Einflüsse von Glukokortikoiden und Makrophagen auf neutrophile Granulozyten im Hinblick auf die Endometritis puerperalis des Rindes

Aus der Klinik für Rinder und

der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover

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Einflüsse von

Glukokortikoiden und Makrophagen

auf neutrophile Granulozyten im Hinblick auf die Endometritis puerperalis des Rindes

INAUGURAL – DISSERTATION

zur Erlangung des Grades eines

Doktors der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von

Torge König

aus Hannover

Hannover 2003

Wissenschaftliche Betreuung:

Univ.-Prof. Dr. med. vet. W. Leibold PD Dr. med. vet. H.-J. Schuberth

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. W. Leibold

2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. M. Kietzmann

Tag der mündlichen Prüfung: 2. Juni 2003

Gefördert durch eine Sachmittelspende und ein Promotionsstipendium der H. WILHELM SCHAUMANN STIFTUNG

meinen Eltern in Bewunderung und Dankbarkeit

Un sourire coûte moins cher que l’ électricité

et donne plus de lumière.

(Abbé Pierre)

Inhaltsverzeichnis

VERZEICHNIS DER ABKÜRZUNGEN UND TERMINI TECHNICI GLOSSAR

1 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG ... 15

2 LITERATURÜBERSICHT ... 17

2.1 Die Endometritis puerperalis des Rindes ... 17

2.2 Polymorphkernige neutrophile Granulozyten (PMN) ... 19

2.2.1 Funktionelle und phänotypische Eigenschaften... 20

2.2.2 Einflussfaktoren auf PMN im peripartalen Zeitraum ... 22

2.3 Glukokortikoide... 24

2.3.1 Struktur und bekannte Wirkungsmechanismen ... 24

2.3.2 Glukokortikoideffekte auf bovine PMN... 26

2.4 Makrophagen ... 27

2.4.1 Funktionelle und phänotypische Eigenschaften... 27

2.4.2 Rolle bei der Infektionsabwehr... 29

3 MATERIAL UND METHODEN... 31

3.1 Geräte und Materialien... 31

3.1.1 Geräte, Klinik- und Laborbedarf... 31

3.1.2 Medikamente, Reagenzien und andere Verbrauchsmaterialien... 34

3.1.3 Puffer, Lösungen und Medien ... 37

3.1.4 Materialien für die Separation und Kultivierung von Leukozyten ... 39

3.1.5 Material zur Gewinnung uteriner PMN... 40

3.1.6 Material für die nicht durchflusszytometrische Differenzierung,

Vitalitätsbestimmung und Zählung von Leukozyten...40

3.1.7 Materialien für die Durchflusszytometrie ...41

3.1.8 Materialien zur durchflusszytometrischen Bestimmung absoluter Zellzahlen ...41

3.1.9 Materialien für die Durchführung der Histamin-Freisetzung und des Radio-immuno-assays (RIA) zur Bestimmung der Histaminkonzen- tration...42

3.1.10 Materialien für das Proliferationstestverfahren...44

3.1.11 Materialien zur Bestimmung der relativen Apoptoserate von Granulozyten...44

3.1.12 Materialien für die indirekte Membranimmunfluoreszenz (MIF)...45

3.1.13 Materialien für die Bestimmung reaktiver Sauerstoffmetaboliten(ROS)...46

3.1.14 Materialien für die Bestimmung der Phagozytosekapazität ...47

3.1.15 Probanden...48

3.2 Methoden...48

3.2.1 Gewinnung und Separation von Leukozyten aus dem Blut ...48

3.2.1.1 Blutentnahme ...48

3.2.1.2 Separation...48

3.2.2 Gewinnung uteriner PMN ...50

3.2.3 Gewinnung und Kultivierung von aus Monozyten generierten Makrophagen (MDM) ...51

3.2.4 Gewinnung von Serum und Plasma ...54

3.2.5 Durchflusszytometrie ...54

3.2.6 Zellzahlbestimmung ...55

3.2.7 Leukozytendifferenzierung...57

3.2.8 Vitalitätsbestimmung ...58

3.2.9 Histamin-Freisetzung und Radio-immuno-assay (RIA) zur Bestimmung des Histamingehaltes ...59

3.2.10 Proliferationstestverfahren ...62

3.2.11 Bestimmung der relativen Apoptoserate von Granulozyten... 63

3.2.12 Indirekte Membranimmunfluoreszenz (MIF)... 65

3.2.13 Bestimmung reaktiver Sauerstoffmetaboliten ... 68

3.2.14 Bestimmung der Phagozytosekapazität ... 69

3.2.15 Bakteriologische Untersuchung von Uterusspülproben... 70

3.2.16 Histologische Untersuchung von Endometriumgewebe... 70

3.2.17 Bestimmung der Konzentration verschiedener Steroidhormone ... 71

3.2.18 Datenverarbeitung und statistische Auswertung... 71

4 ERGEBNISSE... 72

4.1 Einfluss von Dexamethason auf bovine Granulozyten in vivo und in vitro... 72

4.1.1 Einfluss von Dexamethason auf das Differentialblutbild und die Vitalität von Granulozyten des Blutes ... 72

4.1.1.1 Einfluss von Dexamethason auf das Differentialblutbild von Rindern in unterschiedlichen Reproduktionsstadien ... 72

4.1.1.2 Einfluss von Dexamethason auf die Proliferation von Lymphozyten ... 82

4.1.1.3 Nekrose... 84

4.1.1.4 Apoptose... 87

4.1.2 Einfluss von Dexamethason auf die Expression von Oberflächen- strukturen auf PMN des Blutes ... 89

4.1.2.1 Einfluss von Dexamethason in vivo auf die Expression verschiedener Oberflächenmoleküle auf PMN in Abhängigkeit vom Reproduktions- stadium... 89

4.1.2.2 Direkter Einfluss von Dexamethason in vitro auf die Expression von L-Selektin ... 97

4.1.2.3 Direkter Einfluss von Dexamethason in vitro auf die Expression des Bo116-Antigens... 101

4.1.2.4 Indirekter Einfluss von Dexamethason in vitro auf die Expression von L-Selektin auf PMN... 106

4.1.3 Einfluss von Dexamethason auf die Funktionalität von PMN

des Blutes...113

4.1.3.1 Einfluss von Dexamethason in vivo auf die Bildung von reaktiven Sauerstoffmetaboliten (ROS) durch PMN von zyklus- synchronisierten Rindern...113

4.1.3.2 Einfluss von Dexamethason in vitro auf die Funktionalität von PMN ...115

4.1.4 Einfluss von Dexamethason auf bovine PMN des Uterus in vivo ...119

4.1.4.1 Einfluss von Dexamethason auf die Zahl uteriner Granulozyten...119

4.1.4.2 Einfluss von Dexamethason auf die Expression verschiedener Oberflächenmoleküle auf uterinen PMN ...121

4.1.4.3 Einfluss von Dexamethason auf die Bildung von Sauerstoff- metaboliten durch uterine PMN ...124

4.1.5 Einfluss von Dexamethason auf histologische Entzündungsparameter im Endometrium nach IL-8-induzierter Endometritis ...126

4.2 Endokrinologische Veränderungen durch Dexamethason in vivo ...128

4.2.1 Einfluss von Dexamethason auf den Progesterongehalt des Blutes...128

4.2.2 Einfluss von Dexamethason auf den Östrogengehalt des Blutes ...131

4.2.3 Einfluss von Dexamethason auf den Kortisolgehalt des Blutes...133

4.3 Untersuchungen zu Makrophagen-vermittelten Effekten von Dexa- methason, Lipoteichonsäure und Lipopolysacchariden auf PMN des Blutes ...137

4.3.1 Methodische Vorarbeiten ...137

4.3.2 Einfluss Makrophagen-vermittelter Dexamethasoneffekte auf die Vitalität autologer PMN ...144

4.3.3 Einfluss Makrophagen-vermittelter Effekte auf die Expression von PMN-Oberflächenmolekülen...146

4.3.4 Einfluss Makrophagen-vermittelter Dexamethasoneffekte auf die Bildung von Sauerstoffradikalen durch PMN ...148

5 DISKUSSION... 154

5.1 Konzeptionelle Überlegungen... 154

5.2 Dexamethason beeinflusst in vivo PMN des Blutes und des Uterus ... 155

5.3 Wirkungsmechanismen von Dexamethason in vitro ... 161

5.4 Eigenschaften von PMN unter Einfluss von Makrophagen ... 165

5.5 Erkenntnisse zu Pathogenesemechanismen der Endometritis puerperalis des Rindes ... 168

6 ZUSAMMENFASSUNG ... 170

7 SUMMARY... 173

8 LITERATURVERZEICHNIS ... 175

ERKLÄRUNG

Verzeichnis der Abkürzungen und Termini technici

a.a. Aminosäuren

A. pyogenes Arcanobacterium pyogenes a.p. ante partum – vor der Geburt

Abb. Abbildung

ACD-Puffer acid-citrate-dextrose - Citronensäurehydrat-Natriumcitrat- Dextrose-Puffer

ACTH Adrenokortikotropes Hormon

ADCC antibody dependent cellular cytotoxicity – Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität

AF Aszitesflüssigkeit

AG Arbeitsgemeinschaft

AICC antibody independent cellular cytotoxicity – Antikörper- unabhängige zelluläre Zytotoxizität

APC professionell Antigen-präsentierende Zelle Aqua dest. destilliertes Wasser

Aqua tridest. dreifach destilliertes Wasser BHV4 Bovines Herpesvirus 4 BSA Bovines Serum Albumin

CD cluster of differentiation (System zur Bezeichnung zellulärer Differenzierungsantigene)

CGD chronic granulomatous disease – septische Granulomatose

CO2 Kohlenstoffdioxid

CpG Cytosin para Guanin (unmethylierte DNA-Motive v.a. aus Bakterien)

cpm counts per minute – Zählungen pro Minute

CR Komplementrezeptor

DHR 123 Dihydrorhodamin 123 DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure

DTAF Dichlortriazinyl-Amino-Fluorescein DTAF-ZgantiM-

IgG+M (H+L)

DTAF-Ziegen-Antikörper-anti-Maus-IgG und IgM (heavy and light chain – schwere und leichte Kette)

E. coli Escherichia coli

EDTA Ethylendiamintetraacetat Eos. Gr. eosinophile Granulozyten

Fa. Firma

FACScan fluorescence activated cell scanner – (Fluoreszenz-aktiviertes Zellanalysegerät, Durchflusszytometer)

Fc fragment cristalline (kristallisierbarer Antikörperteil, carboxy- terminales Fragment von Immunglobulinen nach Papain-Spaltung)

Fc- Rezeptor Rezeptor für den Fc-Teil eines Antikörpers

FCS Fetales Kälberserum

FITC Fluorescein Isothiocyanate

FL 1, 2, 3 Fluoreszenzintensität (1=grün, 2=orange, 3=rot) FSC forward scatter -Vorwärtsstreulicht

g Gramm

GR Glukokortikoidrezeptor

Gra Granulozyten

HEPES Hydroxyl-Piperazin-Ethan-Sulfonsäure

I10FH+ Iscove-Zellkulturmedium mit L-Glutamin, HEPES-Puffer, Penicillin, Streptomycin und 10% FCS

I10FStrep Iscove-Zellkulturmedium mit L-Glutamin, Streptomycin und 10%

FCS

ICAM-1 intercellular adhesion molecule 1 - interzelluläres Adhäsionsmolekül-1

IFN gamma Interferon gamma

IgG Immunglobulin G

IgM Immunglobulin M

IL Interleukin

iNOS induzierbare Stickstoffoxid Synthetase

kDa kilo Dalton

KGW Körpergewicht

LFA-1 Leukozyten-Funktionsassoziiertes-Antigen-1

Li Lithium

LPS Lipopolysaccharid

LTA Lipoteichonsäure

Lym Lymphozyten

M. avium Mycobacterium avium mAk monoklonaler Antikörper

MDM monocyte derived macrophages – aus Monozyten gewonnene Makrophagen

MHC Major Histocompatibility Complex – Haupthistokompatibilitäts- komplex

MIF Membranimmunfluoreszenz

MIP Makrophagen-inflammatorisches Protein

MNC mononuclear cells - Mononukleäre Zellen (umfassen v.a.

Lymphozyten, Monozyten und Makrophagen)

Mon Monozyten

N Normal

NADPH Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat NHS- Biotin N-Hydroxysuccinimido-Biotin

Nr. Nummer

o.g. oben genannt

O2- Superoxidanion

p.p. post partum – nach der Geburt

PBS phospate buffered saline – Phosphatpuffer (2xPBS = doppelt konzentriert)

PE Phycoerythrin

PEG Polyethylenglykol PGF2alpha ProstaglandinF2alpha

Pipes Piperazin–N,N’-bis[2-ethanesulfonic] acid

PJ Propidiumjodid

PMA Phorbol-Myristat-Acetat

PMN polymorphkernige neutrophile Granulozyten

R0^- Zellkulturmedium RPMI 1640 mit L-Glutamin, HEPES-Puffer und NaHCO3

R10F⁺ Zellkulturmedium RPMI 1640 mit L-Glutamin, HEPES-Puffer und NaHCO3 mit Zusatz von Penicillin, Streptomycin und 10% FCS Ret. sec. Retentio secundinarum - Nachgeburtsverhaltung

RG Reaktionsgefäß

rhIL-8 rekombinantes humanes Interleukin-8

RIA Radio-immuno-assay

ROS reactive oxygen species - reaktive Sauerstoffmetaboliten S. dublin Salmonella enterica subspecies enterica serovar dublin

s.o. siehe oben

s.u. siehe unten

Sc. Streptococcus

SEA Staphylococcus aureus Enterotoxin A

SEM Standardfehler

spp subspecies

SSC side scatter - Seitwärtsstreulicht

St. Staphylococcus

Std. Stunde

Tab. Tabelle

TGF ß transforming growth factor ß

TLR Toll-like Rezeptor

TNF alpha Tumornekrosefaktor alpha Tris Trishydroxymethylaminomethan

unbek. unbekannt

v/v Volumen pro Volumen

vgl. vergleiche

vs versus

x g multipliziert mit der Gravitationsbeschleunigung (9,81 m/s²) ZgantiAch Ziege-anti-Acylhistamin-Nativserum

ZÜ Zellkulturüberstand

Glossar

Basopenie Verringerung der absoluten Zahl basophiler Granulozyten pro Blutvolumen unter die physiologische Norm

Blut-PMN Aus dem peripheren venösen Blut gewonnene segmentkernige neutrophile Granulozyten

Eosinopenie Verringerung der absoluten Zahl eosinophiler Granulozyten pro Blutvolumen unter die physiologische Norm

Falcon Röhrchen-förmiges Reaktionsgefäß aus Kunststoff Ficollpräparation Lymphozytenseparationsmedium (s. 3.1.4)

Interphase Anhäufung von Zellen nach einer Dichtezentrifugation oberhalb einer Phase definierter Dichte

Na-Hydroxid-Pellets Erbsen-große feste Partikel aus Natriumhydroxid

Neutrophilie Steigerung der absoluten Zahl segmentkerniger neutrophiler Granulozyten pro Blutvolumen über die physiologische Norm Neutrozytose Steigerung der absoluten Zahl segmentkerniger neutrophiler

Granulozyten pro Blutvolumen über die physiologische Norm Pellet Anhäufung von Zellen zumeist am Boden eines

Reaktionsgefäßes

Uterus-PMN Aus dem Uteruslumen gewonnene segmentkernige neutrophile Granulozyten

well Vertiefung einer Zellkulturplatte

1 Einleitung und Zielsetzung

Die Endometritis puerperalis des Rindes ist eine mit großer Inzidenz auftretende Erkrankung bevorzugt bei hochleistenden Milchkühen. Sie führt unter anderem zur Beeinflussung der Fertilität und stellt dadurch eine häufige Ursache für den Ausschluss des Tieres von der Herde dar. Deshalb ist die puerperale Gebärmutterentzündung von großer wirtschaftlicher Bedeutung für den Tierhalter. Es werden zahlreiche verschiedene Therapieformen der Endometritis diskutiert und praktiziert. Bisher müssen jedoch alle Behandlungsarten und auch Prophylaxemaßnahmen als unbefriedigend bewertet werden, da es keine vermag, zu einer schnellen und sicheren Heilung zu führen.

Um zu effizienteren Prophylaxe- und Therapiemaßnahmen der Endometritis zu kommen, müssen zunächst die pathogenetischen Mechanismen, die der Entstehung der Erkrankung zugrunde liegen, weiter geklärt werden.

Polymorphkernige neutrophile Granulozyten (PMN) stellen eine Leukozyten- population dar, die bei entzündlichen Vorgängen als erste in dem betroffenen Gewebe nachzuweisen ist. Da es im Zuge der meisten Abkalbungen zu einer bakteriellen Kontamination des Uterus kommt, ist die frühe Abwehrreaktion durch PMN von besonderer Bedeutung für die Verhinderung einer Endometritis. Es gibt gewichtige Hinweise, dass eine peripartale Depression funktioneller Eigenschaften von PMN die Entstehung einer Gebärmutterentzündung begünstigt. Die Trächtigkeit, vornehmlich der Zeitraum um die Geburt, ist durch starke Veränderungen der Steroidhormon- konzentrationen im Blut von Rindern gekennzeichnet. Eine besondere Bedeutung für das uterine Abwehrgeschehen kommt dabei möglicherweise den endogenen Gluko- kortikoiden zu, deren immunologische Wirkungen fast ausschließlich als supprimierend beschrieben werden. Im ersten Teil dieser Arbeit werden deshalb Einflüsse von Glukokortikoiden am Beispiel von Dexamethason auf Funktion und Immunphänotyp boviner PMN in Hinblick auf die lokale uterine Situation untersucht.

Resultate von Vorarbeiten der hiesigen Arbeitsgruppe belegen, dass neutrophile Granulozyten durch die Transmigration vom Blutgefäß ins Uteruslumen Veränderungen in Funktion und Phänotyp erfahren, die möglicherweise eine Einschränkung der lokalen Abwehr in der Gebärmutter darstellen. Im zweiten Teil der vorliegenden Promotions- arbeit werden deshalb Experimente vorgestellt, die der Prüfung der Hypothese dienen, dass residente endometriale Gewebsmakrophagen transmigrierende Granulozyten modu- lieren. Aufmerksamkeit wird dabei auch der Frage geschenkt, ob Glukokortikoide über die Modulation von Makrophagen indirekt PMN beeinflussen.

Bei Untersuchungen zu den Einflüssen von Glukokortikoiden und Makrophagen ist insbesondere zu klären, ob diese die Zahl und Vitalität von PMN in Blut und Uterus beeinflussen und ob funktionell bedeutsame immunphänotypische und auch funktionelle

Eigenschaften von Blut- und Uterus-PMN moduliert werden. Darauf aufbauende Unter- suchungen haben zum Ziel, die Mechanismen, über die Glukokortikoide wirken, zu be- leuchten.

Somit möchte diese Arbeit einen Beitrag zur Klärung pathogenetischer Mechanismen der Endometritis puerperalis des Rindes leisten.

2 Literaturübersicht

2.1 Die Endometritis puerperalis des Rindes

Bedeutung

Die Endometritis puerperalis ist eine multifaktoriell bedingte entzündliche Erkrankung der Gebärmutter des Rindes (GRUNERT 1986). Sie führt zu verlängerten Güstzeiten, sinkender Milchleistung, Infertilität, Trächtigkeitsstörungen sowie erhöhten Abgängen.

SHELDON et al. (2001 und 2002) und MATEUS et al. (2002^a) konnten eine verminderte Uterusinvolution sowie eine Beeinträchtigung des Follikelwachstums durch eine bakterielle Kontamination des Uterus nachweisen. Die puerperale Endometritis stellt aufgrund ihrer hohen Inzidenz (MARKUSFELD 1984, FOURICHON et al. 2001) eine wirtschaftlich bedeutende Erkrankung des Rindes dar.

Ätiologie

Die Endometritis des Rindes tritt zumeist im Frühpuerperium auf (GRUNERT 1986).

Während der Trächtigkeit besteht im Uterus bei intakten Allantois- und Amnionblasen ein steriles Milieu. Bei über 90% der Abkalbungen kommt es zu einer bakteriellen Kontamination des Uterus (DOHMEN et al. 1995, BONDURANT 1999). Diese beruht auf einem unspezifischen Erregerspektrum. In entsprechenden Lochialsekretproben werden zumeist Arcanobacterium (A.) pyogenes, Escherichia (E.) coli, Staphylokokken (St.), Streptokokken (Sc.) und Bacteroides spp. (COHEN et al. 1996, OSSADNIK 1999) nachgewiesen. Nach GRIFFIN et al. (1974) sowie LUGINBÜHL und KÜPFER (1980) ist die Anwesenheit verschiedener Bakterienspezies (ß-hämolysierende Sc., St. aureus, A. pyogenes, E. coli) im Uterus nicht zwingend mit einer Infektion gleichzusetzen.

Der Vorgang der bakteriellen Kontamination mit Entzündung des Endometriums (nur selten ist auch das Myometrium betroffen) stellt unmittelbar post partum zunächst einen physiologischen Vorgang dar (BAIER und BERCHTOLD 1984). Zu diesem Zeitpunkt ist die körpereigene Abwehr des Tieres von entscheidender Bedeutung, denn ihre Kapazität gegenüber den Pathogenen entscheidet über den weiteren Verlauf des Prozesses (BAIER und BERCHTOLD 1984, AHLERS und GRUNERT 1993). Eine intakte Abwehr bei vergleichsweise geringer Pathogenität und Konzentration der Erreger wird zur schnellen Keimeliminierung am Endometrium und im Uteruslumen führen. Ist die Abwehr des Rindes aber geschwächt oder weist der Erreger eine entsprechend hohe Virulenz bei gleichzeitig hoher Konzentration auf, kann es zu einer verschieden stark ausgeprägten Entzündung der Gebärmutter kommen, die auch mit starken Allgemeinstörungen einhergehen kann.

Zu den körpereigenen Abwehrkräften sind mechanische Vorgänge wie Nachgeburts- wehen, Uterusinvolution, Sekretfluss und Schamschluss (AURICH und GRUNERT 1996), physikalische Mechanismen wie zervico-vaginaler Mucus (BONDURANT 1999), aber auch humorale und zelluläre Faktoren des Immunsystems zu rechnen.

Der Entstehung einer Endometritis puerperalis leisten Gewebsschäden des Endo- metriums (etwa durch Schwergeburt, geburtshilfliche Manipulationen und Operationen) und auch eine verzögerte Lösung der Eihäute (Retentio secundinarum [Ret. sec.], GRUNERT 1986) Vorschub. Diese genannten Vorgänge führen zu vergrößerten Wundflächen und bakterienfreundlichem Milieu, so dass Reparation und Regeneration behindert werden. Erkrankungen des Verdauungsapparates (Labmagenverlagerung), Stoffwechselstörungen (Ketose, Hypokalzämie) und auch Erkrankungen des Bewegungsapparates (BADURA et al. 1992) erhöhen die Inzidenz von Endometritiden.

Die Bedeutung einzelner Abwehrmechanismen wird in der Literatur unterschiedlich bewertet. Während einige Autoren die Uterusinvolution in den Vordergrund stellen (NAKAO et al. 1997), gibt es vermehrt Hinweise darauf, dass die verminderte funktionelle Kapazität uteriner Leukozyten für die Entstehung einer Endometritis von entscheidender Bedeutung ist. KLUCINSKI et al. (1995) konnten eine verminderte bakterizide Kapazität uteriner PMN bei induzierter Endometritis feststellen. MATEUS et al. (2002^b) zeigten, dass die spontane Heilung einer puerperalen Endometritis mit einer Steigerung der Bildung reaktiver Sauerstoffmetaboliten (ROS) durch Blut-PMN und mit einer Steigerung der Phagozytosekapazität uteriner PMN einhergeht. Sie folgern, dass eine verminderte funktionelle Kapazität von PMN in der Woche post partum (p. p.) die Empfänglichkeit für eine Endometritis erhöht. CAI et al. (1994) zeigten, dass antepartale Kühe mit verringerter Superoxid-Produktion durch Blut-PMN nach dem Abkalben vermehrt an Endometritis erkanken. Die Autoren folgern aus den Beobachtungen, dass in der verminderten PMN-Funktionalität ein prädisponierender Faktor zur Entstehung einer Gebärmutterentzündung besteht. KEHRLI et al. (1989) sowie ZERBE et al. (1998) beobachteten ebenfalls eine herabgesetzte funktionelle Kapazität von PMN im bovinen Blut in der ersten Woche post partum.

Die Endometritis kann in ein chronisches, abakterielles Stadium übergehen (sogenannte sterile Endometritis), wenn zwar die Bakterien, nicht aber die Entzündungs- produkte eliminiert und die entzündlichen Vorgänge nicht abgeschlossen wurden (BERCHTOLD 1998). Auch Infektionen mit Parasiten (Tritrichomonas spp.) oder Viren (BHV4) können als auslösende Faktoren einer Endometritis wirken. Im Folgenden sollen aber die bakteriellen Infektionen aufgrund der höheren Inzidenz und größeren Bedeutung im Mittelpunkt der Betrachtungen stehen.

Therapie

Die verschiedenen Therapieformen der bovinen Endometritis puerperalis werden vielfältig diskutiert. Systemische und lokale Antibiose (DE KRUIF et al. 1982), Applika- tion von Prostaglandinen (NAKAO et al. 1997), pflanzlichen Suspensionen (HEU-

WIESER et al. 2000), Uterotonika, Lipopolysacchariden (SINGH et al. 2000), Nichtsteroidalen Entzündungshemmern (KONIGSSON et al. 2001), Hyperimmunseren und Zytokinen (HUSSAIN und DANIEL 1991), desinfizierenden Lösungen (STRUBE et al. 1991) oder Laktobazillen (KUMMER et al. 1997), in Verbindung mit oder ohne manueller Abnahme der Eihäute bei Nachgeburtsverhaltung (DRILLICH et al. 2003), sind in vielen Studien mit unterschiedlichen Ergebnissen untersucht worden. Zum spezifischen therapeutischen Einsatz von Dexamethason bei puerperalen Endometritiden ist wenig bekannt, es gibt jedoch Untersuchungen zur Herdengesundheit nach Routine- Geburtseinleitung mit Dexamethason in Kombination mit Prostaglandin. Dabei stellten MURRAY et al. (1994) fest, dass im Vergleich zu spontan kalbenden Tieren bei Kühen mit induzierter Geburt vermehrt Endometritis auftrat. VANDEPLASSCHE und BOUTERS (1983) beobachteten bei puerperalen Kühen nach mehrmaliger Applikation von Glukokortikoiden negative Effekte auf die Phagozytosekapazität von PMN.

Festzustellen bleibt, dass bisher keine praktikable spezifische Prophylaxemöglichkeit zur Endometritis puerperalis gegeben ist. Alle diskutierten Therapieformen sind als unzu- friedenstellend zu bewerten, da es bisher keine Therapie vermag, eine sichere und schnelle Heilung herbeizuführen und Infertilität in allen Fällen zu verhindern.

2.2 Polymorphkernige neutrophile Granulozyten (PMN)

Der Begriff Immunsystem umschreibt komplexe Mechanismen der körpereigenen Abwehr, deren Ziel die Bewahrung der Integrität des eigenen Organismus durch Abwehr körpereigener maligner Prozesse und körperfremder Noxen und Organismen ist. Ein Großteil der Funktionen des Immunsystems wird von Leukozyten geleistet, zu denen auch die polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten (PMN) zählen. Sie werden als Teil des sogenannten angeborenen Immunsystems auf ubiquitäre Noxen hin aktiv, üben aber auch Funktionen im Rahmen des sogenannten adaptiven Immunsystems aus. Neutrophile Granulozyten entwickeln sich unter Einfluss von hämatopoetischen Wachstumsfaktoren aus myeloischen Stammzellen des Knochenmarks und werden in den Blutkreislauf freigesetzt (ROITT et al. 1995). Dort stellen sie unter physiologischen Verhältnissen als stabkernige Form 0-3% und als segmentkernige Form 25-45% der insgesamt 4.000 bis 12.000 bovinen Leukozyten pro µL Blut (KRAFT und DÜRR 1999). Die Lebensdauer von PMN wird bei Mensch und Ratte mit 2 bis 3 Tagen angegeben (ROITT et al. 1995, HILDEBRANDT 1998); die Halbwertszeit von humanen PMN beträgt nach DALE et al.

(1998) ungefähr 19 Stunden. Demgegenüber geben JANEWAY et al. (2002) die Lebensdauer von PMN mit nur wenigen Stunden an. Morphologisch stellen sich bovine PMN als im Durchmesser 10-12 µm messende Zellen (DORE et al. 1990) mit segmentiertem Kern dar. Im Zytoplasma sind Granula mit neutrophilem Färbeverhalten enthalten.

2.2.1 Funktionelle und phänotypische Eigenschaften

Extravasation und Chemotaxis

Die im Blut zirkulierenden PMN kommen besonders in den Kapillargebieten mit verminderter Blutflussgeschwindigkeit mit Endothelzellen der Blutgefäße in Kontakt.

Dies wird durch chemotaktische Faktoren begünstigt. Dieser Kontakt (Margination) wird durch den als „rolling“ bezeichneten Prozess unterstützt, bei dem Adhäsionsmoleküle (v.a. Selektine) von PMN und Endothelzelle miteinander interagieren (SMITH 1993). So wird die Wirkung der angreifenden Scherkräfte gemindert und der Granulozyt rotiert durch die reversible Adhäsion langsam am Endothel entlang. Dieser Prozess ist Voraussetzung für eine Wanderung neutrophiler Granulozyten aus dem Blutstrom (Extravasation) durch das Endothel des Blutgefäßes (Transmigration) in das Gebiet eines entzündlichen Prozesses. Dabei vermögen neutrophile Granulozyten aktiv in Richtung eines Stimulus zu wandern, der von bakteriellen Toxinen, endogenen Pyrogenen (z.B.

Lipopolysaccharide, LPS), Zytokinen (z.B. Interleukin-8, IL-8) oder aktivierten Komplementkomponenten (z.B. C3a und C5a) ausgehen kann (BAGGIOLINI et al. 1993, BOKOCH 1995). Die gerichtete Wanderung (Chemotaxis), induziert durch viele unterschiedliche chemoattraktive Substanzen, bewirkt, dass PMN in der Regel die ersten in ein Entzündungsgebiet einwandernden Abwehrzellen sind. Sie stellen somit eine der primären leukozytären Immunantworten dar (JANEWAY et al. 2002, LEFKOWITZ et al.

1997).

Phagozytose

Neben der Chemotaxis erbringen PMN weitere zelluläre Leistungen im Zuge des Abwehrgeschehens. Dazu zählt die Phagozytose, bei der Fremdpartikel zum Teil nach Opsonisierung durch Komplementfaktoren oder Immunglobuline in Phagosomen der Zelle aufgenommen werden. Diese fusionieren mit Lysosomen zu Phagolysosomen, in denen vom Granulozyten gebildete mikrobizide Enzyme (z.B. Lysozyme, Proteinasen) ebenso wie andere bakterizide Agenzien (z.B. Lactoferrin, Stickstoffoxide, Defensine, ROS [s.u.]) zum Einsatz kommen, wodurch in Verbindung mit einer Veränderung des pH-Milieus die aufgenommenen Noxen in der Regel zerstört werden (LONNERDAL und IYER 1995, ROITT et al. 1995).

Bildung reaktiver Sauerstoffmetaboliten (ROS)

Ein weiterer Mechanismus, durch den sowohl phagozytierte als auch Noxen außerhalb des Granulozyten geschädigt werden, ist die Bildung reaktiver Sauerstoffmetaboliten (reactive oxygen species, ROS). Dabei können verschiedene Aktivierungsmechanismen über z.T. spezifische Rezeptoren zu einer erhöhten Aktivität der membranständigen NADPH- Oxidase des Granulozyten führen, woraufhin das Superoxidanion O2- gebildet wird. In dem auch als „respiratory burst“ bezeichneten kaskadenartig ablaufenden Prozess wird

O2- in Verbindung mit weiteren Substraten und Enzymen des Myeloper- oxidasesystems zu stärker toxischen Sauerstoffverbindungen wie Wasserstoffperoxid (H2O2), Hydroxyradikalen, Peroxidanionen und hypochlorigen Säuren umgebildet. Diese wiederum entfalten eine stark mikrobizide Wirkung (CLIFFORD und REPINE 1982, GOODMAN et al. 1995).

Weitere PMN-Funktionen

PMN vermögen durch die extrazelluläre Ausschüttung von Granula zytolytische Enzyme und reaktive Sauerstoffmetaboliten freizusetzen, durch die Zielzellen geschädigt werden.

Dieser als zellvermittelte Zytotoxizität bezeichnete Prozess kann unter Vermittlung von Antikörpern (ADCC, antibody dependent cellular cytotoxicity), aber auch ohne diese (AICC, antibody independent cellular cytotoxicity) stattfinden. So können beispielsweise infizierte und körpereigene entartete Zellen durch PMN zerstört werden (KIPNIS et al.

1981, SCHNEIDER 1997).

Neben den direkten Einwirkungen von neutrophilen Granulozyten auf Noxen und Fremdorganismen tragen aktivierte PMN auch zur Rekrutierung weiterer Abwehr- mechanismen bei. So lösen nach LLOYD und OPPENHEIM (1992) Lipopolysaccharide und einige Interleukine (IL-1 und -2), die auf PMN wirken, eine Zytokinfreisetzung durch die neutrophilen Granulozyten aus (z.B. IL-1, IL-6, IL-8; WERTHEIM et al. 1993). Diese Botenstoffe wiederum wirken sowohl auf PMN als auch auf mononukleäre Leukozyten (MNC).

Die große Bedeutung von polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten, vor allem für die Abwehr von bakteriellen Infektionen, wird bei Individuen deutlich, deren PMN eine verringerte funktionelle Kapazität aufweisen. Das erbliche Krankheitsbild der humanen septischen Granulomatose (CGD, chronic granulomatous disease), das in der Herabsetzung der ROS-Bildungskapazität durch neutrophile Granulozyten begründet ist, löst typischerweise wiederkehrende pyogene Erkrankungen des Patienten aus (bakterielle Enterokolitis u.ä., MA et al. 2000). Weiterhin wiesen BRENNEIS et al. (1993) bei etwa einem Viertel der untersuchten humanen Patienten mit wiederkehrenden Infektionen eine verminderte ROS-Bildung oder eine verminderte Chemotaxis von PMN nach.

Phänotyp

Polymorphkernige neutrophile Granulozyten exprimieren an ihrer Oberfläche zahlreiche Moleküle, die entsprechend ihrer Antigenstruktur und Funktion bezeichnet werden. Für die vorliegende Arbeit sind vor allem folgende Strukturen von Bedeutung: L-Selektin (CD62L, cluster of differentiation, System zur Bezeichung humaner zellulärer Antigene) ist ein auf Leukozyten exprimiertes Adhäsionsmolekül, das an vaskuläre Addressine von Endothelzellen bindet und damit den als „rolling“ bezeichneten Prozess (s.o.) unterstützt (SMITH 1993, KADONO et al. 2002). CD11a bildet zusammen mit CD18 das Leukozyten-Funktionsassoziierte-Antigen-1 (LFA-1). Dieses stellt ein Adhäsionsmolekül dar, welches an das interzelluläre Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1, u.a. exprimiert von

Endothelzellen) bindet und so Anteil an der sich dem „rolling“ anschließenden Extravasation hat (SMITH 1993). CD11b bildet zusammen mit CD18 den Komplementrezeptor-3 (CR-3). Auch dieser ist an der Extravasation, aber auch an der Vermittlung der Phagozytose und der ROS-Bildung der PMN beteiligt (SMITH 1993, ROITT et al. 1995). CD11c bildet zusammen mit CD18 den Komplementrezeptor-4 (CR- 4). Soweit bekannt, stimmen die Funktionen mit denen von CR-3 überein (ROITT et al.

1995). MHC-Klasse-I (major histocompatibility complex, Haupthistokompatibilitäts- komplex) ist die Bezeichnung eines Moleküls, das interindividuell einen starken Polymorphismus aufweist (SCHUBERTH et al. 1991). Es dient der Präsentation von intrazellulären Antigenen und interagiert v.a. mit Rezeptoren zytotoxischer Lymphozyten.

Das vom monoklonalen Antikörper (mAk) Bo116 spezifisch gebundene Epitop ist auf allen bovinen PMN exprimiert sowie auf einer kleinen Monozytensubpopulation. Es konnte bisher nicht weiter charakterisiert werden. Das PMN-spezifische Antigen, an das der monoklonale Antikörper IL-A110 bindet, wurde ebenfalls bisher nicht genauer bestimmt.

Uterine neutrophile Granulozyten

Neutrophile Granulozyten erfahren durch die Extravasation und Migration Ver- änderungen in ihrem Phänotyp und ihrer funktionellen Kapazität. ZERBE (1994) beobachtete bei durch Leukotrien B4 in den Uterus gelockten PMN u.a. eine gesteigerte Expression von CD11b und eine verminderte Phagozytoseaktivität gegenüber gleichzeitig gewonnenen Blut-PMN, während die Bildung von ROS unverändert war. Bei Einsatz von Interleukin-8 (IL-8) als chemoattraktive Substanz zeigten uterine PMN gegenüber PMN des Blutes z.B. eine gesteigerte Expression von CD11b, eine gesenkte Expression von CD11a sowie eine Steigerung der ROS-Bildung (ZERBE et al. 2003). KLUCINSKI et al.

(1995) konnten eine verminderte bakterizide Kapazität uteriner PMN bei induzierter Endometritis feststellen, während zeitgleich neutrophile Granulozyten des peripheren Blutes keine Veränderungen der bakteriziden Kapazität aufwiesen.

Wodurch die dargestellten funktionellen und phänotypischen Veränderungen der PMN genau erfolgen, ist bisher nicht bekannt und soll in dieser Arbeit näher untersucht werden (s. 4.3). Sowohl ZERBE (1994) als auch FRANK (2000) konnten zeigen, dass die Veränderungen der PMN im Zuge der Wanderung in das Uteruslumen nicht auf dem Kontakt mit den eingesetzten Chemokinen (LTB4 und IL-8) beruhen.

2.2.2 Einflussfaktoren auf PMN im peripartalen Zeitraum

Neutrophile Granulozyten sind zahlreichen Einflüssen ausgesetzt, die zu Veränderungen ihrer Konzentration im Blut, ihrer Funktionalität und ihres Phänotyps führen können.

Besonders in dem für die Entstehung der Endometritis bedeutsamen peripartalen Zeitraum wirken auf die Leukozyten eine Reihe von Faktoren, von denen immunmodulatorische Effekte bekannt sind.

Die massiven Stoffwechselveränderungen, die das Rind schon präpartal, aber auch postpartal mit beginnender Laktation und Futterumstellung erlebt, führen nachweislich zur Funktionsdepression bei PMN (SCHNEIDER 1997, ZERBE et al. 2000). Bakterien und deren Produkte, die peripartal den Uterus kontaminieren und unter Umständen in den Blutkreislauf gelangen, fördern die Ansiedlung weiterer Bakterien (DOHMEN et al.

2000) und modulieren granulozytäre Eigenschaften (MORRIS 1989, OSSADNIK 1999, ZERBE et al. 2002). So führen E. coli und A. pyogenes Konzentrations- und Zeit- abhängig zur Steigerung der Expression z.B. von CD11b und CD11c sowie zur Depression der ROS-Bildungskapazität der PMN. Somit wird auch der Einfluss der Geburtshygiene und des Herdenmanagements auf zelluläre Abwehrfunktionen deutlich.

Peripartal kommt es zu massiven Konzentrationsveränderungen verschiedener Sexual- steroide (HEUWIESER und GRUNERT 1987):

Östrogene weisen im Geburtszeitraum im Vergleich zu nicht trächtigen Rindern sehr hohe Konzentrationen im Blut auf (50 bis 200fach höher als im Östrus). Es sind zahlreiche immunmodulatorische Wirkungen von Östrogenen auf bovine PMN bekannt (ROTH et al. 1983, HOEDEMAKER et al. 1992, WESSENDORF et al. 1998), darunter die Steigerung der PMN-Zahl im Blut, der Phagozytose und der ROS-Bildung, aber auch die Depression der gerichteten Migration. Neben diesen direkten Wirkungen auf Leukozyten sind auch indirekte beschrieben. So steigern Östrogene z.B. die Freisetzung des Adrenokortikotropen Hormons (ACTH) und damit auch die Freisetzung des bekanntermaßen immunmodulierenden Kortisols (ROTH et al. 1983, s. 2.3), einem endogenen Glukokortikoid (s.u.).

Das trächtigkeitserhaltende Sexualsteroid Progesteron weist während der Trächtigkeit hohe Konzentrationen im Blut auf (etwa 5-10 ng/mL Plasma) und erreicht in Folge der Luteolyse im Zuge der Abkalbung innerhalb von 24 bis 48 Stunden Werte von unter 1ng/mL. SCHEIBL und ZERBE (2000) sowie DHALIWAL et al. (2001) beschreiben vor allem deutliche Depressionen der intrauterinen Abwehr bei Progesteroneinfluss.

HOEDEMAKER et al. (1992) konnten zeigen, dass Progesteron die Antikörper- abhängige zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC) von PMN des Blutes senkt. Die immun- suppressive Wirkung von Progesteron wird u.a. dadurch erklärt, dass Progesteron auch vom Glukokortikoid-Rezeptor gebunden wird (OETTEL 2001). MADSEN et al. (2002) sehen einen Zusammenhang zwischen peripartal veränderten Steroidhormon- konzentrationen und zeitgleich auftretenden Änderungen der Expression funktionell bedeutender Gene neutrophiler Granulozyten.

Bei zyklischen Rindern ist die Follikelphase durch steigende Östrogen- und Proges- teronkonzentrationen im Blut gekennzeichnet. Die häufig in der zyklischen Lutealphase beobachteten Infektionen des Genitaltraktes sind nach SUBANDRIO et al. (2000) jedoch nicht auf einen Einfluss der Sexualsteroide auf uterine PMN zurückzuführen. ROTH et al.

(1983) sehen in den physiologischen Veränderungen der Sexualsteroide bei zyklischen Kühen jedoch eine Beeinträchtigung von Funktionen der PMN des Blutes. TIBBETS et al. (1999) zeigten im murinen System, dass Progesteron den Östrogen-induzierten Influx

von PMN und Makrophagen in den Uterus inhibiert. Steroidhormone wie Östrogene und Progesteron entfalten einen Teil ihrer Wirkung nach Bindung an Rezeptoren, die sich vor allem intrazellulär befinden und u.a. in PMN nachgewiesen wurden (MOLERO et al.

2002). Die Rezeptoren weisen mitunter Unterschiede zu humanen Steroidhormon- rezeptoren auf (GREENE und JENSEN 1982).

Endogene Glukokortikoide stellen eine weitere Gruppe von Hormonen dar, die im peripartalen Zeitraum eine deutliche Variation erfahren (HEUWIESER et al. 1987).

Schon während der Trächtigkeit, aber besonders im Zeitraum der Geburt werden endogene Glukokortikoide vermehrt produziert (PREISLER et al. 2000^ab). Dabei ist nicht bekannt, ob diese Steroidhormone nur eine Folge von Stress darstellen oder aber eine metabolische Funktion erfüllen (JARVIS et al. 1998). Nachweislich führen psychischer und physischer Stress zur Ausschüttung endogener Glukokortikoidhormone (PARROTT et al. 1994). Zu solchen Stressoren sind auch das Trennen von der Herde (HASHIZUME et al. 1994) und das Treiben eines Tieres in eine unbekannte Umgebung (z.B.

Abkalbestall, VEISSIER und LE NEINDRE 1988) sowie Wehen zu zählen (HYDBRING et al. 1999). Die Expression der Zielstruktur von Glukokortikoiden in bovinen Leukozyten, der zytosolische Glukokortikoidrezeptor (GR), wird im peripartalen Zeitraum deutlich gesenkt (PREISLER et al. 2000^ab). Immunmodulatorische Eigenschaften und Wirkungsmechanismen von Glukokortikoiden werden unter 2.3 genauer erläutert.

2.3 Glukokortikoide

2.3.1 Struktur und bekannte Wirkungsmechanismen

Glukokortikoide sind Steroidhormone. Endogene, d.h. vom Körper selbst produzierte Glukokortikoide sind von exogenen, d.h. von außen zugeführten synthetischen Glukokortikoiden (Medikamente) zu unterscheiden. Beim Rind repräsentieren v.a.

Kortisol (Hydrokortison), Kortikosteron und Kortison die endogenen Glukokortikoide.

Diese werden unter dem Einfluss des aus dem Hypophysenvorderlappen stammenden Adrenokortikotropen Hormons (ACTH) in der Nebennierenrinde synthetisiert und freigesetzt (ROTH et al. 1982, OETTEL 2001) und deshalb auch als Kortikosteroide bezeichnet. Sowohl Synthese als auch Sekretion der endogenen Kortikosteroide unterliegen einer negativen Rückkopplung (TRZECIAK et al. 1993). Glukokortikoide greifen regulatorisch in zahlreiche Stoffwechselvorgänge ein. Sie wirken auf den Kohlenhydratstoffwechsel, den Proteinstoffwechsel und zeigen antiexsudative, anti- toxische, antiinflammatorische und immunmodulatorische Effekte (OETTEL 2001).

Die exogenen Glukokortikoide stellen Verbindungen dar, die sich strukturell zumeist nur durch wenige Substituenten von endogenen Kortikosteroiden unterscheiden. So weist z.B. das synthetische Dexamethason im Vergleich zum endogenen Kortisol eine weitere

Doppelbindung (zwischen C1 und C2), eine Methylgruppe (an C16alpha) und eine Fluorie- rung (an C9alpha) auf. Dies hat zur Folge, dass die Wirksamkeit von exogenen Gluko- kortikoiden gegenüber endogenen Kortikosteroiden erhöht, pharmakologische Eigen- schaften verbessert, die therapeutische Breite erhöht und einige Nebenwirkungen reduziert werden. Eine weitere Folge der geringen strukturellen Unterschiede ist, dass sowohl exogene als auch endogene Glukokortikoide zumindest einen Teil ihrer Wirkungen über dieselben Rezeptoren (KONTULA et al. 1981, PETERSON et al. 1981) und Mechanismen auslösen.

Der Glukokortikoid-spezifische Rezeptor (GR) liegt zytosolisch, u.a. in Leukozyten vor. Dies ist für verschiedene Spezies, darunter auch für das Rind, nachgewiesen (PREISLER et al. 2000^ab). Nachdem das Glukokortikoid die Zellmembran penetriert hat, kommt es im Zytosol zur Bildung eines Komplexes aus Glukokortikoid und Rezeptor, der in den Kern verlagert wird und dort über eine Beeinträchtigung der Transkription, aber auch über die Hemmung von Transkriptionsfaktoren wirkt (ALMAWI 2001, WEBER et al. 2001). Diese Wirkungsmechanismen werden auch als genomische Effekte bezeichnet.

Dem sind nicht-genomische Wirkungen gegenüberzustellen, die vermutlich auf der physikochemischen Beeinflussung von Bestandteilen der Zellmembranen (Ionenkanäle, Membranproteine) beruhen (PITZALIS et al. 2002).

Durch Glukokortikoide sind auch systemische Effekte zu erwarten, da sie nachweislich die Synthese und Freisetzung verschiedener Hormone wie z.B. von Prolaktin und dem Wachstumshormon (GH, TAYLOR et al. 2000^a) modulieren. Auch diese Mechanismen sind als nicht-genomische Wirkungen zu betrachten. Im Zuge der physiologischen Geburtsinduktion kommt einer solchen Wirkung besondere Bedeutung zu, denn vom Fetus produziertes Kortisol stimuliert die Östrogensynthese in der Plazenta. Dies wiederum führt zum einen zur Freisetzung von ProstaglandinF2alpha mit anschließender Luteolyse und zum anderen zur Sensibilisierung des Myometriums gegenüber Oxytocin, einer Voraussetzung für die Wehen (GRUNERT und ANDRESEN 1995).

Die immunmodulatorischen Einflüsse von Glukokortikoiden (z.B. Hemmung der Lymphozytenproliferation, Senkung der Zytokinsekretion, Verminderung der Expression von Adhäsionsmolekülen) werden im Allgemeinen als immunsuppressiv bewertet (WALLER 2000).

Es sind inzwischen auch endogene Komodulatoren bekannt, denen eine wichtige Bedeutung in Zusammenhang mit Glukokortikoid-induzierten Effekten beigemessen wird, allen voran das Annexin-I (Synonym Lipocortin-I, STRAUSBAUGH und ROSEN 2001, ROVIEZZO et al. 2002).

Exogene Glukokortikoide werden beim Rind aufgrund unterschiedlicher therapeutischer Indikationen eingesetzt. Sie werden v.a. zur Antiphlogese, zur Behandlung von Störungen des Kohlenhydratstoffwechsels, bei Intoxikationen, aber auch zur Einleitung der Geburt genutzt (MURRAY et al. 1984, RAUSCH et al. 1989).

2.3.2 Glukokortikoideffekte auf bovine PMN

Die Wirkung von Glukokortikoiden auf phänotypische und funktionelle Eigenschaften boviner PMN wurde in zahlreichen Studien untersucht. Nach ROTH und KAEBERLE (1985^ab) und REDDY et al. (1990) führt die In-vivo-Applikation von Dexamethason bei Kälbern und Rindern zur Senkung der ROS-Bildung und der Antikörper-abhängigen Zytotoxizität (ADCC). ANDERSON et al. (1999) konnten jedoch keine Beeinträchtigung der Myeloperoxidaseaktivität nach Dexamethasonbehandlung beobachten. Die Antikörper-unabhängige zelluläre Zytotoxizität (AICC) stimulierter PMN wird ebenfalls durch Dexamethason vermindert (STEINBECK et al. 1989). PREISLER et al. (2000^ab) zeigten, dass bei Kühen die Kortisolkonzentration im Blut während des Abkalbens signifikant erhöht ist und dies mit einer Senkung der Expression des Glukokortikoidrezeptors in Leukozyten korreliert. Zum selben Zeitpunkt wurde auch eine Neutrophilie bei gleichzeitig bestehender Leukozytose beobachtet. Diese Veränderungen des Differentialblutbildes beschrieben auch ZERBE et al. (1998) und PREISLER et al.

(2000^ab) peripartal sowie ANDERSON et al. (1999) bei Ochsen und PHILLIPS et al.

(1987) bei Rindern nach Injektion von Dexamethason.

Den Untersuchungen von WEBB und ROTH (1987) sowie STEINBECK et al. (1989) zufolge hemmt eine Dexamethasonbehandlung den Arachidonsäuremetabolismus von neutrophilen Granulozyten. Die Phagozytosekapazität boviner PMN wird durch die Injektion von Dexamethason bei Kälbern gesenkt (REDDY et al. 1990), während die Chemotaxis gesteigert wird, wie ANDERSON et al. (1999) bei Ochsen nachwiesen.

Glukokortikoide beeinflussen neben dem Differentialblutbild und funktionellen Eigenschaften auch phänotypische Eigenschaften von PMN. So zeigten BURTON et al.

(1995) sowie GILBERT et al. (1992) bei Kühen eine Senkung der Expressionsdichte von CD18 nach Kortisol- und Dexamethasonapplikation. In ähnlichen Untersuchungen von ANDERSON et al. (1999) bei Ochsen stellte sich die Expression dieses Liganden jedoch unverändert dar. L-Selektin, ein für die Extravasation wichtiges Oberflächenmolekül von bovinen PMN, wird nach Dexamethason- oder Kortisolapplikation auf Blut-PMN von Rindern ebenfalls vermindert exprimiert (BURTON et al. 1995, BURTON und KEHRLI 1995).

Die Wirkung von Glukokortikoiden auf bovine PMN ist auch Gegenstand von In-vitro- Experimenten gewesen. Dabei waren z.T. Effekte zu beobachten, die den In-vivo- Beobachtungen entgegenstehen. So wiesen HOEDEMAKER et al. (1992) bei bovinen PMN eine Steigerung der ADCC durch Kortisol nach. OHMANN et al. (1987) zeigten eine Dexamethason-bedingte Senkung von Migration und ADCC in vitro. Dies steht möglicherweise in Zusammenhang mit der verminderten Adhärenz Dexamethason- behandelter PMN, die an aktivierten Aortaendothelzellen nachgewiesen wurde (ZWAHLEN et al. 1994). Nach MOIOLA et al. (1994) bewirkt Dexamethason eine Senkung der Phagozytosekapazität bei Kälbern und adulten Rindern. Die LPS-induzierte gesteigerte Expression von CD11b wird durch Dexamethason nicht signifikant verringert

(DIEZ-FRAILE et al. 2000). Auch OHMANN et al. (1987) beobachteten in vitro keine Beeinflussung der Expression von Fc- oder Komplementrezeptoren boviner PMN.

Die Mehrzahl der Studien beim Rind bezieht sich auf die Effekte von Glukokortikoiden auf PMN, die aus dem peripheren Blut gewonnen wurden. Dabei kommen mehrere Autoren zu dem Schluss, dass die erhöhte Glukokortikoid- Konzentration im peripartalen Zeitraum zu erhöhter Infektionsneigung führen könnte (PREISLER et al. 2000^a, WALLER 2000).

Trotzdem sind bisher mit Hinblick auf die lokale Abwehr kaum Effekte von Gluko- kortikoiden auf phänotypische und funktionelle Eigenschaften extravasaler (uteriner) PMN bekannt.

2.4 Makrophagen

Makrophagen zählen ebenso wie Granulozyten zu den Leukozyten des sogenannten angeborenen Immunsystems; sie interagieren aber auch intensiv mit Faktoren der adaptiven Immunmechanismen.

Makrophagen entwickeln sich unter dem Einfluss hämatopoetischer Wachstumsfaktoren aus myeloischen Stammzellen des Knochenmarks. Aus diesem freigesetzt, zirkulieren die Vorstufen der Zellen einige Tage im Blut und vollziehen über die als Monoblast, Promonozyt und Monozyt bezeichneten Stufen die Reifung zum Promakrophagen (ZEMBALA und ASHERSON 1989). Dieser Zelltyp wiederum wandert aus dem Blutgefäß aus und differenziert anschließend im Zielgewebe zum gewebsspezifischen Makrophagen (sogenannter Gewebsmakrophage) aus. Makrophagen sind in besonders großer Zahl in Bindegewebe, Gastrointestinaltrakt und in der Nähe von Blutgefäßen in Leber, Lunge und Milz vorhanden (JANEWAY et al. 2002). Im Zuge von Entzündungen wandern (zeitlich nach PMN) Makrophagen-Vorläufer in das infizierte Gewebe ein und differenzieren ebenfalls zu Makrophagen (sogenannte Exsudat- Makrophagen).

Mikroskopisch stellen sich Makrophagen als zytoplasmareiche, stark granulierte Zellen dar, die durch zahlreiche Pseudopodien imponieren. Bei einem Durchmesser von ungefähr 20 µm (HILDEBRANDT 1998, abhängig vom Aktivierungsstatus) sind Makro- phagen deutlich größer als Granulozyten oder Lymphozyten.

2.4.1 Funktionelle und phänotypische Eigenschaften

Funktionalität

Makrophagen gehören zu den stark phagozytierenden Zellen. Ebenso wie PMN vermögen sie, Pathogene in Phagosomen aufzunehmen und diese im Zellinneren mit Lysosomen zu

des pH-Wertes, bakterizide Enzyme, toxische Sauerstoffderivate, toxische Stickstoff- oxide, antimikrobielle Peptide und Kompetitoren unschädlich gemacht werden (DIMENT und STAHL 1985, JANEWAY et al. 2002). Wie bei PMN ist die Phagozytose z.T. nicht opsonisierter Pathogene möglich, nach Opsonisierung mit Immunglobulinen oder Komplementfaktoren wird die phagozytotische Kapazität in der Regel verstärkt.

Makrophagen bilden wie PMN über den als „respiratory burst“ bezeichneten Prozess toxische Sauerstoffmetaboliten (s. 2.2.1, BOUNOUS et al. 1992, FORMAN und TORRES 2002). OHMANN und BABIUK (1984), BOUNOUS et al. (1992) sowie GOFF et al. (1996) beobachteten eine geringere ROS-Produktion durch bovine MDM als durch bovine PMN. Funktionell sind reaktive Sauerstoffmetaboliten wie bei neutrophilen Granulozyten für die Abwehr von intra- und extrazellulären Erregern bedeutend; es wurden aber auch Hinweise darauf gefunden, dass besonders Wasserstoffperoxid durch die Interaktion mit Thiolen Enzymaktivitäten beeinflussen kann und somit eine Rolle in der intrazellulären Signalgebung übernimmt (FORMAN und TORRES 2002). Die erhöhte ROS-Konzentration in der Zelle ist nur transient, da u.a. der Zelle eigene antioxidative Enzyme die Sauerstoffmetaboliten abbauen und damit die ROS-Wirkung zeitlich begrenzen.

Makrophagen sind in der Lage, große Mengen an toxischem Stickstoffoxid (NO) zu bilden, das schnell in weitere reaktive Stickstoffverbindungen umgesetzt wird. Die NO- Bildung wird durch die induzierbare Stickstoffoxid Synthetase (iNOS) katalysiert, die auch beim Rind nachgewiesen ist (ADLER et al. 1994^b, STICH et al. 1994, ALDWELL et al. 1997). Von verschiedenen Spezies ist bekannt, dass reaktive Stickstoffprodukte zytotoxisch oder zumindest zytostatisch gegen verschiedene Stadien von Bakterien, Viren, Pilzen, Parasiten, Protozoen und entarteten Zellen wirken (MACMICKING et al. 1997).

Somit ist ihre Funktion der von reaktiven Sauerstoffmetaboliten sehr ähnlich. ADLER et al. (1995) beobachteten, dass die bovine iNOS in ihrer Stuktur große Homologien zur murinen und humanen iNOS aufweist (94-97%ige Homologie der Aminosäurensequenz).

Trotzdem wird das bovine Enzym in seiner Aktivität scheinbar anders reguliert als bei anderen Spezies, denn im Gegensatz etwa zur murinen iNOS wird weder die Expression des Enzyms noch seine Aktivität (NO-Bildung) durch homologes Interferon-gamma (IFNgamma) allein gesteigert. Dass die bovine iNOS jedoch in ihrer Expression und auch in der NO-Bildung stimuliert werden kann, ist anhand von LPS und Salmonellen (S.

dublin) gezeigt worden (ADLER et al. 1995, JUNGI et al. 1996^a).

Vor allem gegenüber sehr großen extrazellulären Pathogenen können Makrophagen durch die exozytotische Freisetzung der in den Lysosomen enthaltenen Faktoren zyto- toxisch wirken (JANEWAY et al. 2002). Dieser Vorgang kann unabhängig von Antikörpern (AICC) ablaufen, aber auch in Verbindung mit Antikörpern (ADCC), die an der Oberfläche der Zielzelle binden und so die zu lysierende Zelle markieren.

Makrophagen setzen bei Kontakt mit Bakterien außerdem zahlreiche, vor allem proinflammatorische, Zytokine frei (z.B. Tumornekrosefaktor alpha [TNFalpha], Makrophagen-inflammatorisches Protein [MIP], IL-1, IL-6, IL-8, IL-12, Transforming

growth factor ß [TGFß]), die zur Eigenstimulation, zur Anlockung weiterer Leukozyten, zur Aktivierung bestimmter Lymphozytensubpopulationen und auch zu systemischen Effekten wie Fieber führen (AKIRA und KISHOMOTO 1996, JANEWAY et al. 2002, NORIMATSU et al. 2003). Makrophagen sind auch befähigt, Faktoren zu sezernieren, die der Gewebereorganisation dienen (z.B. Elastase, Kollagenase, ROITT et al. 1995).

Phänotyp

Als funktionell bedeutsame Struktur weist die Plasmamembran von Makrophagen MHC- Klasse-II-Moleküle auf. Deren Expressionsdichte ist stark vom Aktivierungsstatus der Zelle abhängig. MHC-Klasse-II-Moleküle dienen der Präsentation von Antigenen (s. auch 2.4.2) und der Interaktion v.a. mit THelfer-Lymphozyten. Antigenpräsentierende MHC- Klasse-I-Moleküle werden von Makrophagen ebenso exprimiert wie Komplement- rezeptoren (z.B. CD11b, s. 2.2.1), Rezeptoren für Antikörper (Fc-Rezeptor) und Adhä- sionsmoleküle (z.B. CD18, ADLER et al. 1994^a, JUNGI et al. 1997). Außerdem weisen Makrophagen auf ihrer Oberfläche spezielle Moleküle auf, die auf anderen Zellen nicht oder nur geringgradig exprimiert sind. Dazu gehören LPS-Rezeptoren (CD14) (ADLER et al. 1994^a, YANG et al. 1995, JUNGI et al. 1997, YANG et al. 1997), Mannose- Rezeptoren, Scavenger-Rezeptoren (NAITO et al. 1991) und Toll-like Rezeptoren (TLR, DOBROVOLSKAIA und VOGEL 2002, PONTAROLLO et al. 2002, WERLING und JUNGI 2003). Diese Rezeptoren dienen in der Regel der Erkennung häufig auftretender mikrobieller Bestandteile. Bezüglich der Toll-like Rezeptoren sind beim Rind TLR-2, -3, -4 und –9 nachgewiesen (WERLING und JUNGI 2003). Diese erkennen Bestandteile grampositiver (LTA durch TLR-2) sowie gramnegativer (LPS durch TLR-4) Bakterien und auch bestimmte Abschnitte prokaryotischer DNA, darunter sogenannte CpG-Motive (Cytosin para Guanin, durch TLR-9). Die Bindung an diese Toll-like Rezeptoren führt nachweislich zur Aktivierung von Transkriptionsfaktoren (NF-kappaB), die wiederum die Bildung von proinflammatorischen Zytokinen unterstützen.

2.4.2 Rolle bei der Infektionsabwehr

Makrophagen spielen eine bedeutende Rolle in allen Phasen der Infektionsabwehr. Sie sind die vorherrschenden Phagozyten im Gewebe (JANEWAY et al. 2002). Aufgrund ihrer Lage im subepithelialen Bindegewebe und der Vielfalt an Rezeptoren, die weit verbreitete mikrobielle Bestandteile erkennen, treten Makrophagen bei zahlreichen Infektionen mit Pathogenen in Kontakt, sobald diese die Epithelbarriere überwunden haben. In dieser frühen Phase der Infektion können Makrophagen als Teil des unspezifischen Immunsystems Erreger direkt phagozytieren und abtöten. Durch die Freisetzung von Zytokinen und Mediatoren (z.B. TNFalpha, IL-8, Prostaglandine, Leukotriene) steigern sie dabei ihre eigene funktionelle Kapazität, rekrutieren und stimulieren weitere Leukozytenpopulationen, lösen systemische Abwehrreaktionen aus und bewirken somit zahlreiche Entzündungsreaktionen (JANEWAY et al. 2002).

Aufgrund der Expression von MHC-Klasse-II-Molekülen zählen Makrophagen außerdem

zu den professionell-Antigen-präsentierenden Zellen (APC), die intensiv mit Zellen des adaptiven Immunsystems interagieren.

Ein Teil der von Makrophagen initiierten Entzündungsreaktionen besteht in der Anlockung von PMN. So zeigen neutrophile Granulozyten gerichtete Migration zu einigen der von stimulierten Makrophagen freigesetzten Zytokine (z.B. IL-8, CRAVEN 1986, VENUPRASAD et al. 2002). Außerdem weisen neutrophile Granulozyten Rezep- toren auf, die von Makrophagen sezernierte Mediatoren binden und zu einer funktionellen Beeinflussung von PMN führen, wie OHMANN et al. (1990) anhand des TNFalpha zeigen konnten.

Die Interaktion von Makrophagen mit Lymphozyten ist bereits in zahlreichen Projekten untersucht worden. Weniger ist jedoch darüber bekannt, inwiefern Gewebs- makrophagen in der frühen Phase einer Infektion mit in das Entzündungsgebiet einwandernden PMN interagieren und deren phänotypische und funktionelle Eigen- schaften beeinflussen. Für humane PMN und Makrophagen sind Interaktionen und gegenseitige funktionelle Modulationen bekannt, so z. B. im Zuge der Abwehr parasitärer Infektionen (VENUPRASAD et al. 2002) und im Verlauf asthmatischer Erkrankungen (WILKINSON et al. 1989). LEFKOWITZ et al. (1997) konnten außerdem zeigen, dass auch PMN Makrophagen funktionell modulieren können. Durch die Freisetzung von PMN-Faktoren wie z.T. inaktive Formen der Myeloperoxidase wird die bakterizide Aktivität von Makrophagen verstärkt.

Für das Rind sind jedoch bisher kaum Interaktionen von Makrophagen und PMN be- kannt; es sind lediglich Einflüsse boviner Makrophagen auf die Chemotaxis neutrophiler Granulozyten beschrieben (CRAVEN 1986, HENRICKS et al. 1990).

So bleibt die Frage zu klären, inwiefern bovine PMN durch bovine Gewebsmakro- phagen etwa des Endometriums beeinflusst werden.

Der Erfolg der Abwehr von regelmäßig bei Rindergeburten auftretenden Kontami- nationen und Infektionen des Uterus hängt entscheidend von der funktionellen Kapazität der zuerst einwandernden Granulozyten ab. Diese sind während der Migration aus dem Blutgefäß zum Endometrium verschiedenen Einflüssen ausgesetzt, darunter auch dem Kontakt mit residenten Gewebsmakrophagen und oder von Makrophagen sezernierten Faktoren. Weiterhin wirken im peripartalen Zeitraum Faktoren wie veränderte Sexualsteroidhormonkonzentrationen, bakterielle Produkte im Uterus und veränderte Glukokortikoidkonzentrationen sowohl auf die PMN als auch auf die Makrophagen, die aufgrund ihrer subendometrialen Lage Faktoren aus dem Uteruslumen zu einem besonders frühen Zeitpunkt einer Infektion ausgesetzt sind.

Angesichts dieser Tatsachen soll in dieser Arbeit untersucht werden, welche Einflüsse Glukokortikoide, bakterielle Produkte und Makrophagen auf phänotypische und funktionelle Eigenschaften von PMN im Blut und im Besonderen im Uterus haben. Ziel ist es, funktionelle Modulationen von PMN, die möglicherweise für das Entstehen einer Endometritis ätiologisch von Bedeutung sind, genauer zu charakterisieren.

3 Material und Methoden

3.1 Geräte und Materialien

3.1.1 Geräte, Klinik- und Laborbedarf

Geräte

Aqua dest. Aufbereitungsanlage „SG Umkehr- Osmoseanlage Typ RO 50/14 SMB TypI“

Fa. Wasser- und Regenerierstation, Barsbüttel

Aqua tridest. Aufbereitungsanlage „SG Reinstwasser System Typ SG-RS 90-4 UF“

Fa. Wasser- und Regenerierstation, Barsbüttel

Autoklav „Typ GE406“ Fa. Getinge AB, Getinge/Schweden Druckbehälter zur Sterilfiltration „stainless

steel pressure vessel“

Fa. Alloy Products (XX670053), Wisconsin/USA

Durchflusszytometer mit Computereinheit

„Fluorescence Activated Cell Analyser (FACScan^®)“

Fa. Becton Dickinson, Heidelberg

Eismaschine „Typ UBE 30-10“ Fa. Ziegra, Isernhagen Fluoreszenzmikroskop mit Ploemiluminator

und Phasenkontrasteinrichtung Okular: Kpl 10xW

Objektive: Ph2 Neofluar 16/0,40 Ph2 Neofluar 40/0,75 Planneofluar 63 x/1,25; Öl Filtereinsatz 09: Erregerfilter 450-490nm Farbteiler 510nm

Sperrfilter 520nm

Fa. Zeiss (476250-9901), Oberkochen

Folienschweißgerät „Polystar^® 100GE“ Rische und Herfurth, Hamburg Gamma-Counter „LKB Wallac 1272

Clinigamma“

Wallac 0y, Turku/Finnland Heißluftsterilisator „Typ ST5050“ Fa. Heraeus, Hanau

Kühlschrank mit Gefrierfach (–20°C) Einzelhandel

Laborfeinwaage „B6“ Fa. Mettler, Zürich/Schweiz Labor-pH-Meter „766 Calimatic“ Fa. Knick, Berlin

Laborwaage „BL310“ Fa. Sartorius, Göttingen Magnetrührer mit Heizplatte „IKAMAG^®RH“ Fa. Janke u. Kunkel, Staufen

Pipette, einstellbar „Transferpette^®“ (2-20 µL) Fa. Brand (09U2539), Wertheim Pipetten, einstellbar „pipetman“

(100-1.000 µL, 20-200 µL, 10-100 µL, 1- 20 µL)

Fa. Gilson, Villers Le Bel/Frankreich

Röhrchen-Schüttler „Typ Reamix“ Fa. ASID, Unterschleißheim Röhrchen-Schwenker „Typ Automix“ Fa. ASID, Unterschleißheim Rüttler für Mikrotiterplatten „AM69

Microshaker“

Fa. Dynatech, Zug/Schweiz Schlauchpumpe zum Absaugen von

Flüssigkeiten „Rumo100“

Fa. Heidolph (52100), Schwabach

Geräte für Zellkulturarbeiten

Bunsenbrenner mit automatischer Zündung

„gasprofi1“

Fa. Wartewig (6.001.000), Göttingen CO2-Brutschrank „Typ BK5060E“ Fa. Heraeus-Christ (26146040), Hanau CO2-Flasche zur Sterilfiltration Fa. Kohlensäurewerk Hannover, Hannover Einmal-Filter, 0,2 µm Fa. Renner (06001), Dannstadt

Invertmikroskop Okular: CPL W 10x/18 Objektive: Ph1-F-LD 20/0,25 Ph1 10/0,22

Fa. Zeiss (471202-9901), Oberkochen

Pinzette, gebogen, anatomisch Fa. Eickemeyer (170710), Tuttlingen Pipettierhilfe „accu-jet^®“ Fa. Brand (26404), Wertheim

Plastikbox mit Gittereinsatz Einzelhandel

Schere, rostfrei Fa. Fisher Scientific (9204013), Schwerte Sterile Werkbank, „Heraeus Lamin Air^® HLB

2472“

Fa. Heraeus-Christ, Hanau Wasserbad mit Temperaturregelung Typ 1003 Fa. GFL Hannover, Hannover Zellzählkammer nach Bürker Fa. Brand, Wertheim

Zentrifugen

Kühlzentrifuge „Varifuge K Typ 4500“ Fa. Heraeus-Christ, Osterode Plattenzentrifuge mit Plattenrotor (UJ II KS) Fa. Heraeus-Christ, Osterode Tischzentrifuge „Chemico“ mit Winkelrotor für

Reaktionsgefäße 1,5 mL

Fa. Wifug (10209), Bradford/England Tischzentrifuge „Hermle Z230M“ Fa. Hermle, Gosheim

Zentrifuge „Megafuge 1.0R“ Fa. Heraeus-Christ, Osterode

Klinikbedarf

Butterfly-Kanüle „Micro-Flo^TM“ 21G 0,8mm Fa. Industria Biomedica (AS2102), Mailand/Italien

Einmalspritze Luer 10 mL Fa. AMEFA (302020), Limburg Einmalspritze Luer 50 mL „Plastipak^®“ Fa. Becton Dickinson (300865),

Drogheda/Irland

Einmalspritze Luer 5 mL Fa. AMEFA (302010), Limburg Einmal-Untersuchungs-Handschuhe „Gentle

Skin^® sensitive“

Fa. Meditrade^® (1221R), Kiefersfelden Embryotransferkatheter „Neustadt/Aisch“ Fa. Wörrlein Medizintechnik (202074/15),

Ansbach

Kanülen 1,8 x 40mm „TSK STERIJEKT“ Fa. TSK Tochigi/Japan

Lithium-Heparin-Röhrchen (10 mL) Fa. Sarstedt (26369PP), Nürnbrecht Nylon-Gewebe aus PA6.6, „Typ 0188“,

Maschenweite 75 µm, Faden-Durchmesser 50/43 µm, offene Fläche 34%

Fa. Bückmann (03-75/34-1360), Mönchengladbach

Staugurt zur Blutentnahme beim Menschen Fa. Medicalis (31001), Garbsen Staukette nach Witte Fa. Eikemeyer (442015), Tuttlingen Uterus-Biopsiezange Modell Ferris Fa. WDT (27037), Garbsen

Vacutainer^® Brand Luer Adapter Fa. Becton Dickinson (367300), Heidelberg Vacutainer^® Systems, Halter Fa. Becton Dickinson, Heidelberg

Vacutainer^®-Röhrchen (10 mL) mit EDTA-K2 (18 mg)

Fa. Becton Dickinson (367525), Heidelberg Vacutainer^®-Röhrchen (10 mL)

mit Natrium-Heparin (170 IU)

Fa. Becton Dickinson (368480), Heidelberg Vacutainer^®-Röhrchen (10 mL)

mit CAT (clot activator)

Fa. Becton Dickinson (367896), Heidelberg Vacutainer^®-Röhrchen (10 mL) ohne Zusatz Fa. Becton Dickinson (368430), Heidelberg Laborbedarf

6 well-Zellkultur-Makroplatte mit Abdeckplatte

„Cellstar^®“

Fa. Greiner (657160), Frickenhausen Combitips plus 0,5 mL Fa. Eppendorf (0030069.420), Hamburg Combitips plus 2,5 mL Fa. Eppendorf (0030069.447), Hamburg Einmal-Pasteurpipetten aus Polyethylen

niedriger Dichte

Fa. Merck (612F1767), Darmstadt Eppendorf-Reaktionsgefäß mit Deckel 0,5 mL Fa. Sarstedt (72699), Nürnbrecht Eppendorf-Reaktionsgefäß mit Deckel 1,5 mL Fa. Greiner (616201), Frickenhausen Falcon, 50 mL, Polypropylen Fa. Corning (430829), New York/USA Filter 0,2 µm „Sartobran-PH Capsule

Sartobran^®“

Fa. Sartorius (5231307H7SOB), Göttingen Händedesinfektionsmittel „Sterilium^®“ Fa. Bode Chemie (669), Hamburg

Kochtopf Einzelhandel Laborflaschen mit Gewinde, 100 mL, 500 mL

und 1.000 mL

Fa. VWR international, Hannover Mikrotiterplatten „Zellkulturtestplatte“, 96-

Loch, Rundboden, steril

Fa. Techno Plastic Products TPP^®, Trasadingen/Schweiz

Multipette^® pro Fa. Eppendorf (4985000.013), Hamburg Objektträger, ca. 76 x 26mm/3 x 1inch Fa. Menzel-Gläser (02 1102), Braunschweig

Papier, saugfähig Einzelhandel

Pasteurpipetten, 22,5mm aus Glas Fa. Brand (747720), Wertheim Petrischale Durchmesser 94mm Fa. Greiner (633171), Frickenhausen Pipettenspitzen „Plastibrand^®“ 0,5 µL-20 µL Fa. Brand (702565), Wertheim

Pipettenspitzen, blau und gelb Fa. Sarstedt (70/762002 und 70/760002), Nürnbrecht,

Röhrchen für die Durchflusszytometrie, 5 mL Fa. Becton Dickinson (352008), Heidelberg Röhrchen, 15 mL, Polypropylen Fa. Corning (430791), New York/USA RS-Röhrchen (RIA), 5 mL Fa. Greiner (115101), Frickenhausen Saugpipetten (10 mL) Fa. Sarstedt (86.1254.01), Nürnbrecht

Teflonfolie Fa. Angst und Pfister, Zürich/Schweiz

Tesafilm-Klebeband Einzelhandel

Tiegelzange 400mm Fa. Fisher Scientific (9310240), Schwerte Zellkulturflaschen, 200 mL „Nunclon^TMdelta

Surface“

Fa. Nunc^TM (156499), Wiesbaden

3.1.2 Medikamente, Reagenzien und andere Verbrauchsmaterialien

125Jod-Histamin-Tracer LDN Nordhorn, <130 kBq, 1 Flasche Lyophylisat gelöst in 5,5 mL A. dest.

Accustain^TM, Wright Stain, modified Fa. Sigma Diagnostics, St. Louis/USA

Accutase Fa. PAA (L11-007), Linz/Österreich

Acridinorange Fa. Sigma-Aldrich (A6014), Steinheim Ammoniumchlorid (NH4Cl) Fa. Sigma-Aldrich (A4514), Steinheim Annexin-I Fa. Biodesign international (A80108B), Saco,

Maine/USA

Annexin-V-FITC-Kit Fa. Alexis^® (850-020-KI02), Grünberg bovines Serum-Albumin, Fraktion V, (BSA) Fa. PAA (K41-001-100), Linz/Österreich Calciumchlorid (CaCl2 x 2 H2O) Fa. Sigma-Aldrich (C-3881), Steinheim Citronensäure Monohydrat Fa. Roth (5110.1), Karlsruhe

D(+)-Glukose (wasserfrei) Fa. Fluka (49140), Buchs/Schweiz Desinfektionslösung Helipur H Plus Fa. Tierärztebedarf Lehnecke (2390082),

Schortens

Dexamethason Fa. Sigma-Aldrich (D-1756), Steinheim

Dexamethason Injektionslösung

„Dexamethason 0,4P“, (Wirkstoff:

Dexamethason-21-dinatriumphosphat)

Fa. Albrecht, Aulendorf

Dihydrorhodamin 123 (DHR 123) (Molekulargewicht: 346,38 g/mol)

Fa. MoBiTec (D632), Göttingen Dimethylsulfoxid (DMSO) Fa. Baker (7033), Deventer/Holland Dinolytic^® (Wirkstoff: Dinoprost) Fa. Pharmacia, Erlangen

Donkey-anti-goat IgG, Antiserum Grade (Konzentration nicht bestimmt)

Fa. Scantibodies (3AD497); Santee, Kalifornien/USA,

DTAF-Ziegen-Antikörper-anti-Maus-IgG und IgM, schwere und leichte Ketten

= DTAF – ZgantiM – IgG + M (H + L)

Fa. Dianova (115-015-068), Hamburg

Estrumate^® (Wirkstoff: Cloprostenol- Natriumsalz)

Fa. Essex Tierarznei, München Ethanol 641 (absolut, vergällt) Fa. CG Chemikalien, Laatzen

Ethanol, absolut Fa. J.T. Baker (8228), Deventer/Holland Ethidiumbromid Fa. Sigma-Aldrich (E8751), Steinheim Ethylendiamine-Tetraacetat (EDTA) Fa. Sigma-Aldrich (ED2SS), Steinheim Fetales Kälberserum (FCS) Fa. Biochrom (SO 113/431B), Berlin

Feuerzeug Einzelhandel

Fluorescein Isothiocyanate (FITC) Fa. Sigma-Aldrich (F7250), Steinheim Formaldehyd 37%, Rotipuran^® Fa. Roth (49794.1), Karlsruhe

Histamin, freie Base Fa. Sigma-Aldrich (H-7125), Steinheim Interleukin-8, human, rekombinant (72a.a.) Fa. Pepro Tech (200-08M), Rocky Hill,

NJ/USA

Iscove^®-Trockenmedium Fa. Biochrom (T046-10), Berlin

Kaliumchlorid (KCl), kristallin Fa. Sigma-Aldrich (P-4504), Steinheim Kaliumhydrogencarbonat, reinst (KHCO3) Fa. Merck (4852), Darmstadt

Kupfer(II)-sulfat-5-hydrat Fa. Roth (8175.1), Karlsruhe

L-Glutamin Fa. Biochrom (K0283), Berlin

Lipopolysaccharide von Escherichia coli Serotyp 055:B5

Fa. Sigma-Aldrich (L-2637), Steinheim Lipoteichonsäure (LTA) Fa. Sigma-Aldrich (L-2515), Steinheim Lokalanästhetikum „Isocain ad us vet“

(Wirkstoff: Procainhydrochlorid, Epinephrin)

Fa. Selectavet, Weyarn-Holzollig Lymphozytenseparationsmedium Fa. PAA Laboratories (J15-004),

Linz/Österreich

Magnesiumchlorid (MgCl2 x 6 H2O) Fa. Sigma-Aldrich (M-0250), Steinheim N-(2-Hydroxylethyl)piperazin-N’ (-ethan-

sulfonsäure) „Hepes dry substance“ (HEPES)

Fa. Biochrom (L-1603), Berlin

Natriumazid (NaN3), 10%ig Fa. Sigma-Aldrich (S-2002), Steinheim