Beeinflussung der Migration spezifischer CD8 T-Zellen zu soliden Tumoren

tumortragenden Mäusen, im Vergleich zu den Kontroll-Mäusen, im Verlauf der Kontraktion der zellulären Immunantwort zunehmend weniger im Blut detektiert werden. Zur Untersuchung der spezifischen Immunantwort während der T-Zell-Expansionsphase, wurden zunächst OVA+ Tumoren mit Hilfe von HDI in Mäusen erzeugt und dann eine höhere Anzahl naiver spezifischer CD8 T-Zellen (10⁴ OT-I) adoptiv transferiert, um zu einem frühen Zeitpunkt während der T-Zell-Expansion die Detektion der spezifischen T-Zellen zu ermöglichen, die mittels einer LM-OVA-Infektion zur Proliferation stimuliert wurden (Abbildung 9A). Da bekannt ist, dass sich die spezifischen CD8 T-Zellen während der primären Immunisierung nach einer Infektion in den Lymphknoten aufhalten, wurden die Tage 3, 5 und 7 gewählt, um den Zeitpunkt zu erfassen, an dem die tumorspezifischen CD8 T-Zellen anfangen, in Richtung der tumortragenden Lebern zu migrieren (Busch et al., 1998;

Bousso and Robey, 2003; Mempel et al., 2004; Prlic et al., 2006). Vor der Organentnahme wurde die Leber der Mäuse perfundiert, um die sich im Blut befindenden Lymphozyten zu entfernen, und somit möglichst nur die Leber- und Tumorinfiltrierenden Lymphozyten untersucht wurden. Anschließend wurden die Leber und die Milz entnommen. In der Durchflusszytometrie wurde die Frequenz der OT-I-Zellen in den Organen der individuellen Mäuse ermittelt (Abbildung 9B). Es wurde der Quotient aus der OT-I-Frequenz in der Leber (Kontroll-Gruppe) bzw. im tumorhaltiger Leber (OVA+ Gruppe) und der OT-I-Frequenz in der Milz, jeweils pro Gesamtpopulation der CD8 T-Zellen, berechnet. Die Ergebnisse wurden als x-facher Unterschied in der Frequenz der OT-I-Zellen (Leber/Milz) in der Abbildung 9C zusammengefasst.

Abbildung 9: Tumorspezifische CD8 T-Zellen migrieren bereits zu einem frühen Zeitpunkt mit steigender Tendenz in Richtung der tumortragenden Lebern

(A) Um spezifische CD8 T-Zellen (OT-I) zu einem früheren Zeitpunkt detektieren zu können, wurden 10⁴ naive OT-I-Zellen adoptiv in OVA+ tumortragende Mäuse transferiert.

Als Kontrolle dienten Mäuse ohne Lebertumoren. Anschließend wurden die Mäuse mit LM-OVA infiziert um die spezifische Immunantwort zu induzieren. (B) Für die Auswertung wurden an Tag 3, 5 und 7 nach der Infektion mit LM-OVA aus den beiden Gruppen jeweils drei Mäuse getötet und tumortragende Lebern bzw. Lebern von Kontrollmäusen und die Milz entnommen. Gezeigt sind repräsentative Dot plots, wobei die Zahl die Frequenz der OT-I-Zellen pro CD8 T-Zellen angibt. (C) Es wurde bei den einzelnen Tieren der Quotient aus der Frequenz der OT-I-Zellen in tumortragenden Lebern bzw. Lebern von Kontrollmäusen und in der Milz kalkuliert und im Balkendiagramm als x-facher Unterschied der OT-I-Frequenz dargestellt. Das Balkendiagramm zeigt den Mittelwert mit der Standardabweichung (n = 3).

x-fach Unteschied Leber / Milz (%OT-I / CD8) 0 5 10 15 20 25

Mäuse mit OVA+ Tumor Mäuse ohne Tumor

Tag 5 Tag 7

nicht detektierbar

Tag 3

ns *

C

A

A

B

A

A

A

Tag -21 Tag -1 Tag 0

Nach dem adoptiven Transfer und der LM-OVA-Infektion konnten die OT-I-Zellen bereits an Tag 3 in tumorhaltiger Leber und in der Milz der OVA+ Gruppe detektiert werden. In der Kontrollgruppe wurden zu diesem Zeitpunkt keine OT-I-Zellen gefunden. Während das Verhältnis in der Frequenz der OT-I-Zellen in der OVA+ Gruppe mit der Zeit immer weiter zugenommen hat, hatte es sich in der Kontrollgruppe innerhalb der Expansionsphase der spezifischen CD8 T-Zellen nicht verändert. Es scheint, dass es zu einer frühen und massiv verstärkten Migration spezifischer CD8 T-Zellen in Richtung der tumortragenden Leber kommt. Die T-Zell-Immunantwort ist jedoch nicht ausreichend zur Tumor-Eradizierung und die Mäuse erliegen dem Progress des Tumors. In anschließenden Versuchen sollten die tumorspezifischen CD8 T-Zellen phänotypisch charakterisiert werden, um den Zustand der T-Zell-Erschöpfung zu untersuchen.

Einfluss des Tumorwachstums auf Phänotyp und 3.3

Funktionalität tumorspezifischer CD8 T-Zellen

Veränderungen des Phänotyps tumorspezifischer CD8 T-Zellen, insbesondere die Expression des co-inhibitorischen Rezeptors PD-1, wurden vor allem bei den tumorinfiltrierenden Lymphozyten beschrieben (Ahmadzadeh et al., 2009). Eine drastisch verringerte Cytokinproduktion, sowie die damit verbundenen Einschränkungen der Effektorfunktionen, wurden wiederholt im Zusammenhang mit der Hochregulation co-inhibitorischer Rezeptoren auf CD8 T-Zellen berichtet (Zhang et al., 2010; Matsuzaki et al., 2010). Bei der T-Zell-Erschöpfung ist jedoch nicht nur PD-1 involviert, sondern auch andere co-inhibitorische Moleküle, weshalb ihre Expression auf den tumorspezifischen CD8 T-Zellen in den folgenden Experimenten ermittelt werden sollte (Baitsch et al., 2011). Zur Bestätigung der funktionellen Erschöpfung (Dysfunktion) der spezifischen CD8 T-Zellen wird ihre Fähigkeit zur Cytokinproduktion ex vivo mittels intrazellulärer Cytokinfärbung analysiert. Die tumorspezifischen CD8 T-Zellen sollten nicht nur in tumortragender Leber selbst, sondern auch anderen Organen analysiert werden, um zu bewerten, inwiefern die Erschöpfung der T-Zellen lokal und systemisch vorliegt.

3.3.1 Oberflächenexpression der Marker für T-Zell-Erschöpfung auf endogenen spezifischen CD8 T-Zellen

Es wurde zunächst auf endogenen SIINFEKL-spezifischen CD8 T-Zellen die Expression von den Oberflächenmarkern PD-1 und TIM-3 analysiert, die an der T-Zell-Erschöpfung beteiligt

sind (Fourcade et al., 2010). Dafür wurden orthotope Lebertumoren (OVA+ bzw. OVA-) in den Mäusen generiert und nach 26 Tagen mit einer LM-OVA-Infektion die SIINFEKL-spezifische Immunantwort stimuliert. Für die Analyse des Phänotyps SIINFEKL-spezifischer CD8 T-Zellen wurde den Mäusen Blut entnommen und die Zellen mittels SIINFEKL-Tetramer angefärbt. Im Histogramm ist erkennbar, dass an Tag 7 nach der Infektion mit LM-OVA die meisten der SIINFEKL-Tetramer+ CD8 T-Zellen in der OVA+ Tumorgruppe positiv für PD-1 (92%) und TIM-3 (79%) waren (Abbildung 10A). Dagegen war die Expression von PD-1 und TIM-3 in der Gruppe mit den OVA- Tumoren und in der Kontrollgruppe signifikant geringer. Die Messung wurde während der Kontraktionsphase der Immunantwort wiederholt (Tag 14 nach LM-OVA) und zeigte ebenso eine signifikant höhere Expression der beiden T-Zell-Erschöpfungsmarker (Abbildung 10B).

Abbildung 10: Der Phänotyp der SIINFEKL-spezifischen CD8 T-Zellen weist in der OVA+ Tumor-Gruppe auf erhöhte Erschöpfung der T-Zellen hin

(A) Für diese Analyse liegen die Daten aus dem Versuch von Abbildung 5 zugrunde. Es wird der Phänotyp der endogenen spezifischen CD8 T-Zellen (detektiert mit SIINFEKL-Tetramer) aus dem peripheren Blut an Tag 7 nach Infektion mit LM-OVA als Histogramm dargestellt, wobei der Isotyp grau ausgefüllt ist. (B) Die Messung wurde nochmal an Tag 14 wiederholt. Das Balkendiagramm zeigt den Mittelwert mit der Standardabweichung (n = 3 - 7).

Aus den vorliegenden Daten zum Phänotyp, bei der eine dauerhafte Erhöhung zweier Marker der T-Zell-Erschöpfung (PD-1 und TIM-3) in der OVA+ Gruppe festgestellt wurde, kann man auf eine erhöhte Erschöpfung tumorspezifischer CD8 T-Zellen schließen, die im Zusammen-hang mit der Antigenerkennung auftritt.

3.3.2 Expressionsuntersuchung der Oberflächenmarker auf tumorspezifischen CD8