiligen Atome, abhängig von der Stärke des angelegten Magnetfeldes. Mittels Spektroskopie können aufgrund der so genannten chemischen Verschiebung der Resonanzsignale von Protonen in Abhängigkeit von der jeweiligen chemischen Umgebung, also abhängig vom Molekül, Metabolite in vivo detektiert und quantifiziert werden (32). Bei der Protonen- Magnetresonanzspektroskopie (MRS) sind dies u.a. Kreatin, Cholin, N-Acetylaspartat, Myo-Inositol, Glutamat und Glutamin (33, 34). Glutamat und Glutamin können aus technischen Gründen nicht ausreichend separiert werden (34), so dass eine gemeinsame Bestimmung erfolgt.
Die MRS wurde in der Klinik für Neuroradiologie der Medizinischen Hochschule Hannover mit einem 1,5 Tesla-Gerät (Signa Horizon, Standardkopfspule) der Fa. General Electrics (GE Medical Systems, Milwaukee, USA) durchgeführt.
Zur Planung wurden zunächst in sagittaler Schichtführung T2-gewichtete kranielle schnelle IR-Bilder (TR/TE/TI/Schichtdicke/Schichtlücke 4000 ms/40 ms/130 ms/5 mm/5 mm) sowie
Abb. 6: Beispiel für MRS-Auswahlbereich in den Basalganglien
in transversaler und coronarer Schichtführung T1-gewichtete Spinechobilder (TR/TE/Schichtdicke/Schichtlücke 500 ms/15 ms/5 mm/1,5 mm) erstellt. Auf diesen Bildern wurden graphisch je eine quaderförmige Region von ca. 8 cm3 in der occipitalen grauen Substanz, in der parietalo-occipitalen weißen Substanz, in den Basalganglien und im Ponsbereich festgelegt. Die Hemisphärenseite war dabei nicht vorgegeben, der Untersucher konnte je nach Schnittführung die ihm geeigneter scheinende wählen. In diesen definierten Bereichen wurde mittels der STEAM/VOSY Technik (TR/TE/TM 1500 ms/18 ms/30 ms) ein Protonenspektrum aufgenommen.
Dabei werden die Homogenisierung des Magnetfeldes und die Unterdrückung der Wasserresonanzlinie vollautomatisch durchgeführt. Eine Wasserunterdrückung ist notwendig, da dies sonst das Protonensprektrum dominieren würde (34). Die Ergebnisse werden sofort graphisch dargestellt. Die Quantifizierung der Metabolite erfolgte zunächst mit der systemeigenen GE-Software „Probe-Quantification“. Hierbei erhält man keine absoluten Werte, sondern nur Verhältnisse der Signalintensitäten im Vergleich zu Kreatin. Im nächsten Schritt erfolgte die weitere Spektrenanalyse mit dem Programm LCModel. von S. Provencher (35). Dieses Programm analysiert ein in vivo erstelltes Spektrum als eine lineare Kombination kompletter Modell-Spektren der einzelnen Metabolite in vitro mit bekannten Konzentrationen. Zur späteren Koregistrierung mit dem individuellen PET wurde außerdem von jedem Teilnehmer im Rahmen der kernspintomographischen (MR) Untersuchung ein T1-gewichteter 3D-Bildsatz erstellt.
2.2.5. Labor
Neben den Blutentnahmen zur Erstellung der Aktivitätskurven für die beiden PET- Untersuchungen wurden von jedem Studienteilnehmer noch Serum, heparinisiertes
Plasma und eine arterielle Blutgasprobe gewonnen. Die Proteasen MMP1, MMP9, MMP2, TIMP1, TIMP2, TNF-α und TGF-β1 wurden mit dem handelsüblichen Human Biotrak Easy ELISA (GE Healthcare, Amersham Biosciences) gemessen.
Heparinisiertes Plasma wurde verwendet für MMP9 (Verdünnung 1:20), TIMP1 (Verdünnung 1:40), TNF-α (Verdünnung 1:2) und TGF-β1 (Verdünnung 1:12), Serum für MMP1 (Verdünnung 1:4) und MMP2 (Verdünnung 1:100). Die Messung erfolgte gemäß der von der die Tests anbietenden Firma herausgegebenen Gebrauchsanweisung. Zusätzlich wurde im gekühlt transportierten heparinisierten Plasma die arterielle Ammoniak-Konzentration bestimmt, aus dem venösen gewonnen Serum Bilirubin, Albumin sowie Cholinesterase und es erfolgte eine sofortige arterielle Blutgasanalyse inkl. pH-Bestimmung.
2.3. PET-Tracer-Modelle
Die Bilddaten der PET-Untersuchung wurden mittels Rückprojektion rekonstruiert.
Zur Korrektur der Photonenschwächung diente der initial durchgeführte Transmissionsscan, außerdem war eine Korrektur für die während der PET-Studie zerfallenen Nuklide notwendig. Der rekonstruierte Datensatz wurde mit einem 3D- Binominalfilter (5 x 5 x 3 cm) geglättet. Jedes Bild besteht aus 31 Schichten mit einer Schichtdicke von 3,4 mm. Mögliche Kopfbewegungen während der Datenakquisition wurden mit dem Realign-Tool der Software Statistical Parametric Mapping (SPM2, Welcome Department of Cognitive Neurology, Institute of Neurology, University College, London) korrigiert. Um eine standardisierte, automatisierte Auswertung bestimmter Hirnregionen, sog. „volumes of interest“ (VOI), zu ermöglichen, mussten alle Bilddatensätze stereotaktisch normalisiert, d.h. in gleicher Weise ausgerichtet, werden. Zunächst wurden die jeweiligen PET-Bilder mit dem individuellen T1-
gewichteten MR Bild koregistriert (Coregister Tool, SPM2). Hierzu wurde eine Summenbild aus späten PET-Frames verwandt. Dann wurden die MR-Bilder mit Hilfe der SPM2 T1-Maske gleichartig ausgerichtet, die Transformationsparameter wurden dann in gleicher Weise auf die PET-Bilder angewandt.
Folgende 15 VOIs wurden in der zur Anwendung kommenden Bildmaske „Automated Anatomic Labeling atlas“ (AAL) (36) definiert: Nucleus caudatus, anteriores, mittleres und posteriores Cingulum, Nucleus lentiformis, Pons, supplementär motorischer Kortex, Thalamus, Cerebellum, frontaler, Motor-, occipitaler, parietaler und temporaler Kortex und weiße Substanz. Alle VOIs wurden zu einer globalen VOI summiert. Die Blut-Zeitaktivitätskurven (time activity curve TAC) für 15O-Wasser und
13N-Ammoniak wurden für jeden Studienteilnehmer und jedes VOI individuell aus dem Durchschnitt aller Voxelwerte der jeweiligen VOI erstellt. Die zerebrale Kinetik von Wasser bzw. Ammoniak wurde durch die VOI-basierten TACs mittels des
„Kinetic Tool“ der Software PMOD (Version 2.65, PMOD Technologies Ltd, Adliswil, Schweiz) modellhaft abgebildet.
2.3.1. Wasserkinetik
Die Blutaktivitätskurven für 15O-Wasser wurden mit Hilfe des PMOD-Modells
„Flow & Dispersion“ ausgewertet. Dieses erlaubt die gleichzeitige Anpassung des fraktionierten Blutvolumens (fbv), des zerebralen Blutflusses (cerebral blood flow CBF), des Gewebsblutpartitionskoeffizienten p, als auch der zeitlichen Verzögerung Δt zwischen Tracerinjektion und Anflutung im Gewebe und der Dispersion Τ der arteriellen Blutaktivitätskurve bezogen auf den wahren Einstrom des Tracers ins
Gehirn. Als Ausgangswerte für das Wasser-Model wurde festgelegt: fbv = 0,04, CBF = 0,6 ml Blut/ml Gewebe/min und CBF/p = 0,7/min. Die Qualität der Anpassung wurde mittels visueller Kontrolle der Ergebnisse geprüft. Durch Sensitivitätsanalysen konnte gezeigt werden, das CBF und Dispersion unabhängig voneinander angepasst werden konnten.
2.3.2. Ammoniakkinetik
Abb. 7: 2-Gewebs-Kompartimentmodell des zerebralen Ammoniak-Stoffwechsels
Die Biokinetik von Ammoniak kann durch ein 2-Gewebs-Kompartimentmodell (s. Abb. 6) beschrieben werden. Im arteriellen Blut vorhandenes Ammoniak wird nach Überwindung der Blut-Hirn-Schranke in Astrozyten metabolisiert. Die Blut-Hirn- Schranke ist hauptsächlich für das gasförmige Ammoniak, zu geringen Anteilen auch
für das Ammonium-Ion, permeabel. Das Verhältnis von Gas- und ionisierter Form ist pH-abhängig. Der Influx, d.h. die primäre Clearance-Rate von Ammoniak aus dem Blut, lässt sich beschreiben durch die Transportkonstante k1, der Eflux durch die Konstante k2. Über das Enzym Glutaminsynthetase wird Ammoniak an Glutamat gebunden, es entsteht Glutamin. Die Ammoniakumsatzrate (k3) ist dabei nahezu konstant, die cerebrale metabolische Rate von Ammoniak (CMRA) hängt im Wesentlichen von der Ammoniak-Konzentration ab. Glutamin wird nun entweder astrozytär in Vesikeln gelagert (sog. Glutaminpool), in die extrazelluläre Flüssigkeit abgegeben oder es wird von einem Neuron aufgenommen und wieder zu Glutamat gespalten. Glutamat wirkt am postsynaptischen Rezeptor und wird nach erfolgter Neurotransmission wieder von Astrozyten aufgenommen und erneut durch die Glutaminsynthetase umgesetzt (37).
Die Nettorate der Akkumulation von Ammoniak oder Ammoniak-Retentionsrate berechnet sich wie folgt:
kmet = k1 x k3/(k2 + k3).
Zunächst wurde dieses Modell zu einem 1-Kompartiment-Modell modifiziert. Cooper et al. (1) konnten im Tierversuch zeigen, dass die Halbwertszeit für die zerebrale Metabolisierung von Ammoniak bei 1 - 3 s oder sogar darunter liegt. Lockwood et al.
(3) wiesen in ihren Messungen erst nach drei Minuten die ersten Ammoniakmetabolite im Blut nach. Dies wurde durch Rosenspire et al. (38) bestätigt.
Für dieses Modell wurden deshalb nur die Frames 1 - 12 der Datenakquisition, die ersten beiden Minuten nach Messungsbeginn, berücksichtigt. Der Anfall von
Metaboliten und der Ausstrom von Ammoniak aus dem Gewebe ist in diesem Zeitraum vernachlässigbar, d.h. k2 = 0. Daraus ergibt sich, dass kmet in Näherung k1 x k3/k3 entspricht, also kmet = k1. Die Ausgangswerte für dieses Modell waren fbv = 0,04 und kmet = 0,2 ml Blut/ml Gewebe/min. Im Rahmen des Models wurden gleichzeitig fbv, km und die Verzögerung Δt der Blutaktivitätskurve ermittelt.
Eine weitere Auswertung der Daten erfolgte durch ein 2-Kompartimentmodell. Bei fehlenden technischen Voraussetzungen konnte eine individuelle Messung von Ammoniakmetaboliten nicht durchgeführt werden. Rosenspire et al. (38) bestimmten allerdings bereits schon Ammoniakmetabolite bei Gesunden in den ersten fünf Minuten nach Injektion. Die Ergebnisse können nach der Methode der kleinen Quadrate (39) über den beobachteten Zeitraum von fünf Minuten ausgedehnt werden. Zur Anwendung kam diese Methode bereits bei Ahl et al. (14). Mit der entsprechenden Formel
0 2
1 0
0
t t ) )/T t - (t exp(-ln(2) 100
(%) fraction parent
t t 100
kann dann der Einstrom von Ammoniak (k1) ohne individuelle Metabolitenmessung quantifiziert werden. Dabei gilt t0 = 0,48 min und T1/2 = 6,69 min. Die Aufnahme radioaktiver Metabolite ins Gehirn wird hierbei vernachlässigt. Gleichzeitig werden fbv, der 13N-Ammoniakausstrom aus dem Gewebe k2 und die Konversionsrate von
13N-Ammoniak im Gewebe zu Glutamin (k3) berechnet. Die gewählten Voreinstellungen waren fbv = 0,04, k1 = 0,2 ml Blut/ml Gewebe/min, k2 = 0,02/min und k3 = 0,2/min. Eingang in dieses Modell fand der komplette PET-Datensatz von 23,5 min Messdauer.
Die Levenberg-Marquart „option“ und „uniform weights“ kamen bei allen Modellen zur Anwendung. Verzögerung und Dispersion der Aufnahmekurve wurden jeweils für die Blutaktivitätskurve der VOI Gesamthirn individuell ermittelt (Ausgangswerte Δt = 0 und Τ = 0) und dann für die weiteren VOIs des jeweiligen Probanden die so ermittelten Werte beibehalten.
Die zerebrale metabolische Rate für Ammoniak CMRA berechnet sich dann aus kmet
multipliziert mit der arteriellen Plasma-Ammoniakkonzentration [P-NH3], d.h.
CMRA = kmet x [P-NH3].
Nach Renkin (40) und Crone (41) gilt für diffusible Tracer bei konstanter Applikation im steady state
ln (1-E)CBF = -PS
wobei die Extraktion E = 1/k1 der Anteil der Testsubstanz ist, der durch das Gehirn pro Durchfluss aufgenommen wird, CBF der zerebrale Blutfluss, P die Durchlässigkeit der Kapillaren für die betrachtete Substanz (Permeabilitäskoeffizient) und S die Oberflächengröße der Blut-Hirn-Schranke. Dieses Modell setzt voraus, dass es keinen Rückstrom ins Gefäßsystem gibt (10). Lockwood (42) dehnte die Anwendung auf Tracer nach Bolusinjektion, die in der Beobachtungszeit nach ihrer Aufnahme im Gehirn bleiben und nicht zurück diffundieren und deren Metabolite im gleichen Zeitraum ebenfalls das Kompartiment nicht verlassen, aus. Keiding et al.
(11) schließlich bezeichneten das Produkt als „permeability area surface product“
PSbbb. Es gilt also
PSbbb = -CBF ln(1-k1/CBF).
In Anlehnung an Keiding et al. (2006) wurde für die Berücksichtigung von Eflux und Metaboliten das „metabolic area surface product“ PSmet in dieser Studie als
PSmet = -CBF ln(1-kmet/CBF)
definiert.
Relative, d.h. skalierte Werte für k1, kmet, PSbbb und PSmet wurden gebildet durch individuellen Bezug der regionalen Werte auf den Wert der jeweiligen globalen VOI, z.B. sk1 (VOI) = k1 (VOI)/k1 (global). Die Methode des Skalierens wird genutzt, um bei kleinen Kollektiven die Varianz zu reduzieren.
2.4. Statistische Analyse
Es erfolgte zunächst eine univariate Varianzanalyse der regionalen und globalen Werte von CBF, k1, kmet, PSbbb und PSmet und der zugehörigen skalierten Werte sCBF, sk1, skmet, sPSbbb und sPSmet zwischen den verschiedenen Gruppen (Patienten mit Fibrose nach Ishak Score von F2, F4 oder F6 und Kontrollen) mittels ANOVA (analysis of variance). Als post-hoc-Test kam Scheffé, gemäß dem Ergebnis des Levene-Tests, zur Anwendung. Es erfolgte keine Bonferroni-Korrektur. Der Gruppenvergleich der spektroskopischen Daten erfolgte ebenfalls mit ANOVA und
nach Levene-Testung mit dem Tamhane-post-hoc-Test. Außerdem wurden die Spektroskopie-Ergebnisse mit der globalen und den regionalen CMRA und PSbbb, sowie die Blutparameter mit PSbbb der verschiedenen VOIs korreliert (Spearman ρ-Test). Das Signifikanzniveau bei der zweiseitigen Testung wurde mit α ≤ 0,05 festgelegt. Alle statistischen Analysen wurden mit SPSS 14.0.1 durchgeführt.
3. Ergebnisse
3.1. PSE-Syndrom-Test
Zwei Patienten der F4 Fibrose- und einer der F6 Zirrhose-Gruppe erzielten ein pathologisches Testergebnis, d. h. weniger als -4 WP. Die beiden Patienten mit mittelgradiger Leberfibrose erreichten je -5 WP, der Patient mit Leberzirrhose -6 WP.
Die PET-Daten des Patienten mit Leberzirrhose und pathologischem Testergebnis, also einer minimalen hepatischen Enzephalopathie, gingen allerdings nicht in die Ergebnisse der PET-Auswertung ein, da der betreffende Datensatz aus technischen Gründen nicht ausgewertet werden konnte. Damit war die Gruppe der Patienten mit Leberzirrhose, deren Daten in die PET-Ergebnisse eingingen, weder klinisch noch neuropsychometrisch enzephalopathisch. Die PSE-Testergebnisse aller Kontrollpersonen lagen im Normbereich.
3.2. Positronen-Emmissionstomographie
Drei PET-Datensätze der Zirrhose-Gruppe waren unvollständig, so dass keine Auswertung erfolgen konnte. In einem Fall wurde die Messung der 15O-Wasser- Blutaktivitätskurve zu spät gestartet, einmal war das PET-Gerät selbst falsch kalibriert und die Studiendaten konnten leider nicht rekonstruiert werden, im dritten Fall erfolgte eine unvollständige Speicherung der iterativ rekonstruierten Daten. Die PET-Auswertung erfolgte somit für die Datensätze von jeweils 6 Patienten mit Fibrosegrad F2 und F4, 3 Patienten mit Leberzirrhose und 6 gesunden Probanden.
Hierbei ergaben sich keine Unterschiede der globalen oder regionalen Hirndurchblutung zwischen den verschiedenen Patientengruppen (F2, F4, F6) selbst,
zwischen den einzelnen Patientengruppen und den Gesunden und zwischen allen Patienten zusammengefasst und den Kontrollprobanden. Das gleiche gilt für die Plasma-Ammoniak-Konzentration, globale und regionale CMRA, k1, kmet, PSmet und PSbbb (s. Tab. 1).
CBF [ml/ml/min]
P-NH3
[µmol/l]
kmet
[ml/ml/min]
k1
[ml/ml/min]
CMRA [nmol/ml/min]
PSmet
[ml/ml/min]
PSbbb
[ml/ml/min]
Kontrollen (n=6)
0,330 ± 0,038
21 ± 2 0,143 ± 0,022
0,155 ± 0,026
2,94 ± 0,39 0,190 ± 0,036
0,213 ± 0,046 F2
(n=6)
0,324 ± 0,059
23 ± 8 0,145 ± 0,014
0,156 ± 0,016
3,26 ± 1,10 0,195 ± 0,026
0,215 ± 0,030 F4
(n=6)
0,289 ± 0,045
26 ± 8 0,155 ± 0,016
0,166 ± 0,016
3,97 ± 1,21 0,230 ± 0,051
0,257 ± 0,059 F6
(n=3)
0,347 ± 0,088
30 ± 13 0,154 ± 0,021
0,166 ± 0,027
5,79 ± 3,51 0,205 ± 0,020
0,226 ± 0,029 Patienten
gesamt (n=15)
0,315 ± 0,060
25 ± 9 0,151 ± 0,016
0,162 ± 0,018
4,05 ± 1,93 0,211 ± 0,039
0,234 ± 0,046 Normwert P-NH3 17-38 µmol/l
Tab. 1: Globale Mittelwerte der verschiedenen Parameter
Für die skalierte Ammoniak-Einstromrate sk1 und die Umsetzungsrate skmet fanden sich signifikante Unterschiede zwischen den verschiedenen Gruppen für den supplementär motorischen Kortex, das Cerebellum und den temporalen Kortex. sk1
war im supplementär motorischen Kortex (SMA) der Patienten mit F2 und F4 Fibrose verglichen zu Gesunden signifikant niedriger (F2 p = 0,042, F4 p = 0,046). Dies gilt auch für skmet in besagter Region (F2 p = 0,014, F4 p = 0,021). In der Zirrhose- Gruppe war skmet im supplementär motorischen Korte zwar niedriger als bei Gesunden, das Signifikanzniveau wurde jedoch nicht erreicht. Für den Bereich des Cerebellums gab es signifikante Erniedrigungen von sk1 in der F4 Gruppe (p = 0,013) und von skmet in der F4 (p = 0,011) und der F6 Gruppe (p = 0,046) verglichen mit der
(p = 0,006) verglichen mit dem Wert der Kontrollgruppe signifikant erhöht (s. Tab. 2 und 3).
kmet SMA [ml/ml/min]
skmet SMA kmet
Cerebellum [ml/ml/min]
skmet
Cerebellum
kmet
temporaler Kortex [ml/ml/min]
skmet
temporaler Kortex Kontrollen
(n = 6)
0,162 ± 0,027
1,131 ± 0,075
0,160 ± 0,021 1,119 ± 0,035 0,130 ± 0,020 0,907 ± 0,030
F2 (n = 6)
0,145 ± 0,015
1,001 ± 0,052*
0,155 ± 0,014 1,069 ± 0,031 0,136 ± 0,013 0,938 ± 0,014
F4 (n = 6)
0,156 ± 0,017
1,008 ± 0,039*
0,162 ± 0,014 1,048 ± 0,032* 0,147 ± 0,016 0,952 ± 0,005*
F6 (n = 3)
0,166 ± 0,026
1,074 ± 0,077
0,162 ± 0,024 1,049 ± 0,020* 0,153 ± 0,020 0,926 ± 0,005
SMA: supplementär motorischer Kortex
*: signifikanter Unterschied (p ≤ 0.05) verglichen zur Kontrollgruppe
Tab. 2: Regionen mit signifikanten Gruppenunterschieden von skmet
k1 SMA [ml/ml/min]
sk1 SMA k1
Cerebellum [ml/ml/min]
sk1
Cerebellum k1
temporaler Kortex [ml/ml/min]
sk1
temporaler Kortex Kontrollen
(n = 6)
0,175 ± 0,031
1,126 ± 0,083
0,173 ± 0,025 1,117 ± 0,038 0,142 ± 0,023 0,912 ± 0,032
F2 (n = 6)
0,157 ± 0,015
1,011 ± 0,053*
0,167 ± 0,015 1,072 ± 0,030 0,146 ± 0,014 0,937 ± 0,014
F4 (n = 6)
0,168 ± 0,016
1,012 ± 0,040*
0,173 ± 0,013 1,048 ± 0,031* 0,158 ± 0,015 0,952 ± 0,012*
F6 (n = 3)
0,179 ± 0,030
1,082 ± 0,069
0,174 ± 0,030 1,051 ± 0,014 0,154 ± 0,025 0,929 ± 0,007
SMA: supplementär motorischer Kortex
*: signifikanter Unterschied (p ≤ 0.05) verglichen zur Kontrollgruppe
Tab. 3: Regionen mit signifikanten Gruppenunterschieden von sk1
Für sPSmet fanden sich signifikante Gruppenunterschiede im Bereich des Nucleus lentiformis, des supplementär motorischen, des temporalen und des Motorkortex.
sPSmet war signifikant höher (p = 0,050) im Bereich des Nucleus lentiformis und
der Gruppe mit F2 Fibrose verglichen zur Kontrollgruppe. Ebenfalls signifikant niedriger im Bereich des supplementär motorischen Kortex war sPSmet in der F4- Gruppe (p = 0,011) und signifikant erhöht im Bereich des temporalen Kortex (p = 0,024) jeweils im Vergleich zu Gesunden. sPSmet im Motorkortex war in der Gruppe der Patienten mit Leberzirrhose signifikant höher als in der F2- (p = 0,005) und der F4-Gruppe (p = 0,044) (s. Tab. 4).
PSmet Ncl.
lentiformis [ml/ml/min]
sPSmet
Ncl.
lenti- formis
PSmet SMA [ml/ml/min]
sPSmet
SMA
PSmet
temporaler Kortex [ml/ml/min]
sPSmet
temporaler Kortex
PSmet
Motor- kortex [ml/ml/min]
sPSmet
Motor- kortex Kontrollen
(n = 6)
0.200 ± 0.039
1,051 ± 0,057
0.215 ± 0.042
1,132 ± 0,069
0.174 ± 0.033
0,914 ± 0,038
0.189 ± 0.034
0,995 ± 0,016
F2 (n = 6)
0.221 ± 0.028
1,134 ± 0,053*
0.193 ± 0.023
0,993 ± 0,061*
0.186 ± 0.024
0,952 ± 0,024
0.191 ± 0.025
0,978 ± 0,013†
F4 (n = 6)
0.252 ± 0.063
1,088 ± 0,034
0.227 ± 0.045
0,991 ± 0,044*
0.224 ± 0.054
0,972 ± 0,026*
0.229 ± 0.053
0,993 ± 0,022▪
F6 (n = 3)
0.231 ± 0.025
1,123 ± 0,017
0.220 ± 0.028
1,071 ± 0,087
0.190 ± 0.016
0,927 ± 0,013
0.213 ± 0.026
1,035 ± 0,025
SMA: supplementär motorischer Kortex
*: signifikanter Unterschied (p ≤ 0.05) verglichen zur Kontrollgruppe
†: signifikanter Unterschied (p ≤ 0.05) verglichen zur F6-Gruppe
Tab. 4: Regionen mit signifikanten Gruppenunterschieden von PSmet
Die skalierte Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke für Ammoniak sPSbbb war im Bereich des supplementär motorischen Kortex in der F4 Gruppe im Vergleich zu den Kontrollen signifikant erniedrigt (p = 0,044). Im Bereich des motorischen Kortex hatte die Gruppe mit leichter Fibrose (F2) eine tendenziell geringere PSbbb als die mit fortgeschrittenerer Fibrose (F4) oder Zirrhose (F6). Der Unterschied zwischen F2 und F6 war signifikant (p = 0,013) (s. Tab. 5).
PSbbb Ncl.
lentiformis [ml/ml/min]
sPSbbb
Ncl.
lenti- formis
PSbbb SMA [ml/ml/min]
sPSbbb
SMA
PSbbb
temporaler Kortex [ml/ml/min]
sPSbbb
temporaler Kortex
PSbbb
Motor- kortex [ml/ml/min]
sPSbbb
Motor- kortex Kontrollen
(n = 6)
0.225 ± 0.051
1.074 ± 0.057
0.240 ± 0.052
1.132 ± 0.086
0.197 ± 0.042
0.915 ± 0.036
0.211 ± 0.044
0.989 ± 0.020
F2 (n = 6)
0.244 ± 0.037
1.143 ± 0.072
0.216 ± 0.025
1.009 ± 0.064
0.205 ± 0.029
0.952 ± 0.031
0.210 ± 0.031
0.979 ± 0.016†
F4 (n = 6)
0.283 ± 0.074
1.093 ± 0.050
0.254 ± 0.051
0.998 ± 0.047*
0.252 ± 0.064
0.992 ± 0.046
0.255 ± 0.063
0.998 ± 0.039
F6 (n = 3)
0.254 ± 0.030
1.118 ± 0.016
0.244 ± 0.032
1.077 ± 0.093
0.210 ± 0.023
0.924 ± 0.021
0.235 ± 0.037
1.030 ± 0.042
SMA: supplementär motorischer Kortex
*: signifikanter Unterschied (p ≤ 0.05) verglichen zur Kontrollgruppe
†: signifikanter Unterschied (p ≤ 0.05) verglichen zur F6-Gruppe
Tab. 5: Regionen mit signifikanten Gruppenunterschieden von PSbbb
3.3. Magnetresonanztomographie und -spektroskopie
Die Magnetresonanztomographien aller Probanden waren ohne Nachweis struktureller Veränderungen, die über das normale Altersmaß hinausgingen. Die Ergebnisse der Spektroskopie unterschieden sich signifikant zwischen den verschiedenen Gruppen in der ANOVA-Testung lediglich im Kreatin-Gehalt im Bereich des Pons. Der dortige Kreatin-Gehalt konnte mit LCModel erfolgreich bei 5 Kontrollen (3,36 ± 0,17 mmol/l), je 6 Patienten der F2 (3,65 ± 0,65 mmol/l) und der Zirrhose Gruppe (4,19 ± 0,48 mmol/l) sowie 4 der F4 Gruppe (3,08 ± 0,69 mmol/l) bestimmt werden. Signifikante Unterschiede (p = 0,025) bestanden zwischen dem Kreatin-Gehalt des Pons von Patienten mit Leberzirrhose und dem der Kontrollgruppe, wobei die Patienten eine höhere Konzentration aufwiesen. Für die anderen gemessenen Metabolite bestanden keine signifikanten Gruppen- unterschiede.
Die Cholin-Konzentration in den Basalganglien (Mittelwert aller Probanden, für die MRS und auswertbare PET-Untersuchung vorlagen: 1,36 ± 0,22 mmol/l, n = 18 erfolgreiche Messungen, davon 5 aus der Kontroll-, 6 aus der F2-, 4 aus der F4- und 3 aus der F6- Gruppe) korrelierte negativ mit PSbbb mehrerer Hirnregionen (s. Tab. 6) und die Cholin-Konzentration in der parieto-occipitalen weißen Substanz (1,02 ± 0,18 mmol/l, n = 18, davon 4 aus der Kontroll-, 6 aus der F2-, 5 aus der F4- und 3 aus der F6-Gruppe) korrelierte positiv mit PSbbb im Bereich des Nucleus caudatus (r = 0,561, p = 0,016) und des Pons (r = 0,500, p = 0,035).
VOI global Ncl.
caudatus
Anteriores Cingulum
Mittleres Cingulum
Posteriors Cingulum
Ncl.
lentiformis
SMA Pons
r -0.702 -0.244 -0.593 -0.668 -0.597 -0.694 -0.563 -0.440
p 0.001* 0.330 0.010* 0.002* 0.009* 0.001* 0.015* 0.068
VOI Thalamus Cerebellum frontaler Kortex
Motor- kortex
occipitaler Kortex
parietaler Kortex
temporaler Kortex
Weiße Substanz
r -0.503 -0.626 -0.700 -0.717 -0.568 -0.700 -0.536 -0.224
p 0.033* 0.005* 0.001* 0.001* 0.014* 0.001* 0.022* 0.371
SMA: supplementär motorischer Kortex
*: p ≤ 0.05
Tab. 6: Ergebnisse der Korrelation der Cholin-Konzentration der Basalganglien mit PSbbb der verschiedenen VOIs
3.3. Labor
Die Ergebnisse der verschiedenen Laboranalysen sind in Tabelle 7 zusammengefasst. TNF-α war nur in einer Probe (Patient mit F4 Fibrose) oberhalb der Nachweisgrenze des angewandten Tests vorhanden.
CHE [kU/l]
Bilirubin [µmol/l]
Albumin [g/l]
TGF-β1 [ng/ml]
MMP1 [ng/ml]
TIMP2 [ng/ml]
TIMP1 [ng/ml]
MMP9 [ng/ml]
MMP2 [ng/ml]
Kontrollen (n = 6)
9,76 ± 2,07
10 ± 7 38 ± 3 6,4 ± 4,1 40 ± 14 99 ± 87 278 ± 49 679 ± 438
2083 ± 300
F2 (n = 6)
7,69 ± 1,42
9 ± 3 40 ± 3 7,1 ± 5,5 25± 25 83 ± 101 458 ± 212
324 ± 87 2776 ± 355
F4 (n = 6)
6,57 ± 1,50
12 ± 5 36 ± 2 5,3 ± 4,0 26 ± 6 191 ± 291
400 ± 110
422 ± 172
2747 ± 580
F6 (n = 6)
4,91 ± 1,68
15 ± 7 35 ± 5 6,7 ± 4,2 21 ± 9 120 ± 46 531 ± 127
229 ± 81 2950 ± 700
CHE: Cholinesterase
Normwerte: CHE 5,32-11,25 kU/l, Bilirubin bis 17 µmol/l, Albumin 35-52 g/l
Tab. 7: Ergebnisse der Laboranalysen
Ein Zusammenhang zwischen den verschiedenen Proteasen und der Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke für Ammoniak PSbbb konnte hauptsächlich für TIMP2, den Inhibitor von MMP2, gefunden werden. TIMP2 korrelierte negativ mit PSbbb der VOI Gesamthirn (r = -0,455, p =0,038), des temporalen Kortex (r = -0,445, p = 0,043), des Kleinhirns (r = -0,532, p = 0,013), des supplementär motorischen Kortex (r = -0,449, p = 0,041) und des Pons (r = -0,477, p = 0,029). Des Weiteren korrelierten MMP9 negativ mit PSbbb des Nucleus lentiformis (r = -0,457, p = 0,037) und MMP2 mit PSbbb
des posterioren Cingulums (r = -0,444, p = 0,044).
4. Diskussion
4.1. Zusammenfassung
Begründend auf der Studie von Lockwood et al. aus dem Jahre 1991 (12) herrschte lange die Meinung vor, dass neben einem verminderten hepatischen Ammoniak- Abbau eine erhöhte Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke für Ammoniak eine Mitursache der hepatischen Enzephalopathie darstellt. Damit schien erklärt zu sein, dass auch Patienten mit einer normwertigen Blut-Ammoniak-Konzentration enzephalopathisch sein können (13). Ahl et al. (14) fanden später eine tendenziell niedrigere Ammoniak-Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke bei Patienten mit hepatischer Enzephalopathie im Vergleich zu nicht enzephalopathischen Patienten mit Leberzirrhose. In beiden Gruppen lagen die Werte jedoch über den von Lockwood et al. publizierten Kontrolldaten. Neben den Ammoniak-PET- Untersuchungen führte die Arbeitsgruppe in derselben Studienpopulation auch kernspinspektroskopische Untersuchungen des Gehirns der Patienten und Untersuchungen des cerebralen Glukose-Stoffwechsels mittels FDG-PET durch (15).
Hier zeigte sich keine Korrelation zwischen den Parametern des Ammoniak- Stoffwechsels und den Ergebnissen der Spektroskopie oder des Glukose-PET, jedoch eine signifikante Korrelation der Spektroskopie-Ergebnisse (Anstieg der Glutamat/Glutamin-Signalintensität, Abfall der Myo-Inositol- und Cholin- Signalintensität im Vergleich zu Kreatin) mit dem Glukoseumsatz des Gehirns. Die Glutamat/Glutamin-Signalintensität im Gehirn von Patienten mit Leberzirrhose wird allgemein als Korrelat des astrozytären Ammoniakumsatzes interpretiert, Cholin und Myo-Inositol werden als Osmolyte angesehen, welche dazu beitragen, bei Konzentrationswechseln z.B. von Glutamin das Zellvolumen konstant zu halten.
Cholin gilt darüber hinaus als Marker für Zellmembranumsatz (43). Anders ausgedrückt: Die Hirnfunktion, repräsentiert durch den Glukoseumsatz, schien weniger von der aktuellen Ammoniak-Umsatzrate abzuhängen, als vielmehr von davon unabhängigen metabolischen Einflüssen. Als sich in parallelen – bisher noch nicht publizierten – Untersuchungen der Arbeitsgruppe Weißenborn an Patienten mit einer Hepatitis C-Infektion ohne Zirrhose, ein Anstieg des Glutamat/Glutamin- Gehaltes im Gehirn im Vergleich zu gesunden Kontrollen zeigte, wurde die Hypothese entwickelt, dass die Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke für Ammoniak einer U-Funktion entspricht: Mit zunehmendem Grad der Leberentzündung kommt es zunächst infolge des Einflusses von Inflammationsmediatoren wie z.B. TNF-α, TGF-β oder den Metalloproteinasen zu einer Schädigung der Blut-Hirn-Schranke und konsekutiver Erhöhung der Permeabilität für Ammoniak sowie Erhöhung des astrozytären Glutamingehaltes. Bei Entwicklung einer hepatischen Enzephalopathie im Stadium der Leberzirrhose wird diese Funktion, unter anderem durch eine Änderung des zerebralen Blutflusses mit zunehmendem Grad der Enzephalopathie (44), wieder umgekehrt. Die Beeinträchtigung der Hirnfunktion wäre danach eher abhängig von der gesamten im Krankheitsverlauf akkumulierten zerebralen Ammoniaklast als von der Höhe des Ammoniakumsatzes zum jeweiligen Untersuchungszeitpunkt.
Die Hypothese eines U-förmigen Verlaufs der Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke für Ammoniak mit einer höheren Permabilität bei Patienten mit einer mittelgradigen Leberfibrose verglichen zu Gesunden und solchen mit Zirrhose konnte nicht bestätigt werden. Die Auswertung der skalierten Ammoniakaufnahme und Umsatzrate und der PSbbb bzw. PSmet zeigten jedoch regionale Unterschiede zwischen den
