Untersuchung zur Cytokinexpression von tumorspezifischen CD8 T-Zellen

Produktion von Cytokinen, darunter IFNγ, wichtig für die Unterdrückung von Tumorentwicklung (Shankaran et al., 2001). Bei T-Zellerschöpfung wird im Zusammenhang mit chronischen Infektionen durch LCMV eine hierarchische Abfolge beim Verlust von T-Zell-Effektorfunktionen beschrieben. Im ersten Schritt verlieren die CD8 T-Zellen die Fähigkeit IL-2 zu produzieren, danach verlieren sie die Fähigkeit zur TNFα-Produktion und letztlich kommt es zu einem Verlust der IFNγ-Produktion (Wherry et al., 2003; Fuller and Zajac, 2003; Wherry, 2011).

Die Daten zur Überprüfung der Funktionalität wurden im selben Versuch erhoben, der in der Abbildung 11A dargestellt ist. Die Lebern und Lungen wurden perfundiert, um zu gewährleisten, dass keine im Blut zirkulierenden Lymphozyten die Auswertung beeinträchtigen. Aus den einzelnen Organen (Milz, Lunge und Leber) wurden Einzelzellsuspensionen hergestellt und über Nacht inkubiert. Zur Restimulierung wurde das SIINFEKL-Peptid eingesetzt, um eine antigenspezifische Synthese der Cytokine zu bewirken.

Schließlich wurden die IFNγ-produzierenden OT-I-Zellen mittels einer intrazellulären Cytokinfärbung (ICS, intracellular cytokine staining) sichtbar gemacht (Abbildung 14).

Abbildung 14: Funktionale Erschöpfung der OT-I-Zellen in den Organen von Mäusen mit OVA+ Tumoren

Der Versuchsaufbau entspricht dem von Abbildung 11. Zur Überprüfung der Fähigkeit spezifischer CD8 T-Zellen (OT-I), nach einer Antigenstimulation in verschiedenen Organen Cytokine zu produzieren, wurden an Tag 8 nach Infektion mit LM-OVA wurden den Mäusen tumorhaltiges Lebergewebe bzw. Leber von Kontrollmäusen, Lunge und Milz entnommen. Es wurde eine intrazelluläre Cytokinfärbung (ICS) von Interferon-gamma (IFNγ) durchgeführt. Im FACS-Dot plot sind repräsentative Werte der IFNγ-Expression aus den beiden Gruppen dargestellt. Die IFNγ-Expression wurde statistisch ausgewertet, wobei einzelne Symbole für individuelle Mäuse stehen und der Balken den Mittelwert angibt (n = 3).

% IFN+ / OT-I

OVA+ Kontrolle

OVA+ Kontrolle

OVA+ Kontrolle 0

20 40 60 80 100

Milz Lunge Leber

**** ** ***

Die durchflusszytometrische Auswertung zeigte, dass in der OVA+ Tumorgruppe die spezifischen CD8 T-Zellen (OT-I) in allen gemessenen Organen, verglichen mit der Kontrollgruppe, eine deutlich verringerte Cytokinproduktion aufwiesen. Der markante Unterschied in der IFNγ-Produktion der OT-I-Zellen aus OVA+ tumortragenden Mäusen zeigt eine ausgeprägte funktionelle und systemisch nachweisbare Erschöpfung der tumorspezifischen CD8 T-Zellen.

Veränderungen in der mRNA-Expression tumorspezifischer 3.4

CD8 T-Zellen

Die zuvor durchgeführten Mausexperimente haben die phänotypische und funktionelle Erschöpfung der tumorspezifischen CD8 T-Zellen in tumortragenden Versuchsmäusen belegt.

Für die Aufklärung der molekularen Veränderungen, die ein wachsender Tumor auf die spezifische Immunantwort ausübt, sollte die Gesamt-RNA der spezifischen CD8 T-Zellen isoliert und das Transkriptom analysiert werden. Maßgeblich sollten die mRNAs von Genen, die für co-inhibitorischen Moleküle kodieren, untersucht werden, die zuvor auf Proteinebene signifikante Unterschiede in der Durchflusszytometrie gezeigt haben. Die mRNAs von Effektormolekülen, die wichtig für die cytotoxische Funktion von CD8 T-Zellen sind, sollten ebenfalls analysiert werden. Da die spezifischen CD8 T-Zellen in OVA+ tumortragenden Mäusen signifikant geringer waren und auch nicht in der Lage waren die Tumoren zu eradizieren, ist die Betrachtung von Genen interessant, die bei der Zellmitose und Apoptoseregulation mitwirken, um Veränderungen bei Proliferation und Langlebigkeit von T-Zellen untersuchen zu können. Darüber hinaus sollten transkriptionelle Unterschiede von T-Zell-spezifischen Transkriptionsfaktoren analysiert werden.

3.4.1 Transkriptionelle Unterschiede bei erschöpften tumorspezifischen CD8 T-Zellen Im folgenden Versuch sollten die tumorspezifischen CD8 T-Zellen aus den Lebertumoren isoliert und ihre gesamte RNA extrahiert werden, um die einen Microarray durchzuführen. Es wurde hierbei der gleiche Versuchsaufbau wie bei Abbildung 11 verwendet. Dafür wurden in C57BL/6J-Mäusen mittels HDI in der Leber OVA+ Tumoren erzeugt. Als Vergleich dienten tumorfreie Mäuse. Nach einer Wachstumsphase des Tumors von 13 Tagen, wurden 5×10³ naive OT-I-Zellen adoptiv transferiert und mit einer Primärimmunisierung mit PLGA/SIINFEKL + PolyI:C stimuliert und durch eine Infektion mit LM-OVA weiter expandiert (Abbildung 15A). Der Phänotyp erschöpfter T-Zellen wurde mittels

durchflusszytometrischer Analysen aus dem peripheren Blut an Tag 7 und Tag 11 nach der LM-OVA-Infektion bestätigt. Um die tumorinfiltrierenden spezifischen CD8 T-Zellen (OT-I) zu isolieren, wurden die Lebern der Mäuse aus beiden Gruppen an Tag 12 und Tag 13 nach LM-OVA-Infektion perfundiert. Durch die Perfusion sollten die im Blut enthaltenen Lymphozyten entfernt und möglichst nur die Leber- und Lebertumorinfiltrierenden Lymphozyten isoliert werden. Die spezifischen CD8 T-Zellen wurden mit Hilfe von MACS Technologie und eines Hochgeschwindigkeitszellsortiergerätes isoliert und die Reinheit der isolierten OT-I-Zellen wurde mit 99,9% bestätigt (Punkt 5.6.11, Abbildung 24). Naive OT-I-Zellen dienten für den Microarray als Referenzgruppe, wobei bereits Transkriptom-Daten zu naiven OT-I-Zellen existieren (Wirth et al., 2010). Diese Referenzgruppe wurde auch als zusätzliche technische Kontrolle bei der Durchführung des Microarrays eingesetzt.

Abbildung 15A: Experimenteller Aufbau für die Isolierung spezifischer CD8 T-Zellen zur Durchführung des Microarrays

(A) Der Versuchsaufbau entspricht dem von Abbildung 11, wobei naive OVA-spezifische CD8 T-Zellen (5×10³ OT-I) adoptiv in die Mäuse transferiert und anschließend PLGA/SIINFEKL + PolyI:C und einer LM-OVA-Infektion zur Proliferation stimuliert. Für die RNA-Isolierung und den anschließenden Microarray wurden aus der tumorhaltigen Leber bzw. der Leber von Kontrollmäusen die OT-I-Zellen mittels Zellsortierung mit sehr hoher Reinheit isoliert. Als zusätzliche Kontrolle für den Microarray wurde eine Gruppe naiver Mäuse eingesetzt. In die naiven Mäuse wurden 6,5×10⁶ naive OT-I-Zellen adoptiv transferiert, am nächsten Tag die Milz entnommen und die naiven OT-I-Zellen mittels Zellsortierung isoliert.

A

Tag -7 Tag -8

Tag -21 Tag -8 Tag -7 Tag 0 Tag 12, 13 OT-I -Zellsortierung

Microarray Gesamt-RNA -Isolierung

Die Untersuchung des Transkriptoms wurde mit drei Gruppen spezifischer CD8 T-Zellen durchgeführt: (1) funktionell-erschöpfte tumorspezifische CD8 T-Zellen, die aus dem OVA+

Tumor isoliert wurden; (2) voll-funktionelle spezifische CD8 T-Zellen, die aus der Leber isoliert wurden und keine HDI erhalten hatten; (3) naive spezifische CD8 T-Zellen nach adoptivem Transfer, die aus der Milz isoliert wurden. Für den Microarray wurden aus jeder Gruppe biologische Replikate eingesetzt und die im Microarray detektierten Fluoreszenzwerte wurden anschließend statistisch ausgewertet (Abbildung 15B). Es wurden dabei die Anzahl der mRNA-Transkripte der co-inhibitorischen Rezeptoren PD-1, TIM-3, LAG-3, CD160, 2B4 analysiert, wie auch die von anderen Oberflächenmolekülen: TIGIT, CD137, KLRG1 und CD127. Die Daten zeigen, dass in den erschöpften tumorspezifischen CD8 T-Zellen bei allen co-inhibitorischen Rezeptoren die Transkription hochreguliert wurde, jedoch auch bei den co-stimulatorischen Rezeptoren OX40 und CD137. Dagegen wurden bei KLRG1 und CD127 deutlich weniger Transkripte gemessen. Es wurde die Menge an mRNA-Transkripten von Molekülen untersucht, die eine essentielle Rolle bei der Funktionalität von CD8 T-Zellen spielen. Auf transkriptioneller Ebene zeigt sich eine eindeutig verminderte Produktion von IFNγ in tumortragenden Mäusen. Die Transkripte anderer Cytokine (TNFα, IL-2), der Effektormoleküle Granzym B und Perforin und CD107a (LAMP-1, Lysosomen-assoziiertes Membran-Glykoprotein 1), das bei der Degranulation von T-Zellen beteiligt ist, wurden ebenfalls von den erschöpften T-Zellen signifikant geringer gebildet. Dagegen wurden in diesen T-Zellen signifikant mehr Transkripte von Molekülen gemessen, die bei Apoptose-Signalwegen involviert sind (Caspase 3, PERP, BIM, BMF) (Davies et al., 2009; O'Connor et al., 1998; Morales et al., 2004). Es wurden auch Veränderungen bei den Transkriptionsfaktoren (TCF-7 (Tcf-1/Tcf7), T-bet, EOMES) beobachtet, die an der T-Zell-Entwicklung beteiligt sind (Verbeek et al., 1995; Joshi et al., 2007; Zhou et al., 2010).

Pdcd1(PD-1) MACS-Technologie und anschließend mit Hilfe von Durchflusszytometrie isoliert. In jeder Gruppe wurde aus den sortierten OT-I-Zellen die Gesamt-RNA isoliert und für die Transkriptom-Analyse als individuelle biologische Replikate in einem Microarray eingesetzt. In der Abbildung wurde die Fluoreszenz-intensität der gemessenen RNA-Transkripte bestimmter Gene dargestellt. Hierbei wurde die Anzahl der RNA-Transkripte aus den OT-I-Zellen aufgeführt, die aus der OVA+ tumortragenden Gruppe der Mäuse ( Erschöpft) und aus Kontrollmäusen ohne Tumorinduktion ( Effektor) stammen. Die Werte der Fluoreszenintensität aus den naiven OT-I-Zellen wurden als Referenz-werte aufgeführt ( naiv). Einzelne Symbole stehen für individuelle Mäuse, wobei der Balken den Mittelwert angibt (mit Standard-abweichung, n = 3-4)

Oberflächenrezeptoren

B