Checkpoint-Blockade als Immuntherapie

Verschiedene klinische Studien zeigen, dass die vermehrte Expression von PD-1 auf tumorinfiltrierenden Lymphozyten bei verschiedenen Krebs-Arten, wie zum Beispiel HCC, Brustkrebs und Nierenkrebs, als ein negativer Prognose-Faktor gilt (Shi et al., 2011; Muenst et al., 2013; Thompson et al., 2007). Das Vorhandensein von PD-1 auf T-Zellen im Tumorgewebe, wie auch seines Liganden PD-L1 auf den Tumorzellen, gilt dennoch als ein entscheidendes Kriterium für ein Ansprechen durch die gegenwärtig in der Klinik getesteten monoklonalen Checkpoint-Inhibitoren (Topalian et al., 2012; Taube et al., 2014; Tumeh et al., 2014). Es zeigte sich, dass die Ansprechraten bei der Checkpoint-Blockade schwanken können. So beträgt sie durch den Einsatz von Pembrolizumab (anti-PD-1 monoklonaler

Antikörper) beim fortgeschrittenem Melanom 33% (Ribas et al., 2016). Nach Aufschlüsselung der Studienergebnisse zeigte sich, dass die Mutationslast des Tumors eine wesentliche Voraussetzung für das Ansprechen darstellt. Dabei hatten die Patienten von der Behandlung mit anti-CTLA-4-Antikörpern profitiert, bei denen die Tumoren eine höhere Anzahl an somatischen Mutationen aufwiesen. Diese Mutationen können Neoepitope darstellen, die nach erfolgreicher Unterbrechung der T-Zell-Inhibition durch blockierende Antikörper wieder von den T-Zellen erkannt werden (Snyder et al., 2014). Beim nicht-kleinzelligen Lungenkarzinom (SCLC, small cell lung cancer) war die Ansprechrate auf Pembrolizumab sogar 44,8% und war somit wirksamer als die konventionelle Chemotherapie, die eine Ansprechrate von 27,8% aufwies (Reck et al., 2016). Ein entscheidender Beitrag zum Erfolg dieser klinischen Studie war die Vorauswahl der Lungenkrebspatienten basierend auf der PD-L1-Expression, wobei mindestens 50% der Tumorzellen PD-L1 exprimieren sollten.

Das Melanom und der Lungen-Krebs gehören zu den Tumor-Arten mit der höchsten Anzahl an Mutationen, dagegen weist das Hepatozelluläre Karzinom eine deutlich niedrigere Mutationslast auf (Alexandrov et al., 2013). In einer neuen klinische Studie zur Behandlung von HCC konnte durch den Einsatz von Nivolumab (anti-PD-1 monoklonaler Antikörper) eine Ansprechrate von 20% erzielt werden (El-Khoueiry et al., 2017). Für diese Studie wurden die Patienten nicht basierend auf der Expression von PD-L1 ausgewählt, und in einer retrospektiven Analyse der Tumorproben bezüglich der Expression von PD-L1 zeigte sich keine Assoziation zwischen PD-L1-Expression und der Ansprechrate auf PD-1-Blockade. Es sollte auch nicht unterschätzt werden, dass bestimmte Mutationen im Tumor diesen auch für die Checkpoint-Inhibition von Anfang an unempfänglich machen können (Hugo et al., 2016).

Alternativ kommt es auch zur Resistenzentwicklung gegen die PD-1-Blockade bzw.

CTLA-4-Blockade, die durch Genmutationen in den Tumorzellen und die fortwährende Immuneditierung durch das Immunsystem vermittelt wird (Zaretsky et al., 2016; Gao et al., 2016). Somit sind der klinischen Effizienz durch die Checkpoint-Inhibition Grenzen gesetzt.

Obwohl es Untersuchungen zur Aufklärung der molekularen Veränderungen in erschöpften T-Zellen gab, darunter auch zu Veränderungen im T-Zell-Metabolismus, waren es Studien zur chronischen viralen Erkrankungen, die durch LCMV ausgelöst wurden (Wherry et al., 2007;

Doering et al., 2012; Bengsch et al., 2016). Um der vielfältigen Arten der Unterdrückung von CD8 T-Zellen durch den Tumor und sein Mikromilieu auf molekularer Ebene zu verstehen, die in T-Zell-Erschöpfung resultieren, sind weitere Untersuchungen notwendig.

Epidemiologie von Lebertumorerkrankungen 2.3

Das hepatozelluläre Karzinom (HCC, hepatocellular carcinoma) ist die fünfthäufigste Tumorart und die zweithäufigste krebsbedingte Todesursache beim Menschen. Im Jahr 2012 hat es geschätzte 782500 neue Leberkrebserkrankungen und 745500 Todesfälle durch Leberkrebs gegeben, wobei die chinesische Bevölkerung allein jeweils 50% der Neuerkrankungen und Leberkrebstodesfälle ausmacht (Torre et al., 2015). Die Prognose von Leberkrebs ist selbst in Ländern mit sehr guter medizinischer Versorgung schlecht: in den Vereinigten Staaten von Amerika belief sich das 1-jährige Überleben auf 50% und das 5-jährige Überleben auf etwa 10% (Altekruse et al., 2009). Verschiedene Faktoren stellen Risikofaktoren dar, die zur Entstehung von Leberkrebs führen können. Dazu gehören Pilztoxine (Aflatoxine der Pilze Aspergillus flavus und Aspergillus parasiticus), die Lebensmittel kontaminieren (Chen et al., 1996; Wu et al., 2009). Ebenso kann der Befall der Leber durch parasitäre Würmer (Opistorchis viverrini und Clonorchis sinensis) zur Karzinogenese in der Leber führen (Srivatanakul et al., 1991; Shin et al., 1996). Ebenfalls kann Alkoholmissbrauch zur Zirrhose der Leber führen und stellt einen wesentlichen Anteil an der Entstehung von Leberkrebs dar (Donato et al., 2002; Fattovich et al., 2004). Eine falsche Ernährung kann langfristig ebenso zur Hepatokarzinogenese führen. Hierbei ist die andauernde Aufnahme energiereicher Nahrung und Fettleibigkeit zu erwähnen, die zur Entwicklung von nicht-alkoholischer Fettlebererkrankung (NAFLD, non-alcoholic fatty liver disease) führen kann. Als Folge davon kommt es zur Anreicherung von Fett in der Leber, was auch eine schwerere Erkrankungsform von NAFLD, die nicht-alkoholische Steatohepatitis (NASH, non-alcoholic steatohepatitis) hervorrufen kann (Powell et al., 1990; Starley et al., 2010). Die Ausbildung von NASH kann eine Leberzirrhose auslösen und diese kann letztlich die Entstehung von HCC verursachen (Bugianesi et al., 2002; Marrero et al., 2002). Es gibt zudem auch klinische Fälle, die belegen, dass das Hepatozelluläre Karzinom durchaus unabhängig von Zirrhose entstehen kann (Kawada et al., 2009; Ertle et al., 2011; Torres and Harrison, 2012). Ein hoher Teil der HCC-Fälle (78%) wird chronischen Infektionen durch das Hepatitis B Virus (HBV) (53%) oder das Hepatitis C Virus (HCV) (25%) zugeschrieben.

Ebenso ist die Mehrheit der Fälle von Leberzirrhose (57%) mit diesen viralen Infektionen assoziiert (HBV mit 30%, HCV mit 27%) (Perz et al., 2006). Angesichts der vielfältigen Ätiologie des Leberkrebs gibt es entweder präventive Maßnahmen, z.B. in Form von Impfstoffen (HBV), oder die generelle Vorbeugung gegen damit verbundene Risiken durch Alkohol oder Fettleibigkeit. Im frühen Krankheitszustand existieren verschiedene

chirurgische und therapeutische Maßnahmen, dazu gehört die Leberresektion oder -transplantation, sowie die Chemotherapie und verschiedene Formen der Tumorablation (Forner et al., 2012). Beim fortgeschrittenem Hepatozellulären Karzinom gibt es aber gegenwärtig in der Klinik nur den Multikinase-Inhibitor Sorafenib, der einen mittleren Überlebensvorteil von etwa drei Monaten gegenüber dem Placebo zeigte (Llovet et al., 2008;

Sanoff et al., 2016). Somit besteht ein dringender Bedarf an therapeutischen Optionen für die Behandlung von fortgeschrittenem HCC.

Murine Lebertumormodelle 2.4

Es gibt in der Grundlagenforschung verschiedene Mausmodelle, die eingesetzt werden, um therapeutische Ansätze und Vakzine gegen Lebertumore zu entwickeln und zu evaluieren.

Jedes dieser Mausmodelle ist auf bestimmte wissenschaftliche Fragestellungen zugeschnitten.

So gibt es die Karzinogen-induzierte Lebertumorbildung, wobei den Mäusen beispielsweise das krebserzeugende Diethylnitrosamin (DEN) verabreicht wird. Dadurch mutieren Hepatozyten der Leber, wodurch eine heterogene Population an Tumorzellen entsteht, deren Oberflächen-präsentierte Antigene jedoch dem Zufall unterliegen. Ganz ähnlich verhält es sich mit den metabolischen Modellen, bei denen Mäusen energiereiche Ernährung (high-fat diet) vorgesetzt wird und dadurch nach mehreren Monaten Tumoren in der Leber entstehen.

Außer den transgenen Mausmodellen mit konstitutiver und induzierbarer Onkogenexpression, gibt es auch die CRISPR-Cas9-Modelle, mit derer Hilfe eine generelle Überexpression von Onkogenen, bzw. eine gewebespezifische oder zellspezifische Karzinogenese induziert werden kann. Ein wesentlicher Nachteil dieser Modelle ist die langwierige Generierung der entsprechenden genmodifizierten Mäuse, wodurch viele Mäuse zusätzlich zu den eigentlichen Experimenten benötigt werden. Die Verpflanzung von humanen Tumorzellen auf Empfängermäuse ist ein weiteres Modell (xenograft model). Dabei werden jedoch immundefiziente Mäuse eingesetzt, wodurch es nicht zur authentischen Interaktion von Tumorzellen und dem Immunsystem kommt. Alternativ können auch syngene murine Hepatomzellen subkutan in die Flanke von Inzuchtmäusen injiziert werden. Dadurch käme es nicht zu einer spontanen Abstoßung von fremden Zellen (graft-versus-host disease, GvHD) und es wäre ebenfalls möglich die antitumorale Immunantwort zu studieren. Durch die oberflächennahe Lokalisation dieser subkutanen Tumore, ist ihre Vermessung durchführbar, womit beispielsweise die Wirksamkeit von Vakzinen oder Immuntherapeutika direkt evaluiert werden kann. Ein Nachteil ist hingegen, dass die Tumoren nicht im entsprechenden Organ

lokalisiert sind (ektopisch) und die Nährstoffversorgung und Blutzufuhr zum Tumor nicht der Vaskularisation der Leber entspricht. Die Interaktion mit dem Immunsystem findet dadurch nicht in der Leber statt und reflektiert nicht die Tumorentstehung beim Menschen. Eine Alternative dazu stellt das orthotope Lebertumormodell dar, bei dem Tumorzellen in die Leber injiziert werden. Zwar ist damit der Tumor im entsprechenden Organ lokalisiert, doch es findet keine Transformation von Körperzellen zu Tumorzellen statt.

Verwendung des Transposon-Systems für das orthotope 2.5

Lebertumormodell

Aktuell wird in der Lebertumorforschung sehr häufig das Transposon-System als Modell verwendet (Chen and Calvisi, 2014). Dessen großer Vorteil ist die flexibel austauschbare Genkassette, mit derer Hilfe eine stabile Integration und Expression von Transgenen direkt in der Leber erreicht wird. Hierbei handelt es sich genau genommen um ein autochtones Lebertumormodell, das oft als ein orthotopes Lebertumormodell bezeichnet wird. Im Gegensatz zum konventionellen orthotopen Modell, bei dem Tumorzellen in die Leber verpflanzt werden, um einen Lebertumor zu generieren, entstehen beim autochtonen Modell die Tumoren direkt aus den Leberhepatozyten. In dem autochtonen Lebertumormodell liegt sowohl die organspezifische Mikroumgebung, als auch die native Vaskularisation des Organs vor. Damit handelt es sich also um ein klinisch relevantes Lebertumormodell, das nicht nur Flexibilität bei der Antigenauswahl ermöglicht, sondern bei dem auch ein intaktes Immunsystem zur Verfügung steht.

Das Transposon-System wird für die stabile Integration von Transgenen eingesetzt. Es wurde bereits in vitro bei eukaryotischen Zellen und auch bei der Mutagenese von Keimbahnzellen für die Generierung von transgenen Mäusen erfolgreich eingesetzt (Izsvak et al., 2000; Horie et al., 2001). Die Verwendung des Transposon-Systems in vivo hat demonstriert, dass eine stabile Expression von Transgenen auch in Organen möglich ist. Bei der Untersuchung von Leberkrebs wird das Transposon-System in Verbindung mit der Hydrodynamischen Schwanzveneninjektion (HDI) eingesetzt (Fan et al., 2012; Ho et al., 2012). Die hydrodynamische Schwanzveneninjektion wird benutzt, um eine Transfektion der Hepatozyten zu erreichen (Liu et al., 1999; Zhang et al., 1999). Eine innovative Neuentwicklung stellt das in vivo-Elektroporationsmodell dar, mit dessen Gebrauch ein unilokulärer Tumor erzeugt werden kann, wobei sich auch die Anwendbarkeit des Transposon-Systems auf eine Vielzahl von Organen ausweitet (Gurlevik et al., 2013;

Gurlevik et al., 2016). Zur stabilen Integration der im Transposon klonierten Gene wird die Sleeping Beauty (SB) Transposase verwendet, die aus der Tc1/mariner Überfamilie der transposablen Elemente mit Hilfe der Gentechnologie aus Lachsfischen (Salmonidae) rekonstruiert wurde (Ivics et al., 1997). Die Sleeping Beauty Transposase kann am Transposon invertierte Sequenzwiederholungen (inverted terminal repeats, IR) und die darin enthaltenen direkten Sequenzwiederholungen (direct repeats, DR) erkennen, welche als Bindungsstellen für die Transposase dienen. Die Transposase schneidet das Transposon aus dem Transfer-Plasmid, und integriert das Transposon zwischen ein TA-Dinukleotid (Luo et al., 1998; Liu et al., 2004; Vigdal et al., 2002). Dabei erfolgt die Integration ins Genom bevorzugt in wiederholende Mikrosatellit-DNA-Abschnitte, die in nicht-codierenden Bereichen der DNA liegen (Yant et al., 2005).

In der Leber von Menschen werden einige Signalwege bei der Karzinogenese dereguliert, zu denen der Ras-Signalweg gehört (Calvisi et al., 2006). Seit seiner Entdeckung in humanen Tumorzellen ist das Onkogen Ras zu einem wichtigen Teil der Tumorforschung geworden (Santos et al., 1982; Der et al., 1982; Parada et al., 1982). Die Aktivierung von Ras wird unter anderem durch eine missense Mutation in Codon 12 ausgelöst – also durch eine nicht-synonyme Mutation, die für eine andere Aminosäure codiert (Taparowsky et al., 1982; Reddy et al., 1982; Tabin et al., 1982). Ras Proteine gehören zur Familie der kleinen GTPasen (Guanosintriphosphat (GTP)), die als molekulare Schalter bei Signaltransduktionswegen wirken, zu denen der Ras-Raf-MEK-ERK-Signalweg gehört, über den Zellwachstum, Überleben und Migration von Zellen reguliert werden (Schubbert et al., 2007). Zwar ist die Mutationshäufigkeit von Ras beim humanen HCC relativ selten, dennoch kommt es zu einer generellen Aktivierung des Ras-Signalwegs beim HCC (Challen et al., 1992; Calvisi et al., 2006). Eine Expression von aktiviertem NRas (N steht dabei für Neuroblastoma) in der Leber von Wildtyp-Mäusen führt alleine jedoch nicht zur Tumorentstehung, sondern bewirkt in den Hepatozyten zelluläre Seneszenz, wobei die entstandenen prämalignen Hepatozyten von infiltrierenden Immunzellen eradiziert werden (Kang et al., 2011). Es sind mehrere Mutationsereignisse notwendig, um in Zellen Karzinogenese auszulösen. So kann beispielsweise Darmkrebs als Abfolge von aktivierenden Mutationen in Protoonkogenen und inaktivierenden Mutation in Tumorsuppressorgenen entstehen (Vogelstein et al., 1988;

Fearon and Vogelstein, 1990). Ein aktiviertes Onkogen bewirkt bei einer Zelle keine maligne Transformation, wenn jedoch in derselben Zelle auch ein Tumorsuppressorgen durch Mutation inaktiviert wird, kann sie zur Tumorzelle entarten. Ein bekanntes Bespiel für ein Tumorsuppressorgen ist TP53, das bei der Karzinogenese häufig mutiert ist, darunter auch bei

Leberkrebs (Hollstein et al., 1991; Hsu et al., 1991). Es codiert für das Tumorsuppressorprotein p53 und kann im Fall von Beschädigungen der DNA in den betroffenen Zellen Seneszenz und Apoptose induzieren, um mutationsbedingte maligne Zellentwicklung zu verhindern (Lowe et al., 1993; Clarke et al., 1993; Schmitt et al., 2002).

Ein weiteres Protoonkogen ist AKT, welches in verschiedene Zellprozesse involviert ist, zu denen Apoptose, Zellwachstum, Glucosemetabolismus, Lipidstoffwechsel und Zellüberleben gehören (Datta et al., 1997; Datta et al., 1999; Krycer et al., 2010). Die Überexpression von AKT kann ebenfalls eine Transformation zu Tumorzellen herbeiführen (Aoki et al., 1998).

Bei humanen HCCs gilt die Phosphorylierung von AKT als wichtiger Faktor, der zur Aggressivität des Tumors beiträgt, und ist auch bei HCC-Patienten mit einer schlechteren Prognose assoziiert (Nakanishi et al., 2005). Damit das Protoonkogen AKT im Maustumormodell in einem versuchszeitlichen Rahmen zur Karzinogense beiträgt, wird es myristoyliert (Orsulic et al., 2002). Die Fusionierung einer Myristoylierungssequenz an den N-Terminus an AKT1 erzeugt, verglichen mit der Wildtyp-Variante, eine 10-fach aktivere Form des Enzyms (Kotani et al., 1999). Durch die Myristoylierung wird AKT1 in die Nähe der Membran und der Phosphoinositid-3-Kinase (PI3K) gebracht, die AKT1 phosphoryliert und aktiviert (Peitzsch and McLaughlin, 1993; Farazi et al., 2001; Franke et al., 1997).

Zielsetzung der vorliegenden Arbeit 2.6

Da die cytotoxischen T-Zellen durch co-inhibitorische Regulationsmechanismen in der Tumormikroumgebung an der Ausübung ihrer Effektorfunktionen beträchtlich behindert werden, stellt der Einsatz blockierender Antikörper gegen Immun-Checkpoint-Moleküle eine aussichtsreiche Neuentwicklung in der Immuntherapie dar. Es besteht dennoch ein dringender Bedarf zur Verbesserung der therapeutischen Wirksamkeit und zur Verhinderung der Resistenzentwicklung bei den Tumorzellen. Um ein besseres Verständnis der molekularen Veränderungen bei dysfunktionalen, tumorspezifischen CD8 T-Zellen zu erhalten, ist es notwendig die molekularen Ursachen für die T-Zell-Erschöpfung weiter aufzuschlüsseln. Zur Untersuchung der spezifischen CD8 T-Zell-Immunantworten gegen solide Tumoren sollte zunächst in immunkompetenten Mäusen ein orthotopes Lebertumormodell unter Verwendung des Modellantigens Ovalbumin etabliert werden. Das Wachstum der orthotopen Lebertumoren sollte mittels Biolumineszenzmessungen in vivo visualisiert und durch histologische Untersuchungen abgesichert werden. Zudem sollte die Frequenz der tumorspezifischen CD8 T-Zellen in verschiedenen Geweben bestimmt werden, um ihre Migration zu den tumortragenden Lebern zu untersuchen. Da die co-inhibitorischen Rezeptoren essentiell für das Entstehen der T-Zell-Erschöpfung sind, sollte eine detaillierte Phänotypisierung der tumorspezifischen CD8 T-Zellen erfolgen. Die Ausprägung der funktionellen Erschöpfung hinsichtlich fehlender Cytokinproduktion sollte charakterisiert werden. Um die molekularen Veränderungen auf transkriptioneller Ebene zu untersuchen, sollten die erschöpften tumorspezifischen CD8 T-Zellen aus dem Tumor isoliert und ihre gesamte RNA mit Hilfe eines transkriptomweiten Microarrays analysiert werden. Dabei sollten die transkriptionellen Unterschiede zwischen funktionellen T-Zellen und den erschöpften T-Zellen untersucht werden und zur Identifikation neuer Zielmoleküle für die Steigerung der Wirksamkeit von Immuntherapie führen. Anschließend sollten ausgewählte transkriptionelle Unterschiede in tumortragenden Mäusen in vivo validiert werden. Ebenfalls sollte der zeitliche Verlauf bei der Hochregulation co-inhibitorischer Moleküle und deren Expressionsunterschiede auf spezifischen CD8 T-Zellen in verschiedenen Geweben untersucht werden. Schließlich sollte die Bedeutung eines Kandidatengens bei der Immunregulation sowie seine therapeutische Wirksamkeit im Tumormodell evaluiert werden.

3 Ergebnisse

Generierung von orthotopen Lebertumoren mittels 3.1

Transposon-System für die Untersuchung tumorspezifischer CD8 T-Zell-Immunantworten

Die Untersuchung von tumorspezifischen CD8 T-Zellen sollte in einem orthotopen Modell erfolgen. In diesen orthotopen Tumoren interagieren T-Zellen mit den Tumorzellen in der entsprechenden organspezifischen Umgebung. In diesem Modell sollte ein Tumorwachstum initiiert werden, bei dem die Immunantwort nicht in der Lage ist, die Tumoren zu eradizieren und somit die tumorspezifischen CD8 T-Zellen analysiert werden konnten. Für die Generierung von Tumoren in der Leber der Mäuse wurde das Transposon-System ausgewählt, bei dem Wildtypmäuse (C57BL/6J) verwendet und auf transgene Mäuse verzichtet werden kann. Die entstandenen Tumoren sollten histologisch untersucht werden, um das Entstehung eines HCC zu bestätigen. Da es sich um ein orthotopes Tumormodell handelt, muss jedoch auch eine Wachstumskinetik der Lebertumoren bestimmt werden. Eine wesentliche Anforderung an das Modell ist, dass nur das entstehende Tumorgewebe das Antigen exprimiert, nicht jedoch das gesunde Gewebe.

3.1.1 Verwendung des Transposon-Systems für die Generierung orthotoper