Medizinische Hochschule Hannover
Klinik für Gastroenterologie, Hepatologie und Endokrinologie der Medizinischen Hochschule Hannover
PD Dr. med. Thomas Wirth
Analyse von tumorspezifischen CD8 T - Zell - Immunantworten im transgenen, orthotopen
HCC - Modell
INAUGURALDISSERTATION
zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften - Doctor rerum naturalium -
(Dr. rer. nat.)
vorgelegt von
Dmitrij Ostroumov
aus Odessa
Hannover 2017
Angenommen durch den Senat: 06.11.2017
Präsident: Prof. Dr. med. Christopher Baum
Wissenschaftliche Betreuung: PD Dr. med. Thomas Wirth
Wissenschaftliche Zweitbetreuung: Prof. Dr. rer. nat. Reinhard Schwinzer
1. Referent: PD Dr. med. Thomas Wirth
2. Referent: Prof. Dr. rer. nat. Reinhard Schwinzer 3. Referent: Prof.‘in Dr. phil. nat. Dr. med. Ulrike Köhl Tag der mündlichen Prüfung: 06.11.2017
Prüfungsausschuss
Vorsitz: Prof. Dr. rer. nat. Jürgen Alves 1. Prüfer: PD Dr. med. Thomas Wirth
2. Prüfer: Prof. Dr. rer. nat. Reinhard Schwinzer 3. Prüfer: Prof.‘in Dr. phil. nat. Dr. med. Ulrike Köhl
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis ...I
1 Zusammenfassung ... 1
Abstract ... 2
2 Einleitung ... 3
Angeborenes und adaptives Immunsystem ... 3
2.1 2.1.1 Angeborenes Immunsystem ... 3
2.1.2 Adaptives Immunsystem ... 4
2.1.3 Die Rolle des Immunsystems in der Leber ... 7
T-Zell-Erschöpfung ... 8
2.2 2.2.1 T-Zell-Erschöpfung im Zusammenhang chronischer viraler Erkrankungen ... 9
2.2.2 Beitrag der Tumormikroumgebung zur Immunregulation ... 10
2.2.3 T-Zell-Erschöpfung bei Tumorerkrankungen ... 12
2.2.4 Checkpoint-Blockade als Immuntherapie ... 14
Epidemiologie von Lebertumorerkrankungen ... 16
2.3 Murine Lebertumormodelle ... 17
2.4 Verwendung des Transposon-Systems für das orthotope Lebertumormodell ... 18
2.5 Zielsetzung der vorliegenden Arbeit ... 21
2.6
3 Ergebnisse ... 22
Generierung von orthotopen Lebertumoren mittels Transposon-System für die 3.1 Untersuchung tumorspezifischer CD8 T-Zell-Immunantworten ... 22
3.1.1 Verwendung des Transposon-Systems für die Generierung orthotoper Lebertumoren .... 22
3.1.2 Monitoring des Tumorwachstums orthotoper Lebertumoren mittels Luciferase-Expression ... 24
3.1.3 Expression des Modellantigens Ovalbumin in induzierten Lebertumoren ... 25
Untersuchungen der tumorspezifischen CD8 T-Zell-Immun-antworten in 3.2 tumortragenden Mäusen ... 26
3.2.1 Vergleich der Frequenzen tumorspezifischer CD8 T-Zellen in tumortragenden Mäusen unter Verwendung des Modellantigens Ovalbumin ... 27
3.2.2 Antigenerkennung durch tumorspezifische CD8 T-Zellen und Überleben tumortragender Mäuse ... 29
3.2.3 Adoptiver Transfer tumorspezifischer CD8 T-Zellen in tumortragende Mäuse ... 32
3.2.4 Beeinflussung der Migration spezifischer CD8 T-Zellen zu soliden Tumoren ... 34
Einfluss des Tumorwachstums auf Phänotyp und Funktionalität tumorspezifischer 3.3 CD8 T-Zellen ... 36
3.3.1 Oberflächenexpression der Marker für T-Zell-Erschöpfung auf endogenen
spezifischen CD8 T-Zellen ... 36
3.3.2 Expressionsuntersuchung der Oberflächenmarker auf tumorspezifischen CD8 T-Zellen in verschiedenen Geweben von tumortragenden Mäusen ... 38
3.3.3 Marker der T-Zell-Differenzierung im Zusammenhang mit T-Zell-Erschöpfung ... 42
3.3.4 Untersuchung zur Cytokinexpression von tumorspezifischen CD8 T-Zellen ... 44
Veränderungen in der mRNA-Expression tumorspezifischer CD8 T-Zellen ... 45
3.4 3.4.1 Transkriptionelle Unterschiede bei erschöpften tumorspezifischen CD8 T-Zellen ... 45
3.4.2 Genregulation bei erschöpften tumorspezifischen CD8 T-Zellen ... 49
Validierung transkriptioneller Unterschiede tumor-spezifischer CD8 T-Zellen im 3.5 orthotopen Tumormodell ... 50
3.5.1 Unterschiede in der Expression der Marker für T-Zell-Erschöpfung während der Expansionsphase der T-Zell-Immunantwort ... 51
3.5.2 Beeinflussung der Cytokinexpression und Degranulation tumorspezifischer CD8 T-Zellen durch das Wachstum solider Tumoren... 53
TIGIT inhibiert tumorspezifische CD8 T-Zellen ... 56
3.6 3.6.1 Untersuchung der Oberflächenexpression von PD-1 und TIGIT auf tumorspezifischen CD8 T-Zellen ... 56
3.6.2 Untersuchung der Wirksamkeit der Immun-Checkpoint-Inhibition im Tumormodell ... 57
4 Diskussion ... 59
Benutzung des Transposon-Systems zur Untersuchung der spezifischen CD8 T- 4.1 Zell-Immunantwort gegen solide Tumoren. ... 60
Tumor-induzierte T-Zell-Erschöpfung ... 63
4.2 Einfluss der T-Zell-Erschöpfung auf Effektorfunktion und Gedächtnis- 4.3 T-Zell-Bildung ... 65
Transkriptionelle Veränderungen spezifischer CD8 T-Zellen im Tumormilieu ... 67
4.4 Veränderungen bei der Regulation von Apoptose und Transkription in erschöpften 4.5 tumorspezifischer T-Zellen ... 70
Organspezifische Unterschiede im Phänotyp und Polyfunktionalität erschöpfter 4.6 tumorspezifischer T-Zellen ... 73
Beitrag des co-inhibitorischen Rezeptors TIGIT zur T-Zell-Erschöpfung ... 75
4.7 Ausblick ... 79
4.8
5 Material und Methoden ... 80
Material ... 80
5.1 5.1.1 Verbrauchsmaterialien ... 80
5.1.2 Kits ... 80
5.1.3 Geräte ... 81
5.1.4 Software ... 82
5.1.5 Chemikalien und Reagenzien ... 82
5.1.6 Medien und Rezepturen ... 83
5.1.7 Enzyme ... 86
5.1.8 Molekulargewichtsstandards... 86
5.1.9 Antikörper ... 86
5.1.10 Peptid ... 87
5.1.11 Oligonukleotide (Primer) ... 87
5.1.12 Plasmide ... 88
5.1.13 Plasmide, die im Rahmen dieser Doktorarbeit konstruiert wurden ... 88
5.1.14 Bakterienstämme ... 90
5.1.15 Zelllinien ... 91
5.1.16 Versuchstiere ... 91
Molekularbiologische Methoden ... 91
5.2 5.2.1 Polymerasekettenreaktion (PCR) ... 91
5.2.2 Gelelektrophorese ... 92
5.2.3 Spaltung von DNA mittels Restriktionsenzymen ... 92
5.2.4 Modifikation von DNA durch DNA Polymerase I (Klenow-Fragment) ... 92
5.2.5 Dephosphorylierung ... 93
5.2.6 Ligation von DNA-Enden ... 93
5.2.7 Aufreinigung von DNA-Fragmenten mittels Säule ... 93
5.2.8 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen ... 93
5.2.9 Transformation durch Elektroporation von kompetenten Bakterien ... 94
5.2.10 Transformation von chemisch kompetenten Bakterien ... 94
5.2.11 Vervielfältigung von Bakterien... 94
5.2.12 Plasmidpräparation (Mini-Präparation) ... 94
5.2.13 Plasmidpräparation (Midi- / Maxi-Präparation) ... 95
5.2.14 Bestimmung der DNA-Konzentration ... 95
Zellbiologische Methoden ... 96
5.3 5.3.1 Zellkultur ... 96
5.3.2 Einfrieren von Zellen in flüssigem Stickstoff ... 96
5.3.3 Auftauen von Zellen aus flüssigem Stickstoff ... 96
5.3.4 Zellzahlbestimmung ... 96
5.3.5 Zelltransfektion mit Polyethylenimin (PEI) ... 96
Proteinbiochemische Methoden ... 97
5.4 5.4.1 Histologie ... 97
5.4.2 Herstellung von Zellextrakten aus Zellenkultur und Gewebeproben ... 97
5.4.3 Luciferaseassay ... 98
5.4.4 β-Galactosidase-Assay ... 98
5.4.5 Bradford-Assay zur quantitativen Bestimmung der Proteinmenge ... 98
5.4.6 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ... 98
5.4.7 Western Blot ... 99
Tierexperimentelle Methoden ... 99
5.5 5.5.1 Durchführung der Tierversuche ... 99
5.5.2 Haltung der Tiere ... 99
5.5.3 Applikationemethoden und Tumorinduktion mittels HDI ... 100
5.5.4 Konjugation von Peptid und PLGA-Mikrosphären ... 100
5.5.5 Listeria monocytogenes – Injektion ... 100
5.5.6 In vivo Überwachung des Tumorwachstums am IVIS ... 101
5.5.7 Etablierung subkutaner Tumoren und Berechnung des Tumorvolumens ... 102
5.5.8 Behandlung tumortragender Mäuse mit monoklonalen Antikörpern ... 102
5.5.9 Probenentnahmen ... 102
Immunologische Methoden ... 103
5.6 5.6.1 Probenaufbereitung für die durchflusszytometrische Analyse ... 103
5.6.2 Färbung der Zellen durch Oberflächenantikörper ... 103
5.6.3 Isolierung von Lymphozyten aus der Leber bzw. Lebertumor ... 104
5.6.4 Aufreinigung von Lymphozyten aus der Leber bzw. Lebertumor mit MACS-Technologie ... 104
5.6.5 Konjugation von SIINFEKL-Tetramer (APC) ... 105
5.6.6 Adoptiver Transfer spezifischer CD8 T-Zellen (OT-I) ... 105
5.6.7 In vitro - Stimulation der Zellen und CD107a-Färbung ... 106
5.6.8 Färbung der Zellen durch intrazelluläre Antikörper ... 107
5.6.9 Analyse der Proben am Durchflusszytometer ... 107
5.6.10 Auswertung der Daten aus der Durchflusszytometrie ... 108
5.6.11 Sortierung spezifischer CD8 T-Zellen mittels FACS ... 108
5.6.12 RNA-Isolierung ... 110
5.6.13 Kontrolle der isolierten RNA ... 111
5.6.14 Microarray ... 111
Statistische Auswertung ... 112
5.7
6 Literaturverzeichnis ... 113
7 Anhang ... 134
Funktionelle Annotation von Genen mit signifikanter Regulation in erschöpften 7.1 tumorspezifischen CD8 T-Zellen ... 134
Abkürzungsverzeichnis ... 145
7.2
8 Lebenslauf ... 147
9 Publikationen und Posterpräsentationen... 148
10 Danksagung ... 149
11 Erklärung zur Dissertation ... 150
1 Zusammenfassung
Das hepatozelluläre Karzinom (HCC, hepatocellular carcinoma) ist eine der häufigsten Tumorarten, mit steigender Inzidenz und weist eine hohe Mortalität auf. Da die Tumorumgebung durch eine Dysfunktion cytotoxischer T-Zellen charakterisiert ist, die eine wirksame Bekämpfung des Tumors durch T-Zellen unterdrückt, ist es entscheidend, die Ursachen für diese fehlende funktionelle Tumorimmunabwehr aufzuklären. Durch die Verwendung des Transposonsystems wurde ein orthotopes Lebertumormodell etabliert und funktionell charakterisiert. Dies ermöglichte detaillierte Untersuchungen der tumorspezifischen CD8 T-Zell-Immunantworten zur Untersuchung der Tumor-induzierten T-Zell-Erschöpfung mittels typischer Marker. Um die zugrundeliegenden molekularen Ursachen für die T-Zell-Erschöpfung näher zu beleuchten, wurde im Rahmen dieser Arbeit die erste transkriptomweite Microarray-Analyse erschöpfter tumorspezifischer CD8 T-Zellen beim HCC durchgeführt. Auf transkriptioneller Ebene wurden bei den tumorspezifischen CD8 T-Zellen molekulare Veränderungen aufgedeckt, die zur T-Zell-Erschöpfung beitragen. Auf der Basis der mRNA-Expressionsdaten konnten außerdem Veränderungen in Genen identifiziert werden, die verantwortlich sind für Apoptose, Chemotaxis, Effektorfunktion, Proliferation und Signaltransduktion. Die Veränderungen umfassten auch Transkriptionsfaktoren, die entscheidend für die Differenzierung und Erwerb von Effektorfunktionen bei T-Zellen sind. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die T-Zell-Erschöpfung durch ein komplexes Zusammenwirken verschiedener co-inhibitorischer Rezeptoren induziert wird, wodurch eine wirksame antitumorale Immunabwehr verhindert wird. Im Verlauf der in vivo-Validierung mehrerer transkriptioneller Veränderungen zeigte sich eine deutliche Beteiligung des co-inhibitorischen Rezeptors TIGIT bei der Ausprägung der T-Zell-Erschöpfung. Da die erhöhte Expression von TIGIT auf spezifischen CD8 T-Zellen bei Antigenerkennung auftrat, wurde die funktionelle Beteiligung von TIGIT an der T-Zell-Erschöpfung untersucht. Im Tumormodell mit murinen Hepatomzellen zeigte sich, dass die immuntherapeutische Kombinationsblockade aus anti-TIGIT und anti-PD-1 das Überleben von Mäusen verlängern konnte. Diese Untersuchungen zeigten, dass die T-Zell-Erschöpfung komplexe Veränderungen in tumorspezifischen CD8 T-Zellen auslöst, die unter Beteiligung mehrerer co-inhibitorischer Rezeptoren entstehen und vermutlich nur durch Kombination von Immuntherapien wirksam behandelt werden können.
Abstract
Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most common types of cancer with increasing incidence and a high mortality. Due to the characteristic emergence of T cell dysfunction in the tumor environment which prevents efficacious control of tumor growth by cytotoxic T cells it is essential to elucidate the causes of the dysfunctional antitumor immune response.
An orthotopic liver cancer model was established by using the transposon system and functionally characterized. This allowed for in-depth investigations of specific antitumor CD8 T cell immune responses in order to explore the cancer-induced T cell exhaustion by the use of typical markers. To uncover the underlying molecular causes of T cell exhaustion the present work shows the first whole transcriptome microarray analysis of exhausted HCC-specific CD8 T cells. On the transcriptional level molecular changes have been revealed in tumor-specific CD8 T cells that contribute to T cell exhaustion. Based on the mRNA expression data we identified changes in genes that are responsible for apoptosis, chemotaxis, effector function, proliferation and signal transduction. The alterations also comprised transcription factors that are crucial for differentiation and acquisition of T cell effector functions. The investigations suggest that T cell exhaustion is induced by a complex interplay of different co-inhibitory receptors, thereby preventing an efficacious antitumor immune response. In the course of in vivo validation of several transcriptional changes the co-inhibitory receptor TIGIT showed a marked involvement during the occurrence of T cell exhaustion. Since increased TIGIT expression on specific CD8 T cells occurred during antigen recognition, the functional involvement of TIGIT in T cell exhaustion was investigated. In a cancer model using murine hepatoma cells the combined blockade of anti-TIGIT and anti-PD-1 could prolong the survival of mice. The study demonstrated that T cell exhaustion elicits complex changes in tumor-specific CD8 T cells with the participation of several co-inhibitory receptors and can presumably only be treated efficaciously by a combination of immunotherapies.
2 Einleitung
Angeborenes und adaptives Immunsystem 2.1
Das Immunsystem von Mensch und Maus lässt sich generell in zwei Teile untergliedern, das angeborene und das adaptive Immunsystem. Beide ergänzen ihre Funktionen räumlich und zeitlich, um den Wirt vor Pathogenen und anderen schädlichen Einflüssen zu schützen.
Während das adaptive Immunsystem für den Aufbau einer effektiven Immunabwehr 4 bis 7 Tage benötigt, ist das angeborene Immunsystem unmittelbar und sofort wirksam. Das angeborene und adaptive Immunsystem umfassen unterschiedliche Zelltypen mit verschiedenen Wirkmechanismen, die auf komplexe Weise miteinander und mit den anderen Körperzellen interagieren können. In den folgenden Abschnitten wird ein Überblick über die jeweiligen zellulären Komponenten des Immunsystems gegeben, wobei das Hauptaugenmerk der vorliegenden Arbeit auf den CD8 T-Zellen liegt, die dem Schutz des Körpers dienen und einen wichtigen Bestandteil des adaptiven Immunsystems darstellen.
2.1.1 Angeborenes Immunsystem
In der Immunologie wird die CD-Nomenklatur verwendet (cluster of differentiation, CD), entsprechend derer eine Vielzahl von Oberflächenmolekülen bezeichnet werden. Sie wird zur Gruppeneinteilung und Charakterisierung von Zellen des Immunsystems und anderer Körperzellen benutzt.
Das angeborene Immunsystems kann sehr schnell aktiv werden und ist nicht auf bestimmte Pathogene spezialisiert, sondern besitzt Mustererkennungsrezeptoren (Pattern Recognition Receptors, PRRs), mit deren Hilfe es Pathogen-assoziierte molekulare Muster (Pathogen- associated molecular patterns, PAMPs) erkennen kann. Zu den Zelltypen des angeborenen Immunsystems zählen unter anderem phagozytierende Zellen: Makrophagen, Neutrophile und dendritische Zellen (DC). Diese Zellen können, nachdem sie das Pathogen erkannt haben, es aufnehmen (phagozytieren) und können dieses schließlich in speziellen Vesikeln, den Lysosomen, zerstören. Die dabei entstehenden Antigenbestandteile der Pathogene können in Form von Peptiden mittels spezieller Proteinkomplexe, den Klasse-II-Haupthistokompatibilitätskomplexen (class II major histocompatibility complex, MHC-Klasse-II) gebunden werden. Die dabei entstehenden Peptid:MHC-Klasse-II-Komplexe können dann auf der Zelloberfläche für andere Zellen präsentiert werden. Die T-Zellen gehören zum adaptiven Immunsystem und können die präsentierten Peptid:MHC-Komplexe
erkennen. Beim Menschen werden die MHC-Moleküle als humane Leukozytenantigene (human leukocyte antigen, HLA) bezeichnet. Zu den professionellen Antigen-präsentierenden Zellen (antigen presenting cells, APCs) gehören vorwiegend die dendritischen Zellen und die Makrophagen. Außerdem existierten in den Körperzellen Proteinkomplexe, die Proteasomen, die beschädigte und nicht mehr benötigte Proteine innerhalb der Zelle zu Peptiden degradieren. Es ist zu beachten, dass alle kernhaltigen Körperzellen mittels Klasse-I-Haupthistokompatibilitätskomplexen (MHC-Klasse-I) diese intrazellulären Peptide auf ihrer Oberfläche als Peptid:MHC-Klasse-I-Komplexe präsentieren können (Neefjes et al., 2011). Die durch MHC-Klasse-I-Komplexe präsentierten Peptide entstammen intrazellulären Pathogenen, beispielsweise Viren oder Bakterien, wobei im Verlauf ihres Replikations- und Lebenszyklus ihre viralen oder bakteriellen Proteine ins Cytosol der Wirtszelle gelangen.
Somit geben sich infizierte Körperzellen über die Peptid:MHC-Komplexe den T-Zellen gegenüber als infiziert zu erkennen. Zum angeborenen Immunsystem gehören auch die natürlichen Killerzellen (NK-Zellen), die die Körperzellen ohne MHC-Klasse-I-Komplexe auf der Zelloberfläche als körperfremd erkennen und sofort töten. Durch das Proteasom werden aber nicht nur Proteine von Bakterien und Viren proteolytisch gespalten, sondern auch zelleigene Proteinbestandteile. Die dabei entstehenden Peptide werden schließlich ebenfalls auf MHC-Klasse-I-Komplexe geladen und auf der Zelloberfläche präsentiert. Dadurch geben sich die Körperzellen dem Immunsystem selbst zu erkennen, und werden somit als körpereigen und nicht infiziert erkannt.
2.1.2 Adaptives Immunsystem
Obwohl das adaptive Immunsystem 4 bis 7 Tage benötigt, um eine wirksame Immunantwort zu entwickeln, kann es die Bedrohungen für den Wirtskörper sehr viel spezifischer erkennen.
Das adaptive Immunsystem besteht aus B-Zellen und T-Zellen, die zu den Lymphozyten gehören. Die B-Zellen können nach ihrer Aktivierung proliferieren und Antikörper sezernieren, die spezifische Strukturen erkennen und binden können. Durch die anschließende Präsenz der Antikörper im Blut wird gegen bestimmte Pathogene eine dauerhafte Immunität generiert, die den Wirtskörper schützt. Somit sind B-Zellen ein sehr wichtiger Bestandteil des adaptiven Immunsystems, und durch die Produktion spezifischer Antikörper sind sie auch Teil einer humoralen Immunantwort.
Ein weiterer Vorteil des adaptiven Immunsystems ist die Bildung eines immunologischen Gedächtnisses, wodurch der Körper, beispielsweise auf eine erneute Infektion durch das
gleiche Virus, schneller reagieren kann als bei einer erstmaligen Infektion. Dadurch kommt es zu einer schnelleren Proliferation von B-Zellen und T-Zellen, die Antikörper sezernieren bzw.
zu Effektorzellen differenzieren und das Antigen schneller beseitigen. Nachdem das Antigen erfolgreich bekämpft wurde, kommt es anschließend zu einer weiteren Differenzierung der adaptiven Immunzellen. Dabei bleiben nur die langlebigen Gedächtnis-B-Zellen und Gedächtnis-T-Zellen am Leben, wohingegen die kurzlebigen Effektorzellen absterben.
Im Gegensatz zu B-Zellen bewirken die T-Zellen eine zellvermittelte Immunität, wobei mehrere Arten von T-Zellen existieren, die unterschiedliche Co-Rezeptoren auf ihrer Oberfläche exprimieren und unterschiedliche Funktionen aufweisen. Dazu gehören die CD4 T-Zellen, die die von APCs präsentierten Peptid:MHC-Klasse-II-Komplexe mit Hilfe ihres T-Zell-Rezeptors (T cell receptor, TCR) spezifisch erkennen können. Die CD4 T-Zellen sind als Typ1 T-Helferzellen (Th1) in der Lage den professionellen cytotoxischen CD8 T-Zellen Hilfe zu leisten, indem sie Cytokine sezernieren, insbesondere Interleukin-2 (IL-2), oder durch Zell-Zell-Kontakt über spezielle Rezeptoren Co-Stimulation vermitteln (Bevan, 2004).
Darüber hinaus können CD4 T-Zellen ebenfalls cytotoxisch wirken und sowohl Pathogene und Tumorzellen beseitigen (Takeuchi and Saito, 2017). Die Typ2 T-Helferzellen (Th2) sind CD4 T-Zellen, die durch die Ausschüttung von IL-4 eine B-Zell-vermittelte Immunantwort fördern, wobei gleichzeitig eine Th1-Immunantwort unterdrückt wird. Es gibt außerdem noch die Th17-Helferzellen (Th17), die durch die Ausschüttung von IL-17 definiert werden (Park et al., 2005). Die Th17-Helferzellen spielen eine Rolle bei der Entstehung von Autoimmunität, können aber auch eine Abstoßung von Tumorzellen bewirken (Bettelli et al., 2007; Muranski et al., 2008). Zu den CD4 T-Zellen gehören auch die regulatorischen T-Zellen (Tregs), die als CD4+ CD25+ FoxP3+ T-Zellen beschrieben werden (Ramsdell, 2003). Die Tregs sind Suppressor-T-Zellen, die vorwiegend in der Peripherie durch die Ausschüttung von anti-inflammatorischen IL-10 und transformierendem Wachstumsfaktor-beta (transforming growth factor β, TGF-β) immunsuppressiv auf Effektor- T-Zellen wirken und so Toleranz induzieren können. Ein für die Immunabwehr sehr bedeutender Typ von T-Zellen sind die CD8 T-Zellen. Sie können mit antigenpräsentierenden Zellen interagieren und die präsentierten Peptid:MHC-Klasse-I-Komplexe spezifisch mittels ihrem T-Zell-Rezeptor erkennen. Durch die somatische Rekombination von genetischen Abschnitten (V(D)J-Rekombination) erreichen die TCRs von T-Zellen eine sehr hohe Variabilität. Aufgrund dieser Variabilität entsteht ein großes Repertoire an T-Zellen, und somit an T-Zell-Klonen mit unterschiedlichen Spezifitäten, mit deren Hilfe das Immunsystem eine große Vielzahl verschiedener Peptid:MHC-Komplexe spezifisch erkennen kann. Zur
Vermeidung von Autoimmunität seitens des adaptiven Immunsystems gibt es die zentrale Toleranz, die dafür sorgt, dass möglichst alle autoreaktive Zellen aus dem Repertoire der B- und T-Zellen entfernt werden. Dadurch wird vermieden, dass eine adaptive Immunantwort körpereigene Strukturen erkennt und angreift. Damit eine naive (also Antigen-unerfahrene) CD8 T-Zelle aktiviert wird, muss sie im Lymphknoten ihr entsprechendes Peptid:MHC-Klasse-I-Komplex auf der Oberfläche einer antigenpräsentierenden Zelle spezifisch erkennen. Die Interaktion zwischen TCR und Peptid:MHC-Komplex ist jedoch nicht ausreichend, um die T-Zelle zu aktivieren, sondern löst stattdessen bei der T-Zelle Anergie aus. Eine anerge T-Zelle kann dann keine Immunantwort gegen das spezifische Antigen ausführen. Für die Aktivierung benötigen naive CD8 T-Zellen zusätzlich zur Erkennung des Peptid:MHC-I-Komplexes durch ihren TCR (Signal 1) auch eine Co-Stimulation durch die antigenpräsentierende Zelle (Signal 2). Auf der Oberfläche von naiven CD8 T-Zellen wird konstitutiv der co-stimulierende Rezeptor CD28 exprimiert, das an seine Liganden CD80 (B7-1) und CD86 (B7-2) auf der Oberfläche der antigenpräsentierenden Zelle bindet und dadurch eine starke Co-Stimulation an die T-Zelle vermittelt (Jenkins et al., 1991; Harding and Allison, 1993). Zusätzlich ist für die Proliferation von T-Zellen auch eine Ausschüttung von inflammatorischen Cytokinen (Signal 3) forderlich (Haring et al., 2006).
Hierbei fungiert das durch dendritische Zellen produzierte IL-12 als T-Zell-stimulierendes Cytokin und beschleunigt die Differenzierung von naiven T-Zellen zu Effektor-T-Zellen (Curtsinger et al., 1999). Ebenso können Interferone (IFNα, IFNβ, IFNγ) stimulierend auf T-Zellen wirken und ihre Expansion fördern (Curtsinger et al., 2005; Whitmire et al., 2005).
Zusätzlich können T-Zellen auch selbst IL-2 produzieren, um ihre Proliferation zu beschleunigen. Die ausdifferenzierten cytotoxischen CD8 Effektor-T-Zellen verlassen die lymphatischen Gefäße und treten in die Blutbahn ein. Durch die Blutzirkulation werden die T-Zellen in die Peripherie gebracht und können somit schließlich an den jeweiligen Ort der Inflammation und in die Organe migrieren, um ihr spezifisches Antigen zu bekämpfen. Wenn die CD8 Effektor-T-Zelle ihr Antigen auf Körperzellen erkennt, in Form von präsentierten Peptid:MHC-Klasse-I-Komplexen, werden die entsprechenden Zellen direkt getötet. Es gibt diverse Mechanismen mit derer Hilfe CD8 T-Zellen die spezifisch erkannten Zielzellen töten können (Harty et al., 2000). Zum einen können die cytotoxischen CD8 T-Zellen lytische Granula freisetzen, die Perforin und Granzym B enthalten. Perforin bildet porenartige Strukturen in der Membran der Zielzelle, durch die Granzym B in die Zelle gelangt und anschließend die Apoptose der Zielzelle induzieren kann. Außerdem wirken die CD8 T-Zellen cytotoxisch durch die Sekretion der proinflammatorischen Cytokine Interferon
gamma (IFNγ) und Tumornekrosefaktor alpha (TNFα). Zusätzlich bewirkt das IFNγ bei Zellen eine generelle Erhöhung der Expression von Molekülen der MHC-Klasse-I, wodurch den CD8 T-Zellen vermehrt Peptid:MHC-Klasse-I-Komplexe präsentiert werden. Dadurch wird eine Erkennung von Zielzellen mittels TCR begünstigt. Darüber hinaus inhibiert IFNγ direkt die virale Replikation und aktiviert Makrophagen, die zur Quelle der Inflammation migrieren, um Pathogene zu phagozytieren. Die Produktion von IFNγ geht somit direkt mit der cytotoxischen Aktivität von CD8 T-Zellen einher (Ghanekar et al., 2001). Das Cytokin TNFα agiert in Synergie mit IFNγ bei der Hochregulation von Molekülen der MHC-Klasse-I und kann zusätzlich Nekrose bei Tumorzellen auslösen (Marley et al., 1989; Liu et al., 2011).
In der Grundlagenforschung wird der adoptive Transfer von T-Zellen eingesetzt, um immunologische Fragestellungen zu beantworten. Dabei wird unter anderem auch das Thy1/OT-I-System verwendet. Beim OT-I-System (OVA transgenic-I T-cell receptor), handelt es sich um CD8 T-Zellen, die transgen für einen T-Zell-Rezeptor sind (OT-I-Rezeptor). Somit können diese CD8 T-Zellen (OT-I-Zellen) das OVA257–264 Epitop SIINFEKL H-2Kb-restringiert erkennen. Dabei werden die Mäuse für Versuchszwecke so gezüchtet, dass die CD8 T-Zellen außer dem transgenen OT-I-TCR auch den Membranrezeptor CD90.1 (Thy1.1) auf ihrer Oberfläche aufweisen. Dadurch sind sie nach adoptivem Transfer unterscheidbar von der endogenen CD8 T-Zell-Population in den Empfänger-Mäusen, die positiv für CD90.2 (Thy1.2) ist. Seit seiner Etablierung findet dieses Modell vielmals Verwendung in der immunologischen Grundlagenforschung (Hogquist et al., 1994; Foulds et al., 2002; Pham et al., 2009).
2.1.3 Die Rolle des Immunsystems in der Leber
Die Leber ist ein überlebenswichtiges Organ und erfüllt viele Funktionen, die dem Lebenserhalt des Körpers dienen. Dazu gehören die Synthese und Sekretion von Proteinen, Metabolismus von Nährstoffen, Gluconeogenese, sowie Detoxifikation des Blutes von schädlichen Substanzen. In diesem komplexen Organ sind neben den Leberzellen (Hepatozyten) und den Epithelzellen der Gallengängen (Cholangiozyten) auch mehrere andere Zelltypen lokalisiert. So befinden sich lebersinusoide Zellen (liver sinusoidal endothelial cells, LSECs), Lebermakrophagen (Kupffer-Zellen) und hepatische Sternzellen (hepatic stellate cells, HSCs) in der Leber. Da die Leber ein stark durchblutetes Organ ist, gelangen außerdem verschiedene Lymphozytenpopulationen, darunter CD8 T-Zellen, in die Leber (Doherty et al., 1999; Racanelli and Rehermann, 2006). Es ist jedoch zu beachten, dass
es sich bei der Leber um ein Organ handelt, welches durch seine Funktion und Lokalisation mit einer Vielzahl von Substanzen aus dem Darm in Kontakt kommt, darunter Lipopolysaccharid (LPS), die inflammatorisch wirken. Damit es nicht zu einer chronischen Entzündung in der Leber kommt und durch eine Aktivierung des Immunsystems Autoimmunität ausgelöst wird, wird in der Leber generell eine Immunsuppression induziert.
Dies geschieht auch über die lebersinusoiden Zellen und Kupffer-Zellen, die anti-inflammatorische Cytokine ausschütten, dazu gehören IL-10 und TGF-β (Knolle et al., 1998). Zusätzlich können die LSECs eine Aktivierung von T-Zellen verhindern, indem sie die benötigte Co-Stimulation durch dendritische Zellen unterdrücken (Schildberg et al., 2008).
Die LSECs sind jedoch auch in der Lage direkt Toleranz bei T-Zellen zu induzieren (Limmer et al., 2000). Insgesamt wird dadurch in der Leber lokal eine Aktivierung der T-Zellen unterdrückt und Toleranz induziert (Knolle and Gerken, 2000; Crispe, 2003). Die Toleranz kann zudem dynamisch reguliert werden und ist auch von der Konzentration des Antigens in der Leber abhängig. So können LSECs bei höherer Antigenkonzentration auch die Differenzierung von Effektor-T-Zellen in Abhängigkeit von IL-2 auslösen (Schurich et al., 2010). Zudem kann bei Infektionen durch hepatotrope Viren eine T-Zell-Immunantwort induziert werden, wobei die erfolgreiche Bekämpfung der Antigens von der Qualität der T-Zellen abhängt (Thimme et al., 2001).
T-Zell-Erschöpfung 2.2
Es ist zu beachten, dass die Aufgabe von cytotoxischen T-Zellen sich nicht nur auf die Bekämpfung von viralen oder bakteriellen Antigenen beschränkt. Vielmehr ist die generelle Erkennung von körper-fremd (non-self) und körper-eigen (self) wichtig. Bei der Karzinogenese entstehen in der DNA der zu Tumorzellen veränderten Körperzellen auch Mutationen. Dadurch werden auf ihrer Zelloberfläche die durch Mutation veränderten körper-eigenen Peptide als Peptid:MHC-Komplexe präsentiert. Diese Neoantigene können von cytotoxischen T-Zellen erkannt und die entstandenen Tumorzellen anschließend getötet werden. In der Tumorumgebung gibt es jedoch Regulationsmechanismen der peripheren Toleranz, die eine wirksame Eradizierung von entstandenen Tumorzellen limitieren oder verhindern. Ein regulatorischer Mechanismus des Immunsystems ist derzeit in den Vordergrund der Tumorforschung gerückt – die Immun-Checkpoint-Inhibition, die durch co-inhibitorische Rezeptoren vermittelt wird. Dabei werden Effektor-T-Zellen unterdrückt
und die T-Zellen verlieren mit der Zeit sogar ihre cytotoxische Aktivität zur Bekämpfung von Tumorzellen. Dieser Zustand wird als T-Zell-Erschöpfung bezeichnet.
2.2.1 T-Zell-Erschöpfung im Zusammenhang chronischer viraler Erkrankungen
Die funktionelle Erschöpfung von T-Zellen wurde ursprünglich bei chronischen viralen Infektionen beobachtet, darunter Infektionen mit dem Lymphozytären-Choriomeningitis- Virus (LCMV) (Moskophidis et al., 1993; Ahmed et al., 1984; Wherry et al., 2003). So gibt es beim LCMV verschiedene virale Varianten, die entweder eine akute Infektion (mit dem LCMV Stamm Armstrong 53b) oder eine chronische Infektion (mit dem LCMV Stamm Klon13) auslösen, die mit viraler Persistenz und mit graduellem Verlust der Funktionalität der spezifischen T-Zellen einhergeht (Salvato et al., 1991). Als Ursache für die Persistenz des chronischen LCMV wurden Mutationen in seinem Genom ausgemacht, die einen verstärkten Tropismus gegenüber Makrophagen, sowie eine vermehrte virale Replikation in diesen phagozytierenden Zellen bewirkten (Matloubian et al., 1993). Während der chronischen Infektion mit LCMV wird vor allem von dendritischen Zellen das immunsuppressive IL-10 freigesetzt, was neben verringerten spezifischen CD4 und CD8 T-Zell-Immunantworten auch die Persistenz des Virus zur Folge hat. Demzufolge ist die Grundlagenforschung bei der Aufklärung diverser Mechanismen im Zusammenhang mit der chronischen LCMV-Infektion und der damit verbundenen Erschöpfung der T-Zellen bedeutend vorangeschritten. Bei der Erschöpfung von T-Zellen sind mehrere co-inhibitorische Rezeptoren involviert, deren immunsuppressive Wirkung in verschiedenen Modellen untersucht wird. Zu den co-inhibitorischen Rezeptoren zählen das Oberflächenmolekül PD-1 (Programmed cell death 1, auch bekannt als CD279), CTLA-4 (cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4, CD152) und TIM-3 (T-cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3, CD366). Ebenfalls sind LAG-3 (Lymphocyte activation gene 3, CD223), 2B4 (CD244) sowie CD160 involviert (Nirschl and Drake, 2013). Diese co-inhibitorischen Rezeptoren regulieren die T-Zell-Immunantwort jedoch auf verschiedene Weise. So unterscheiden sich zum Beispiel die Wirkmechanismen von CTLA-4 und PD-1 (Parry et al., 2005). CTLA-4 und PD-1 können somit auch in Synergie agieren, wodurch sie zusammen die Aktivierung des PI3K/AKT-Signalwegs unterbinden, der notwendig für die T-Zell-Aktivierung und deren IL-2- und Interferon-gamma (IFNγ)-Produktion ist (Sasaki et al., 2000; Kane et al., 2001).
Die Inhibition der T-Zellen tritt aber auch bei Patienten auf, die eine chronische Infektion durch das humane Immundefizienz-Virus (HIV) oder das Hepatitis-C-Virus (HCV)
aufweisen (Shankar et al., 2000; Wedemeyer et al., 2002). Bei viraler Persistenz wird auf der Oberfläche von spezifischen CD8 T-Zellen vermehrt das co-inhibitorische Molekül PD-1 exprimiert, was mit dem Verlust von T-Zell-Funktionen und dem Voranschreiten der Erkrankung in Verbindung steht (Urbani et al., 2006; Day et al., 2006). Das Molekül PD-1 wurde ursprünglich im Zusammenhang mit programmiertem Zelltod beschrieben (Ishida et al., 1992). Es wird nach Aktivierung auf der Oberfläche von T-Zellen exprimiert und interagiert mit seinen Liganden PD-L1 (CD274, B7 Homolog 1 (B7-H1)) und PD-L2 (CD273, B7-DC), um eine inhibierende Wirkung auf die T-Zellen auszuüben (Freeman et al., 2000; Latchman et al., 2001). Zudem wurde bei Infektionen mit HIV bzw. HCV auf den HIV- bzw. HCV-spezifischen CD8 T-Zellen eine Hochregulation von LAG-3 beobachtet (Tian et al., 2015; Chen et al., 2015). In diesen Untersuchungen wurde ebenfalls eine reduzierte Funktionalität der jeweiligen spezifischen CD8 T-Zellen festgestellt. Weiterhin ist erhöhte Frequenz von TIM-3 positiven sowie von PD-1 und TIM-3 doppelt-positiven T-Zellen ebenfalls einhergehend mit dem Fortschreiten der Erkrankung (Jones et al., 2008; Vali et al., 2010). Die Literatur verweist somit darauf, dass die T-Zell-Immunantwort wesentlich durch co-inhibitorische Rezeptoren reguliert wird, die auf der Oberfläche der T-Zellen exprimiert werden.
2.2.2 Beitrag der Tumormikroumgebung zur Immunregulation
Es hat sich gezeigt, dass die Expression von MHC-Molekülen und anderer Moleküle der Antigenprozessierungsmaschinerie bei Melanom- und Lungen-Tumoren oft vermindert oder mutiert ist, um die Präsentation möglicher Antigene zu minimieren (Johnsen et al., 1998;
Kikuchi et al., 2007; Tao et al., 2008). Dies stellt für die T-Zellen eine Limitation dar, weil sie dadurch statistisch weniger Peptid:MHC-Komplexe erkennen können. Trotzdem ist der komplette Verlust der MHC-Expression ein sehr selten auftretendes Ereignis (Giorda et al., 2003). Bei Melanom-Tumoren ist der Verlust der MHC-Expression mit dem Fortschreiten der Krankheit und einer verringerten Überlebensdauer assoziiert (Kageshita et al., 1999). Dabei korreliert die Infiltration der Melanom-Tumoren durch T-Zellen sehr stark mit der Expression von MHC-Molekülen (Al-Batran et al., 2005). Verschiedene Studien haben gezeigt, dass auch hepatozelluläre Tumore MHC-Moleküle variabel exprimieren können (Kurokohchi et al., 1996; Deng et al., 2003). Die Tumorzellen sind jedoch nicht alleine für die Unterdrückung der adaptiven T-Zell-Antwort verantwortlich. In der Tumorumgebung werden häufig immunsuppressive Zellen gefunden, zu denen myeloide Suppressorzellen (MDSCs, myeloid-
derived suppressor cells) gehören (Gabrilovich et al., 2012; Wan et al., 2015). Dabei handelt es sich um eine heterogene Population von Zellen, die sich morphologisch, phänotypisch und in der Stärke ihrer suppressiven Funktionen unterscheiden (Yang et al., 2006a; Dolcetti et al., 2010; Peranzoni et al., 2010). Oft werden diese Zellen durch die Expression von CD11b und Gr-1 (bei der Maus) bzw. CD33 und CD14 (beim Menschen) beschrieben (Gabrilovich et al., 2012). Die Mechanismen, mit deren Hilfe die MDSCs suppressiv wirken, sind relativ vielfältig. Häufig wird dabei die erhöhte Produktion von Arginase durch MDSCs beschrieben, einem Enzym, welches den Abbau von L-Arginin katalysiert und zudem die Expression der ζ-Kette (CD3-Zetta-Kette) des T-Zell-Rezeptors verringert und so die Immunantwort durch T-Zellen inhibieren kann (Rodriguez et al., 2004; Zea et al., 2005). Dabei ist von Bedeutung, dass die Verfügbarkeit von L-Arginin wichtig für die Proliferation von T-Zellen und ihre antitumorale Aktivität ist (Zea et al., 2004; Rodriguez et al., 2007; Geiger et al., 2016).
Weiterhin wird im peritumoralen Stroma von HCC-Patienten von tumorassoziierten Makrophagen und durch den Tumor aktivierten Monozyten der Ligand PD-L1 exprimiert (Kuang et al., 2009). Dabei kommt es bei zur Inhibition der Proliferationsfähigkeit von T-Zellen, sowie ihrer Perforin- und IFNγ-Produktion. Darüber hinaus korreliert die Expression von PD-L1 mit erhöhter Mortalität und verringertem Überleben von Patienten mit Leberkrebs.
Ein weiterer Aspekt der Tumormikroumgebung beim HCC und anderen Tumorentitäten ist die Hypoxie, d.h. eine Sauerstoffunterversorgung in der Umgebung, die wachstumsstimulierend auf Hepatomzellen wirkt (Gwak et al., 2005). Die Hypoxie bewirkt eine Aktivierung des Transkriptionsfaktors HIF-1α (Hypoxie-induzierter Faktor-1 alpha), der eine große Vielzahl an Genen zu regulieren vermag, und vorwiegend bei der Geweberegeneration beteiligt ist (Botusan et al., 2008; Wan et al., 2008; Weidemann and Johnson, 2008). Aufgrund der hypoxischen Bedingungen kommt es in der Umgebung des Tumors zu diversen Veränderungen. Zum einen begünstigt es die Proliferation von Tumorzellen und die Metastasierung des Tumors, zum anderen bewirkt es auch eine vermehrte Angiogenese, die einer besseren Nährstoffversorgung des Tumors förderlich ist (Li et al., 2011; Tian et al., 2014). Darüber hinaus scheint sich die Hypoxie in der Tumormikroumgebung unterstützend auf die Entwicklung von Resistenzen gegen Chemotherapie und auf die Unterdrückung von Apoptose bei HCC-Zellen auszuwirken (Wu et al., 2007). Durch die Hypoxie werden also diverse aggressive Eigenschaften des Tumors begünstigt.
Ein weiterer Einfluss der Hypoxie zeigt sich in der Rekrutierung von regulatorischen T-Zellen. Die regulatorischen T-Zellen (Tregs) werden als CD4+ CD25+ FoxP3+ T-Zellen beschrieben (Ramsdell, 2003). Das FoxP3 (Forkhead-Box P3) ist ein Transkriptionsfaktor der spezifisch bei regulatorischen T-Zellen exprimiert wird und von dem ihre Entwicklung und immunsuppressiven Eigenschaften abhängen (Khattri et al., 2003; Fontenot et al., 2003). Da die Abwesenheit von funktionellem FoxP3 zur Autoimmunität beiträgt, haben Tregs im Immunsystem eine tragende Rolle bei der Steuerung von T-Zell-Immunantworten (Wildin et al., 2001; Brunkow et al., 2001). Während hypoxischer Bedingungen wird mittels vom Tumor produziertem Chemokin CCL28 (CC-Chemokin-Ligand 28), das über den zugehörigen Rezeptor CCR10 auf der Oberfläche von Tregs bindet, die Chemotaxis dieser Toleranz- fördernden Zellen induziert (Facciabene et al., 2011). Die Tregs wiederum fördern durch Sekretion von VEGF-A (Vascular endothelial growth factor A) die Angiogenese und unterstützen auf diese Weise das Tumor-Wachstum. Dies ist besonders klinisch relevant, weil die Erhöhung der regulatorischen T-Zellen im Blut von HCC-Patienten mit einem Voranschreiten der Erkrankung, erhöhter Mortalität und verringerter Überlebensdauer korreliert. Dabei führt die Anreicherung dieser Zellen in den tumorinfiltrierenden Lymphozyten zur Inhibition der CD8 T-Zellen, indem ihre Aktivierung, Proliferation, sowie Degranulation und die Cytokin-, Granzym- und Perforin-Produktion reduziert werden (Fu et al., 2007). Das Verhältnis von Tregs und cytotoxischen CD8 T-Zellen spielt besonders in der Tumorrandzone eine Rolle, wo sie die Proliferation der CD8 T-Zellen inhibieren (Yang et al., 2006b). Ebenso ist das intratumorale Gleichgewicht von CD8 T-Zellen und Tregs zu einem wichtigen prognostischen Überlebensfaktor nach der Resektion des HCC-Tumors geworden (Gao et al., 2007). Dabei wurde belegt, dass je höher der Anteil aktivierter CD8 T-Zellen im Tumor im Verhältnis zu aktivierten Tregs ist, desto länger ist das rezidivfreie Überleben und desto länger ist das allgemeine Überleben. Insgesamt zeigt sich, dass die Tregs eine bedeutsame Rolle bei der Immunsuppression tumorspezifischer T-Zellen haben.
2.2.3 T-Zell-Erschöpfung bei Tumorerkrankungen
In Patienten mit malignen Tumorerkrankungen kommt ebenfalls es zu einer vermehrten Hochregulation von co-inhibitorischen Rezeptoren auf der Oberfläche von T-Zellen, was mit der T-Zell-Erschöpfung in Verbindung steht (Baitsch et al., 2011). Mittels dieser co-inhibitorischer Rezeptoren, aber auch durch andere Mechanismen, wird bei den Zellen des Immunsystems von Tumorpatienten eine Immunsuppression hervorgerufen. Im Folgenden
sind einige der Mechanismen aufgeführt, durch welche der Tumor direkt oder indirekt eine Inhibition von T-Zellen erreicht, was in der funktionellen Erschöpfung von T-Zellen mündet.
So können die CD8 T-Zellen von Melanom-Patienten, die spezifisch gegen tumorassoziierte Antigene sind, weniger Cytokine produzieren (Fourcade et al., 2010). Wie bei den virusspezifischen CD8 T-Zellen in Fällen chronischer viraler Infektion werden auch auf tumorspezifischen CD8 T-Zellen mehrere co-inhibitorische Rezeptoren hochreguliert, was auf Erschöpfung der T-Zellen hindeutet (Baitsch et al., 2011). Einer der prominentesten Wege für den Tumor, um der Immunabwehr auszuweichen, ist die Expression von PD-L1 (Wang et al., 2011). Die Interaktion von PD-1 und PD-L1, dient eigentlich der peripheren Toleranz und soll Autoimmunität verhindern, indem es die T-Zell-Rezeptor-vermittelte Proliferation von T-Zellen und ihre Cytokinproduktion inhibiert (Freeman et al., 2000; Ansari et al., 2003; Keir et al., 2006). Die PD-1/PD-L1-Interaktion wird vom Tumor ausgenutzt und kann bei tumorspezifischen T-Zellen Apoptose auslösen (Dong et al., 2002). Dieser Regulationsweg hat bei Tumorpatienten eindeutige Konsequenzen. Die vermehrte Expression von PD-1 auf CD8 T-Zellen, die im Blut von HCC-Patienten zirkulieren und die den Tumor infiltrieren, wird mit Voranschreiten der Erkrankung in Verbindung gebracht (Shi et al., 2011). Zudem haben Patienten mit einer geringeren Expression von PD-L1 und PD-L2 in HCC- Lebertumoren ein längeres Überleben ohne Wiederauftreten der Erkrankung und auch ein verlängertes Gesamtüberleben (Gao et al., 2009). Außer PD-1 gibt es noch weitere co-inhibitorische Rezeptoren, deren Anwesenheit und Bindung an die entsprechenden Liganden sich immunregulatorisch auf die T-Zellen auswirkt. Zu den wesentlichen Aspekten der regulatorischen T-Zellen gehört auch die Expression von CTLA-4 und die Sekretion von TGF-β, wobei CTLA-4 sich negativ auf die Aktivierung cytotoxischer T-Zellen auswirkt und das Cytokin TGF-β immunsuppressiv wirkt (Read et al., 2000). CTLA-4 kann mit einer höheren Affinität an die Moleküle CD80 und CD86 binden, die auf der Oberfläche der antigenpräsentierenden Zellen exprimiert werden, zu denen DCs und Makrophagen gehören (Krummel and Allison, 1995; Walunas et al., 1996; Sperling et al., 1996; Sharpe, 2009).
Dabei wird die Interaktion der Liganden CD80/CD86 mit dem eigentlichen Rezeptor CD28 auf der Oberfläche von T-Zellen unterbunden. Bei diesem Vorgang der Reduktion von CD80/CD86 auf den APCs mittels CTLA-4 handelt es sich um den Mechanismus der Transendozytose (Oderup et al., 2006; Qureshi et al., 2011). Dabei werden durch die CTLA-4-Interaktion die CD80/CD86-Liganden von der Oberfläche der APCs eingefangen und entfernt. Zudem wirkt sich die CTLA-4-Expression auf den T-Zellen selbst ebenfalls inhibierend auf ihre Aktivierung aus, wobei CTLA-4 auch auf der T-Zell-Oberfläche mit der
CD28-vermittelten Co-Stimulation interferiert (Walunas et al., 1994; Carreno et al., 2000;
Engelhardt et al., 2006). Die CD28-Moleküle vermitteln den T-Zellen bei der Interaktion mit CD80/CD86 ein starkes co-stimulatorisches Aktivierungssignal, das auch Anergie bei T-Zellen verhindert (Harding et al., 1992). Die Tregs haben somit einen wesentlichen Einfluss auf die entstehende Immunantwort und können auch generell die Expression von CD80/CD86 auf den antigenpräsentierenden Zellen reduzieren (Cederbom et al., 2000). Die Immunregulation über den Rezeptor TIM-3 gilt als ein weiterer Mechanismus zur Verhinderung von Autoimmunität, wobei TIM-3 an Galectin 9, als seinen Liganden, bindet (Monney et al., 2002; Zhu et al., 2005). Vergleichbar mit der Induktion der Expression von PD-L1 durch IFNγ auf der Oberfläche von Hepatomzellen, kann auch eine Expression von Galectin 9 durch IFNγ angeregt werden (Asakura et al., 2002). Die Hochregulation von Galectin 9 kann durch die Wirkung von IFNγ auch auf den MDSCs induziert werden.
Demzufolge interferieren die MDSCs auch über die Galectin 9/TIM-3-Interaktion mit der T-Zell-Immunantwort (Dardalhon et al., 2010; Sakuishi et al., 2011). Diese Interaktion hat gravierende Folgen für die Immunantwort. So kann Galectin 9 die TIM-3-abhängige Unterdrückung der IFNγ-Produktion bei Th1-Helferzellen induzieren, wie auch Apoptose bei aktivierten CD4 und CD8 T-Zellen auslösen (Zhu et al., 2005; Kashio et al., 2003). Wie schon bei der Interaktion von PD-1/PD-L1, nutzen Tumorzellen die Bindung von TIM-3/Galectin 9 aus, um Immunantworten zu unterdrücken. So zeigte sich im murinen Tumormodell, dass die Sekretion von Galectin 9 durch Tumorzellen die Apoptose von tumorinfiltrierenden CD8 T-Zellen über deren hohe Expression von TIM-3 induzieren kann (Kang et al., 2015).
2.2.4 Checkpoint-Blockade als Immuntherapie
Verschiedene klinische Studien zeigen, dass die vermehrte Expression von PD-1 auf tumorinfiltrierenden Lymphozyten bei verschiedenen Krebs-Arten, wie zum Beispiel HCC, Brustkrebs und Nierenkrebs, als ein negativer Prognose-Faktor gilt (Shi et al., 2011; Muenst et al., 2013; Thompson et al., 2007). Das Vorhandensein von PD-1 auf T-Zellen im Tumorgewebe, wie auch seines Liganden PD-L1 auf den Tumorzellen, gilt dennoch als ein entscheidendes Kriterium für ein Ansprechen durch die gegenwärtig in der Klinik getesteten monoklonalen Checkpoint-Inhibitoren (Topalian et al., 2012; Taube et al., 2014; Tumeh et al., 2014). Es zeigte sich, dass die Ansprechraten bei der Checkpoint-Blockade schwanken können. So beträgt sie durch den Einsatz von Pembrolizumab (anti-PD-1 monoklonaler
Antikörper) beim fortgeschrittenem Melanom 33% (Ribas et al., 2016). Nach Aufschlüsselung der Studienergebnisse zeigte sich, dass die Mutationslast des Tumors eine wesentliche Voraussetzung für das Ansprechen darstellt. Dabei hatten die Patienten von der Behandlung mit anti-CTLA-4-Antikörpern profitiert, bei denen die Tumoren eine höhere Anzahl an somatischen Mutationen aufwiesen. Diese Mutationen können Neoepitope darstellen, die nach erfolgreicher Unterbrechung der T-Zell-Inhibition durch blockierende Antikörper wieder von den T-Zellen erkannt werden (Snyder et al., 2014). Beim nicht-kleinzelligen Lungenkarzinom (SCLC, small cell lung cancer) war die Ansprechrate auf Pembrolizumab sogar 44,8% und war somit wirksamer als die konventionelle Chemotherapie, die eine Ansprechrate von 27,8% aufwies (Reck et al., 2016). Ein entscheidender Beitrag zum Erfolg dieser klinischen Studie war die Vorauswahl der Lungenkrebspatienten basierend auf der PD-L1-Expression, wobei mindestens 50% der Tumorzellen PD-L1 exprimieren sollten.
Das Melanom und der Lungen-Krebs gehören zu den Tumor-Arten mit der höchsten Anzahl an Mutationen, dagegen weist das Hepatozelluläre Karzinom eine deutlich niedrigere Mutationslast auf (Alexandrov et al., 2013). In einer neuen klinische Studie zur Behandlung von HCC konnte durch den Einsatz von Nivolumab (anti-PD-1 monoklonaler Antikörper) eine Ansprechrate von 20% erzielt werden (El-Khoueiry et al., 2017). Für diese Studie wurden die Patienten nicht basierend auf der Expression von PD-L1 ausgewählt, und in einer retrospektiven Analyse der Tumorproben bezüglich der Expression von PD-L1 zeigte sich keine Assoziation zwischen PD-L1-Expression und der Ansprechrate auf PD-1-Blockade. Es sollte auch nicht unterschätzt werden, dass bestimmte Mutationen im Tumor diesen auch für die Checkpoint-Inhibition von Anfang an unempfänglich machen können (Hugo et al., 2016).
Alternativ kommt es auch zur Resistenzentwicklung gegen die PD-1-Blockade bzw.
CTLA-4-Blockade, die durch Genmutationen in den Tumorzellen und die fortwährende Immuneditierung durch das Immunsystem vermittelt wird (Zaretsky et al., 2016; Gao et al., 2016). Somit sind der klinischen Effizienz durch die Checkpoint-Inhibition Grenzen gesetzt.
Obwohl es Untersuchungen zur Aufklärung der molekularen Veränderungen in erschöpften T-Zellen gab, darunter auch zu Veränderungen im T-Zell-Metabolismus, waren es Studien zur chronischen viralen Erkrankungen, die durch LCMV ausgelöst wurden (Wherry et al., 2007;
Doering et al., 2012; Bengsch et al., 2016). Um der vielfältigen Arten der Unterdrückung von CD8 T-Zellen durch den Tumor und sein Mikromilieu auf molekularer Ebene zu verstehen, die in T-Zell-Erschöpfung resultieren, sind weitere Untersuchungen notwendig.
Epidemiologie von Lebertumorerkrankungen 2.3
Das hepatozelluläre Karzinom (HCC, hepatocellular carcinoma) ist die fünfthäufigste Tumorart und die zweithäufigste krebsbedingte Todesursache beim Menschen. Im Jahr 2012 hat es geschätzte 782500 neue Leberkrebserkrankungen und 745500 Todesfälle durch Leberkrebs gegeben, wobei die chinesische Bevölkerung allein jeweils 50% der Neuerkrankungen und Leberkrebstodesfälle ausmacht (Torre et al., 2015). Die Prognose von Leberkrebs ist selbst in Ländern mit sehr guter medizinischer Versorgung schlecht: in den Vereinigten Staaten von Amerika belief sich das 1-jährige Überleben auf 50% und das 5-jährige Überleben auf etwa 10% (Altekruse et al., 2009). Verschiedene Faktoren stellen Risikofaktoren dar, die zur Entstehung von Leberkrebs führen können. Dazu gehören Pilztoxine (Aflatoxine der Pilze Aspergillus flavus und Aspergillus parasiticus), die Lebensmittel kontaminieren (Chen et al., 1996; Wu et al., 2009). Ebenso kann der Befall der Leber durch parasitäre Würmer (Opistorchis viverrini und Clonorchis sinensis) zur Karzinogenese in der Leber führen (Srivatanakul et al., 1991; Shin et al., 1996). Ebenfalls kann Alkoholmissbrauch zur Zirrhose der Leber führen und stellt einen wesentlichen Anteil an der Entstehung von Leberkrebs dar (Donato et al., 2002; Fattovich et al., 2004). Eine falsche Ernährung kann langfristig ebenso zur Hepatokarzinogenese führen. Hierbei ist die andauernde Aufnahme energiereicher Nahrung und Fettleibigkeit zu erwähnen, die zur Entwicklung von nicht-alkoholischer Fettlebererkrankung (NAFLD, non-alcoholic fatty liver disease) führen kann. Als Folge davon kommt es zur Anreicherung von Fett in der Leber, was auch eine schwerere Erkrankungsform von NAFLD, die nicht-alkoholische Steatohepatitis (NASH, non-alcoholic steatohepatitis) hervorrufen kann (Powell et al., 1990; Starley et al., 2010). Die Ausbildung von NASH kann eine Leberzirrhose auslösen und diese kann letztlich die Entstehung von HCC verursachen (Bugianesi et al., 2002; Marrero et al., 2002). Es gibt zudem auch klinische Fälle, die belegen, dass das Hepatozelluläre Karzinom durchaus unabhängig von Zirrhose entstehen kann (Kawada et al., 2009; Ertle et al., 2011; Torres and Harrison, 2012). Ein hoher Teil der HCC-Fälle (78%) wird chronischen Infektionen durch das Hepatitis B Virus (HBV) (53%) oder das Hepatitis C Virus (HCV) (25%) zugeschrieben.
Ebenso ist die Mehrheit der Fälle von Leberzirrhose (57%) mit diesen viralen Infektionen assoziiert (HBV mit 30%, HCV mit 27%) (Perz et al., 2006). Angesichts der vielfältigen Ätiologie des Leberkrebs gibt es entweder präventive Maßnahmen, z.B. in Form von Impfstoffen (HBV), oder die generelle Vorbeugung gegen damit verbundene Risiken durch Alkohol oder Fettleibigkeit. Im frühen Krankheitszustand existieren verschiedene
chirurgische und therapeutische Maßnahmen, dazu gehört die Leberresektion oder -transplantation, sowie die Chemotherapie und verschiedene Formen der Tumorablation (Forner et al., 2012). Beim fortgeschrittenem Hepatozellulären Karzinom gibt es aber gegenwärtig in der Klinik nur den Multikinase-Inhibitor Sorafenib, der einen mittleren Überlebensvorteil von etwa drei Monaten gegenüber dem Placebo zeigte (Llovet et al., 2008;
Sanoff et al., 2016). Somit besteht ein dringender Bedarf an therapeutischen Optionen für die Behandlung von fortgeschrittenem HCC.
Murine Lebertumormodelle 2.4
Es gibt in der Grundlagenforschung verschiedene Mausmodelle, die eingesetzt werden, um therapeutische Ansätze und Vakzine gegen Lebertumore zu entwickeln und zu evaluieren.
Jedes dieser Mausmodelle ist auf bestimmte wissenschaftliche Fragestellungen zugeschnitten.
So gibt es die Karzinogen-induzierte Lebertumorbildung, wobei den Mäusen beispielsweise das krebserzeugende Diethylnitrosamin (DEN) verabreicht wird. Dadurch mutieren Hepatozyten der Leber, wodurch eine heterogene Population an Tumorzellen entsteht, deren Oberflächen-präsentierte Antigene jedoch dem Zufall unterliegen. Ganz ähnlich verhält es sich mit den metabolischen Modellen, bei denen Mäusen energiereiche Ernährung (high-fat diet) vorgesetzt wird und dadurch nach mehreren Monaten Tumoren in der Leber entstehen.
Außer den transgenen Mausmodellen mit konstitutiver und induzierbarer Onkogenexpression, gibt es auch die CRISPR-Cas9-Modelle, mit derer Hilfe eine generelle Überexpression von Onkogenen, bzw. eine gewebespezifische oder zellspezifische Karzinogenese induziert werden kann. Ein wesentlicher Nachteil dieser Modelle ist die langwierige Generierung der entsprechenden genmodifizierten Mäuse, wodurch viele Mäuse zusätzlich zu den eigentlichen Experimenten benötigt werden. Die Verpflanzung von humanen Tumorzellen auf Empfängermäuse ist ein weiteres Modell (xenograft model). Dabei werden jedoch immundefiziente Mäuse eingesetzt, wodurch es nicht zur authentischen Interaktion von Tumorzellen und dem Immunsystem kommt. Alternativ können auch syngene murine Hepatomzellen subkutan in die Flanke von Inzuchtmäusen injiziert werden. Dadurch käme es nicht zu einer spontanen Abstoßung von fremden Zellen (graft-versus-host disease, GvHD) und es wäre ebenfalls möglich die antitumorale Immunantwort zu studieren. Durch die oberflächennahe Lokalisation dieser subkutanen Tumore, ist ihre Vermessung durchführbar, womit beispielsweise die Wirksamkeit von Vakzinen oder Immuntherapeutika direkt evaluiert werden kann. Ein Nachteil ist hingegen, dass die Tumoren nicht im entsprechenden Organ
lokalisiert sind (ektopisch) und die Nährstoffversorgung und Blutzufuhr zum Tumor nicht der Vaskularisation der Leber entspricht. Die Interaktion mit dem Immunsystem findet dadurch nicht in der Leber statt und reflektiert nicht die Tumorentstehung beim Menschen. Eine Alternative dazu stellt das orthotope Lebertumormodell dar, bei dem Tumorzellen in die Leber injiziert werden. Zwar ist damit der Tumor im entsprechenden Organ lokalisiert, doch es findet keine Transformation von Körperzellen zu Tumorzellen statt.
Verwendung des Transposon-Systems für das orthotope 2.5
Lebertumormodell
Aktuell wird in der Lebertumorforschung sehr häufig das Transposon-System als Modell verwendet (Chen and Calvisi, 2014). Dessen großer Vorteil ist die flexibel austauschbare Genkassette, mit derer Hilfe eine stabile Integration und Expression von Transgenen direkt in der Leber erreicht wird. Hierbei handelt es sich genau genommen um ein autochtones Lebertumormodell, das oft als ein orthotopes Lebertumormodell bezeichnet wird. Im Gegensatz zum konventionellen orthotopen Modell, bei dem Tumorzellen in die Leber verpflanzt werden, um einen Lebertumor zu generieren, entstehen beim autochtonen Modell die Tumoren direkt aus den Leberhepatozyten. In dem autochtonen Lebertumormodell liegt sowohl die organspezifische Mikroumgebung, als auch die native Vaskularisation des Organs vor. Damit handelt es sich also um ein klinisch relevantes Lebertumormodell, das nicht nur Flexibilität bei der Antigenauswahl ermöglicht, sondern bei dem auch ein intaktes Immunsystem zur Verfügung steht.
Das Transposon-System wird für die stabile Integration von Transgenen eingesetzt. Es wurde bereits in vitro bei eukaryotischen Zellen und auch bei der Mutagenese von Keimbahnzellen für die Generierung von transgenen Mäusen erfolgreich eingesetzt (Izsvak et al., 2000; Horie et al., 2001). Die Verwendung des Transposon-Systems in vivo hat demonstriert, dass eine stabile Expression von Transgenen auch in Organen möglich ist. Bei der Untersuchung von Leberkrebs wird das Transposon-System in Verbindung mit der Hydrodynamischen Schwanzveneninjektion (HDI) eingesetzt (Fan et al., 2012; Ho et al., 2012). Die hydrodynamische Schwanzveneninjektion wird benutzt, um eine Transfektion der Hepatozyten zu erreichen (Liu et al., 1999; Zhang et al., 1999). Eine innovative Neuentwicklung stellt das in vivo-Elektroporationsmodell dar, mit dessen Gebrauch ein unilokulärer Tumor erzeugt werden kann, wobei sich auch die Anwendbarkeit des Transposon-Systems auf eine Vielzahl von Organen ausweitet (Gurlevik et al., 2013;
Gurlevik et al., 2016). Zur stabilen Integration der im Transposon klonierten Gene wird die Sleeping Beauty (SB) Transposase verwendet, die aus der Tc1/mariner Überfamilie der transposablen Elemente mit Hilfe der Gentechnologie aus Lachsfischen (Salmonidae) rekonstruiert wurde (Ivics et al., 1997). Die Sleeping Beauty Transposase kann am Transposon invertierte Sequenzwiederholungen (inverted terminal repeats, IR) und die darin enthaltenen direkten Sequenzwiederholungen (direct repeats, DR) erkennen, welche als Bindungsstellen für die Transposase dienen. Die Transposase schneidet das Transposon aus dem Transfer-Plasmid, und integriert das Transposon zwischen ein TA-Dinukleotid (Luo et al., 1998; Liu et al., 2004; Vigdal et al., 2002). Dabei erfolgt die Integration ins Genom bevorzugt in wiederholende Mikrosatellit-DNA-Abschnitte, die in nicht-codierenden Bereichen der DNA liegen (Yant et al., 2005).
In der Leber von Menschen werden einige Signalwege bei der Karzinogenese dereguliert, zu denen der Ras-Signalweg gehört (Calvisi et al., 2006). Seit seiner Entdeckung in humanen Tumorzellen ist das Onkogen Ras zu einem wichtigen Teil der Tumorforschung geworden (Santos et al., 1982; Der et al., 1982; Parada et al., 1982). Die Aktivierung von Ras wird unter anderem durch eine missense Mutation in Codon 12 ausgelöst – also durch eine nicht- synonyme Mutation, die für eine andere Aminosäure codiert (Taparowsky et al., 1982; Reddy et al., 1982; Tabin et al., 1982). Ras Proteine gehören zur Familie der kleinen GTPasen (Guanosintriphosphat (GTP)), die als molekulare Schalter bei Signaltransduktionswegen wirken, zu denen der Ras-Raf-MEK-ERK-Signalweg gehört, über den Zellwachstum, Überleben und Migration von Zellen reguliert werden (Schubbert et al., 2007). Zwar ist die Mutationshäufigkeit von Ras beim humanen HCC relativ selten, dennoch kommt es zu einer generellen Aktivierung des Ras-Signalwegs beim HCC (Challen et al., 1992; Calvisi et al., 2006). Eine Expression von aktiviertem NRas (N steht dabei für Neuroblastoma) in der Leber von Wildtyp-Mäusen führt alleine jedoch nicht zur Tumorentstehung, sondern bewirkt in den Hepatozyten zelluläre Seneszenz, wobei die entstandenen prämalignen Hepatozyten von infiltrierenden Immunzellen eradiziert werden (Kang et al., 2011). Es sind mehrere Mutationsereignisse notwendig, um in Zellen Karzinogenese auszulösen. So kann beispielsweise Darmkrebs als Abfolge von aktivierenden Mutationen in Protoonkogenen und inaktivierenden Mutation in Tumorsuppressorgenen entstehen (Vogelstein et al., 1988;
Fearon and Vogelstein, 1990). Ein aktiviertes Onkogen bewirkt bei einer Zelle keine maligne Transformation, wenn jedoch in derselben Zelle auch ein Tumorsuppressorgen durch Mutation inaktiviert wird, kann sie zur Tumorzelle entarten. Ein bekanntes Bespiel für ein Tumorsuppressorgen ist TP53, das bei der Karzinogenese häufig mutiert ist, darunter auch bei
Leberkrebs (Hollstein et al., 1991; Hsu et al., 1991). Es codiert für das Tumorsuppressorprotein p53 und kann im Fall von Beschädigungen der DNA in den betroffenen Zellen Seneszenz und Apoptose induzieren, um mutationsbedingte maligne Zellentwicklung zu verhindern (Lowe et al., 1993; Clarke et al., 1993; Schmitt et al., 2002).
Ein weiteres Protoonkogen ist AKT, welches in verschiedene Zellprozesse involviert ist, zu denen Apoptose, Zellwachstum, Glucosemetabolismus, Lipidstoffwechsel und Zellüberleben gehören (Datta et al., 1997; Datta et al., 1999; Krycer et al., 2010). Die Überexpression von AKT kann ebenfalls eine Transformation zu Tumorzellen herbeiführen (Aoki et al., 1998).
Bei humanen HCCs gilt die Phosphorylierung von AKT als wichtiger Faktor, der zur Aggressivität des Tumors beiträgt, und ist auch bei HCC-Patienten mit einer schlechteren Prognose assoziiert (Nakanishi et al., 2005). Damit das Protoonkogen AKT im Maustumormodell in einem versuchszeitlichen Rahmen zur Karzinogense beiträgt, wird es myristoyliert (Orsulic et al., 2002). Die Fusionierung einer Myristoylierungssequenz an den N-Terminus an AKT1 erzeugt, verglichen mit der Wildtyp-Variante, eine 10-fach aktivere Form des Enzyms (Kotani et al., 1999). Durch die Myristoylierung wird AKT1 in die Nähe der Membran und der Phosphoinositid-3-Kinase (PI3K) gebracht, die AKT1 phosphoryliert und aktiviert (Peitzsch and McLaughlin, 1993; Farazi et al., 2001; Franke et al., 1997).
Zielsetzung der vorliegenden Arbeit 2.6
Da die cytotoxischen T-Zellen durch co-inhibitorische Regulationsmechanismen in der Tumormikroumgebung an der Ausübung ihrer Effektorfunktionen beträchtlich behindert werden, stellt der Einsatz blockierender Antikörper gegen Immun-Checkpoint-Moleküle eine aussichtsreiche Neuentwicklung in der Immuntherapie dar. Es besteht dennoch ein dringender Bedarf zur Verbesserung der therapeutischen Wirksamkeit und zur Verhinderung der Resistenzentwicklung bei den Tumorzellen. Um ein besseres Verständnis der molekularen Veränderungen bei dysfunktionalen, tumorspezifischen CD8 T-Zellen zu erhalten, ist es notwendig die molekularen Ursachen für die T-Zell-Erschöpfung weiter aufzuschlüsseln. Zur Untersuchung der spezifischen CD8 T-Zell-Immunantworten gegen solide Tumoren sollte zunächst in immunkompetenten Mäusen ein orthotopes Lebertumormodell unter Verwendung des Modellantigens Ovalbumin etabliert werden. Das Wachstum der orthotopen Lebertumoren sollte mittels Biolumineszenzmessungen in vivo visualisiert und durch histologische Untersuchungen abgesichert werden. Zudem sollte die Frequenz der tumorspezifischen CD8 T-Zellen in verschiedenen Geweben bestimmt werden, um ihre Migration zu den tumortragenden Lebern zu untersuchen. Da die co-inhibitorischen Rezeptoren essentiell für das Entstehen der T-Zell-Erschöpfung sind, sollte eine detaillierte Phänotypisierung der tumorspezifischen CD8 T-Zellen erfolgen. Die Ausprägung der funktionellen Erschöpfung hinsichtlich fehlender Cytokinproduktion sollte charakterisiert werden. Um die molekularen Veränderungen auf transkriptioneller Ebene zu untersuchen, sollten die erschöpften tumorspezifischen CD8 T-Zellen aus dem Tumor isoliert und ihre gesamte RNA mit Hilfe eines transkriptomweiten Microarrays analysiert werden. Dabei sollten die transkriptionellen Unterschiede zwischen funktionellen T-Zellen und den erschöpften T-Zellen untersucht werden und zur Identifikation neuer Zielmoleküle für die Steigerung der Wirksamkeit von Immuntherapie führen. Anschließend sollten ausgewählte transkriptionelle Unterschiede in tumortragenden Mäusen in vivo validiert werden. Ebenfalls sollte der zeitliche Verlauf bei der Hochregulation co-inhibitorischer Moleküle und deren Expressionsunterschiede auf spezifischen CD8 T-Zellen in verschiedenen Geweben untersucht werden. Schließlich sollte die Bedeutung eines Kandidatengens bei der Immunregulation sowie seine therapeutische Wirksamkeit im Tumormodell evaluiert werden.
