Expressionsuntersuchung der Oberflächenmarker auf tumorspezifischen CD8 T-Zellen

Basierend auf den zuvor generierten Daten zum Phänotyp tumorspezifischer CD8 T-Zellen wurden nachfolgend Versuche unter Verwendung des adoptiven T-Zell-Transfers durchgeführt. In diesen Versuchen sollte der Phänotyp tumorspezifischer CD8 T-Zellen ausführlicher beschrieben und ihre Funktionalität überprüft werden. Für die vereinfachte Darstellung der adoptiv transferierten SIIINFEKL-spezifischen CD8 T-Zellen (OT-I-Zellen) mittels Durchflusszytometrie wurde eine Anzahl relativ geringe Anzahl (5×10³ OT-I-Zellen) in Mäuse transferiert, bei denen OVA+ Tumore erzeugt wurden, bzw. in tumorfreie Kontrollmäuse. Wie in der Abbildung 8A beschrieben, wurden die transferierten Zellen mit Hilfe einer primären Immunisierung mit PLGA-SIINFEKL + PolyI:C und der LM-OVA-Infektion zur Proliferation angeregt (Abbildung 11A). In der durchflusszytometrischen Analyse der im Blut zirkulierenden SIINFEKL-spezifischen CD8 T-Zellen wurden die OT-I-Zellen auf die Expression der T-Zell-Erschöpfungsmarker (PD-1, TIM-3, CD160, LAG-3 und 2B4) untersucht und diese Expression als Histogramm dargestellt (Abbildung 11B). In der Versuchsgruppe der Mäuse mit OVA+ Tumoren wurden bei den OT-I-Zellen alle gemessenen Oberflächenmarker, die auf T-Zell-Erschöpfung hinweisen, deutlich höher exprimiert.

Die Daten zum Phänotyp tumorspezifischer CD8 T-Zellen, deuten auf eine Erschöpfung der T-Zellen hin. In vorangegangenen Versuchen wurde anhand des Phänotyps die T-Zell-Erschöpfung zunächst bei endogenen CD8 T-Zellen beobachtet (Abbildung 10). Hier

Abbildung 11: Im Blut untersuchte spezifische CD8 T-Zellen zeigen den Phänotyp erschöpfter T-Zellen

(A) Der Versuchsaufbau entspricht dem von Abbildung 8, wobei jedoch 5×10³ OT-I-Zellen adoptiv transferiert wurden, um die Detektion zu erleichtern. (B) Die Auswertung wurde an Tag 7 nach der Listerieninfektion durchgeführt. Es sind FACS-Histogramme von im peripheren Blut zirkulierenden OT-I-Zellen aus repräsentativen Mäusen der beiden Gruppen dargestellt. Der Isotyp ist grau ausgefüllt. Das Balkendiagramm zeigt die statistische Auswertung der Expressionsunterschiede der Oberflächenmarker bei peripheren OT-I-Zellen an Tag 7 nach der Listerieninfektion. Das Balkendiagramm zeigt den Mittelwert mit der Standardabweichung (n = 12 - 15).

B

% positive Zellen

OV A+

Kontrolle OV

A+ Kontrolle

OV A+

Kontrolle OV

A+ Kontrolle

OV A+

Kontrolle 0

20 40 60 80 100

PD-1 TIM-3 CD160 LAG-3 2B4

**** **** ** *** ****

A

Tag -21 Tag -8 Tag -7 Tag 0

konnte die T-Zell-Erschöpfung auch bei TCR-transgenen CD8 T-Zellen bestätigt werden, die in tumortragende Mäuse transferiert wurden (Abbildung 11). Die bisherigen Versuche befassten sich mit im Blut zirkulierenden spezifischen CD8 T-Zellen. Nachfolgend sollten die OT-I-Zellen in der tumorhaltigen Leber selbst und in anderen Organen untersucht werden, um den Phänotyp und die Funktionalität der tumorspezifischen CD8 T-Zellen, sowie den Einfluss der Lokalisierung auf den Phänotyp ausführlicher zu analysieren.

Um aufzuklären, ob der Phänotyp erschöpfter T-Zellen bei den spezifischen CD8 T-Zellen in verschiedenen Organen und auch in der tumorhaltigen Leber auftritt, wurde der gleiche Versuchsaufbau wie in Abbildung 11A eingesetzt. Es sollten hierbei lediglich die Organ- und tumorinfiltrierenden Lymphozyten untersucht werden. Zu diesem Zweck wurden an Tag 8 nach Infektion mit LM-OVA die Lebern und die Lungen perfundiert, um die im Blut zirkulierenden Lymphozyten und somit einen möglichen Einfluss dieser Lymphozyten bei der Untersuchung des Phänotyps Organ- und tumorinfiltrierender Lymphozyten, zu entfernen. Es wurde der Phänotyp der OT-I-Zellen anhand der Marker für T-Zell-Erschöpfung (PD-1, TIM-3, CD160, LAG-3 und 2B4) untersucht (Abbildung 12A). Der Phänotyp von tumorinfiltrierenden OT-I-Zellen wurde untersucht, wobei tumorfreie Mäuse als Kontrolle dienten. Die im OVA+ Tumor gefundenen OT-I-Zellen waren fast alle positiv für PD-1 (99%), aber auch andere Marker der T-Zell-Erschöpfung waren auf den OT-I-Zellen erhöht, darunter: LAG-3 (86%), TIM-3 (84%), 2B4 (84%) und CD160 (53%). Dagegen war die Frequenz der OT-I-Zellen, die positiv für einen dieser Oberflächenmarker war, in der Kontrollgruppe ohne Tumor deutlich geringer. Zur Überprüfung, ob während der Kontraktionsphase der T-Zell-Immunantwort diese erhöhte Oberflächenexpression anhält, wurde die Messung an Tag 15 wiederholt. Zum Vergleich des Phänotyps der OT-I-Zellen aus einem sekundären lymphatischen Organ wurde die Milz entnommen. Die Lunge wurde als ein weiteres peripheres nicht-lymphatisches Gewebe zur Analyse herangezogen. Die Frequenz der OT-I-Zellen, die positiv für einen der Oberflächenmarker war, wurde mittels Balkendiagrammen dargestellt (Abbildung 12B). Dabei waren in der OVA+ Gruppe zu beiden Zeitpunkten und in allen Geweben fast alle OT-I-Zellen positiv für PD-1. Die Frequenz der TIM-3 positiven OT-I-Zellen war zwar auch in allen Organen in Mäusen der OVA+ Gruppe deutlich erhöht, allerdings in der Lunge nahm die Expression über die Zeit ab.

Bei CD160 blieb lediglich die erhöhte Expression auf den OT-I-Zellen in der Milz und in der Leber, während in der Lunge an Tag 15 keine Unterschiede mehr vorlagen. Zwar war an Tag 8 ein überwiegender Anteil der OT-I-Zellen positiv für LAG-3 in Milz und Leber, jedoch nur ca. 50% in der Lunge, so waren die Unterschiede an Tag 15 lediglich noch moderat. Das

Oberflächenmolekül 2B4 zeigte zu beiden Messzeitpunkten und in allen untersuchten OT-I-Zellen im tumorhaltiger Leber, sowie Lunge und Milz, weist auf deutliche Erschöpfung der T-Zellen hin

(A) Es wurde der gleiche Versuchsaufbau wie bei Abbildung 11 verwendet. Die Lebern der tumortragenden bzw. der Mäuse aus der Kontrollgruppe wurden perfundiert, um periphere Lymphozyten zu enfernen. Die Histogramme zeigen den Phänotyp der OT-I- Zellen von repräsentativen Mäusen aus beiden Gruppen an Tag 8 nach Infektion mit LM-OVA. Die Zahlen stehen für die Frequenz der OT-I-Zellen, die positiv für einen der Marker sind. Der Isotyp ist grau ausgefüllt. (B) Statistische Auswertung des Phänotyps der OT-I-Zellen in verschiedenen Organen (Balkendiagramm zeigt den Mittelwert mit Standardabweichung, n = 3).

Der Phänotyp der OT-I-Zellen, der zuvor im Blut gemessen wurde (Abbildung 11), wurde hier auf den tumorinfiltrierenden OT-I-Zellen bestätigt. Dabei war die Expression der gemessener Oberflächenmoleküle, die mit T-Zell-Erschöpfung assoziiert sind (PD-1, TIM-3, CD160, LAG-3 und 2B4) auf den tumorspezifischen CD8 T-Zellen im Blut tumortragender Mäuse wie auch in der tumorhaltigen Leber erhöht. In allen untersuchten Organen waren die meisten OT-I-Zellen aus der OVA+ Gruppe während des Versuchszeitraums anhaltend positiv für PD-1, TIM-3 und 2B4, gefolgt von LAG-3 und CD160. Die erhobenen Daten lassen vermuten, dass es zu einer systemischen Erschöpfung spezifischer CD8 T-Zellen kommt, die besonders in der tumorhaltigen Leber ausgeprägt ist.

3.3.3 Marker der T-Zell-Differenzierung im Zusammenhang mit T-Zell-Erschöpfung