des Zentrums Innere Medizin der Medizinischen Hochschule Hannover
Direktor. Univ.-Prof. Dr. med. habil. A. Kapp
Zur Regulation und Expression der Transkriptionsfaktoren T-bet und Gata-3 bei allergisch-entzündlichen Ekzemerkrankungen
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Mareike Alter aus Hannover
Hannover 2006
am
Präsident: Herr Professor Dr. med. Dieter Bitter-Suermann Betreuer der Arbeit: Frau Professor Dr. med. Miriam Wittmann
Herr Professor Dr. med. Thomas Werfel
Referent: Herr PD Dr. med. Veit Erpenbeck
Koreferent: Frau Proffessor Dr. med. Britta Eiz-Vesper
Tag der mündlichen Prüfung: 02.05.2007
Promotionsausschussmitglieder: Herr Professor Dr. med. Tobias Welte Herr Professor Dr. med. Carlos Guzman Herr Professor Dr. med. Frank Goosé
Gewidmet meiner Mutter
Elke Beyland und
meinen Geschwistern Julia und Ernst Moritz
Inhaltsverzeichnis
... ... 4Abkürzungen
... 8Zusammenfassung
... 91. Einleitung
... 111.1 Prinzipien der Differenzierung der T-Helferzellen ... 11
1.2 Die abstammungsspezifischen Transkriptionsfaktoren und ihre Funktion in der Th-Zell Differenzierung ... 13
1.2.1 Der Transkriptionsfaktor GATA-3... 13
1.2.2 Der Transkriptionsfaktor T-bet ... 14
1.3.1 IL-12 und Signalwege über den IL-12β2Rezeptor ... 16
1.3.2 IL-4 und Signalwege über den IL-4α Rezeptor ... 17
1.4 Die Transkriptionsfaktoren GATA-3 und T-bet und ihre Funktion bei entzündlichen Erkrankungen ... 18
1.4.1 Die Rolle von T-bet bei chronisch entzündlichen Erkrankungen wie Morbus Crohn und Asthma bronchiale... 18
1.4.2 Allergische Ekzemerkrankungen der Haut ... 20
1.4.2.1 Allergische Kontaktdermatitis... 20
1.4.2.2 Atopische Dermatitis... 22
1.5 Fragestellung der Arbeit... 24
2. Material und Methoden
... 252.1 Separation humaner peripherer mononukleärer Blutzellen (PBMC) ... 25
2.2 Gewinnung reiner CD4+ T-Lymphozyten ... 25
2.3 Kultur und Simulation... 26
2.4 Hautbiopsien... 28
2.4.1 Entnahme von Hautbiopsien ... 28
2.5.1 Isolation von Gesamt-RNA aus Blutzellen ... 29
2.5.2 Isolation von Gesamt-RNA aus Gewebe ... 29
2.6 Reverse Transkription (RT) ... 30
2.7 Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ... 30
2.7.1 Light Cycler ÆRapid Cycle Real-Time-PCR... 31
2.7.2 Real-Time-Fluoreszenz-PCR ... 32
2.7.3 Herstellung der Standardkurven / der Kalibratoren ... 33
2.7.4 Die Kalibrator-normalisierte relative Quantifizierung ... 34
2.7.5 Theorie der Amplifikations- Effizienz ... 34
2.7.7 Datenanalyse / Quantifizierung der Proben ... 35
2.8 Proteingewinnung und Nachweismethoden ... 36
2.8.1 Kernextraktion... 36
2.8.2 Western Blot... 36
2.8.3 Chemilumineszenz-Electro-Mobility-Shift-Assay (EMSA) ... 38
2.9 Durchflusszytometrie und FACS-Analyse... 40
2.9.1 Intrazelluläre IFNγ Färbung ... 41
2.10 Statistik... 42
3. Ergebnisse
... 433.1 Optimierung der PCR für die qualitative und quantitative Auswertung... 43
3.1.1 Qualitative PCR-Ergebnisse verschiedener Zielgene ... 45
3.1.2 Etablierung der quantitativen PCR... 53
3.1.2.1 Erstellung der Standardkurven für die quantitative PCR ... 53
3.1.2.2 Quantitative Auswertung mit Hilfe der Standardkurven... 54
3.1.3 Ergebnisse der Quantitativen PCR... 57
3.1.3.1 Gegensätzliche Effekte von IL-12 und IL-4 auf die T-bet Expression in Abhängigkeit der T-Zell-Rezeptor Stimulation ... 57
3.1.3.2 Gegensätzliche Effekte von IL-12 und IL-4 auf die GATA-3 Expression in Abhängigkeit der T-Zell-Rezeptor Stimulation ... 58
3.2 Exemplarische Darstellung der quantitativen PCR-Analyse von Hautbiopsien ... 60
3.4 Proteinnachweis mit den Electro-Mobility-Shift-Assay (EMSA) ... 68
3.4.1 Exemplarische Darstellung von EMSA-Versuchen zum Protein- und Funktionalitätsnachweis von T-bet Protein... 68
3.5 Durchflusszytometrische Bestimmung der intrazellulären IFNγ Menge in CD4+- Lymphozyten nach unterschiedlichen Stimulationsbedingungen ... 71
3.6 Vergleich der Expressionen von T-bet mRNA in der quantitativen PCR und der IL- 12Rβ2-Kette in der FACS Analyse... 74
4. Diskussion
... 764.1 Ziel der Arbeit ... 76
4.2 Wirkungen von IL-12 und IL-4 auf die T-bet Expression ... 77
4.3 Wirkungen von IL-12 und IL-4 auf die GATA-3 Expression ... 81
4.4 Die Rolle von IFNγ... 82
4.5 Die Rolle von CD28 bei der Th-2-Differenzierung ... 83
4.6 Die Bedeutung des Th-1 spezifischen Transkriptionsfaktors T-bet... 84
4.7 Die Rolle des T-Zell Rezeptors und Signalwege über den T-Zell-Rezeptor ... 85
4.8 Konventionelle semi-quantitative PCR ... 86
4.9 Vor- und Nachteile der quantitativen PCR ... 87
4.10 Housekeeping genes... 88
4.11 Western Blot und EMSA... 89
4.12 Hautbiopsien... 90
4.13 Bedeutung der Transkriptionsfaktoren GATA-3 und T-bet in der entzündeten Haut ... 91
4.14 Zytokinmilieu der Haut während des Verlaufs der Ekzemreaktion – Chronifizierung eines Ekzems ... 92
4.15 Probandenabhängigkeit der Ergebnisse ... 93
4.16 Ausblick ... 94
5 Literaturverzeichnis
... 966.1 Verzeichnis der Abbildungen... 112
6.2 Verzeichnis der Tabellen... 114
6.3 Lebenslauf ... 115
6.4 Liste wissenschaftlicher Publikationen ... 117
6.5 Erklärung nach § 2 Abs. 2 Nrn. 5. und 6. der Promotionsordnung der Medizinischen Hochschule Hannover ... 118
6.6 Danksagung... 119
AD Atopische Dermatitis APC Antigen presenting cell (engl.)
AK Antikörper
Cal Calibrator (engl.)
CD Cluster of Differentiation (Leukozytenantigen) (engl.) CLA Cutaneus Lymphocyte Antigen (engl.)
DNA Desoxyribonucleinacid (engl.)
ELAM Endothelial Leucocyte Adhesion Molecule (engl.)
EMSA Electro-Mobility-Shift-Assay (engl.)
FACS Fluorescence Activated Cell Sorter (engl.) GAPDH Glyceraldehyd-3-phosphat Dehydrogenase GATA-3 Transkriptionsfaktor aus der GATA-Familie HLA Human Leukocyte Antigen (engl.)
IFNγ Interferon-γ
IgE Immunglobulin Klasse E IgG Immunglobulin Klasse G
IL-12Rβ2 Interleukin-12 Rezeptor-β2 Kette
IL Interleukin
NFAT Nuclear Factor of Activated T-cells (engl.) NK Natural Killer Cell (engl.)
PBMC Peripheral Blood Mononuclear Cells (engl.) PCR Polymerase Chain Reaction (engl.)
RealQuant Relative Quantification Software (engl.) RNA Ribonucleinacid (engl.)
RT-PCR Reverse Transkriptase-PCR TCR T-Cell-Receptor (engl.)
STAT Signal Transducer And Transkription Factor (engl.) T-bet T-box expressed in T-cells (engl.)
Tc Cytotoxic T-Cell (engl.)
TGFβ Transforming Growth Factor β (engl.) Th0 naive T-Helferzellen
Th-1 T-Helferzellen Typ 1 Th-2 T-Helferzellen Typ 2
Zusammenfassung
Diese Arbeit beschäftigt sich im Besonderen mit den Th-1 bzw. Th-2 spezifischen
„Schlüssel“-Transkriptionsfaktoren T-bet und GATA-3.
Zunächst wurde die Expression der beiden Transkriptionsfaktoren sowie der hiermit assoziierten Schlüsselzytokine IL-4 und γIFN im direkten Vergleich bestimmt. IL-12 führte zu einer Zunahme von T-bet und IFNγ und einer Abnahme der Expression von GATA-3 und IL-4 in humanen T-Zellen. Eine Stimulation mit IL-4 führte zu einer entgegengesetzten Entwicklung. Diese Ergebnisse sind als Bestätigung bereits veröffentlichter Studien anzusehen. Im Gegensatz zu anderen Studien fand sich allerdings hier keine Induktion von T- bet durch IFNγ.
Der Effekt von IL-12 und IL-4 auf die T-bet Expression hing kritisch vom Zeitpunkt der Stimulation mit IL-12 und IL-4 relativ zur Signalgebung über den TCR mit CD3/CD28 ab.
Eine maximale Expression von T-bet war nach Stimulation mit IL-12 nach vorhergehender Stimulation über den TCR zu beobachten.
Überraschenderweise führte auch eine Stimulation mit dem „Th-2 Zytokin“ IL-4 zur Induktion von T-bet, wobei IL-4 vor der Stimulation des TCR gegeben werden musste.
Die T-bet Expression, die hier auf Transkriptionsebene bestimmt wurde, war mit der Expression von IFNγ, welches auch auf Proteinebene gemessen wurde, assoziiert.
Zusätzlich wurde T-bet auch auf Proteinebene mittels Westernblot und seine DNA- Bindungsfähigkeit mittels EMSA bestimmt. Hierbei zeigte sich, dass T-bet nach Stimulation mit CD3/CD28 und IL-12 auch auf Proteinebene nachweisbar ist.
Neben T-Zellen aus dem Blut wurde auch die Expression von T-bet mRNA in chronisch entzündeter Haut nachgewiesen. Es zeigten sich Parallelen zu anderen entzündlichen Erkrankungen wie Asthma bronchiale und M. Crohn, bei denen ebenfalls T-bet im chronisch entzündlichen Gewebe gefunden wurde.
Diese Ergebnisse stimmen mit der allgemeingültigen Annahme überein, dass in chronisch entzündlicher Haut ein Th-1 Milieu vorliegt und bekommen durch die Versuche mit T-Zellen aus chronisch entzündlicher Haut klinische Relevanz. Die zentrale Rolle der Transkriptionsfaktoren T-bet und GATA-3 wird auch durch die Versuche an Blut-T-Zellen hervorgehoben.
Schlussfolgernd ist ein neuer therapeutischer Ansatz zur Unterbrechung des Chronifizierungsprozesses über T-bet denkbar.
1. Einleitung
1.1 Prinzipien der Differenzierung der T-Helferzellen
T-Helfer-Lymphozyten (Th) lassen sich in verschiedene Subpopulationen (Th-0, Th-1 und Th-2 Lymphozyten) einteilen, die durch das sezernierte Zytokinmuster charakterisiert werden (Mosman und Coffman, 1984, Seder und Paul, 1994). Naive T-Helferzellen sind T- Helferzellen, die noch keinen Antigenkontakt hatten. Sie können sowohl IFNγ (Interferon-γ), als auch IL-4, IL-5 und IL-13 produzieren. Naive T-Helferzellen exprimieren auf ihrer Oberfläche die hochaffine Interleukin-12-Rezeptorβ2-Untereinheit (IL-12Rβ2) des IL-12- Rezeptors und den Interleukin-4-Rezeptor (IL-4R) (Smits et al., 2001). Nach Antigenkontakt unter Th-1 (v.a. durch IL-12) oder Th-2 (v.a. durch IL-4) polarisierenden Bedingungen differenzieren Th-0 Zellen zu IFNγ-produzierenden Th-1 Lymphozyten, zu IL-4, IL-5 und IL- 13 sezernierenden Th-2 Lymphozyten, oder zu Th-0 Lymphozyten des „intermediären“ Th-0 Phänotyps. Diese Polarisierung scheint bei Mäusen wesentlich stärker ausgeprägt zu sein als beim Menschen, bei dem eher der intermediäre Phänotyp vorliegt. Neuerdings wurden auch T-Lymphozyten beschrieben, die nicht in dieses Muster zu passen scheinen. So nimmt eine als Th-3 Lymphozyten bezeichnete Subpopulation über die Produktion von TGFβ und IL-10 wahrscheinlich regulatorische Aufgaben wahr (Neurath et al., 2001) und wird den regulatorischen T-Zellen (Treg) zugeordnet.
Die Th-1 Lymphozyten sind am Zustandekommen des verzögerten Typs der hypersensitiven Immunantwort beteiligt, unterstützen die Produktion Komplement-fixierender Immunglobuline und helfen bei der Abwehr intrazellulärer Pathogene und Viren. Die Hauptaufgabe der Th-2 Lymphozyten liegt in der Unterstützung der Differenzierung von eosinophilen Granulozyten und Unterstützung des Antikörperklassenwechsels zu IgG1 (in Versuchen an Mäusen nachgewiesen) und IgE. Die Th-2 Immunantwort ist Bestandteil der Abwehr gegen Helmithen und anderen extrazellulären Pathogenen.
Nach dem aktuellen pathogenetischen Verständnis nimmt man an, dass übersteigerte Th-1 Immunantworten zur Entstehung von organspezifischen Autoimmunerkrankungen, wie zum Beispiel Diabetes mellitus Typ I und Multipler Sklerose beitragen, während überschießende Th-2 Immunantworten bei der Entstehung von Allergien und Asthma eine Rolle spielen.
Obwohl die Differenzierung durch die Antigenkonzentration und die Art der kostimulatorischen Moleküle beeinflusst wird, spielen Zytokine die größte Rolle in der Regulation des Differenzierungsprozesses (Übersicht in O´Gara, 1998, Abbas et al., 1996).
Das wichtigste Zytokin, welches die Th-2 Differenzierung induziert, ist IL-4. Es vermittelt seine Effekte auf naive Th-0 Lymphozyten vor allem durch einen über STAT-6 (signal transducer and transkriptionfaktor-6) vermittelten Signalweg. Mäuse mit Mangel an IL-4, IL- 4R oder STAT6 können keine Th-2 Zellen entwickeln (Übersicht in Nelms et al., 1999). IL- 12, dessen Signal hauptsächlich über den STAT-4-Weg vermittelt wird, ist der wesentliche Faktor bei der Entwicklung von Th-1 Lymphozyten. Mäuse, denen IL-12, IL-12Rβ2 oder STAT-4 fehlt, zeigen deutlich reduzierte Th-1-Antworten (Gately et al., 1998).
Genablationsstudien zeigen, dass STAT-4 und STAT-6 für die jeweilige Differenzierung von Th-1- und Th-2 Lymphozyten essentiell sind (Kaplan und Grusby, 1998).
Die Differenzierung von Th-2 Lymphozyten ist mit einem Chromatin-Remodeling des IL-4 und des IL-13 Lokus assoziiert, wohingegen die Differenzierung in Th-1-Zellen mit der Umgestaltung des IFNγ Genlokus einhergeht (Agarwal und Rao, 1998). In naiven Th-Zellen befinden sich Zytokingene abseits des Heterochromatins, wodurch sie sich in einem Zustand befinden, in dem sie bereit für eine schnelle Transkription sind. Nach der Polarisation unter Th-1 oder Th-2 induzierenden Bedingungen, werden die Zytokinallele des jeweils gegensätzlichen Zytokinmusters ruhiggestellt und in das Heterochromatin zurückverlagert (Grogan et. al., 2001). Verglichen mit naiven Th-Zellen zeigen differenzierte Th-1 und Th-2 Zellen deutliche Veränderungen in der Chromatinstruktur und in dem Zustand der DNA- Methylierung des IFNγ Lokus und der miteinander verbundenen Gene von IL-4, IL-5 und IL- 13 (Avni et al., 2000, O´Gara et al., 2000). Dekondensiertes Chromatin ist durch eine Hyper- Azetylierung der entsprechenden Histone und durch eine gesteigerte Zugänglichkeit für Transkriptionsfaktoren gekennzeichnet (Strahl, et al., 2000, Cheung et al., 2000). Die Th-Zell Differenzierung ist mit einem dynamischen Prozess der Chromatin-Remodelierung und Histon-Azetylierung an den regulatorischen Regionen der IFNγ und IL-4 Gene assoziiert. Die Stimulation von naiven Th-Zellen für wenige Tage führt zu einer nicht-selektiven Histon- Azetylierung an beiden Zytokingenen. Hierfür ist nur die Stimulierung über den T-Zell- Rezeptor notwendig, der Vorgang ist unabhängig von polarisierenden Zytokinen. Zu späteren Zeitpunkten (ca. 1 Woche) wird die nicht-selektive Histon-Azetylierung durch eine selektive Hyper-Azetylierung im Bereich der entsprechenden Zytokingene ersetzt. Dieser Vorgang ist
abhängig von der fortwährenden Gegenwart der polarisierenden Zytokine und der durch sie aktivierten Transkriptionsfaktoren (IL-4 Æ STAT-6 /Gata-3, IL-12Æ T-bet).
1.2 Die abstammungsspezifischen Transkriptionsfaktoren und ihre Funktion in der Th-Zell Differenzierung
1.2.1 Der Transkriptionsfaktor GATA-3
In den letzten Jahren sind zwei Th-2 spezifische Transkriptionsfaktoren - das c-maf Protoonkogen und GATA-3 identifiziert worden, welche die Differenzierung von Th-2 Lymphozyten regulieren und die Produktion von Th-2 Zytokinen kontrollieren.
GATA-3 ist ein pleiotroper Transkriptionsfaktor, der zur C4 Zink-Finger-Familie gehört und in Mastzellen, eosinophilen Granulozyten, basophilen Granulozyten und embryonalen Gehirn- und Nierenzellen exprimiert wird (Pandolfi et al., 1995, Ho et al., 1991, Ting et al., 1996). Die gezielte Entfernung von GATA-3 bei Mäusen (sog. GATA-3-Knockout-Mäuse) führt während der Embryonalphase zu Störungen bei der fetalen Leber-Hämatopoese und Defekten im Zentralen Nervensystem (Pandolfi et al., 1995).
Es wurde gezeigt, dass GATA-3 notwendig für die Th-Zell Differenzierung ist (Ting et al., 1996). Erst später wurde entdeckt, dass GATA-3 eine Schlüsselrolle in der Th-2, nicht jedoch der Th-1 Zell-Polarisierung spielt (Zheng et Flavell 1997, Zhang et al., 1998). GATA-3 kommt jedoch nicht nur bei der Th-2 Differenzierung eine wichtige Rolle zu, sondern kann auch bereits polarisierte Th-1 Zellen wieder zum Th-2 Phänotyp zurückführen. Antisense- GATA-3 reduziert die Menge der Th-2 Zytokine, die von Th-2-Zellklonen oder von primären Th-2 Lymphozyten produziert wird (Finotto et al., 2001, Kline et al., 2002).
GATA-3 transaktiviert insbesondere den IL-5 Promotor, während der IL-4 Promotor nur schwach transaktiviert wird. Tatsächlich führt eine ektope Überexpression von GATA-3 in primären Th-1 Lymphozyten zu einer Hochregulation der IL-4 und IL-5 Expression, zur Herunterregulierung der β2 Kette des IL-12 Rezeptors, zu einer Blockade des STAT-4 Signalweges und der Expression von IFNγ. Durch ektope Expression kann GATA-3 die Th-2
Entwicklung in STAT-6 defizienten Zellen wieder herstellen, was nahe legt, dass es als ein
"Master switch"-Faktor auch für STAT-6 unabhängige Th-2 Differenzierungswege fungiert.
GATA-3 wird von IL-4 in einem STAT-6 abhängigen Signalweg induziert, c-Maf dagegen durch einen T-Zell-Rezeptor abhängigen Signalweg. Wenn GATA-3 durch IL-4 und STAT-6 induziert wird, kann es den c-maf-Promotor transaktivieren. Zudem Seite ist c-Maf ein hochpotenter Transaktivator des GATA-3 Promotors und des GATA-3 Enhancers. Während GATA-3 hauptsächlich IL-5 transaktiviert, wirkt c-Maf eher auf den IL-4 Promoter.
Dieses demonstriert die Verknüpfung zwischen den Gata-3 und c-Maf abhängigen Signalwegen und macht deutlich, dass sowohl T-Zell-Rezeptor Aktivierung, als auch IL-4/
STAT6 wichtige Rollen in der Differenzierung der Th-2 Zellen einnehmen (Ho et al., 1998).
Ouang et al. (1998) konnten einen positiven Feedbackmechanismus aufzeigen, der ermöglicht, dass es zu einer STAT-6 unabhängigen GATA-3 Autoaktivierung kommt, was zur Stabilisierung der Th-2 Antwort führt.
1.2.2 Der Transkriptionsfaktor T-bet
Szabo et al. (2000) isolierten einen Transkriptionsfaktor, der zuständig für die gewebsspezifische Expression von Th-1 Zytokinen ist. Diesen Transkriptionsfaktor nannten sie T-box-expressed in T-cells (T-bet). T-box Gene codieren eine Famililie phylogenetisch verwandter DNA bindender Proteine, die Genexpressionen während der Embryogenese regulieren (Sinha et al., 2000).
Humanes T-bet ist ein Protein aus 535 Aminosäuren (Zhang und Yang, 2000). Mittels Northern-Blot Analysen konnte T-bet in Lunge, Thymus und Milz nachgewiesen werden (Zhang et Yang, 2000). Eine T-bet Expression kann in CD4+, CD8+ und NK Zellen gefunden werden, allerdings scheint die Abhängigkeit der IFNγ-Expression von T-bet in CD4+ Zellen am ausgeprägtesten zu sein (Szabo et al., 2002).
T-bet ist ein Th-1 spezifischer Transkriptionsfaktor, der die Expression des Th-1 Zytokins IFNγ kontrolliert. Szabo et al. (2000) zeigten, dass T-bet sogar in bereits polarisierten Th-2 Zellen die Produktion von IFNγ induzieren kann. T-bet wird sowohl in sich entwickelnden,
als auch in bereits festgelegten Th-1 Zellen exprimiert (Szabo et al., 2000). T-bet initiiert die Th-1 Differenzierung von naiven Th-Vorläuferzellen, indem es sowohl das Th-1 Gen- Programm aktiviert als auch das gegensätzliche Th-2 Gen-Programm unterdrückt (Szabo et al., 2000). Der Wechsel eines Th-2 Phänotyps in einen stabilen Th0/Th-1 Phänotyp ist verbunden mit dem Verlust der GATA-3 Expression (Kennzeichen des Th-2 Phänotyps) und der Induktion der T-bet Expression (Smits et al., 2001). Lighvani et al (2001) beschrieben, dass T-bet eine Rolle im Chromatin-Remodeling des IFNγ-Genes spielt und so einen Effekt auf die vererbbare Polarisierung ("Imprinting") der T-Zellen ausübt.
Eine weitere Funktion von T-bet ist die Induktion der Expression der hochaffinen IL-12β2- Kette des IL-12 Rezeptors. Die ektope Expression von T-bet in STAT-4 defizienten Zellen stellt die IFNγ Expression wieder her und induzierte die Expression des IL-12Rβ2 Rezeptors.
Die zunächst von Szabo et al. (2000) aufgestellte Annahme, dass T-bet durch IL-12 und STAT-4 induziert wird, ist durch das Vorliegen neuerer Daten anzuzweifeln. Diese weisen darauf hin, dass T-bet durch IFNγ und STAT-1 während der TCR abhängigen T-Zell Aktivierung induziert wird (Lighvani et al., 2001).
Neuere Daten deuten weiterhin darauf hin, dass T-bet die Expression von GATA-3 und der Th-2 Zytokine nicht vollständig abschaltet, sondern zur Expression von Th-1 Zytokinen bei zuvor bestehendem Th-2 Zytokinmuster führt (Szabo et al., 2002). Das bedeutet, dass ein Th- 1 Zytokinmuster, charakterisiert insbesondere durch die Expression von IFNγ, auch in Th-2 polarisierten Zellen dominieren kann.
IFNγ und T-bet alleine sind nicht ausreichend, um eine vollständige Th-1 Entwicklung zu erreichen. Afkarian et al. (2002) nehmen an, dass nach der Aktivierung von T-Zellen mit IFNγ und Stimulation über den TCR T-bet induziert wird und dadurch die IL-12Rβ2 Untereinheit hochreguliert wird. Nun ist eine Signalgebung über IL12 und STAT-4 möglich und kann eine optimale Th-1 Differenzierung einleiten (Afkarian et al., 2002).
Die Signalwege, in die der Transkriptionsfaktor T-bet einbezogen ist, sind offensichtlich eng miteinander verbunden und T-bet scheint eine zentrale Rolle in ihrer Regulation einzunehmen. Die Bedeutung von T-bet auf die Th-1 Reaktion wird durch in vivo Experimente mit T-bet Knockout Mäusen unterstrichen, die an allergischem Asthma
erkrankten (Finotto et al., 2002). T-bet wurde auch in Gewebeproben bei entzündlichen Darmerkrankungen wie Morbus Crohn nachgewiesen (Neurath et al., 2002).
1.3.1 IL-12 und Signalwege über den IL-12β2Rezeptor
Die Fähigkeit einer T-Zelle, auf IL-12 zu antworten, ist abhängig von der Expression des hochaffinen IL-12-Rezeptors, welcher aus einer β1 und einer β2 Untereinheit zusammengesetzt ist. Die IL-12Rβ2 Untereinheit vermittelt hauptsächlich die Signaltransduktion. Diese schließt die Aktivierung von STAT-4 ein, das für die Th-1 Entwicklung essentiell ist.
Th-0- und Th-1 Lymphozyten exprimieren die IL-12Rβ2 Kette und es wurde gezeigt, dass im humanen System IL-12 selbst – neben Typ I Interferonen - für die Hochregulation der vom T- Zell-Rezeptor induzierten IL-12Rβ2 Kette verantwortlich ist (Rogge et al., 2000). Polarisierte Th-2 Lymphozyten exprimieren nicht die signaltransduzierende β2 Untereinheit des IL-12 Rezeptors und reagieren daher nicht auf IL-12. Detaillierte Analysen von Rogge et al. (2000) zeigen, dass IL-4 zu einem großen Teil für die Unterdrückung der IL-12Rβ2 Kette verantwortlich ist.
Studien im Mausmodell legen nahe, dass diese gegensinnigen Effekte von IL-12 und IL-4 auf die IL-12Rβ2 Kette zumindest teilweise durch GATA-3 vermittelt werden, da dieses die Gentranskription der IL-12Rβ2 Kette hemmt (Ouyang et al., 2000). Im Vergleich zu polarisierten Maus Th-2 Lymphozyten sind humane Th-2 Lymphozyten weniger stabil (Manetti et al., 1994, Yssel et al., 1994, Smits et al., 2001).
Durch Stimulation des T-Zell Rezeptors mit stimulierenden anti-CD3/ anti-CD28-AK wird die IL-12Rβ2 Kette niedrig exprimiert. Die Expression ermöglicht IL-12, Signale auszulösen, welche die Expression der IL-12Rβ2 Kette weiter erhöhen. Die Gabe auf unstimulierte T- Zellen ist nicht ausreichend, eine stabile Expression der IL-12Rβ2 Kette zu gewährleisten (Smits et al., 2001).
Im Gegensatz dazu kann der Effekt von IL-4 auf die IL-12Rβ2 Kette nur unter anhaltenden Th-2 Bedingungen aufrecht erhalten bleiben. Der Wechsel in einen stabilen Th0/Th-1
Phänotyp ist verbunden mit einem Verlust der GATA-3 Expression (als Kennzeichen des Th- 2 Phänotyps) und der Induktion der T-bet Expression (stellvertretend für den Th-1Phänotyp) (Smits et al., 2001).
IL-12 wird insbesondere von Antigen präsentierenden Zellen produziert. Diese Produktion kann unter anderem durch CD40 Ligand supprimiert werden (Wittmann et al., 2002).
1.3.2 IL-4 und Signalwege über den IL-4α Rezeptor
IL-4 ist ein multifunktionelles Zytokin, welches eine wichtige Rolle bei der Regulation von Immunreaktionen spielt. Der IL-4α Rezeptor (IL-4Rα) ist ein 140kd großes Transmembranprotein, das IL-4 mit hoher Affinität bindet und ubiquitär exprimiert wird (Galizzi et al., 1990).
Die Bindung von IL-4 an seinen Rezeptor löst die Formation des IL-4R Komplexes aus, bestehend aus der spezifischen IL-4Rα Kette und der gewöhnlichen γc-Kette der Rezeptoren für IL-2, IL-4, IL-7 IL-9 und IL-15 (Hage et al., 1999) und führt zur Phosphorylierung von JAK1 und JAK3, wodurch diese Kinasen aktiviert werden und die ersten Schritte der Signaltransduktion eingeleitet werden (Miyazaki et al., 1994; Russel et al., 1994).
Die Induktion der jeweiligen Gene durch IL-4 beinhaltet die Aktivierung von STAT-6, welches wiederum die Transkription von GATA-3 aktiviert (Kurata, et al., 1999).
1.4 Die Transkriptionsfaktoren GATA-3 und T-bet und ihre Funktion bei entzündlichen Erkrankungen
1.4.1 Die Rolle von T-bet bei chronisch entzündlichen Erkrankungen wie Morbus Crohn und Asthma bronchiale
Peyer Plaques, sind organisierte lymphatische Gewebe im Dünndarm. Hier reguliert das Immunsystem eine Immunantwort auf Nahrungsmittel-Antigene, die physiologische Flora und pathogene Keime. Daher ist das Verständnis der Regulation in diesen Geweben wichtig für eine genauere Einsicht in Erkrankungen wie Nahrungsmittelallergien oder chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (z.B. Morbus Crohn).
Frisch isolierte T-Zellen aus menschlichen Peyer Plaques sekretieren spontan Zytokine mit einer deutlichen Th-1 Dominanz (Hauer et al., 1998). Des weiteren zeigen frisch isolierte menschliche T-Zellen aus Peyer Plaques in vitro nach Kontakt mit Nahrungsmittelantigenen eine T-Zellaktivierung, welche von IFNγ dominiert wird, während nur wenige Zellen IL-4, IL-5 und IL-10 produzieren. In aufgereinigten CD4+ und CD8+ Lymphozyten aus Peyer Plaques sind RNA-Transkripte für IL-12Rβ2 zu finden. Aktives STAT-4, ein Transkriptionsfaktor, der für die IL-12 vermittelte Th-1 Differenzierung notwendig ist, kann aus Biopsien aus Peyer Plaques und Ileummukosa nachgewiesen werden. Die STAT-4-DNA Bindungsfähigkeit konnte mittels Elctro mobility shift assay (EMSA) demonstriert werden (Montelone et al., 2003). Kernextrakte von T-Zellen aus Peyer Plaques enthalten STAT-4 und T-bet (Montelone et al., 2003).
Obwohl die Ätiologie chronisch entzündlicher Darmerkrankungen noch unbekannt ist, wird vermutet, dass sie mit der Aktivierung des Mukosa-assoziierten Immunsystems als Antwort auf bakterielle Antigene und nachfolgender pathologischer Zytokinproduktion zusammenhängt. Die chronische intestinale Entzündung wird zumindest teilweise durch das Verhältnis zwischen der IFNγ / IL-4 und TGFβ (Transforming growth factor β) Aktivität kontrolliert.
Neurath et al. (2002) diskutieren, dass ein durch T-bet regulierter Weg der T-Zell Aktivierung zu einer intestinalen Fehlregulation zwischen IFNγ / IL-4 und TGFβ führt und so die Entwicklung der chronischen intestinalen Entzündung begünstigt.
Interessanterweise unterscheidet sich die Zytokinproduktion von Lamina propria CD4+
Lymphozyten bei Morbus Crohn und Colitis ulcerosa. Während Morbus Crohn mit einer erhöhten Produktion des Th-1 Zytokins IFNγ assoziiert ist, ist Colitis ulcerosa Th-2 assoziiert.
Passend dazu wird T-bet bei Patienten mit Morbus Crohn exprimiert, nicht aber bei Colitis Ulcerosa und Kontrollpatienten (Neurath et al., 2002).
Beim allergischen Asthma bronchiale ist unter anderem eine überschießende Immunantwort auf ubiquitäre Inhalationsallergene bei genetisch prädispositionierten Individuen zu beobachten. In der Pathogenese der allergischen Atemwegserkrankungen haben T- Helferzellen eine Schlüsselfunktion. Die Lunge der Patienten, die an Asthma erkrankt sind, ist von Th-Zellen, die Th-2 Typ Zytokine (IL-4, IL-5 und IL-13) produzieren, infiltriert.
Studien an transgenen Mäusen weisen darauf hin, dass die Expression einer dominant negativen Mutation von GATA-3 eine allergische Atemwegsentzündung verhindern kann (Zhang et al., 1999), was darauf hindeutet, dass GATA-3 eine wichtige Rolle bei der Th-2 Zell-vermittelten Atemwegsentzündung spielt (Ray, et. al 1999). Die spezifische Blockade der GATA-3 Expression in der Lunge mit Antisense-Oligonukleotiden führt zur Unterdrückung der Atemwegsentzündung und der Th-2 Zytokinproduktion (Finotto et al., 2001).
Es wurde entdeckt, dass T-bet in Lungen von Patienten mit allergischem Asthma signifikant niedriger exprimiert wird als in Lungen von nicht-asthmatischen Kontrollpatienten. Die Studie beschreibt weiter die Ausbildung eines Asthma-ähnlichen Krankheitsbildes bei T-bet defizienten Mäusen (Glimcher, et al., 2002).
1.4.2 Allergische Ekzemerkrankungen der Haut
Ekzemerkrankungen werden im klinischen Alltag sehr häufig diagnostiziert. Die wichtigsten Ekzemerkrankungen sind das allergische Kontaktekzem und die atopische Dermatitis (AD).
Ekzeme sind nichtkontagiöse entzündliche Dermatosen, die haupsächlich auf die Epidermis und das obere Korium beschränkt sind. Akute Ekzeme sind durch eine intensive, meist unscharf begrenzte Rötung, leichte Infiltrationen und viele Papulovesikel gekennzeichnet.
Das chronische Ekzem geht mit einer blasseren Rötung, feiner Schuppung, einer Verdickung der Haut und, bei einem hochchronischen Verlauf, mit einer Lichenifikation einher. Diese Veränderungen variieren mit der Intensität und dem Stadium des Ekzems und werden außerdem durch sekundäre Ereignisse, wie z.B. Superinfektionen, modifiziert (Burton, 1992).
Das histologische Korrelat findet sich in der Präsenz eines überwiegend lymphohistiozytären Infiltrates an den oberen dermalen Blutgefäßen einer Spongiose und variierende Abstufungen der Akanthose. Das mononukleäre Infiltrat in Dermis und Epidermis besteht zum größten Teil aus CD4+ Th Zellen, es können aber auch unterschiedlich große Anteile von CD8+ T-Zellen gefunden werden (Bressler et al., 1984, Gawkroder et al., 1986, Ralfkiaer et al., 1984).
Weiterhin infiltrieren Blutmonozyten, basophile und eosinophile Granulozyten die Dermis (Dvorak et al., 1972, 1976; Bruijnzeel et al., 1993; Kapp et al., 1995, Breuer et al., 2006) Subjektiv besteht in der Regel starker Juckreiz. Sowohl morphologisch als auch histologisch sind die beiden Erkrankungsbilder, allergische Kontaktdermatitis und AD, nicht von einander zu unterscheiden. Diese Übereinstimmung kann durch die gemeinsame Endstrecke, die in der Freisetzung von Zytokinen besteht, erklärt werden (Barnetson et al., 1996, Burton, 1992).
1.4.2.1 Allergische Kontaktdermatitis
Die allergische Kontaktdermatitis stellt den Prototyp einer durch T-Zellen vermittelten Immunreaktion dar; eine Hypersensitivitätsreaktion vom Spättyp, bei der es sich nach der Einteilung von Coombs und Gell um eine Typ IV Reaktion handelt. Die allergische Kontaktdermatitis wird hauptsächlich durch niedermolekulare Haptene hervorgerufen, die erst nach Bindung an körpereigene Proteine (Serumproteine, Zellmembranproteine) zum Allergen
werden (Eisen et al., 1952). Unter normalen Umständen penetrieren insbesondere Moleküle mit einer Größe von unter 1kD in die Haut. Die Sensibilisierung wird durch Langerhanszellen, die mit dem entsprechenden Allergen aus der Epidermis über afferente Lymphgefäße in regionale Lymphknoten einwandern, eingeleitet. Die Langerhanszellen präsentieren das Allergen in Assoziation mit MHC Klasse II den T-Lymphozyten in parakortikalen Bereichen der Lymphknoten.
Die klinische Symptomatik wird durch erneuten Allergenkontakt ausgelöst, wenn spezifische T-Lymphozyten aktiviert werden und in die Haut wandern (Maibach et al., 1993). Nach der Sensibilisierung kommt es bei erneutem Allergenkontakt zu einer sogenannten „Booster“- Reaktion in den regionären Lymphknoten und zur Zunahme der spezifischen Lymphozyten in der Zirkulation.
Die Auswanderung in die Haut wird wahrscheinlich durch sogenannte Homingfaktoren auf der Oberfläche der Lymphozyten wie dem „cutaneus lymphocyte antigen“ (CLA) und Adhäsionsmolekülen auf kutanen Gefäßen wie „endothelial leucocyte adhesion molekule“
(ELAM) verursacht (Santamaria-Babi et al., 1995; Wardorf et al., 1991).
Durch die Aktivierung kommt es zur Proliferation und Sekretion von Zytokinen (Grabbe, 1998). Das Maximum der Infiltration nach Allergenexposition liegt bei 48-72 Stunden, was wichtig für die Beurteilung von Epikutantestungen ist. Nach ausbleibender Allergenexposition wird die Reaktion wieder herunterreguliert. Während das allergische Kontaktekzem lange Zeit als klassische Th-1 Reaktion angesehen wurde, mehren sich die Hinweise, dass auch hier ein biphasisches Entzündungsgeschehen, mit einer initial eher Th-2 ähnlichen Reaktionslage und einem anschließendem Wechsel zu einer Th-1 dominierten Immunantwort, vorliegt. In der akuten Phase der allergischen Kontaktdermatitis herrscht eher ein Th-2-Zytokinmilieu vor (Werfel et al., 1997a), das sich während der Chronifizierung des Ekzems in ein vorwiegendes Th-1-Muster umwandelt (Werfel 1997b, Wittmann et al., 2001)
1.4.2.2 Atopische Dermatitis
Die atopische Dermatitis (AD) ist eine chronisch rezidivierende entzündliche Hauterkrankung, die vorwiegend im frühen Kindesalter beginnt.
Die Kriterien für die Diagnose der AD bestehen nach Hanifin und Raikja in chronischen oder chronisch rezidivierenden, z.T. heftig juckenden, ekzematösen Morphen in charakteristischer Verteilung. Außerdem gehört eine positive Eigen- oder Familienanamnese zu den Hauptkriterien. Die genetische Basis der AD wird durch Zwillingsstudien unterstrichen.
Eine Reihe von Untersuchungen weist auf Dysregulationen der zellulären Immunantwort hin (Kapp et al., 1995, Leung et al., 2004, Breuer et al., 2006). Die Hautläsionen der AD sind histologisch durch die Infiltration mit CD4+ Lymphozyten, Monozyten bzw. Makrophagen, Mastzellen und Eosinophilen gekennzeichnet. Zudem finden auch Interaktionen mit Keratinozyten statt (Wittmann et al., 2006)
Bei der AD spielen Umweltfaktoren und multiple Provokationsfaktoren eine Rolle (Werfel et al., 1998). Es ist bekannt, dass die Serum-IgE-Spiegel bei der Mehrheit der Erkrankungen erhöht sind und dass insbesondere auch spezifisches IgE, welches Umweltallergene (Atopene) wie Pollen, Tierepithelien oder Milbenantigene bindet, im speziellen bei der extrinsischen Form der AD nachweisbar sind (Hoffmann et al., 1975, Johnson et al., 1974). Bei der intrinsischen Form bleibt der Nachweis spezifischer Sensibilisierungen jedoch negativ. Die Ätiologie dieses Krankheitsbildes ist z.Zt. noch weitgehend unverstanden (Werfel et al., 1999)
Bei Patienten mit AD exprimieren Langerhanszellen Fc-Rezeptoren für IgE in der Haut. In Ekzemläsionen, die mittels Epikutanapplikation von Atopenen hervorgerufen werden (sog.
Atopie-Patch-Test-Reaktionen), finden sich Langerhanszellen, die spezifische Antigene und IgE auf ihrer Oberfläche tragen (Bieber et al., 1989, 1992). Spezifisches IgE und T-Zellen können gemeinsam an einer Hautreaktion beteiligt sein, bei der über IgE an Fc-Rzeptoren auf Langerhanszellen Allergene gebunden und T-Zellen präsentiert werden (Mudde et al., 1992, 1990, Novak et al., 2005). Dieses und der Nachweis Antigen-spezifischer T-Lymphozyten in Atopie-Patch-Test-Läsionen (Sager 1992, Wistokat-Wülfing et al., 1999) legen nahe, dass eine z.T. IgE-vermittelte Kontaktüberempfindlichkeit bei der AD eine wichtige Rolle spielt.
Die Allergene müssen dazu nicht unbedingt von außen auf die Haut gelangen, sondern können auch über den Blutweg die Haut erreichen, was z.B. durch Nahrungsmittel als auslösende Schubfaktoren deutlich wird (Werfel et al, 2004). Im Rahmen einer Chronifizierung ist es aber auch möglich, dass sich die antigenspezifische Immunantwort bei der AD in eine vom Antigen unabhängige, sich selbst aufrechterhaltende Entzündungsantwort übergeht, die durch zahlreiche endogene und auch exogene Faktoren getriggert wird.
Obwohl die AD eher zu den Th-2 vermittelten Erkrankungen gezählt wird (Cooper, 1994), ist klar, dass im Hautkompartiment in den chronischen Krankheitsstadien ein von IFNγ geprägtes Milieu vorherrscht. Mittlerweile anerkannt ist die Tatsache, dass ein Wechsel von Th-2 in der akuten Phase zu einer Th-1 vermittelten Immunantwort in der chronischen Phase der atopischen Dermatitis stattfindet (Grewe et al., 1998, Bruijnzeel et al.1993, Werfel et al., 1997a, Werfel 1997b, Wittmann et al., 2001). Unklar ist bisher, welche Rolle in diesem Wechsel die Transkriptionsfaktoren T-bet und GATA-3 spielen. Überträgt man die Ergebnisse, welche im Bereich der Entzündungsreaktionen bei Asthma (Glimcher et al, 2002) und bei Darmerkrankungen (Neurath et al., 2002) gewonnen wurden auf das Hautmodell, ist gut vorstellbar, dass in der chronischen Entzündungsreaktion der Haut eine erhöhte Expression von T-bet und in der akuten Entzündung eine erhöhte Expression von GATA-3 vorliegt.
1.5 Fragestellung der Arbeit
In dieser Arbeit sollen Faktoren, die den Wechsel des Zytokinmilieus beeinflussen, untersucht werden. Weiterhin sollen Signalwege, die bei der Chronifizierung relevant werden können, näher charakterisiert werden. In der aktuellen Literatur kommt T-bet für die chronische Entzündungsphase eine wesentliche Bedeutung zu. Ein besseres Verständnis des Zytokinwechsels und der Chronifizierungsreaktion scheint eng mit einer genauen Kenntnis der T-bet Regulation verbunden zu sein. Dieser Regulationsweg soll daher näher betrachtet werden.
Die meisten Studien im Bezug auf die T-bet Regulation sind an Mäusen durchgeführt worden.
Aufgrund vorliegender Literatur ist jedoch bekannt, dass gerade in Hinblick auf die T-Zell Differenzierung bedeutende speziesspezifische Abweichungen vorliegen können. Gibt es auch für T-bet derartige Unterschiede?
In vorausgegangenen Studien wurde die Expression von T-bet in entzündlichen Geweben (Darm, Lunge) nachgewiesen. Daher stellte sich die Frage, ob auch in der entzündeten Haut T-bet oder GATA-3 nachgewiesen werden kann. Gibt es hierbei Unterschiede zwischen der chronisch entzündeten Haut und der akut entzündeten Haut? Korreliert die aufgefundene T- bet/GATA-3 Expression mit oben genannten Vorstellungen des Zytokinmilieus in der entsprechenden Phase der Entzündung?
Es ist bisher wenig über den Nachweis von T-bet auf Proteinebene berichtet worden. Sind Daten aus der RNA-Analyse überhaupt auf die Proteinebene übertragbar? Kann eine DNA- Bindungsfähigkeit dieses Proteins und damit seine Funktionalität nachgewiesen werden?
2. Material und Methoden
2.1 Separation humaner peripherer mononukleärer Blutzellen (PBMC)
Zur Gewinnung peripherer, mononukleärer Blutzellen wurde eine Dichtegradientenzentrifugation mit Vollblut über ein Trennmedium (Lymphoprep, Axis- Shield, Oslo, Norwegen) durchgeführt. Das Zellgemisch aus Lymphozyten, Monozyten und Thrombozyten reichert sich aufgrund seiner Dichte an der Grenze zwischen Ficoll und Medium (Interphase) an und kann mittels Pasteurpipetten entnommen werden. Im Zellsediment befinden sich Erythrozyten und Granulozyten.
Heparinisiertes, venöses Vollblut wurde 1:2 mit Iscoves Basismedium (Seromed, Berlin) verdünnt. 15ml Lymphoprep wurde mit 35ml Blut-Medium-Gemisch in einem 50ml Probenröhrchen überschichtet und 40 Minuten bei 400 x g zentrifugiert. Nach Aufnahme der Interphase in 10ml Iscoves Medium schloss sich eine weitere Zentrifugation für 15 Minuten bei 400 x g an. Anschließend fanden zwei Waschgänge mit Iscoves-Medium bei 150 x g für 15 Minuten statt, um in der Lösung enthaltene Thrombozyten zu entfernen. Das Zellpellet wurde in IAB-Medium (Iscoves-Basismedium mit humanen AB-Serum) aufgenommen und die Zellen in einer Neubauer-Zählkammer unter einem Lichtmikroskop gezählt.
2.2 Gewinnung reiner CD4+ T-Lymphozyten
Die Isolation von humanen CD4+ T-Helfer aus PBMC wird durch das Entfernen von nicht Th-Zellen erreicht (sogenannte Negativselektion). Für das Herausfiltern von B-Zellen, Monozyten, NK-Zellen, zytotoxischen T-Zellen, dendritischen Zellen, Erythrozytenvorläufer- Zellen, Thrombozyten und Basophilen werden diese Zellen mit einem Cocktail aus Hapten- konjugierten CD8, CD11b, CD19, CD26, CD36 und CD56 Antikörpern und MACS MicroBeads, die an einen Anti-Hapten monoklonalen Antikörper gekoppelt sind, indirekt magnetisch markiert. Die magnetisch markierten Zellen werden in einer MACS-Säule im magnetischen Feld von MidiMACS zurückgehalten.
Material:
CD4+-Isolation-Kit (Milteniy, Bergisch Gladbach) Methode:
Die Zellen wurden in 80µl MACS-Puffer pro 1x107 Zellen aufgenommen, 20µl/1x107 Zellen Hapten-Antikörper Cocktail wurde hinzugefügt und für 10 Minuten bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden nun zweimal mit MACS-Puffer gewaschen und das Pellet in 80 µl Puffer aufgenommen. 20µl MACS Anti-Hapten MicroBeads wurden beigemischt und 15 Minuten bei 4°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen nochmals gewaschen und in 500µl MACS-Puffer pro 1x108 Zellen aufgenommen und über die Säule Typ BS im magnetischen Feld des Zellseperators (MidiMACS, Milteniy, Bergisch Gladbach) gegeben. Im Durchfluss befanden sich die angereicherten CD4+ T-Helferzellen. Die CD4+ Th Zellen wurden zentrifugiert, das Pellet in IAB resuspendiert und die Zellen in einer Neubauer-Zählkammer gezählt.
2.3 Kultur und Simulation
Tab. 2.1.: Verwendete Stimulantien und deren Konzentrationen
Stimulanzien: Firma: Konzentration
IL-12 R&D Systems 100 ng / ml
IL-4 R&D Systems 10 ng / ml
AntiCD3 CLB 1 ng / ml
AntiCD28 CLB 0,2 µg / ml
IFNγ R&D Systems 10 ng/ml
Für die PCR wurden 1x105 Zellen in 200µl IAB-Medium kultiviert, für den Westernblot 5x107 Zellen in 2000µl IAB-Medium. Die Stimulation der Zellen für die PCR erfolgte nach folgendem Schema:
1.Tag 3.Tag IL-12 100 ng / ml
IL-4 10 ng / ml
anti-CD3/anti-CD28 1 ng / ml/ 0,2 µg / ml IFNγ 10 ng/ml
anti-CD3/anti-CD28 1 ng / ml/ 0,2 µg / ml IL-12 100 ng / ml anti-CD3/anti-CD28 1 ng / ml/ 0,2 µg / ml IL-4 10 ng / ml anti-CD3/anti-CD28 1 ng / ml/ 0,2 µg / ml IFNγ 10 ng/ml
IL-12 100 ng / ml anti-CD3/anti-CD28 1 ng / ml/ 0,2 µg / ml IL-4 10 ng / ml anti-CD3/anti-CD28 1 ng / ml/ 0,2 µg / ml IFNγ 10 ng/ml anti-CD3/anti-CD28 1 ng / ml/ 0,2 µg / ml
IL12 100 ng / ml IL-4 10 ng / ml
anti-CD3/anti-CD28 1 ng / ml/ 0,2 µg / ml IFNγ 10 ng/ml
Tab. 2.2.: Stimulationsschema für die PCR
Jeweils ein Ansatz wurde zwei Tage vor der Lyse mit IL-12, IL-4, IFNγ und stimulierenden anti-CD3/anti-CD28-Antikörpern (kurz: CD3/CD28) stimuliert. Diese Zellen erhielten am Tag der Lyse keinen zweiten Stimulus. Drei Ansätze wurden zwei Tage vor der Lyse mit CD3/CD28 und am Tag der Lyse nochmals mit IL-12, IL-4 und IFNγ stimuliert. Jeweils ein Ansatz erhielt am 1.Tag IL-12, IL-4 und IFNγ und am 3.Tag wieder CD3/CD28. Schließlich wurde noch jeweils ein Ansatz nur am 3.Tag mit IL-12, IL-4, CD3/CD28 und IFNγ versehen.
Der zweite Stimulus inkubierte 2 Stunden.
Für den Westernblot wurden die Zellen 3 Tage lang mit IL-12 und CD3/CD28 inkubiert.
2.4 Hautbiopsien
2.4.1 Entnahme von Hautbiopsien
Um genügend Material für die PCR zu erhalten, wurden bei geeigneten Probanden mit akuten oder chronischen Hautläsionen Hautbiopsien mit einem Durchmesser von 2mm entnommen.
Die Patienten wurden vor der Stanzenentnahme über mögliche Risiken des Eingriffes ausführlich informiert. Alle Patienten gaben ihre schriftliche Einwilligung zur Entnahme einer Hautbiopsie aus wissenschaftlichen Gründen. Die verschiedenen Hautläsionen wurden mit einer Digitalkamera fotografiert. Die zur Stanzenentnahme vorgesehene Stelle wurde mit Cutasept desinfiziert und es erfolgte eine oberflächliche Anästhesie mit 1% Scandicain.
Gleich nach der Entname der Hautprobe mittels 2mm Biopsiestanze wurden Blutreste mit isotoner, steriler NaCl-Lösung abgespült und der Stanzzylinder danach in RNA-later (Ambion (Europe) Ltd., Huntingdon, Cambridgeshire, United Kingdom) aufbewahrt, was den Abbau der RNA durch RNasen verhinderte. Innerhalb dieser Lösung konnte die Haut für mehrere Tage bei 4°C gelagert werden.
Dieses Vorgehen wurde von der Ethikkomisssion der Medizinischen Hochschule Hannover genehmigt.
2.4.2 Verarbeitung der Hautbiopsien
Die Hautbiopsien wurden aus der RNA-later Lösung (Ambion) herausgenommen und grob mit einem Skalpell zerkleinert. Danach erfolgte die Zermörserung in einem mit flüssigen Stickstoff gefüllten Mörser. Zur weiteren Verarbeitung wurde jeweils 400-600 µl Lysis-Puffer (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim) auf die zermörserte Haut gegeben anschließend mit einer 21G Kanüle mehrmals ein Scheerschritt durchgeführt. Durch dieses Vorgehen wurde sichergestellt, dass die Zellen zerstört und die RNA freigesetzt wurden. Außerdem wurde in diesem Arbeitsgang die DNA zerkleinert, wodurch ein besseres Ausgangsmaterial für die anschließende RNA Isolierung erreicht wurde. Die Suspension wurde in ein steriles, RNase-freies Gefäß gegeben und bei -80°C gelagert.
2.5 RNA-Isolation
2.5.1 Isolation von Gesamt-RNA aus Blutzellen
Material:
High Pure RNA Isolation Kit (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim) Methode:
Die Lyse erfolgte durch Aufnehmen und Inkubation der Zellen in 20µl PBS und 80µl Lysepuffer unter gleichzeitiger Inaktivierung von RNasen. Nach dem Einsetzen des Filtrationsgefäßes in das Auffanggefäß wurde die Probe in das Filtrationsgefäß pipettiert und 15 s bei 8000 x g zentrifugiert. Die Nukleinsäuren wurden in Gegenwart eines chaotropen Salzes innerhalb von Sekunden an die Glasfaseroberfläche des Filtrationsgefäßes gebunden.
Es wurden nur Nukleinsäuren gebunden, da die Bindebedingungen für RNA optimiert waren.
Die lyophylisierte DNase wurde in Elutionspuffer gelöst, 1:10 mit DNase-Inkubationspuffer verdünnt und direkt auf das Glasfaservlies des Filtrationsgefäßes gegeben. Diese Verdauungsreaktion diente dem Abbau kontaminierender genomischer DNA. Nach mehreren Waschschritten konnte die RNA frei von Begleitsubstanzen wie zum Beispiel Salze, Proteine und andere zelluläre Verunreinigungen mit 50µl Elutionspuffer (Nuklease-freies, steriles bidestiliertes Wasser) eluiert werden.
2.5.2 Isolation von Gesamt-RNA aus Gewebe
Material:
High Pure Tissue Kit (Roche Molecular Biochemicals/Mannheim)
,
Ethanol, absolutMethode:
Die Hautbiopsien wurden in Gegenwart von 400-500µl stark denaturierend wirkendem Lysepuffer, der Guanidium-HCl enthält, zerkleinert und homogenisiert, um unmittelbar RNasen zu inaktivieren und die Isolierung von intakter RNA sicherzustellen. Andere zelluläre und extrazelluläre Bestandteile wurden durch Zentrifugation und ausschließlicher Weiterverarbeitung des Überstandes entfernt. Nach Zugabe von 150-200 µl Ethanol wurde die RNA in Gegenwart eines chaotropen Salzes (Guanidium-HCl) selektiv an ein Glasfaservlies
gebunden. Die restlichen Arbeitschritte waren identisch mit denen der RNA-Isolation aus Blutzellen.
2.6 Reverse Transkription (RT)
Material:
1st Strand cDNA Synthesis Kit for RT-PCR (AMV) (Roche Molecular Biochemicals/Mannheim)
Für jede Probe wurden pipettiert (Mastermix, alle Komponeneten im o.g. Kit vorhanden):
2µl 10x Reaktionspuffer 4µl 25mM MgCl2
2µl Desoxynukleotid-Mix 2µl Oligo-p(dT)15Primer 1µl RNase-Inhibitor
0,8µl AMV-Reverse Transkriptase Methode:
Zunächst wurden 8,2µl der RNA für 2-3Minuten auf 65°C erhitzt und danach direkt auf Eis gestellt was ein Linearisieren der. Sekundärstrukturen zur Folge hat. Zu der linearisierten RNA wurden 11,8µl Master-Mix (Reaktionsgemisch aus den oben angegebenen Komponenten) gegeben. In einem Thermoblock lief die Reverse Transkription für 60 Minuten bei 42°C ab. danach wurde 5 Minuten bei 95°C denaturiert, um die Reverse Transkriptase zu inaktivieren und anschließend auf 4°C abgekühlt. Die c-DNA wurde bei -20°C aufbewahrt!
2.7 Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Die Polymerase Kettenreaktion erlaubt es, beliebige DNA-Abschnitte zu amplifizieren. Man benötigt dazu zwei spezifische Oligonukleotide (Primer), die mit jeweils einem der Stränge auf beiden Seiten des zu amplifizierenden DNA-Abschnittes hybridisieren, eine ausreichende Menge der vier Desoxynukleosid-triphosphate und eine spezielle, hitzestabile DNA abhängige Polymerase (Taq-Polymerase).
Zunächst wird der gesamte Ansatz auf 95°C erhitzt, um doppelsträngige DNA in Einzelstränge zu zerlegen (Denaturierung). Dann wird die Probe auf 50-60°C abgekühlt (Annealing), um die Hybridisierung der Primer zu ermöglichen. Von den Primern ausgehend synthetisiert bei ca. 72°C die Taq-Polymerase nun in beide Richtungen neue komplementäre DNA-Stränge (Extension). Dieser Zyklus wird mit derselben Reaktionsmischung 20 - 30 mal wiederholt. Bei idealen Bedingungen (Effizienz = 2) verdoppelt sich die neu synthetisierte DNA in jedem neuen Zyklus.
Früher wurde die Spezifität des amplifizierten Produktes im Agarosegel anhand der Basenpaarlänge überprüft. Bei der Real-Time PCR kann dieser Schritt durch die Schmelzkurvenanalyse ersetzt werden.
2.7.1 Light Cycler ÆRapid Cycle Real-Time-PCR
Real-Time PCR bedeutet, dass das PCR-Produkt während der Amplifikation analysiert werden kann. Dies erfolgt über Fluoreszenzmessung in optisch klaren Küvetten.
SYBR Green I ist ein Doppelstrang-spezifischer Fluoreszenzfarbstoff. Wenn die PCR fortschreitet, wird Doppelstrang-DNA (dsDNA) synthetisiert und die Fluoreszenz nimmt zu.
Die Menge an Doppelstrang-DNA kann so jeden Zyklus durch die Fluoreszenz bestimmt werden, wobei die Fluoreszenz am Ende jedes Zyklus gemessen wird. Wenn die Fluoreszenz gegen die Anzahl der Zyklen aufgetragen wird, ergibt sich eine Wachstumskurve mit einer initialen Phase, einer exponentiellen log-linearen Phase und einer finalen Plateauphase. Hohe Ausgangskonzentrationen des Templates verschieben die Wachstumskurve in Richtung früherer Zyklen. Mithilfe der Real-Time-Messung kann sichergestellt werden, dass die Quantifizierung in der log-linearen Phase des exponentiellen Wachstums erfolgt. Nur so kann auf die initiale Kopienzahl geschlossen werden.
2.7.2 Real-Time-Fluoreszenz-PCR
Die Real-Time Fluoreszenz PCR wurde am Light Cycler durchgeführt. Für die quantitative PCR wurde der dsDNA bindende Fluoreszenzfarbstoff SYBR Green I (Roche Molecular Biochemicals) verwendet. Die PCR wurde mit sich schnell wiederholenden Zyklen mit einem Reaktionsvolumen von 20µl (beinhaltend 0,5µM jedes Primers (T-bet, β-Aktin, GATA-3) und 1µl cDNA) durchgeführt. Weiter wurden 2 µl LightCycler-FastStart DNA Master SYBR Green I (enthält Puffer, FastStart Taq-Polymerase, dNTPs, 10mM MgCl2 und eine kalibrierte Menge des SYBR Green I Farbstoffs) und zusätzlich eine austitrierte Menge MgCl2 (von 1,4µl für β-Aktin bis 1,6µl für T-bet und GATA-3) eingesetzt. Nach einer initialen Denaturierung bei 95°C für 10 Minuten folgte ein touch-down PCR Programm mit 50 Zyklen Amplifizierung, bestehend aus Denaturierung (95°C), Annealing (58-68°C) und Extension (72°C), wobei sich die Annealingtemperatur von 68° bei jedem Zyklus um 0,5°C bis zu einer Zieltemperatur von 58°C erniedrigte. Dieses touch-down Programm diente dazu, dass in den ersten Zyklen nur die Primer mit einer hohen Spezifität an die DNA banden. Außerdem war es so möglich, alle verschiedenen Primer in demselben PCR-Programm laufen zu lassen, was für die Quantifizierung von großer Bedeutung ist.
Das Fluoreszenzsignal wurde für diese Zielsequenzen (Targets) bei 85°C gemessen, um Primer Dimere aus der Quantifizierung auszuschließen (Primer Dimere schmelzen bei relativ hohen Temperaturen, während spezifische Bindungen stabil bleiben). Für die quantitative Analyse wurde die Auswertung "second derivative maximum" („Personenunabhängige“
Analyse durch die Light Cycler Software in der log-linearen Phase) verwendet.
Nach der Amplifikation wurde zum Abschluss eine Schmelzkurve geschrieben, bei der die Proben erst auf 65°C abgekühlt und dann die Temperatur in Schritten von 0,2°C pro Sekunde bis 95°C angehoben wurde. Hierbei wurde die Fluoreszenz kontinuierlich gemessen, um den Zerfall des PCR Produktes zu überwachen. So konnte jedes spezifische PCR Produkt einem spezifischen Schmelzpunkt zugeordnet werden (z.B.: Tm für β-Aktin: 90,5°C).
2.7.3 Herstellung der Standardkurven / der Kalibratoren
Für die Bestimmung der Ausgangskopienzahl des Targets wurde die Kalibrator-normalisierte relative Quantifizierung angewendet. Dazu mussten zunächst die Standardkurven hergestellt werden.
Material:
High Pure PCR-Product Purification Kit (Roche Molecular Biochemicals. Mannheim), Ethanol, absolut
Methode:
In der Gegenwart eines chaotropen Salzes bindet die Produkt-DNA selektiv an ein Glasfaservlies in einem speziellen Zentrifugationsgefäß. Die DNA bleibt gebunden, während in einer Reihe von schnellen Wasch- und Zentrifugationsschritten (30sec bei 1300 x g) kontaminierende kleine Moleküle (kleine Nukleinsäuren, Salze) entfernt werden. Schließlich eluiert ein Puffer mit niedrigem Salzgehalt die DNA aus dem Glasfaservlies.
Herstellung der Verdünnungsreihe:
Zunächst wurden alle aufgereinigten Amplifikate (β-Aktin, T-bet, Gata-3, IFNγ, CD3, IL-4) zu gleichen Teilen vermischt. Diese Mischung wurde nun in Verhältnissen von 1:100 bis 1:1000000 verdünnt. Mit dieser Verdünnungsreihe wurde erneut eine PCR unter Verwendung eines touch-down Programmes durchgeführt.
Aus den daraus resultierenden Daten wurde eine Standardkurve erstellt und diese in die Relative Quantification Software (RelQuant) (Roche Molecular Biochemicals) exportiert. In der RelQuant Software wurde durch die Datenpunkte eine optimierte Kurvenpassform gelegt und die Daten in einer Koeffizienten-Datei gespeichert. Eine Verdünnungsstufe dieser Standardkurven (1:10000) wurde als Kalibrator aufbewahrt und eingefroren. Dieser Kalibrator war nötig, um in weiteren relativen Quantifizierungen von Patientenproben wieder Bezug zu den gespeicherten Standardkurve herstellen zu können.
Im späteren Verlauf der Arbeit mit der RelQuant Software stellte sich heraus, dass es nicht unbedingt nötig war, einen Kalibrator zu verwenden, der Templates aller Zielgene und des Referenzgenes enthielt. Es zeigte sich, dass es vorteilhafter ist, von jedem Zielgen und der
Referenz einen separaten Kalibrator herzustellen, wodurch die Gefahr von Kontaminierungen verringert wurde.
2.7.4 Die Kalibrator-normalisierte relative Quantifizierung
Für jede Probe und für einen definierten Kalibrator wurde die relative Menge von Zielgen und Referenzgen bestimmt. Die Berechnung der Daten basierte auf den Werten der Crossingpoints (Anzahl der Zyklen, nach denen der Übergang in die exponentielle log-lineare Phase erfolgt), die durch den LightCycler erhoben wurden. Die Ergebnisse wurden ausgedrückt als Verhältnis Ziel/Referenz der Probe geteilt durch das Verhältnis Ziel/Referenz des Kalibrators.
Die Effizienz-berichtigte Quantifizierung basierte auf relativen Standardkurven, welche die PCR Effizienz des Zielgenes und des Referenzgenes beschrieben. Diese relativen Standardkurven wurden einmal erhoben, in der Relative Quantification Software gespeichert und konnten für jede Analyse verwendet werden.
Bei schwachen Signalen war die Standardkurve nicht mehr linear. Daher wurde eine optimierte Kurvenpassform durch die Datenpunkte gelegt. Diese Kurve bestand aus zwei Abschnitten: Einen lineareren Abschnitt, der die oberen Konzentrationen mit starkem Signal beschrieb und einen gebogenen Abschnitt, der die unteren Konzentrationen beschrieb, welche ein schwächeres Signal hatten. Die Passform ist mathematisch durch Passformkoeffizienten definiert. Die relativen Standardverdünnungen deckten den relevanten Konzentrationsbereich von Ziel- und Referenznukleinsäuren ab, wie sie in einer typischen Probe gefunden wurden.
2.7.5 Theorie der Amplifikations- Effizienz
PCR ist durch die Formel beschrieben: N = N0 x 2n N ist die Zahl aller Kopien nach n Zyklen
N0 ist die initiale Anzahl der Kopien
n ist die Anzahl der durchgeführten PCR-Zyklen
Die maximale Effizienz ist 2 - dabei wird jedes PCR Produkt bei jedem Zyklus repliziert. Die minimale Effizienz ist 1 - es findet keine Amplifikation statt. In der Realität beeinflussen viele PCR-Parameter die PCR-Effizienz, so dass sie oft kleiner als zwei ist.
Die LightCycler Software berechnet die Neigung (slope) für jede Standardkurve aus den relativen Abständen zwischen den einzelnen Kreuzungspunktwerten. Die Effizienz einer PCR wird nach der Formel berechnet: E = 10-1/slope
2.7.7 Datenanalyse / Quantifizierung der Proben
Mit den Proben wurde eine PCR im touch-down Programm durchgeführt. Zusätzlich zu den Proben wurde jeweils der Kalibrator für das Zielgen (z.B. T-bet) und für die Referenz (z.B. β- Aktin) pipettiert. Im Pipettierschema musste außerdem darauf geachtet werden, dass immer zuerst das Zielgen und dann die Referenz einer Probe (prädefinierte Positionen) verwendet wurde.
Pipettierschema:
Kalibrator Zielgen Kalibrator Referenz Probe 1 Zielgen Probe 1 Referenz Probe 2 Zielgen Probe 2 Referenz
Die so gewonnenen Daten wurden mit Hilfe der Relative Quantification Software (Roche Molecular Biochemicals) ausgewertet. Das Ergebnis war dann eine relative Kalibrator- normalisierte Menge des Zielgens.
2.8 Proteingewinnung und Nachweismethoden
2.8.1 Kernextraktion
Das Kit (NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents (Pierce/Rockford/USA) enthielt:
Cytoplasma Extraktions Reagenz I (CER I) Cytoplasma Extraktions Reagenz II (CER II) Nuklear Extraktions Reagenz (NER)
5 x107 Zellen wurden aus der Kulturplatte aufgenommen und 7 Minuten bei 1200 x g bei 4°C zentrifugiert. Das Medium wurde vollständig entfernt und das Pellet auf Eis gestellt. Für das weitere Vorgehen musste zunächst das Volumen des Pellets ermittelt werden. Bei einem geballten Zellvolumen von ca. 20µl wurde das Pellet in 200 µl eiskaltem CER I resuspendiert und gut durchmischt. Anschließend wurde 11µl eiskaltes CER II hinzugefügt. Nach einer Minute Inkubation auf Eis wurde das Extrakt bei 16000 x g 5 Minuten lang zentrifugiert. Der entstandene Überstand ist der Cytoplasmaextrakt und wurde sofort in ein vorgekühltes Reaktionsgefäß überführt und eingefroren. Im Pellet waren die Kerne enthalten, es wurde in 100µl NER aufgenommen. Anschließend wurde das Extrakt alle 10 Minuten 15 Sekunden lang, über einen Zeitraum von 40 Minuten, gut durchmischt. Nachdem noch einmal bei 16000 x g 10 Minuten lang zentrifugiert worden war, wurde der Überstand (Kernextrakte) sofort in ein vorgekühltes Reaktionsgefäß überführt und anschließend bei -80°C eingefroren.
2.8.2 Western Blot
Zur Denaturierung der Proben wurden sie 1:4 mit dem reduzierenden Proteinauftragspuffer Roti-Load1 (Carl Roth GmbH, Karlsruhe) verdünnt und anschließend 5 Minuten auf 99°C erhitzt. Das Gel wurde mit 15-20 µl Proteinextrakt beladen und ca. 1 Stunde bei 190 Volt (25mA) unter Verwendung eines Tris-Gly Runningpuffers aufgetrennt.
Transfer:
Nach Auftrennung der Proteinextrakte erfolgte der Transfer auf eine Nitrozellulosefolie. Dazu wurde das Gel 10 Minuten in Kathodenpuffer und die Nitrocellulosefolie in Anodenpuffer equilibriert. Auf die Anode der Trans-Blot SD semi-dry transfer cell (Bio-Rad, Hercules, Canada) wurden aufgeschichtet:
1. Mit Anodenpuffer getränktes Filterpapier
2. Mit Anodenpuffer angefeuchtete Nitrocellulosefolie 3. In Kathodenpuffer equilibriertes Gel
4. Mit Kathodenpuffer getränktes Filterpapier
Darauf wurde die Kathode gelegt und der Deckel geschlossen.
Der Transfer erfolgte bei 23 Volt über 45-60 Minuten. Auf der Nitrocellulosefolie wurden die Proben nach dem Färben nummeriert und in 5%-Milch-TBS (dem TBS wurde Magermilchpulver hinzugefügt) zur Verminderung unspezifischer Antikörperbindungen 30 Minuten geblockt.
Für den Antikörper, T-bet N19 (Santa Cruz Biotechnology), wurden zwei Konzentrationen (1:100 und 1:1000) in Vorversuchen getestet. Die Inkubation erfolgte über Nacht bei Raumtemperatur.
Der Nachweisantikörper Kaninchen-Ziege (Pierce Biotechnology/Rockford/USA) wurde in einer Konzentration von 1:100 und 1:1000 mit Milch-TBS verdünnt und inkubierte 2 Stunden bei Raumtemperatur.
Als Kombination erwies sich die Verdünnung 1:100 des T-bet N19 Antikörpers mit der Verdünnung 1:10000 des Kaninchen-Ziege-Antikörpers. Zum Beweis, dass es sich bei einer nachgewiesenen Bande um eine spezifische Antikörperbindung handelte, wurde das Experiment parallel mit einem Block-Peptid durchgeführt. 50 µl Block-Peptid wurde mit 10µl T-bet N19 und 40 µl PBS 2-3Stunden inkubiert. Anschließend wurde es mit Milch-TBS 1:10 verdünnt und auf die Probe gegeben.
Die Detektion erfolgte mit dem Entwicklungssystem Chemiglow (Pierce Biotechnology/Rockford/USA). Die Komponenten wurden in gleichen Teilen unverdünnt
zusammengegeben und ca. 3 Minuten mit den Proben inkubiert. Die Auswertung wurde mit dem Chemilmager (Biorad) durchgeführt.
2.8.3 Chemilumineszenz-Electro-Mobility-Shift-Assay (EMSA)
Material:
LightShift Chemiluminescent EMSA Kit (Pierce Biotechnology/Rockford/USA)
Biotin 3´oder 5´ End-markierte DNA: T-bet Oligo 1 (5´-Bio-AAT TTC ACA CCT AGG TGT GAA ATT-3´)
Unmarkierte T-bet Oligo´s (Herstellung der Oligonukleotide durch TIB MOLBIOL/Berlin) Positiv geladene Nylonmembran (Roth GmbH, Karlsruhe)
5 x TBE (450 mM Tris, 450 mM Borsäure, 10 mM EDTA, pH 8,3) Polyacrylamidgel in 0,5 x TBE
Methode:
Der elektrophoretic mobility shift assay (EMSA) wird benutzt, um DNA-Protein Interaktionen zu untersuchen. Dieser Assay basiert darauf, dass Komplexe aus DNA und Protein sich während der elektrophoretischen Auftrennung in einem nativen Polyacrylamid Gel langsamer bewegen als ungebundene DNA. Dadurch findet ein „Shift“, eine Veränderung in der Vorwärtsbewegung der markierten DNA-Bande statt.
Biotin-markierte Oligonukleotide, welche die entsprechende Bindungsstelle des Proteins enthalten, wurden mit einem Kernextrakt inkubiert. Dieses Gemisch wurde auf einem nativen Polyacrylamidgel elektrophoretisch aufgetrennt und auf eine Nylonmembran überführt. Die Biotin-markierte DNA wurde mit einem Streptavidin Meerrettich Peroxidase Konjugat (Pierce Biotechnology/Rockford/USA) und dem LightShift Chemilumineszenz Substrat nachgewiesen.
Mit dem im Kit vorhandenen EBNA-Kontroll-System erfolgte eine Positiv-, eine Negativ- sowie ein Spezifiätskontrolle (durch Zugabe eines Überschusses an unmarkierter EBNA- DNA). Wie bei dem EBNA Kontroll System sollten auch mit dem Test-System jeweils 3 Reaktionen durchgeführt werden. Von den mit dem NE-PER (Nuclear and Cytoplasmic
Extraction Reagents, Pierce Biotechnology/Rockford/USA) gewonnenen Kernextrakten (siehe Kapitel Kernextraktion) wurden jeweils 2-3μl in die Reaktion eingesetzt.
Alle Komponenten der Bindungsreaktionen des Testsystems und des Kontrollsystems wurden zusammengefügt und für 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Zu den 20μl jeder Bindungsreaktion wurden jeweils 5μl Ladepuffer hinzugegeben und mit der Pipette vorsichtig vermischt. 20μl jeder Probe wurden in die Elektrophorese eingesetzt. Das LightShift EMSA Kit ist für ein 4-6% Polyacrylamidgel in 0,5x TBE für die Elektrophorese in einer Größe von 8 x 8 x 0,1cm optimiert worden. Die Elektrophorese wurde mit 100V für 30-60 Minuten durchgeführt (bis der Bromphenolblau Farbstoff ca. ¾ der Länge des Gels gewandert ist).
Anschließend an die Elektrophorese wurden die nun aufgetrennten Bindungsreaktionen auf die Nylonmembran überführt. Der Transfer fand mit 0,5x TBE bei 380 mA (~100V) für 30 Minuten statt. Nach einem erfolgreichen Transfer (keine Reste von Bromphenolblau im Gel zu erkennen) wurde die auf die Membran überführte DNA mittels Cross-linking verbunden.
Das Cross-linking fand bei 120 mJ/cm2 unter Verwendung eines UV-Crosslinkers mit 254 nm UV-Lampen statt.
Detektion:
Die Membran wurde zunächst für 15 Minuten in 20 ml LightShift™ Blockpuffer inkubiert.
Anschließend wurde der Blockpuffer durch eine Konjugat/Blockpuffer Lösung (66,7 μl LightShift™ stabilisierte Streptavidin-Meerrettich Konjugat mit 20ml LightShift™
Blockpuffer) ersetzt. Die Membran wurde dann 4mal für 5 Minuten mit 20 ml Waschlösung (40 ml LightShift™ 4x Waschpuffer mit 120 ml hochreinem Wasser) gewaschen. Danach wurde die Membran in 30 ml LightShift™ Substrat Equilibrations Puffer 5 Minuten inkubiert.
Die Membran wurde nun mit der LightShift™ Substrat Arbeitslösung (6ml LightShift™
Luminol/Enhancer Lösung mit 6ml stabiler Peroxid Lösung) 5 Minuten getränkt und anschließend wurde die Reaktion mit einer CCD Kamera nachgewiesen.
2.9 Durchflusszytometrie und FACS-Analyse
Mit Hilfe des FACS (Fluorescence-activated cell sorter) (Becton Dickinson, Mountain View, CA) ist es möglich, Blutzellen (z.B. Lymphozyten, Monozyten) zu zählen und nach vorheriger direkter Färbung mit spezifischen Fluoreszenzfarbstoffen (zumeist grün (FITC) oder rot (PE) leuchtende Farbstoffe) näher zu differenzieren. Diese Immunfluoreszenz- Farbstoffe sind an monoklonale Antikörper gekoppelt, die spezifisch entweder an Oberflächenbestandteile (z.B. an CD-Moleküle) der Blutzellen oder intrazellulär (siehe unten) binden.
Im FACS-Scan wird das Gemisch an gefärbten Zellen durch eine dünne Kapillare gezwungen, so dass ein Fluss einzelner Zellen den Laserstrahl des FACS -Scan passiert.
Photomultipler tubes (PMTs) messen die Streuung des Laserstrahls, die durch die Passage jeder einzelnen Zelle verursacht wird und man erhält auf diese Weise Informationen über Zellgröße (Forward-Scatter), über die Zellgranularität (Side-Scatter) und über die Bindung von Fluoreszenz-Farbstoffen (PE für Rot, FITC für grün). Die Informationen werden mit Hilfe eines Computers analysiert.
In der Analyse werden die Zellen zunächst in einem Dot Plot aufgetragen, in dem jede registrierte Zelle mit einem Punkt dargestellt wird. In diesem Dot Plot kann man nun eingrenzen, welche Zellen man genauer untersuchen möchte, in dem man entweder auf Monozyten, Lymphozyten oder proliferierte Lymphozyten „gated“, die sich in diesem Dot Plot in unterschiedlichen Regionen befinden. Die „gegateten“ Zellen werden bei einer Einfachfärbung in einem weiteren Dot Plot in ihrer Anzahl gegen den verwendeten Farbstoff (PE oder FITC) oder bei einer Doppelfärbung die einzelnen Farbstoffe gegeneinander dargestellt. Durch Quadrantenanalyse in diesen Dot Plots erhält man den Anteil Fluoreszenz- Farbstoff positiver bzw. negativer Zellen. Die Auswertungen können auch als Histogramm dargestellt werden.
2.9.1 Intrazelluläre IFNγ Färbung
3x 105 Zellen (PBMC´s oder CD4+ Zellen) wurden nach folgendem Schema stimuliert:
Probe 48 Stunden 10 Stunden
1 --- ---
2 CD3/CD28 IL-12 3 CD3/CD28 IL-4
4 IL-12 CD3/CD28
5 IL-4 CD3/CD28
6 IL-12 ---
7 IL-4 ---
8 CD3/CD28 ---
9 --- IL-12
10 --- IL-4
11 --- CD3/CD28
Tab. 2.3: Stimulationschema für die intrazelluläre Färbung
Außerdem erhielten alle Zellen nach Gabe des letzen Stimulus Brefeldin. Die intrazelluläre Färbung und Quantifikation der Zytokine wurde wie schon zuvor beschrieben durchgeführt.
Für die intrazelluläre Färbung wurden PE-konjugierte Zytokin-spezifische monoklonale Antikörper (monokloner Maus Anti-Human-IFNγ AK/ Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland) und eine IgG1 Isotypkontrolle (monoklonaler Antikörper) mit einer Endkonzentration von 2μg/ml benutzt Die Expression der Oberflächen-Antigene wurde mittels PE oder FITC- markierten monoklonalen Maus anti-Human Antikörpern gerichtet gegen den IL-4-Rezeptor bzw. den IL-12Rβ2 bestimmt (Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland).
Direkt im Anschluss erfolgte die Messung mittels FACS Scan. Gemessen wurde im FACS- Scan Vorwärtsscatter gegen PE. Verglichen wurde die Anzahl der Zellen im linken oberen Quadranten mit dem Mediumwert und der jeweiligen Stimulation der Zellen.
2.10 Statistik
Die statistische Analyse wurde mit Hilfe des Programmes SigmaStat durchgeführt. In Balkendiagrammen wurden Mittelwerte und Standardabweichungen angegeben. Bei normal verteilten Daten wurde bei zwei unabhängigen Variabeln der t-Test, bzw. bei abhängigen Variablen der gepaarte-t-Test durchgeführt (Darstellung der verbundenen Einzelmessungen in den entsprechenden Abbildungen). Nicht normal verteilte Daten wurden mit Hilfe des Mann- Whitney-Rank-Sum Tests ausgewertet.
