Klinik für Rinder
Einfluss der Fütterung von Omega-3-Fettsäure auf die Spermaqualität von Bullen
INAUGURAL – DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
( Dr. med. vet. )
vorgelegt von
Frauke Dehning
aus Rotenburg/ Wümme
Hannover 2008
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Heinrich Bollwein
1. Gutachter: Prof. Dr. H. Bollwein 2. Gutachter: Prof. Dr. J. Kamphues
Tag der mündlichen Prüfung: 19. November 2008
Diese Arbeit wurde von der MASTERRIND GmbH Verden finanziell unterstützt.
Meinen Eltern und
Martin
1. EINLEITUNG... 1
2. LITERATURÜBERSICHT... 3
2.1 Morphologie des Bullenspermiums... 3
2.1.1 Die Plasmamembran... 4
2.1.2 Das Akrosom... 4
2.1.3 Der Zellkern... 5
2.1.4 Die Mitochondrien... 5
2.2 Überblick über die Spermatogenese und Reifung der Spermien im Nebenhoden... 5 2.2.1 Spermacytogenese... 6
2.2.2 Spermiogenese... 6
2.2.3 Nebenhodenpassage... 6
2.3 Bedeutung und Einsatz von Docosahexaensäure... 7
2.3.1 Aufbau und Synthese... 7
2.3.2 Vorkommen und Bedeutung... 8
2.3.3 Omega-3-Fütterungsversuche bei Rindern und anderen Tierarten... 10
2.4 Reaktive Sauerstoffspezies (ROS)... 12
2.4.1 Physiologische Effekte von ROS... 12
2.4.2 Pathologische Effekte von ROS und oxidativer Stress... 12
2.4.2.1 Lipidperoxidation und Schäden an der Membran... 13
2.4.2.2 Schäden an intrazellulären Strukturen... 14
2.5 Einfluss der Kryokonservierung auf die Spermien... 15
2.6 Methoden zur Beurteilung der Spermaqualität... 16
2.6.1 Mikroskopische Beurteilung... 17
2.6.2 Durchflusszytometrische Untersuchungen... 17 2.6.2.1 Untersuchung der Plasmamembran- und der akrosomalen Integrität mittels
FITC-PNA/SYTO®17/PI–Färbung...
18 2.6.2.2 Untersuchung auf Lipidperoxidation in der Membran mittels
C11-Bodipy 581/591–Färbung...
19
2.6.2.3 Untersuchung auf das Vorhandensein von intrazellulärem Stress... 20
2.6.2.3.1 Erfassung mittels Dichlorofluoreszein (DCFH)... 21
2.6.2.3.2 Erfassung mittels Dihydrorhodamin123 (DHR)... 22
2.6.2.4 Untersuchung der Integrität der Spermachromatinstruktur mittels Sperm Chromatin Structure Assay (SCSATM)... 22 3. MATERIAL UND METHODEN... 24
3.1 Material... 24
3.1.1 Bullen... 24
3.1.2 Futter... 24
3.2 Methoden... 25
3.2.1 Versuchsdurchführung... 25
3.2.2 Gewinnung und Verarbeitung des Spermas... 28
3.2.3 Mikroskopische Untersuchungen der nativen Proben... 28
3.2.4 Durchflusszytometrische Untersuchungen... 29
3.2.4.1 FITC-PNA/PI-Färbung... 30
3.2.4.2 Dihydrorhodamin123 (DHR)/PI-Färbung... 31
3.2.4.3 Dichlorofluoreszein (DCFH)/PI-Färbung... 33
3.2.3.4 C11-Bodipy581/591 (Bodipy)/PI-Färbung... 35
3.2.4.5 Analyse der Spermachromatinstruktur (SCSA™)... 36
3.2.5 Bestimmung des Vitamin E-Status... 39
3.2.6 Bestimmung der Fettsäure-Methyl-Ester (FAME) in Spermienzellen... 39
3.2.6.1 Prinzip der Methode... 40
3.2.6.2 Probenaufbereitung... 40
3.2.6.3 Lipidisolation... 40
3.2.6.4 Kalibrierung... 41
3.2.6.5 Probenmessung und Auswertung... 41
3.2.7 Statistische Auswertung... 41
4. ERGEBNISSE... 43
4.1 Ergebnisse der Analyse der Fettsäuren in den Spermien... 43
4.2 Vergleich der Spermaparameter zwischen den Versuchsphasen und den Tiergruppen...
46
4.2.1 Konventionelle Spermaparameter... 46
4.2.2 Durchflusszytometrisch ermittelte Spermaparameter... 50
4.2.3 Vitamin E-Gehalt... 65
5. DISKUSSION... 66
5.1 Versuchsdesign... 66
5.2 Einfluss auf die Fettsäurezusammensetzung in den Spermien... 67
5.3 Einfluss auf die Spermaqualität... 69
5.4 Schlussfolgerungen und Ausblick... 73
6. ZUSAMMENFASSUNG... 75
7. SUMMARY... 77
8. LITERATURVERZEICHNIS... 79
9. ANHANG... 94
9.1 Medien zur Messung und Verdünnung des nativen Spermas... 94
9.1.1 TRIS Eigelb-Verdünner für Tiefgefriersperma... 94
9.1.2 Elektrolytlösung für Coulter Counter 10l... 95
9.2 Medien, Chemikalien und Geräte für die durchflusszytometrischen Versuche... 95 9.2.1 Tyrode-Medium... 95
9.2.2 Medien für SCSA... 96
9.2.3 Chemikalien... 97
9.2.4 Fluorochrome... 98
9.2.5 Geräte und Instrumente zur Spermaaufbereitung... 99
9.3 Gaschromatographie-Bedingungen... 100
9.4 Futtermittelzusammensetzung... 100
9.4.1 Omega-3-Fett Leinsamenöl... 100
9.4.2 Bergafat T-300... 100
9.4.3 Kraftfutter „Rinderspezialfutter“... 101
9.4.4 Mineralfutter... 101
9.4.5 Vitamin E-Konzentrat... 102
10. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS... 103
1. EINLEITUNG
Bei der instrumentellen Samenübertragung ist es sehr wichtig, dass das eingesetzte Sperma von guter Qualität ist, da bis zur Verbringung in den weiblichen Reproduktionstrakt verschiedene Verarbeitungsprozesse wie z.B. das Verdünnen, das Kühlen, das Einfrieren, sowie das Auftauen die Spermien schädigen können. Seit über fünfzig Jahren wird Bullensperma zwar erfolgreich kryokonserviert, dennoch überleben nur etwa fünfzig Prozent der Spermien diesen Prozess (HAMMERSTEDT et al. 1990; NAGY et al. 2004).
Eine wichtige Struktur, die während der Kryokonservierung einer sehr hohen Belastung ausgesetzt ist, ist die Plasmamembran der Spermien (QUINN 1981; HAMMERSTEDT et al.
1990). Diese spielt nicht nur eine wichtige Rolle hinsichtlich des Stoffaustausches zwischen extra- und intrazellulärem Milieu, sondern auch im Rahmen der Fertilisation (GADELLA et al. 1999). So hängt der Erfolg der Befruchtung ganz wesentlich von der Fluidität der Plasmamembran der Spermien ab. Diese wiederum wird beeinflusst von dem Gehalt an verschiedenen Fettsäuren (CEROLINI et al. 1997; KELSO et al. 1997c). Je höher der Anteil an ungesättigten Fettsäuren in der Plasmamembran ist, desto größer ist deren Fluidität (NISSEN u. KREYSEL 1983). Bei der Kryokonservierung der Spermien wurden Verschiebungen im relativen Gehalt an verschiedenen Fettsäuren beobachtet. So stieg in einer Studie von CEROLINI et al. (2001) die Menge an gesättigten und einfach ungesättigten Fettsäuren in Eberspermien auf Kosten der mehrfach ungesättigten Fettsäuren nach dem Gefrier- und Auftauprozess an. Diese Verschiebung im Fettsäurenmuster führten die Autoren auf die während des Einfrierens und Auftauens vermehrt ablaufenden Oxidationsprozesse zurück (CEROLINI et al. 2001).
Einige Studien zielen daher darauf ab, das Fettsäurenmuster in den Spermienmembranen zu beeinflussen und den Anteil an ungesättigten Fettsäuren zu erhöhen. ROOKE et al. (2001) und BRINSKO et al. (2005) konnten in Studien an Ebern bzw. Hengsten zeigen, dass sich durch die Fütterung von Thunfischöl der Anteil an mehrfach ungesättigten Fettsäuren in den Spermien steigern ließ und sich die Spermaqualität verbesserte.
Ein erhöhter Anteil an mehrfach ungesättigten Fettsäuren in der Spermienmembran kann jedoch nicht nur positive, sondern auch negative Effekte auf die männliche Fertilität haben.
Mehrfach ungesättigte Fettsäuren können die Bildung von Peroxiden, welche hauptsächlich
auf der Entstehung reaktiver Sauerstoffradikale basiert, induzieren und damit die Befruchtungsfähigkeit der Spermien reduzieren (SIKKA et al. 1995).
Da entsprechende Fütterungsversuche mit Bullen bisher nicht durchgeführt worden sind, ist es das Ziel der vorliegenden Arbeit zu überprüfen, ob die Spermaqualität und die Fettsäurenzusammensetzung der Spermienmembran von Bullen durch die orale Zufuhr von ungesättigten Fettsäuren beeinflusst werden
.
2. LITERATURÜBERSICHT
2.1 Morphologie des Bullenspermiums
Das reife befruchtungsfähige Bullenspermium (Abb. 1) gleicht in seinem grundsätzlichen Aufbau dem anderer Tierarten. Es gliedert sich in Kopf und Schwanz, wobei sich am Kopf ein akrosomaler und ein postakrosomaler Abschnitt unterscheiden lassen (SAACKE u.
ALMQUIST 1964). Der Schwanz wird in ein kurzes Halsstück, ein Mittelstück sowie ein Hauptstück und ein Endstück eingeteilt (SINOWATZ 2001). Nachfolgend werden nur die für das Verständnis der vorliegenden Arbeit wichtigsten Aspekte einiger biochemischer Veränderungen und der Morphologie des Spermiums aufgeführt.
Abb.1: Schematische Darstellung der Spermienmorphologie anhand eines Sagittalschnittes (modifiziert nach GADELLA et al. 2001)
Plasmamembran
äußere Akrosomenmembran Akrosomeninhalt
innere Akrosomenmembran Kernmembran
Chromatinsubstanz postakrosomale Zentriole Mitochondrien
akrosomaler Bereich
postakrosomaler Bereich Halsregion Mittelstück
Hauptstück
Endstück
Kopf
Schwanz
2.1.1 Die Plasmamembran
Die das Spermium umgebende Plasmamembran zeigt das typische Bauprinzip von Biomembranen mit einer Doppellipidschicht und eingelagerten Molekülen. Den Hauptbestandteil bilden Phospholipide, zwischen die Cholesterinmoleküle, Proteine, Glykolipide und Proteoglykane eingelagert sind. Die Zusammensetzung ist in den verschiedenen Bereichen Kopf, Hals und Schwanz unterschiedlich.
Bei Bullen sind die vorherrschenden Phospholipide Phosphatidylcholine, Cholinplasmalogen, Phosphatidylethanolamin, Ethanolaminplasmalogen, Phosphatidylserin, Sphingomyelin und Cardiolipin (POULOS et al. 1973b). Die häufigste, mit Phospholipiden veresterte Fettsäure von Bullenspermien ist die Docosahexaensäure (DHA C22:6 n3), eine mehrfach ungesättigte Omega-3-Fettsäure (POULOS et al. 1973b).
Durch ihre besondere Struktur ist die Plasmamembran relativ impermeabel für polare, elektrisch geladene Teilchen (BUDDECKE 1980). Wird die Plasmamembran z.B. durch tiefe Temperaturen geschädigt, kommt es zum Verlust der Membranfluidität und zur Auflösung der lamellären Doppelmembranstruktur. Die Membranpermeabilität und die metabolische Funktionsfähigkeit dieser biologischen Einheit werden somit stark gestört (WATSON 1981).
2.1.2 Das Akrosom
Während der Spermatogenese entsteht das Akrosom aus enzymgefüllten Vesikeln des Golgi- Apparates (EDDY u. O`BRIEN 1994). Es liegt als abgeflachtes Vesikel der apikalen Hälfte des Spermienkopfes kappenartig auf. Im Längsschnitt sind vier Membranschichten übereinander zu erkennen. Der Kernmembran liegt direkt die innere akrosomale Membran auf. Zwischen ihr und der äußeren Membran befindet sich die akrosomale Matrix. Die äußere akrosomale Membran ist von der Plasmamembran umschlossen. Dazwischen befindet sich ein cytoplasmatischer Spalt. Am äquatorialen Segment der Spermienzelle gehen die innere und äußere akrosomale Membran ineinander über (SCHUELKE 1982). Das Akrosom enthält die für die Interaktion zwischen Spermium und Eizelle unerlässlichen hydrolytischen Enzyme (Akrosin, Hyaluronidase, saure Hydrolasen und Esterasen), die bei Kontakt der beiden Zellen aktiviert werden.
2.1.3 Der Zellkern
Der Kopf des Spermiums ist fast vollständig vom Zellkern ausgefüllt. Der Zellkern besteht wiederum vollständig aus verpacktem Chromatin (LOVE u. KENNEY 1998). Als Chromatin bezeichnet man die DNA mit ihren nukleären Proteinen. Sie ist höher kondensiert als in somatischen Zellen und lamellenartig verpackt (SARTORI BLANC et al. 2001). Während der Spermiogenese und des Transportes der Spermien vom Hoden in den Nebenhoden verändert das Spermienchromatin mehrfach seine Struktur, bis es einen vorerst endgültigen Zustand erreicht (MEISTRICH et al. 1976). Die Zellkernproteine des diploiden Genoms, die Histone, werden im Verlauf der Spermatogenese durch kleinere Proteine, die Protamine, ersetzt. Durch die Komprimierung der Chromatinsubstanz wird während der Spermatogenese und der epididymalen Reifungsphase die Erbsubstanz vermehrt gegenüber mutagenen Substanzen und Umwelteinflüssen geschützt und ihre Integrität bis zur Fertilisation aufrechterhalten (LOVE u. KENNEY 1998; EVENSON u. JOST 2000).
2.1.4 Die Mitochondrien
Die Mitochondrien reifer Spermienzellen besitzen eine längsovale Form und sind schraubenartig im Mittelstück des Schwanzes angeordnet. Über Glykolyse und oxidative Phosphorylierung synthetisieren sie ATP-Moleküle, die unter anderem der Fortbewegung der Spermien dienen (GRAVANCE et al. 2000).
Für die Motilität der Spermien ist eine korrekte Funktionsweise der Mitochondrien essentiell (AUGER et al. 2001). Defekte Mitochondrien können nicht nur einen Motilitätsverlust bewirken, sondern sie können auch zu verringerter Lebensfähigkeit und morphologischen Veränderungen am Spermium führen. Für eine ungestörte Funktion der Mitochondrien ist eine korrekte Integrität Voraussetzung. Die mitochondriale Hülle besteht aber zu großen Anteilen aus Phospholipiden, die durch ROS oxidiert werden können. Letzteres kann wiederum nachteilige Auswirkungen auf die Kapazitation und Akrosomreaktion haben und damit eine verminderte Fruchtbarkeit bedingen (DE LAMIRANDE u. GAGNON 1992).
2.2 Überblick über die Spermatogenese und Reifung der Spermien im Nebenhoden Die Spermatogenese umfasst die Spermacytogenese als Entstehung und Vermehrung der Ursamenzellen (Spermatogonien) und die Spermiogenese als zytologische Transformation
der Spermatiden (siehe Abb. 2). Nach der Nebenhodenpassage, in der weitere Reifungs- vorgänge stattfinden, ist die Produktion von befruchtungsfähigen Spermatozoa abgeschlossen (BARTH u. OKO 1989).
2.2.1 Spermacytogenese
Aus den Ursamenzellen werden zunächst runde Spermatogonien gebildet und nach mitotischen Teilungen primäre Spermatiden. In den anschließenden Reifeteilungen wird der Chromosomensatz halbiert und es entstehen sekundäre Spermatiden (BERNDTSON u.
DESJARDINS 1974).
2.2.2 Spermiogenese
Die Differenzierung der Spermatiden zu Spermatozoen umfasst die speziesspezifische Aus- gestaltung des Spermienkopfes, die Bildung des Akrosoms und die Entwicklung des Schwan- zes (BERNDTSON u. DESJARDINS 1974). Der Prozess der Spermiogenese ist in vier Phasen eingeteilt: Golgi-, Kappen-, Akrosom- und Reifungsphase.
2.2.3 Nebenhodenpassage
Während der Nebenhodenpassage erfahren die Spermien verschiedene physiologische, biochemische und morphologische Veränderungen, die insgesamt als epididymale Spermienreifung bezeichnet werden und zur vollen Befruchtungsfähigkeit der Spermien führen (SINOWATZ 2001). Im Nebenhoden erfährt die Plasmamembran Veränderungen hinsichtlich ihrer Lipid- und Glykoproteinzusammensetzung (POULOS et al. 1973a, 1973b).
Außerdem wird die Motilität der Spermien von einer unkoordinierten Bewegung im Nebenhodenkopf zu einer gerichteten Vorwärtsbewegung im Nebenhodenschwanz verändert (SINOWATZ 2001).
Der Prozess der Spermatocytogenese dauert etwa 45 Tage, die Spermiogenese etwa 17 Tage und die Reifung im Nebenhoden zwischen 8-16 Tagen (SINOWATZ 2001).
Abb. 2: Verlauf der Spermatogenese und der Nebenhodenpassage der Spermien des Rindes (modifiziert nach BARTH u. OKO 1989).
2.3 Bedeutung und Einsatz von Docosahexaensäure (DHA) 2.3.1 Aufbau und Synthese
DHA ist eine mehrfach ungesättigte Fettsäure aus der Omega-3-Familie. Sie besteht aus 22 Kohlenstoffatomen und besitzt die erste von sechs Doppelbindungen am dritten C-Atom (siehe Abb. 3). Tiere können diese Fettsäure entweder direkt aus dem Futter aufnehmen oder aus Vorstufen von Omega-3-Fettsäuren, wie zum Beispiel Alpha-Linolensäure (C18:3n3), synthetisieren (SARGENT 1997). Alpha-Linolensäure ist in Lipiden enthalten, die in Chloroplasten vorkommen und somit über frische Blätter und Gras in kleineren Mengen aufnehmbar. Beim Silieren wird der Anteil reduziert. Leinsamenöl ist eines der wenigen pflanzlichen Öle, die Alpha-Linolensäure in größerer Menge enthalten. Fischöl ist besonders reich an Alpha-Linolensäure und DHA und stellt eine gute Aufnahmequelle dar (SARGENT 1997).
Bei Ratten werden die längerkettigen Fettsäuren hauptsächlich in den Mikrosomen der Leber synthetisiert. Dort befinden sich die Desaturasen für den Einbau der Doppelbindungen und die Elongasen für die Kettenverlängerung. Beim Rind wird in der Leber nur wenig Aktivität von Desaturasen, hingegen aber Aktivität von Elongasen nachgewiesen (ST JOHN et al.
1991). In einem Versuch wurde der Umbau von Palmitat zu Oleat beurteilt und dabei
beobachtet, dass die Synthese hauptsächlich in den Mikrosomen des subkutanen Fettgewebes stattfindet (ST JOHN et al. 1991).
ω3-FS-Elongation in der Leber
• Ausgangsstoff α-LinolensäureC18:3n3
• Stufenweises Einfügen von Doppelbindungen und Kettenverlängerung mittels Desaturasen und Elongasen
• Nach mehreren Schritten Produkt DocosahexaensäureC22:6n3
Abb. 3: Schema der Omega-3-Fettsäure-Elongation im Gewebe (nach SOLVAYPHARMA 2003)
2.3.2 Vorkommen und Bedeutung
Die Omega-3-Fettsäure DHA ist in der Spermienmembran von Säugetieren eine der häufigsten Fettsäuren. Der Anteil variiert jedoch bei den verschiedenen Tierarten. So enthalten Bullenspermien 61,1% und Widderspermien 61,4% DHA, Eberspermien und humane Spermien hingegen nur 37,7% bzw. 35,2% DHA (SALEM et al. 1986). Der Koalabär hat ebenfalls einen hohen Anteil, nämlich 59,2 %, der Wombat 42% und das Känguru nur 30,6% DHA in der Spermienmembran, wobei die Spermien der letzten drei Tierarten aus dem Nebenhodenschwanz entnommen wurden (MILLER et al. 2004). Bei Vögeln (KELSO et al.
1996) überwiegt der Anteil an Omega-6-Fettsäuren, vor allem der Arachidonsäure (20:4n-6) und der Docosatetraensäure (22:4n-6).
Omega-3-FS-Elongation im Gewebe
Ein hoher Anteil von DHA wird mit einer erhöhten Fluidität der Membran und einer erhöhten Motilität der Spermien beim Hahn (CEROLINI et al. 1997) und auch beim Menschen (NISSEN u. KREYSEL 1983) assoziiert. Bei Männern, in deren Ejakulaten Spermien mit herabgesetzter Beweglichkeit auftreten (Asthenozoospermie), findet man verminderte DHA- Gehalte in der Spermienmembran und im Seminalplasma, jedoch nicht im Blutserum (CONQUER et al. 1999). Auch eine orale Zufuhr von DHA an Männer mit Asthenozoospermie bewirkt keine Erhöhung des DHA-Anteils in den Spermien. Es tritt nur eine leichte Steigerung der DHA-Konzentration im Serum und im Seminalplasma ein. Es ist daher anzunehmen, dass eventuell nur Vorstufen von DHA wie z.B. Alpha-Linolensäure in Spermien aufgenommen werden können. Nach der oralen Aufnahme von DHA ist außerdem keine Zunahme der Motilität der Spermien zu verzeichnen. (CONQUER et al. 2000).
Ein reduzierter Anteil an DHA in den Spermalipiden vom Menschen, z.B. bedingt durch verstärkte Lipidperoxidation oder Asthenozoospermie, ist assoziiert mit einer verminderten Konzentration des Spermas sowie mit Spermien mit geringerer Vorwärtsmotilität und vermehrten morphologischen Veränderungen (NISSEN u. KREYSEL 1983; ZALATA et al.
1998; CONQUER et al. 1999).
Eine altersbedingte Reduzierung von Volumen, Qualität und Fruchtbarkeit des Ejakulates bei Hähnen (KELSO et al. 1996; CEROLINI et al. 1997; KELSO et al. 1997b) und Bullen (KELSO et al. 1997c) wird auch auf eine Abnahme von mehrfach ungesättigten Fettsäuren (C20 bis C22) in der Spermienmembran zurückgeführt.
Bei Hengsten wird ein hoher Anteil an DHA bzw. ein hohes Verhältnis von Omega-3- zu Omega-6-Fettsäuren mit einer besseren Kryokonservierbarkeit assoziiert (BRINSKO et al.
2005). Ähnliches gilt auch für andere Tierarten. Bullensperma lässt sich gut einfrieren und besitzt einen hohen Anteil an DHA. Im Vergleich dazu beinhaltet das Sperma von Hengsten und Ebern einen höheren Anteil der Omega-6-Fettsäure Docosapentaensäure (DPA). Die Kryokonservierung der Spermien dieser beiden Spezies gestaltet sich deutlich problematischer (PARKS u. LYNCH 1992).
Es wird außerdem berichtet, dass das Sperma vom Afrikanischen Elefanten gut kryokonserviert werden kann und das vom Asiatischen Elefanten hingegen nicht. Der Afrikanische Elefant hat im Gegensatz zum Asiatischen deutlich höhere Anteile an DHA und DPA (SWAIN u. MILLER 2000). Ähnliches ist auch beim Fuchs beschrieben. Sperma vom
Silberfuchs mit hohen DPA-Gehalten lässt sich im Vergleich zu demjenigen des Blaufuchses, das niedrigere DPA-Gehalte aufweist, gut einfrieren (MILLER et al. 2005).
Wichtig ist aber nicht nur ein hoher Anteil an DHA, sondern auch das Verhältnis von ungesättigten zu gesättigten Fettsäuren. Das Sperma der Säugetiere lässt sich dabei in zwei Gruppen einteilen: Die eine hat einen hohen Quotienten (2,5-3,0) und lässt sich relativ einfach einfrieren, die andere Gruppe hat einen niedrigeren Quotienten (1,0) und lässt sich vergleichsweise schlecht kryokonservieren (WHITE 1993).
Dem widersprechen jedoch Untersuchungen an Beuteltieren. Das Sperma von Kängurus und Koalas hat ein Verhältnis von ungesättigten zu gesättigten Fettsäuren von 5,2 bzw. 7,6 in der Spermienmembran und lässt sich schlecht oder gar nicht kryokonservieren. Das Sperma von Wombats hingegen besitzt nur einen Quotienten von 1,9 und lässt sich sehr wohl kryokonservieren (MILLER et al. 2004).
2.3.3 Omega-3-Fütterungsversuche bei Rindern und anderen Tierarten
Während der Spermienreifung treten verschiedene Änderungen an den Spermien auf. Es ist vor allem zu beobachten, dass der Anteil an Phospholipiden in der Membran im ejakulierten Sperma niedriger ist als beim unreifen Sperma im Hoden. Im Gegensatz dazu nimmt der Anteil an DHA im Ejakulat zu. Er steigt von 35,8 Gewichtsprozent im Hoden auf 56 Gewichtsprozent im ejakulierten Sperma des Bullen an (POULOS et al. 1973b). Eine Abnahme der Phospholipide sowie eine Änderung der Fettsäurenzusammensetzung während des Reifungsprozesses vom Nebenhodenkörper bis zum Nebenhodenschwanz, sind auch bei Ratten beschrieben (AVELDANO et al. 1992).
Dies lässt die Annahme zu, dass das Fettsäurenmuster der Spermien diätetisch beeinflussbar ist (KELSO et al. 1997a). Diese Hypothese wurde in verschiedenen Fütterungsversuchen überprüft (KELSO et al. 1997b; ROOKE et al. 2001; BRINSKO et al. 2005).
Sperma von Vögeln und Säugetieren unterscheidet sich, wie bereits oben erwähnt, hinsichtlich seiner Fettsäurenzusammensetzung in der Plasmamembran. Vögel besitzen mehr Fettsäuren vom Omega-6-Typ und Säuger mehr vom Omega-3-Typ. In einem Fütterungsversuch von KELSO et al. (1997a) wurde untersucht, ob das Fettsäurenmuster phylogenetisch determiniert ist oder sich durch eine Fütterung mit Omega-3-Fettsäuren in Richtung des Fettsäurenmusters von Säugern verschieben lässt. In dem Versuch wurde das
Omega-3-Fett aus Thunfischöl über 48 Wochen an Hähne verfüttert. Durch die Fischöl- Supplementierung wurde eine signifikante Änderung im Verhältnis von Omega-6- zu Omega- 3-Fettsäuren erzielt, indem die Konzentration von Omega-6 (Docosapentaensäure) ab- und die von Omega-3 (Docosahexaensäure) zunahm. Der Anteil von DHA in den Spermien wurde von 3,8 auf 9,8% gesteigert, erreichte jedoch nicht so hohe Werte wie bei Säugern (Bulle 61,3% und Eber 37,7%). Das Fettsäurenmuster ist demnach zwar genetisch determiniert, aber in einer gewissen Spannweite veränderbar (KELSO et al. 1997a).
Beim Schwein wurde der Effekt von Thunfischöl auf die Lipidzusammensetzung im Sperma und der Effekt auf die in vitro-Charakteristika überprüft (ROOKE et al. 2001). Den Ebern wurde über 6 Wochen zusätzlich zum Grundfutter Thunfischöl und Vitamin E supplementiert.
Der Anteil von DHA in der Spermamembran erhöhte sich von 34,5g auf 42,9g und der Anteil von DPA sank von 29,8g auf 17,9g, wobei die Werte jeweils auf 100g der gesamten Fettsäuren bezogen wurden. Außerdem hatte die Anzahl von vorwärtsbeweglichen Spermien zugenommen. Auch der Anteil von Spermien mit normaler Morphologie sowie mit intaktem Akrosom war angestiegen.
BRINSKO et al. (2005) haben bei Hengsten überprüft, ob eine zusätzliche DHA-Fütterung die Qualität von frischem, gekühltem und gefrorenem Sperma beeinflusst. Acht Hengsten wurde in einem Latin-Square-Verfahren über jeweils 14 Wochen DHA und Omega-3- Fettsäuren zur Grundration supplementiert. Der DHA-Anteil pro Spermium erhöhte sich während der Omega-3-Fett-Fütterung auf das Dreifache. Der Quotient von DHA zu DPA stieg um das 1,5fache an. Im flüssigkonservierten Sperma änderten sich die Bewegungsmerkmale nicht. Erst nach 48 Stunden Kühlung war die Total- und Vorwärtsbeweglichkeit bei den Spermien der mit DHA gefütterten Hengste höher als bei den Spermien der Kontrollgruppe. Nach Füttern des Omega-3-Fett-Supplements nahm die Motilität im gekühlten Sperma nach 24-stündiger Lagerung nur um 32% anstatt um 50% ab.
Besonders profitierten Hengste mit einer Vorwärtsbeweglichkeit der Spermien von unter 40%
nach 24-stündiger Lagerung von der Omega-3-Fett-Zulage. Die Motilität war hier zwar noch immer suboptimal, aber nach dem Einfrieren tendenziell besser als ohne Supplement.
Beim Rind wurden bisher Studien mit ungesättigten Fettsäuren unter anderem mit dem Ziel durchgeführt, das Fettsäurenmuster der Milch (ABUGHAZALEH et al. 2003) bzw. des Fleisches (WOOD et al. 1999; SCOLLAN et al. 2001; GILLIS et al. 2004) zu beeinflussen.
Im Gegensatz zum Monogastrier stehen dem Wiederkäuer oral zugeführte ungesättigte Fettsäuren nicht direkt zur Aufnahme im Darm zur Verfügung. Bei Wiederkäuern stellt die Biohydrogenierung der ungesättigten Fette durch die Bakterien im Pansen ein Problem dar (DROCHNER 1996; HAGEMEISTER 1997). Deswegen wurden verschiedene Verfahren entwickelt, um diesen Prozess zu umgehen. Jedoch sehen verschiedene Autoren in Methoden wie dem Coating (ASHES et al. 1992), der Verseifung (PALMQUIST u. SCHANBACHER 1991) oder der Amidbildung (FOTOUHI u. JENKINS 1992) die Gefahr, dass das eingesetzte ungesättigte Fett nur unvollständig vor der Biohydrogenierung im Pansen geschützt wird.
2.4 Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) 2.4.1 Physiologische Effekte von ROS
ROS (reactive oxygen species) sind sehr kurzlebige (10-11 bis 10-9 sec), stark oxidierende Reaktionspartner, die gerne mit anderen organischen Stoffen reagieren, um ihre eigene Elektronenstruktur zu stabilisieren. Sie sind durch ein oder mehrere freie Radikale gekennzeichnet, die bei Reaktion eine Oxidation oder Reduktion des Reaktionspartners bewirken (GRIVEAU u. LE LANNOU 1997). Zu den ROS zählen laut SIKKA (2001) die Superoxidanionen (O2-), Hydrogenperoxide (H2O2), Peroxylradikale (ROO·) und die überaus reaktiven Hydroxylradikale (OH·).
ROS haben neben pathologischen auch physiologische Effekte. In geringen Konzentrationen wirken sie u.a. als Mediatoren bei der Spermienkapazitation mit (GRIVEAU u. LE LANNOU 1997). Bei Rinderspermien wird eine niedrige Konzentration von ROS im Ejakulat für die Fusion von Spermium und Oozyte als wichtig erachtet (BLONDIN et al. 1997). Auch bei Elektronentransferreaktionen, Regulationsprozessen und bei der Bakterienabwehr haben Radikale eine physiologische Funktion (AITKEN u. FISHER 1994). Sie werden in höheren Konzentrationen von Leukozyten produziert und wirken bei der Phagozytose mit (BAUMBER et al. 2000).
2.4.2 Pathologische Effekte von ROS und oxidativer Stress
Unter physiologischen Bedingungen besteht ein Gleichgewicht zwischen den produzierten und den von Antioxidantien abgefangenen Radikalen (DANDEKAR et al. 2002). Das Gleichgewicht kann zum Beispiel durch Temperaturänderungen in Richtung erhöhter
Radikalproduktion verschoben werden (NEILD et al. 2005). Somit entsteht für die Spermien oxidativer Stress mit unterschiedlichen Auswirkungen. Beim „oxidativen Stress“ handelt es sich um Vorgänge, die sich negativ auf die Spermien auswirken, verursacht durch die Anwesenheit von reaktiven Sauerstoffspezies. Diese Radikale können zum einen von den Spermien selbst oder auch von kontaminierenden Leukozyten produziert werden (PLANTE et al. 1994). Spermien produzieren hauptsächlich O2·- Radikale (BALL et al. 2001). Bei den Spermien, die Radikale produzieren, handelt es sich um unbewegliche, morphologisch abnormale Spermien oder um morphologisch normale, aber funktionell abnormale Spermien (PLANTE et al. 1994).
2.4.2.1 Lipidperoxidation und Schäden an der Membran
Die Membran der Spermien enthält viele an Phospholipide und Cholesterin gebundene ungesättigte Fettsäuren, die bevorzugte Substrate für die ROS darstellen (BROUWERS et al.
2005). Bei dem Zusammentreffen mit ROS unterliegen die reichlich vorhandenen ungesättigten Fettsäuren der Autoxidation (Lipidperoxidation). Bei der Lipidperoxidation gibt es zwei unterschiedliche Wege, den nicht enzymatischen und den enzymatischen Weg.
Beim nicht enzymatischen Weg greifen die ROS an den Doppelbindungen der ungesättigten Fettsäuren an und produzieren ein Lipidradikal. Hier beginnt eine Kettenreaktion. Das entstandene Alkylradikal wandelt sich zu einem gebundenen Dien um, welches im Anschluss mit Sauerstoff zu einem sehr reaktiven Peroxylradikal (LOO·) reagiert. Die entstehenden Alkyl- und Peroxylradikale können erneut weitere Doppelbindungen der ungesättigten Fettsäuren angreifen und, je nach Dichte, weitere Peroxidationsprozesse an der Spermien- membran auslösen. Dies führt zu einer Destabilisierung und zu Einbußen in der Funktion.
Sind Übergangsmetalle wie z.B. Kupfer oder Eisen vorhanden, so können immer wieder neue Reaktionsketten von gebildeten Lipidhydroperoxiden gestartet werden (Fenton-Reaktion) und der Grad der Lipidperoxidation steigt an. Erst wenn zwei Radikale miteinander reagieren, kommt es zum Kettenabbruch (GRIVEAU u. LE LANNOU 1997). Die während dieses Prozesses entstehenden Lipidperoxide wirken sich negativ auf die Motilität der Spermien aus und führen zu einem Verkleben der Spermien untereinander (KIM u. PARTHASARATHY 1998). Die Fruchtbarkeit des Spermas wird durch die eingeschränkte Motilität sowie durch die Störung der Allgemeinfunktion des Spermiums herabgesetzt (SIKKA 2001).
Die enzymatische Peroxidation ist NADPH- und ADP-abhängig und führt letztendlich zu dem Produkt Malondialdehyd (MDA). Die Ermittlung des MDA-Gehaltes dient als Indikator für die Lipidperoxidation der Spermien. Die bei der Lipidperoxidation entstehenden Aldehyde sind für die Spermien selbst hochtoxisch und führen zu einem Motilitätsverlust (ALVAREZ et al. 1987; SELLEY et al. 1991).
Die durch die Peroxidbildung hervorgerufenen Schäden sind zum Teil durch noch nicht bekannte Mechanismen reparabel (DE LAMIRANDE u. GAGNON 1992). Trotzdem hat die durch die Lipidperoxidation beeinträchtigte Fluidität der Spermamembran weitreichende Folgen: So wird dadurch die Fähigkeit zur Akrosomenreaktion und Oozytenpenetration verschlechtert (AITKEN et al. 1991; AITKEN et al. 1993) und die Fruchtbarkeit des Spermas nimmt ab (SIKKA 2001).
2.4.2.2 Schäden an intrazellulären Strukturen
Ziel für den Angriff von ROS ist nicht nur die Plasmamembran. Laut SIKKA et al. (1995) wird auch die spermale DNA geschädigt. Die Schädigung kann einerseits durch Oxidation von DNA-Basen und Disulfidgruppen von Proteinen geschehen (SIKKA et al. 1995), andererseits auch durch kovalente Bindungen, die zu Strangbrüchen und Cross-Linkings führen können (ERNSTER 1993). In jedem Fall kann die Erbinformation nicht mehr korrekt weitergegeben werden (SIKKA et al. 1995), weil Spermien nicht die Fähigkeit besitzen, ihre DNA zu reparieren. Eine Reparatur ist erst nach der Fusion mit der Oozyte möglich (AITKEN et al. 2003).
Auch die Mitochondrien und deren Syntheseprodukte sind vom oxidativen Stress betroffen.
Der Funktionsverlust beruht laut SIKKA (2001) auf zwei Ursachen: 1. Die Reaktion von H2O2 mit intrazellulärem ATP bedingt ein Energiedefizit und geht mit einem Abfall der Motilität einher. 2. Die reaktiven Sauerstoffspezies können mit den in der Hülle der Mitochondrien enthaltenen Phospholipiden reagieren (ALVAREZ u. STOREY 1982). Für eine physiologische Funktion ist aber eine intakte Membran unabdingbar (SIKKA 2001).
SIKKA (2001) fand bei Versuchen mit menschlichen Spermien heraus, dass besonders das an Mitochondrien reiche Mittelstück von oxidativen Prozessen betroffen ist. Laut DE LAMIRANDE und GAGNON (1992) wird durch den oxidativen Stress die Fähigkeit zur Kapazitation und Akrosomreaktion negativ beeinflusst. Bei in vitro-Versuchen mit
Hengstsperma führte eine erhöhte Konzentration von ROS zu einer herabgesetzten Motilität, aber es war keine messbare negative Beeinflussung der Akrosomenintegrität und der Lebensfähigkeit der Spermien zu beobachten (BAUMBER et al. 2000). Hydrogenperoxide (H2O2) lösen bei Pferdespermien die stärksten zytotoxischen Effekte aus (BALL et al. 2001).
Laut KIM u. PARTHASARATHY (1998) scheinen die Hydrogenperoxide (H2O2) bei in vitro-Versuchen am meisten toxisch zu sein.
2.5 Einfluss der Kryokonservierung auf die Spermien
Obwohl Bullenspermien seit über fünfzig Jahren erfolgreich kryokonserviert werden, sind die Einfrierbedingungen immer noch suboptimal und bedürfen weiterer Forschung (HAMMERSTEDT et al. 1990; NAGY et al. 2004). Durch funktionelle und strukturelle Einbußen überlebt nur etwa die Hälfte der Spermien des frischen Ejakulates diesen Prozess (HOLT 2000).
Für die Schädigung der Spermien ist vor allem das zweimalige Durchlaufen der kritischen Temperaturzone von –15° C bis –60° C verantwortlich. Dies geschieht jeweils einmal beim Einfrieren und dann noch einmal beim Auftauen (MAZUR 1977).
Je nach Zusammensetzung des Verdünners und der Gefrierrate setzt zwischen -5° C und -15° C die Eiskristallbildung im Extrazellularraum ein. Da durch die Plasmamembran die Eisbildung in der Zelle verzögert wird, entsteht ein osmotisches Gefälle zwischen dem Extrazellularraum und dem Zellinneren (MAZUR 1977).
Neben den osmotischen Veränderungen treten auch Veränderungen an der Plasmamembran auf. Nur bei Körpertemperatur ist die Membran dynamisch und beweglich (QUINN 1981).
Eine Abkühlung verschiebt den Aggregatzustand der Phospholipide vom flüssigen in den kristallinen Bereich. Dabei sammeln sich in den Bereichen der flüssigen Lipide Proteine an.
In den kristallinen Bereichen bilden sich Aggregate mit hexagonaler Struktur. Diese hexagonale Struktur führt zu einem gestörten Ionentransport durch die Membran, da zusätzliche Poren gebildet werden. In einigen Teilen der Membran wird die hexagonale Struktur auch nach dem Wiedererwärmen beibehalten (AMANN u. PICKETT 1987).
Begründet auf dem osmotischen Gefälle zwischen dem Extrazellular- und Zellinnenraum sowie auf den zusätzlich gebildeten Poren in der Plasmamembran kommt es zu einer pH-
Wert-Verschiebung in der Samenzelle. Dies zieht eine Denaturierung von Membranen und Proteinen nach sich. Der Ablauf findet analog beim Auftauen statt (MAZUR 1977).
Insgesamt werden gravierende Änderungen der Membranpermeabilität ausgelöst, die bis zum Tod der Spermienzelle führen können (MAZUR 1977).
Bei einer Studie von BALL (2001) an Pferdesperma stieg die H2O2-Produktion im Frisch- sowie im Tiefgefriersperma nach dem Auftauen signifikant mit der Zeit und der Spermien- konzentration an. Nach dem Auftauprozess war die Menge an produziertem H2O2 wiederum signifikant größer als die im Frischsperma vorhandene Menge (BALL et al. 2001).
Kryokonservierte Bullenspermien sind nach dem Gefrier- und Auftau-Prozess empfindlicher gegenüber Lipidperoxidation als frische Spermien (BROUWERS u. GADELLA 2003). Die Zugabe von Vitamin A zum Sperma kann die Plasmamembran auch während der Kapazitation vor der Lipidperoxidation schützen (O'FLAHERTY et al. 1997).
In einer Studie von CEROLINI et al. (2001) mit Ebersperma nahm die Menge an gesättigten und einfach ungesättigten Fettsäuren auf Kosten der mehrfach ungesättigten Fettsäuren nach dem Gefrier- und Auftauprozess zu. Dieser Anstieg wurde auf Oxidationsprozesse und Schäden an den Membranen während der Kryokonservierung zurückgeführt (CEROLINI et al. 2001).
Auch DARIN-BENNETT et al. (1973) beschreiben, dass es aufgrund des Kälteschocks zum Verlust von Lipiden aus der Spermienmembran kommt.
2.6 Methoden zur Beurteilung der Spermaqualität
Nachfolgend soll erläutert werden, an welchen Methoden sich die Analyse der für diese Arbeit relevanten Untersuchungsparameter orientiert. Das Volumen und die Konzentration des Ejakulates werden makroskopisch ermittelt. Mikroskopisch wird die Vorwärtsmotilität der Spermien geschätzt. Durchflusszytometrisch werden mehrere Parameter bestimmt. Es handelt sich dabei um die Integrität der Plasmamembran und den akrosomalen Status, die Integrität der Spermienchromatinstruktur, die Erfassung des intrazellulären Stresses und der Lipidperoxidation der Membran.
2.6.1 Mikroskopische Beurteilung
Bei der konventionellen mikroskopischen Erfassung mittels Auge und Mikroskop wird die Gesamtmotilität, sowie der Anteil an vorwärts-, orts- und unbeweglichen Spermien ermittelt.
Diese Beurteilungen sind einer gewissen Subjektivität unterworfen (MALMGREN 1997).
Deswegen sieht MALMGREN (1997) in der computergestützten Auswertung eine Möglichkeit, bessere Aussagen hinsichtlich der Fertilität zu bekommen.
Über den Zusammenhang zwischen Motilität und Fertilität bestehen kontroverse Aussagen:
DOWSETT u. PATTIE (1982) gehen von keiner Korrelation aus, während SAMPER et al.
(1991) und JASKO et al. (1992) hingegen positive Zusammenhänge fanden.
2.6.2 Durchflusszytometrische Untersuchungen
Das Verfahren der Durchflusszytometrie ermöglicht es, in kurzer Zeit viele lebende Zellen zu beurteilen. Mit geringem Aufwand können die Zellen mit Fluoreszenzfarbstoffen angefärbt und gemessen werden. Damit ist das Durchflusszytometer eine gute technische Lösung, um schnelle, präzise und reproduzierbare Messungen von Zellsuspensionen, einschließlich Spermienzellen, durchzuführen (THOMAS et al. 1997; NAGY et al. 2003).
Das Prinzip des Durchflusszytometers beruht darauf, dass mit Fluoreszenzfarbstoffen gefärbte Zellen an einem fokussierten Laserstrahl vorbeigeführt werden. Nach Anregung emittieren die gefärbten Zellen entsprechend ihres Farbstoffes Licht bestimmter Wellenlängen, das von Detektoren aufgefangen, gemessen und interpretiert wird. Das Prinzip der hydrodynamischen Fokussierung garantiert, dass die Zellen nur einzeln den gemeinsamen Fokus von Anregungslicht (Laserstrahl) und Nachweisoptik passieren (NEBE 1996).
Das emittierte Licht wird in Spannungsimpulse umgewandelt. Anschließend werden die analogen in digitale Signale umgewandelt, welche die Weiterverarbeitung der Daten durch einen an das Durchflusszytometer angeschlossenen Computer ermöglichen (BALLACHEY et al. 1986). Eine detaillierte Beschreibung des Verfahrens findet sich in der Dissertation von BAARZ (2006).
Je nach Wahl des Fluorochroms können verschiedene Zelleigenschaften sowie Änderungen der Zellfunktionen des Spermiums überprüft werden. Durch gezielte Kombination von
Fluorochromen können auch mehrere Zellfunktionen gleichzeitig bestimmt werden (GARNER et al. 1997; NAGY et al. 2003).
2.6.2.1 Untersuchung der Plasmamembran- und der akrosomalen Integrität mittels FITC-PNA/SYTO®17/PI – Färbung
Bei der Untersuchung der akrosomalen Integrität gilt es, die „echte“ Akrosomreaktion von der
„falschen“ zu unterscheiden. Bei der „echten“ Akrosomreaktion handelt es sich um einen physiologischen Vorgang der lebenden Zellen. Bei der „falschen“ Akrosomreaktion liegt ein degenerativer Vorgang, verursacht durch Autolyse bei Tod, Kryokonservierung und Alterungsprozessen, vor (BEDFORD 1970).
Zur Erhebung der akrosomalen Integrität und der Lebensfähigkeit eignen sich kombinierte Färbemethoden mit mehreren Farbstoffen. THOMAS et al. (1997) beschreiben diese Methode erstmals an kryokonservierten, unfixierten Bullenspermien. Dabei werden die Farbstoffe Fluoreszein-Isothiocyanat (FITC), SYTO®17 sowie Propidiumjodid (PI) eingesetzt. Der Fluoreszenzfarbstoff Fluoreszein-Isothiocyanat (FITC) dient als Nachweis für eine stattgefundene Akrosomreaktion. Dieser Farbstoff ist an das Lektin PNA (Peanut Agglutinin von Arachis hypogea) gekoppelt, welches selektiv an die äußere Akrosommembran bindet (MORTIMER et al. 1987; BLOTTNER et al. 1998). Nach Anregung mit Laserlicht emittiert der gekoppelte Farbstoff grün fluoreszierendes Licht. PNA ist dem Lektin PSA (Pisum sativum) vorzuziehen, da mögliche Eigelbpartikel aus dem Verdünnermedium eine Affinität zu PSA besitzen (THOMAS et al. 1997).
SYTO®17 ist ein membranpermeabler Stoff, der die DNA von lebenden, membranintakten und toten, membrangeschädigten Spermien anfärben kann. Nach Laseranregung erscheint eine orange Kernfluoreszenz. Propidiumjodid (PI) kann nur die DNA membrangeschädigter, also toter Spermien anfärben. Es emittiert Rotfluoreszenz nach Laseranregung und verdrängt SYTO®17 von der DNA (GARNER et al. 1994).
Mit der kombinierten Färbung von FITC-PNA/SYTO®17/PI lassen sich vier verschiedene Populationen von Spermien unterscheiden:
1. lebende Spermien mit intaktem Akrosom: orange Kernfluoreszenz
2. lebende Spermien mit Akrosomreaktion: orange Kernfluoreszenz; grüne Akrosomfluoreszenz
3. tote Spermien mit intaktem Akrosom/fehlendem Akrosom: rote Kernfluoreszenz 4. tote Spermien mit Akrosomreaktion: rote Kernfluoreszenz; grüne Akrosomfluoreszenz Demnach lassen sich vitale von toten und akrosomgeschädigte von nicht akrosomgeschädigten Spermien unterscheiden (THOMAS et al. 1997).
Eine weitere Methode, um diese Zelleigenschaften zu definieren, ist die von NAGY et al.
(2003) beschriebene Dreifach-Färbung mit den Fluoreszenzfarbstoffen SYBR–14, PE-PNA und Propidiumiodid. Sie beruht auf dem oben beschriebenen Prinzip. Anstelle von FITC-PNA wird hier Phycoerythrin-PNA verwendet, ein Stoff, der nach Laseranregung rot fluoresziert.
SYBR-14 ist ein membranpermeabler Fluoreszenzfarbstoff, der sich an die DNA anlagert und nach Laseranregung grün fluoresziert. RATHI et al. (2001) wandten zur Erhebung des akrosomalen Status von lebenden Spermien eine kombinierte Färbung ausschließlich mit den beiden Farbstoffen FITC-PNA und Propidiumjodid an.
2.6.2.2 Untersuchung auf Lipidperoxidation in der Membran mittels C11-Bodipy 581/591 – Färbung
Der Farbstoff C11-Bodipy 581/591 ist ein fluoreszierendes Fettsäurenanalogon, mit einem Emissionsmaximum im roten Bereich bei 595 nm. Nach einer mittels Radikalen induzierten Oxidation ändert sich das Farbspektrum hin zur Grünfluoreszenz bei 545 nm (DRUMMEN et al. 2002).
Der Farbstoff ist nicht anfällig für Umweltveränderungen wie z.B. pH-Wert-Verschiebungen und kaum toxisch. Er ist in der Lipiddoppelschicht verankert und bleibt auch im oxidierten Zustand lipidlöslich und verlässt die Membran nicht. Im Gegensatz zur Messung des Malondialdehyds, einem späten Produkt der Lipidperoxidation, zeigt C11-Bodipy581/591 schon geringe durch ROS bedingte Veränderungen in der Membran an. Außerdem wird die Lipidperoxidation einzelner Zellen gemessen und nicht die des gesamten Ejakulates (DRUMMEN et al. 2002).
Der Vorteil dieses Farbstoffes ist außerdem, dass er sich in Bezug auf den Angriff von ROS wie die Membranlipide verhält. Gegenüber OH•, Peroxyl, Alkoxyl und ONOO- zeigt sich Bodipy sehr reaktiv, wohingegen die Anwesenheit von O2•-, NO•, H2O2 und Hydroperoxiden keinen oxidierenden Einfluss hat. Er ist in der Lage, in die meisten Zellmembranen einzudringen, ohne dabei eine bestimmte Organelle zu bevorzugen (DRUMMEN et al. 2002).
Aufgrund der genannten Eigenschaften eignet sich C11-Bodipy 581/591 dazu, den Grad der Lipidperoxidation in Membranen zu erfassen und die antioxidative Kapazität von Modell- Membran-Systemen darzustellen. Die Zunahme der Grünfluoreszenz kann als Maß für die Lipidperoxidation angesehen werden (HALLIWELL u. WHITEMAN 2004).
Eine Studie zur Lipidperoxidation an kryokonserviertem Bullensperma zeigt, dass die spontane Peroxidation nur bei vitalen Spermien vorhanden ist und nicht auf den Zelltod zurückzuführen ist. Eine besondere Erkenntnis dieser Studie ist, dass die Lipidperoxidation vor allem im Mittelstück und Schwanz ausgeprägt ist und signifikant weniger im Kopfbereich. Bei der Stimulierung der Lipidperoxidation an flüssigkonserviertem Sperma mit tertiärem Butylhydroperoxid ist dieser Effekt noch stärker ausgeprägt, was auf die Aktivität von Antioxidantien im Kopfbereich schließen lässt (BROUWERS u. GADELLA 2003).
Studien an Hengstsperma zeigen, dass der Grad der Lipidperoxidation in kryokonserviertem Sperma höher ist als in Nativsperma (NEILD et al. 2005). Außerdem nimmt die Lipidperoxidation bei Hengstspermien in der wärmeren Jahreszeit zu (HECZKO 2004).
Nach BROUWERS u. GADELLA (2003) ist mittels Bodipy sowohl eine Qualifizierung als auch Quantifizierung der Lipidperoxidation möglich, da sie eine hohe Korrelation zwischen der Fluoreszenzintensität und der Menge an gebildeten Peroxiden festgestellt haben.
2.6.2.3 Untersuchung auf das Vorhandensein von intrazellulärem Stress
Für die Untersuchung auf ROS in der Zelle sind die beiden Farbstoffe Dihydrorhodamin123 (DHR) und Dichlorofluoreszein (DCFH) geeignet. Beide weisen zum Teil unterschiedliche Spezies von ROS nach (HAUGLAND 2002). Eine Übersicht ist auf der folgenden Seite dargestellt.
Übersicht über den Nachweis verschiedener ROS-Spezies mittels DCFH und DHR (modifiziert nach WEIGOLDT (2003))
ROS-Spezies DCFH DHR
Wasserstoffperoxid (H2O2) nachweisbar* schwach nachweisbar Hypochlorsäure (HOCL) nicht nachweisbar nachweisbar
Peroxylradikal (HOO·) nachweisbar nicht nachweisbar Peroxynitritanionen (ONOO·) nachweisbar nachweisbar Hydroxylradikale (OH•) nachweisbar nachweisbar
Sauerstoffanionen (O2•-) nicht nachweisbar schwach nachweisbar
*nachweisbar in Anwesenheit von Peroxidasen
2.6.2.3.1 Erfassung mittels Dichlorofluoreszein (DCFH)
Dichlorofluoreszein ist ein nicht leuchtender Farbstoff. Um die Zellpenetration zu erleichtern, wird er meistens als Diacetat eingesetzt. In der Zelle wird die Esterverbindung durch Esterasen hydrolysiert und das DCFH liegt wieder frei vor. Das Diazetat akkumuliert vorwiegend im Zytosol (MARCHESI et al. 1999). Nach Oxidation mit ROS entsteht das hochfluoreszente Dichlorofluoreszein (DCF), das im grünen Bereich bei 525 nm fluoresziert (HALLIWELL u. WHITEMAN 2004).
DCFH kann nicht von allen ROS oxidiert werden. Es ist sensitiv gegenüber Peroxylen, Alkoxylen, NO2•, Carbonaten, Peroxynitrit und OH·-Radikalen, wohingegen H2O2 alleine und O2•- die oxidierenden Eigenschaften fehlen (BILSKI et al. 2002; OHASHI et al. 2002;
MYHRE et al. 2003). Nur in Anwesenheit von Rettichperoxidase oder Hämoproteinen kann H2O2 DCFH zu DCF oxidieren (LEBEL et al. 1992).
Die DCF-Fluoreszenz kann als Indikator für generalisierten oxidativen Stress innerhalb der Zelle angesehen werden. Sie dient nicht als direkter Nachweis für spezielle Sauerstoffspezies wie z.B. H2O2 , NO•, Lipidperoxide oder O2•- (HALLIWELL u. WHITEMAN 2004).
ROTHE et al. (1988) und OSTROVIDOV et al. (2000) hingegen sehen in der Färbung mit DCFH oder DHR123 gebräuchliche Methoden zum Nachweis bestimmter ROS in der Spermatologie.
HECZKO (2004) wies einen kontinuierlichen Anstieg von ROS in Hengstsperma im Zeitraum von März bis Juli anhand von durchflusszytometrischen Messungen mit DHR und DCFH nach.
2.6.2.3.2 Erfassung mittels Dihydrorhodamin123 (DHR)
Dihydrorhodamin ist ebenfalls ein nicht leuchtender Farbstoff. Er erlangt seine Grünfluoreszenz bei 536 nm durch die Oxidation zu Rhodamin 123 nach Laseranregung.
Durch seine lipophilen Eigenschaften und der positiven Ladung akkumuliert Rhodamin 123 in den Mitochondrien und wird dort durch das Membranpotential festgehalten. Dadurch dringt nur wenig Farbstoff wieder nach außen (BUXSER et al. 1999; HALLIWELL u. WHITEMAN 2004). Nach ROTHE et al. (1988) hat DHR eine höhere Sensitivität beim Nachweis von ROS als DCFH.
DHR wird allgemein zum Nachweis von reaktiven Gruppen verwendet, wie beispielsweise OH•, ONOO-, NO2• oder Peroxidaseabkömmlingen. Es reagiert nur schlecht in Anwesenheit von O2•-, H2O2 oder NO•. Im Unterschied zu DCFH weist es Hypochlorsäure (HOCL) nach (BUXSER et al. 1999).
2.6.2.4 Untersuchung der Integrität der Spermachromatinstruktur mittels Sperm Chromatin Structure Assay (SCSATM)
Der Sperm Chromatin Structure Assay (SCSATM) wurde 1980 von EVENSON entwickelt.
Der Test beruht auf der Empfänglichkeit der spermalen DNA für Denaturierung gegenüber Säureeinwirkung (EVENSON et al. 1980).
Für die ersten Studien wurde menschliches Sperma benutzt, doch mittlerweile findet dieser Test bei vielen Spezies wie z. B. Rindern (BALLACHEY et al. 1988), Schweinen (EVENSON et al. 1994; BOE-HANSEN et al. 2005), Pferden (LOVE 2005), Schafen, Iberischem Rotwild und Hunden (GARCIA-MACIAS et al. 2006) Anwendung. Die verschiedenen Spezies weisen dabei eine unterschiedliche Verdichtung des Chromatins auf.
(EVENSON et al. 2002). Zudem bestehen Unterschiede bezüglich der Verdichtung des Chromatins bei den einzelnen Spermien eines Ejakulates. Eine zunehmende Heterogenität ist assoziiert mit Störungen in der Spermatogenese und mit Sub- oder Infertilität. Studien an Spermien von z.B. Menschen (EVENSON et al. 1984), Mäusen (EVENSON et al. 1985),
Bullen (BALLACHEY et al. 1986; WATERHOUSE et al. 2006) und Hengsten (LOVE 2005) belegen dies.
Der SCSATM eignet sich nicht nur für die Bestimmung der Fruchtbarkeit des Spermas, sondern kann auch zur Beurteilung von Verdünnermedien eingesetzt werden, wie eine Studie an Hengstsperma beweist. Es zeigte sich, dass die Spermien nach Inkubation in verschiedenen Verdünnermedien mit differierenden Seminalplasma-Gehalten unterschiedliche DFI und SD- DFI-Werte aufweisen (LOVE 2005).
Der SCSATM beruht auf der Annahme, dass abnormal strukturiertes Chromatin empfindlicher auf Säureeinwirkung reagiert als normal gepacktes Chromatin. Durch die Denaturierung wird die doppelsträngige DNA in Einzelstränge aufgetrennt. Der SCSATM macht sich die Eigenschaften des metachromatischen Farbstoffs Akridinorange (AO) zunutze. Dieser fluoresziert grün bei Anlagerung an doppelsträngige DNA und rot bei der Anlagerung an einzelsträngige DNA (EVENSON et al. 1991; EVENSON et al. 1995).
Mittels Durchflusszytometrie wird der Anteil an Rot- und Grünfluoreszenz ermittelt. Die Intensität der Rotfluoreszenz dividiert durch die Gesamtfluoreszenzintensität ergibt den DNA-Fragmentationsindex DFI (EVENSON et al. 2002). Er nimmt Werte zwischen 0 und 1 an, kann aber auch in Prozentpunkten (%) angegeben werden.
Laut EVENSON u. WIXON (2006) ist der DFI–Wert bei Bullen nicht unbedingt geeignet, um eine Aussage über die Fertilität zu treffen. Die Verfasser sehen eine höhere Korrelation zwischen der Variation der Chromatinstruktur (SD-DFI) und der Fruchtbarkeit (EVENSON u.
WIXON 2006).
3. MATERIAL UND METHODEN 3.1 Material
3.1.1 Bullen
Für den praktischen Versuch der vorliegenden Arbeit wurden 20 Wartebullen der Besamungsstation Masterrind GmbH in Verden ausgewählt (18 Holstein-Frisian sowie 2 Red- Holstein-Frisian). Das Alter der Tiere variierte zu Beginn des Versuches von zwei Jahren bis zu viereinhalb Jahren. Das durchschnittliche Alter der aus 9 Tieren bestehenden Versuchgruppe betrug 3,2 ± 1,0 Jahre und der aus acht Tieren bestehenden Kontrollgruppe 3,7 ± 0,8 Jahre. Zu Beginn des Versuches befanden sich in beiden Gruppen zehn Tiere. Zwei Bullen mussten wegen Krankheit aus dem Versuch ausscheiden; ein Bulle aus der Kontrollgruppe des ersten Versuchsdurchganges am 01.08.2006 wegen einer Penisverletzung und ein weiterer Bulle aus der Kontrollgruppe des zweiten Durchganges am 06.03.2007 wegen einer Lahmheit. Ein weiterer Bulle des ersten Versuchsdurchganges wies in mehreren Ejakulaten eitriges Sekret auf und wurde deshalb von der Auswertung ausgeschlossen. Das Allgemeinbefinden und die Ejakulatbeschaffenheit der anderen Tiere waren unauffällig.
Die regelmäßig in der Vorversuchs- und Fütterungsphase jeweils am Dienstag und Freitag gewonnenen Ejakulate bildeten neben den mittwochs entnommenen Blutproben das Untersuchungsgut. Vor der Versuchsdurchführung waren die ausgewählten Bullen mehrere Monate nicht für die Spermaproduktion eingesetzt worden. In dem Zeitraum von etwa 3 Wochen vor Versuchbeginn wurden pro Bulle 3 bis 4 Ejakulate gewonnen.
3.1.2 Futter
Bei dem Versuchsfutter handelte es sich um das pansenstabile Omega-3-Fett Leinsamenöl der Firma Noba Vetveredeling B.V., das zu circa 70% aus mehrfach ungesättigten Fettsäuren bestand. In dem Futtermittel waren folgende Fettsäuren in den angegebenen Anteilen vertreten: Ölsäure (C18:1): 10 bis 22%, Linolsäure (C18:2): 12 bis 18%, Linolensäure (C18:3): 56 bis 71%. Die genaue Zusammensetzung des Futtermittels ist im Anhang unter Nr.
9.4.1 zu finden.
Die Pansenstabilität wurde durch eine spezielle Technologie erzielt, bei der das Leinsamenöl auf Cellulose aufgetragen wurde und so fein granulierte. Die entstehenden Perlen wurden mit gehärteten Pflanzenfetten (Palmfett) umhüllt. Der erhöhte Schmelzpunkt des gehärteten Fettes
trägt zur Pansenstabilität bei. Um die Schmackhaftigkeit des Futters zu erhöhen, wurde dem Omega-3-Fett ein Geschmacksstoff mit Heuaroma zugesetzt.
Die tägliche Zufuhr des Omega-3-Produktes in dem Versuch betrug pro Tier und Tag 800 g, wobei jeweils eine Hälfte davon morgens und abends verabreicht wurde. Um den Bullen pro Tag 400 g Leinöl zu verabreichen, mussten 800 g des gecoateten Fettes eingesetzt werden, da 50% des Gewichts auf das Coatingmaterial entfielen. Der Kontrollgruppe wurde als Ausgleich für die Fettbilanzierung das gesättigte Palmfett Bergafat® T300 der Firma Berg und Schmidt gefüttert (genaue Zusammensetzung siehe Anhang Nr. 9.4.2). Die tägliche Zufuhr pro Tier und Tag betrug hier 400 g, aufgeteilt auf zwei Portionen.
3.2 Methoden
3.2.1 Versuchsdurchführung:
Es wurden zwei Fütterungsversuche hintereinander durchgeführt. Zwischen dem ersten und dem zweiten Fütterungsversuch war eine vierwöchige Pause. Im ersten Versuch wurden die Daten von acht Bullen (jeweils vier in der Versuchs- und Kontrollgruppe) und im zweiten Versuch die Daten von fünf Bullen der Versuchs- und vier Bullen der Kontrollgruppe ausgewertet. Ein Fütterungsversuch setzte sich aus einer vier- bzw. achtwöchigen Vorversuchsphase und einer zwölfwöchigen Fütterungsphase zusammen (Tab. 3.1). In der Vorversuchszeit wurde im Gegensatz zur Fütterungsphase kein Fettsupplement gefüttert; sie diente der Ermittlung der Grunddaten. Während des gesamten Zeitraums wurde die Grundration an Heu/Silage und Kraftfutter konstant gehalten. Sie bestand aus etwa 15 kg Heu pro Tag und etwa 2 kg Kraftfutter (Zusammensetzung des Kraftfutters siehe Anhang unter Nr.
9.4.3).
Der Vorversuch des ersten Fütterungsversuches begann am 23.06.2006. Nach Feststellung eines Vitamin E-Mangels wurde ab dem 25.07.2006 ein Vitamin E-Konzentrat (BioWeyxin Carnitin-E-Mulgat – Zusammensetzung, Anwendung und Dosierung siehe Anhang Nr. 9.4.5) für vier Wochen oral verabreicht. Gleichzeitig wurde der Anteil des Mineralfutters von 100 g pro Tag auf 200 g erhöht (Zusammensetzung des Mineralfutters siehe Anhang Nr. 9.4.4).
Durch den Vitamin E-Mangel erhöhte sich im ersten Fütterungsversuch die Vorversuchszeit auf acht Wochen. Für die Ergebnisauswertung wurden nur die letzten vier Wochen der Vorversuchszeit ab dem 28.07.2006 herangezogen. Die Fettfütterung begann am 23.08.2006.
Da der Vitamin E-Gehalt wieder deutlich abgesunken war, wurde ab dem 14.09.2006 erneut das Vitamin E-Konzentrat für vier Wochen verabreicht. Am 10.11.2006 endete der erste Fütterungsversuch.
Tab. 3.1: Zeitlicher Ablauf der durchgeführten Maßnahmen bzw. der Ereignisse während der Untersuchungen
Versuch Datum Versuchsphase und Bemerkungen
1
23.06.2006 25.07.2006
01.08.2006 23.08.2006 14.09.2006 10.11.2006
Vorversuch (8 Wochen)
Vitamin E-Zulage für 4 Wochen; Mineralfutter von 100g/Tier/Tag auf 200g/Tier/Tag erhöht
Erster Bulle scheidet aus (Penisverletzung) Fettfütterung (12 Wochen)
Vitamin E-Zulage für 4 Wochen Ende der Fettzulage
2
04.12.2006 14.12.2006 02.01.2007 06.03.2007 23.03.2007
Vorversuch (4 Wochen)
Erhöhung des Mineralfutters von 100g/Tier/Tag auf 300g/Tier/Tag Fettfütterung (12 Wochen)
Zweiter Bulle scheidet aus (Lahmheit) Ende der Fettfütterung
Der Vorversuch des zweiten Fütterungsversuches startete am 04.12.2006. Begründet auf den Erfahrungen des ersten Versuches und vorhandener niedrigerer Vitamin E-Werte im Blut, wurde hier der Mineralfutteranteil am 14.12.2006 vonn 100g auf 300 g pro Tag erhöht und kein Vitamin E-Konzentrat zugesetzt. Die zweite Fettfütterung begann am 02.01.2007 und endete am 23.03.2007. Eine Übersicht über die durchgeführten spermatologischen Untersuchungen zeigt die Tabelle 3.2.
Die Blutentnahmen erfolgten im ersten Versuch vom 28.06.2006 bis 13.09.2006 wöchentlich.
Danach wurde bis zum Ende des ersten Versuches und im gesamten zweiten Fütterungsversuch die Blutentnahme alle zwei Wochen durchgeführt. Das Blut wurde aus der Vena coccygia mediana entnommen.
Für die Auswertung der Ergebnisse wurden die aus beiden Fütterungsversuchen ermittelten Daten zusammengefasst. Aus den beiden insgesamt jeweils 16 Wochen dauernden Fütterungsversuchen wurden vier Phasen zu je vier Wochen gebildet. Die erste Phase beinhaltet dabei die Daten der Vorversuchszeit und die anderen drei Phasen stellen die Daten der Fettfütterung dar.
Tab. 3.2: Übersicht über die verschiedenen durchgeführten spermatologischen Untersuchungen an den unterschiedlichen Arten des Spermas. Im ersten Durchgang wurden 8 und im zweiten Durchgang 9 Bullen untersucht.
Art des Spermas Durchgeführte Untersuchung Anzahl der Ejakulate Nativsperma, direkt nach
Gewinnung
Flüssigkonserviert
Kryokonserviert, Messung unmittelbar nach dem Auftauen
Kryokonserviert, Messung 3 Std. nach dem Auftauen
Abzentrifugierte Spermien, schockgefroren
Mikroskopische Schätzung von vorwärts-, orts- und unbeweglichen Spermien
Durchflusszytometrie (FITC-PNA, DHR, DCFH, C11-Bodipy581/591)
Durchflusszytometrie (FITC-PNA, DHR, DCFH, C11-Bodipy581/591)
Durchflusszytometrie
(DHR, DCFH, C11-Bodipy581/591) Durchflusszytometrie
SCSA
Gaschromatographische Bestimmung der Fettsäuren
2 Ejakulate/Bulle und Woche
2 Ejakulate/Bulle und Woche
2 Ejakulate/Bulle und Woche
2 Ejakulate/Bulle und Woche
1 Ejakulat/Bulle und Woche
1 Ejakulat/Bulle aus Woche 1 und 16
DCFH= Dichlorofluoreszein; DHR= Dihydrorhodamin123; SCSA= Analyse der Spermachromatinstruktur
3.2.2 Gewinnung und Verarbeitung des Spermas
Die Spermagewinnung erfolgte mit Hilfe eines Phantoms oder eines Ochsen als Sprungpartner. Zur Vorbereitung der Bullen wurden zwei Blindsprünge durchgeführt, bei denen der Bulle aufsprang, aber noch kein Ejakulat entnommen wurde. Erst beim dritten Sprung wurde der Bulle mittels einer auf 42°C vorgewärmten, künstlichen Scheide des Modells Hannover abgesamt. Das Ejakulat wurde in einem Tulpenglas aufgefangen.
Im Labor wurde neben der mikroskopischen Beurteilung auch die Farbe und der Geruch, sowie das Volumen und die Konzentration des Ejakulates ermittelt, um die Verdünnung zu berechnen. Anschließend wurde das Ejakulat langsam in mehreren Schritten heruntergekühlt:
Im ersten Wasserbad (Fa. Thermo Haake, Karlsruhe) mit einer Temperatur von 27°C verblieb das Ejakulat etwa fünf Minuten. Im nächsten Schritt wurde es im zweiten Wasserbad (Fa.
Thermo Haake, Karlsruhe) in etwa fünf Minuten auf 23°C heruntergekühlt.
Das Sperma wurde mit Triladyl-Eigelbverdünner (20°C) auf 60 Millionen Spermien/ml in Glasflaschen bei Raumtemperatur verdünnt (Rezept siehe Anhang Nr. 9.1). Dies geschah in zwei Stufen: Im ersten Schritt wurde das Ejakulat mit dem Verdünner ohne Glyzerinzusatz unter Rühren versetzt. Erst im zweiten Schritt wurde der Verdünner mit Glyzerin zugegeben.
Das verdünnte Sperma wurde bei Raumtemperatur in 0,25 ml-Pailletten mit einer Abfüllmaschine von IMV (Typ MRS3 L`Aigle, France) abgefüllt. Danach wurden die Pailletten auf Rampen gelegt und über vier Stunden bis zum Einfrieren auf 5°C heruntergekühlt. Das Einfrieren erfolgte stufenweise auf Rampen in der Samengefrieranlage Model K („roter Däne“, Fa. Hede Nielsen, Horsens, Dänemark). Innerhalb von anderthalb Minuten wurden die Pailletten auf den Rampen im Stickstoffdampf auf -110°C gekühlt und für einige Minute die Temperatur gehalten. Insgesamt dauerte der Einfriervorgang in der Samengefrieranlage 6,5 Minuten. Danach wurden die Pailletten direkt in flüssigen Stickstoff bei –196°C versenkt.
3.2.3 Mikroskopische Untersuchungen der nativen Proben
Für die mikroskopische Untersuchung des nativen, unverdünnten Spermas wurde ein Mikroskop von Olympus (Typ BH2, Fa. Olympus, Hamburg, Deutschland) verwendet. Dazu wurden auf einen Objektträger mit einer Glaspipette drei Tropfen Nativsperma gegeben. Ein etwa erbsengroßer Tropfen diente zur Schätzung der Massenbewegung und zwei etwa
linsengroße Tropfen, die mit einem Deckglas abgedeckt wurden, dienten zur Schätzung des Anteils vorwärtsbeweglicher Spermien. Für die Bewertung wurden circa zehn Gesichtsfelder herangezogen. Für die Beurteilung der Motilität wurde die 200-fache Vergrößerung verwendet. In die Beurteilung der Motilität wurden alle Ejakulate mit einbezogen, außer denjenigen, welche blutige oder eitrige Bestandteile in der Samenflüssigkeit aufwiesen.
3.2.4 Durchflusszytometrische Untersuchungen
Für die Messungen stand ein Durchflusszytometer der Fa. Beckman Coulter (Fullerton, Californien, USA) vom Typ EPICS XL/MCL zur Verfügung. Die Messung erfolgte mit der Software Expo 32 ADC XL 4 Color und die Auswertung mit Expo 32 ADC Analysis.
Lediglich die Auswertung des SCSA wurde mit dem Software-Programm DAS Version 4.40 (BEISKER 1994) durchgeführt. Das Gerät war mit einem luftgekühlten Argonionenlaser der Wellenlänge 488 nm ausgestattet. Von den drei verschiedenen Filtern wurden für die Messungen nur der FL1 (530/30 nm) für die Grünfluoreszenz und der FL3 (650 LP nm) für die Rotfluoreszenz genutzt. Die Fluoreszenzintensität wurde logarithmisch dargestellt, außer beim SCSA, dort wurde die lineare Darstellung verwendet.
Bei allen durchgeführten Färbungen, egal ob flüssig- oder kryokonserviert, wurden immer fünf Pailletten gepoolt, um die Auswirkungen der Variabilität, welche zwischen den Pailletten eines kryokonservierten Ejakulates bestehen, möglichst gering zu halten. Die Ausnahme bildete der SCSA. Hierfür wurde nur eine Paillette aufgetaut, da die Variabilität in der DNA- Integrität zwischen den Pailletten eines Ejakulates sehr gering ist (BOLLWEIN, pers.
Mitteilung 2006). Bei allen kryokonservierten Proben (mit Ausnahme des SCSA) wurden immer fünf Pailletten zusammen bei 37°C über 30 Sekunden aufgetaut. Alle durchflusszytometrischen Tests, außer der SCSA, wurden sowohl an flüssig- als auch an kryokonservierten Proben durchgeführt.
Bei allen Tests, außer dem SCSA, wurden die Spermien vor der Färbung ähnlich aufbereitet.
Die Spermiensuspension wurde von der Ausgangskonzentration von 60 Mio pro ml auf etwa 5 Mio Spermien pro ml verdünnt. Dazu wurden 40 µl Spermien mit 460 µl Tyrode (Rezept siehe Anhang Nr. 9.2.1) versetzt. Die Farbstoffe, die Tyrode und die Eppendorf-Cups wurden
auf 37°C im Thermoblock oder Wasserbad vorgewärmt. Die Inkubation der Proben erfolgte in einem Wärmeschrank bei 37°C.
Für den SCSA wurde die Spermiensuspension auf 2 Mio Spermien/ml mit TNE-Puffer verdünnt. Alle Medien (Rezept für Medien siehe Anhang Nr. 9.2.2) standen während der Messung auf Eis bei 4°C. Die Inkubation erfolgte bei Raumtemperatur.
Die Messungen an den kryokonservierten Proben wurden direkt nach dem Auftauen (FITC- PNA, DHR, DCFH und C11-Bodipy581/591) bzw. erst nach 3 Stunden Inkubation im Wärmeschrank bei 37°C (DHR, DCFH, C11-Bodipy581/591 und SCSA) durchgeführt. Die ermittelten Ergebnisse wurden so in 0h- und 3h-Werte unterschieden.
Bei bestimmten Tests (DHR, DCFH, C11-Bodipy581/591) wurden der Spermiensuspension aus dem flüssigkonservierten oder kryokonserviertem Sperma Stimulatoren der ROS-Bildung (H2O2) und der LPO (Butylhydroperoxid) zugesetzt. Nach der Kryokonservierung erfolgte die Zugabe direkt nach dem Auftauen oder nach dreistündiger Inkubation. Die anschließend ermittelten Werte wurden entsprechend als stimulierte Werte bezeichnet. Die Proben ohne Zusatz eines Stimulators wurden als unstimulierte Proben bezeichnet. Bei der Darstellung der Ergebnisse wurden die Differenzen zwischen den stimulierten und unstimulierten Werten eines Versuchzeitpunktes (flüssigkonserviert, 0h- und 3h-Inkubationszeit) gebildet.
3.2.4.1 FITC-PNA/PI-Färbung
Der FITC-PNA-Test gibt Auskunft über den akrosomalen Status der Spermien. Durch die Kombination mit dem Farbstoff Propidiumjodid werden lebende Spermien mit intaktem Akrosom von jenen mit Akrosomreaktion bzw. -schädigung und von toten Spermien unterschieden. Nur in membrangeschädigte Zellen kann Propidiumjodid eindringen und so eine Rotfluoreszenz hervorrufen. Bei einer Schädigung des Akrosoms oder einer akrosomalen Reaktion bindet das FITC-PNA und das Akrosom fluoresziert grün (THOMAS et al. 1997;
BLOTTNER et al. 1998). Nähere Angaben zu diesem Test sind in der Dissertation von BAARZ (2006) zu finden.
Zu der mit Tyrode verdünnten Spermiensuspension wurden 5 µl FITC-PNA sowie 3 µl Propidiumjodid (Rezept und Konzentrationen siehe Anhang Nr. 9.2.4 ) zugesetzt und auf dem Vortexer gemischt. Es folgte eine 15-minütige Inkubation bei 37°C und vor dem Messen ein erneutes Vortexen.
