Beeinflussung der Cytokinexpression und Degranulation tumorspezifischer CD8

Um die Funktionalität der OT-I-Zellen während der Expansionsphase zu überprüfen, wurde der Versuchsaufbau von Abbildung 9A benutzt. Den Mäusen wurde an Tag 5 nach der Infektion mit LM-OVA die Milz entnommen und eine intrazelluläre Cytokinfärbung durchgeführt. Es sollte überprüft werden, ob die OT-I-Zellen zu diesem frühen Zeitpunkt noch fähig sind, die Cytokine IFNγ und TNFα zu produzieren. Die durchflusszytometrische Analyse zeigte, dass sich in der Milz OVA+ tumortragender Mäuse bereits während der Expansionsphase (Tag 5) nur eine geringe Frequenz IFNγ+ TNFα+ doppelt-positiver OT-I-Zellen detektiert werden konnte, die bis zum Höhepunkt der spezifischen CD8 T-Zell-Immunantwort (Tag 7) weiter abgenommen hat (von 0,79% zu 0,39%). Dagegen hatte sich die Frequenz der IFNγ+ TNFα+ OT-I-Zellen fast verdoppelt (von 18,59% zu 28,38%) (Abbildung 17A, 17B). Es wurde auch die Messung der Fähigkeit zur Cytokinproduktion von tumorinfiltrierenden OT-I-Zellen durchgeführt. Wie schon in der Milz beobachtet wurde, gab es bereits während der Expansionsphase nur einen kleinen Anteil an cytokinproduzierenden OT-I-Zellen in tumorhaltiger Leber, der ebenfalls weiter abgenommen hatte. Bei der Kontrollgruppe hatte sich die Frequenz der IFNγ+ TNFα+ OT-I-Zellen um fast die Hälfte verringert (Abbildung 17C, 17D).

Die Fähigkeit der spezifischen CD8 T-Zellen (OT-I) zur Degranulation, gemessen anhand des Markers für Degranulation: CD107a, wurde in der Milz und in perfundierter Leber überprüft (Betts et al., 2003). Zur Überprüfung der Fähigkeit zur Cytokinproduktion und ihrer Sezernierung wurde die intrazelluläre Cytokinfärbung von IFNγ mit der CD107a-Färbung kombiniert. In der Milz der OVA+ tumortragenden Versuchstiere zeigten die OT-I-Zellen eine signifikante Reduktion dieser beiden Fähigkeiten verglichen mit der Kontrollgruppe, wo

% IFN+ TNF+ / OT-I 0 10 20 30 40

*** **

OVA+

Kontrolle

Tag 5 Tag 7

B A

% IFN+ TNF+ / OT-I 0 20 40 60

**** ****

Tag 5 Tag 7

OVA+

Kontrolle

C D

Abbildung 17: Verlust der Polyfunktionalität der spezifischen CD8 T-Zellen in tumortragenden Mäusen

(A) Durch HDI wurden OVA+ Tumore generiert. Nach einer Wachstumsphase des Tumors von 3 Wochen wurden 10⁴ OT-I-Zellen in tumortragende Mäuse bzw. in tumorfreie Kontrollen adoptiv transferiert. An Tag 5 und Tag 7 nach der LM-OVA-Infektion wurde zur Ermittlung der Expression cytotoxischer Moleküle durch die OT-I-Zellen in der Milz eine intrazelluläre Cytokinfärbung (ICS) von IFNγ und TNFα durchgeführt, und die Zellen wurden in der Durchflusszytometrie analysiert. Das Quadranten-Dot plot zeigt repräsentative Werte der Cytokinexpression von OT-I-Zellen aus den beiden Gruppen. (B) Die individuellen Mäuse sind in der statistischen Abbildung der Werte aus der Milz als einzelne Symbole abgebildet, Balken symbolisieren den Mittelwert (n = 3). (C) Es erfolgte auch die Bestimmung der Cytokinexpression der OT-I-Zellen aus dem tumortragenden Lebergewebe bzw. Leber von Kontrollmäusen an den gleichen Zeitpunkten. Das Quadranten-Dot plot zeigt Werte der Cytokinexpression repräsentativer Mäuse. (D) Die Cytokinexpression der OT-I-Zellen aus der Leber wurde statistisch dargestellt, wobei die einzelnen Symbole für individuelle Mäuse stehen, Balken symbolisieren den Mittelwert (n = 3).

sich die Frequenz der IFNγ+ CD107a+ OT-I-Zellen von Tag 5 bis Tag 7 nach der Infektion mit LM-OVA mehr als verdoppelt hatte (Abbildung 18A, 18B). Bei den tumorinfiltrierenden OT-I-Zellen war der Anteil der IFNγ+ CD107a+ Zellen auch deutlich verringert. Verglichen mit der tumortragenden Gruppe, blieb in den Lebern der Kontrolltiere die Fähigkeit zur IFNγ -Produktion und Degranulation relativ unverändert hoch, während die FACS-Analyse in tumorhaltigen Lebern eine Abnahme bei den IFNγ+ CD107a+ OT-I-Zellen zeigte

Abbildung 18: Verlust der Cytokinproduktion und Degranulation zeigt funktionelle Erschöpfung spezifischer CD8 T-Zellen in tumortragenden Mäusen

(A) Die Daten entstammen demselben Versuch, der in Abbildung 17 gezeigt wird. Um die Fähigkeit zur IFNγ-Produktion und -sekretion von OT-I-Zellen in der Milz zu analysieren wurde an Tag 5 und Tag 7 nach der LM-OVA-Infektion eine intrazelluläre Cytokinfärbung (ICS) von IFNγ und eine CD107a-Färbung durchgeführt. Das Quadranten-Dot plot zeigt repräsentative Werte von OT-I-Zellen aus den beiden Gruppen. (B) In der statistischen Auswertung sind die IFNγ CD107a doppelt-positive OT-I-Zellen abgebildet. Die einzelnen Symbole beziehen sich auf individuelle Mäuse, Balken symbolisieren den Mittelwert (n = 3). (C) Es wurde mittels ICS die Cytokin- und die CD107a-Expression im tumorhaltigen Lebergewebe bzw. Leber von Kontrollmäusen analysiert. Im Quadranten-Dot plot sind die Messwerte aus repräsentativen Tieren dargestellt. (D) Die statistische Darstellung der IFNγ- und CD107a-Färbung von OT-I-Zellen aus dem tumorhaltigen Lebergewebe bzw. Leber von Kontrollmäusen zeigt die Messwerte der individuellen Mäuse als Symbole, Balken symbolisieren den Mittelwert (n = 3).

TIGIT inhibiert tumorspezifische CD8 T-Zellen 3.6

Die zuvor gezeigten Daten aus der Durchflusszytometrie zur Expression von CD137 haben gezeigt, dass die Tumorumgebung für eine phänotypische Veränderung bei den spezifischen CD8 T-Zellen sorgt, die zuvor in der Milz nicht nachweisbar war. Hierbei handelte es sich um Untersuchungen in OVA+ tumortragenden Tieren. Eine Hochregulation von TIGIT auf den spezifischen CD8 T-Zellen wurde in Milz und tumorhaltiger Leber festgestellt. Um auszuschließen dass die Tumorumgebung einen Einfluss auf die Expression von TIGIT auf den tumorspezifischen CD8 T-Zellen hat, und zwar auch ohne das Vorhandensein des relevanten Antigens OVA im Tumor, sollten auch OT-I-Zellen aus OVA- tumorhaltigen Lebern analysiert werden. Klinische Daten weisen darauf hin, dass die Kombination aus verschiedenen Immun-Checkpoint-blockierenden Antikörpern zum verbesserten Überleben von Patienten beitragen (Wolchok et al., 2013; Postow et al., 2015). Aus diesem Grund sollte im Tumormodell, ohne Kenntnis über die exprimierten Antigene, die Relevanz von TIGIT bei der Immunsuppression überprüft werden. Dafür sollten Mäuse, die Tumoren aus murinen Hepatomzellen tragen, entweder mit anti-TIGIT blockierenden Antikörpern, oder mit anti-PD-1, oder mit anti-TIGIT in Kombination mit anti-PD-1 behandelt werden.

3.6.1 Untersuchung der Oberflächenexpression von PD-1 und TIGIT auf tumorspezifischen CD8 T-Zellen

Die Expression der beiden Oberflächenmarker TIGIT und PD-1 wurde im Versuch mit adoptiven T-Zell-Transfer und LM-OVA-Infektion in tumortragendem Lebergewebe bzw.

Lebern von Kontrollmäusen untersucht. Für diesen Versuch wurden jeweils orthotope Lebertumoren mit bzw. ohne Modellantigen mittels HDI in den C57BL/6J Mäusen generiert, wobei Mäuse ohne Lebertumoren als Kontrolle benutzt wurden (Abbildung 19A). Die OT-I-Zellen, welche die tumorhaltige Leber in der OVA+ Gruppe infiltrieren, zeigen im Quadranten-Gate eine starke Verschiebung hin zu einem PD-1+ TIGIT+ Phänotyp. Dagegen gab es bei den OT-I-Zellen aus der tumorhaltigen Leber in der OVA- Gruppe keine so deutliche Veränderung in der Oberflächenexpression von PD-1 oder TIGIT. Zwar traten mehr PD-1 positive OT-I-Zellen in der tumorhaltigen Leber der OVA- Gruppe als in den gesunden Kontroll-Lebern auf, jedoch bei der Oberflächenexpression von TIGIT wurden keine Unterschiede zwischen der OVA- Lebertumor-Gruppe und der Kontrollgruppe festgestellt (Abbildung 19B).

3.6.2 Untersuchung der Wirksamkeit der Immun-Checkpoint-Inhibition im