Dichlorofluoreszein (DCFH)/PI-Färbung

Dieser Farbstoff gibt Auskunft über die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies in der (Spermien-)Zelle. Durch Zugabe von Propidiumjodid werden auch hier lebende von toten Zellen unterschieden. Die Intensität der Grünfluoreszenz gibt Auskunft über die Höhe des oxidativen Stresses (HALLIWELL u. WHITEMAN 2004).

Auch bei dieser Färbung wurde ein Doppelansatz von stimulierten und unstimulierten Proben durchgeführt und die kryokonservierten Proben jeweils 0h und 3h nach dem Auftauen durch-flusszytometrisch analysiert.

Die Farbstoffe und Tyrode sowie die Eppendorf-Cups wurden auf 37°C im Thermoblock oder Wasserbad vorgewärmt. Es wurden vier Flow-Röhrchen mit der unter 3.2.4 beschriebenen

Spermaverdünnung mit Tyrode vorbereitet. Zu den ersten beiden Proben (0h-Wert) wurden unverzüglich nach dem Auftauen 4,8 µl DCFH sowie 2,5 µl PI zugesetzt. Zu dem zweiten Röhrchen wurden außerdem als Stimulator 2,5 µl H2O2 zugesetzt. Es folgte eine 15-minütige Inkubation im Wärmeschrank bei 37°C. Zeitgleich wurden die Proben für die durchflusszytometrische Messung nach dreistündiger Inkubation angesetzt. Dies geschah wie bei den 0h-Werten, mit dem Unterschied, dass PI erst nach 2 Stunden 45 Minuten zugesetzt wurde. Die Inkubation über drei Stunden erfolgte ebenfalls bei 37°C im Wärmeschrank.

Bei der Messung kamen der FL-1-Filter für die Grünfluoreszenz (DCFH) und der FL-3-Filter für die Rotfluoreszenz (Propidiumjodid) zum Einsatz (Abb. 3.3). Für die Auswertung wurde die Differenz zwischen den mittleren Grünfluoreszenzen der stimulierten und unstimulierten lebenden Spermien gebildet.

A

B

Abb. 3.3: Punktwolkendiagramm der Spermienpopulationen nach DCFH/PI-Färbung und anschließender durchflusszytometrischer Analyse

A= Anteil an toten Spermien und B= Anteil an lebenden Spermien

Auf der X-Achse (FL1) wird die Grünfluoreszenzintensität von DCFH dargestellt.

Auf der Y-Achse (FL3) wird die Intensität der Rotfluoreszenz von Propidiumjodid dargestellt. Je höher der oxidative Stress ist, desto weiter rechts befindet sich die Punktwolke.

3.2.4.4 C11-Bodipy^581/591 (Bodipy)/PI-Färbung

Der Farbstoff C11-Bodipy^581/591 wird in die Membran eingebaut und ändert durch Lipidperoxidation seine Struktur und emittiert grüne Fluoreszenz. Auch hier wird durch einen erhöhten oxidativen Stress die Fluoreszenz des Farbstoffes erhöht (DRUMMEN et al. 2002;

HALLIWELL u. WHITEMAN 2004). Als Stimulator dient in diesem Fall tertiäres Butylhydroperoxid (BUT), das lipophil ist und so in die Plasmamembran eindringen kann.

Bei dieser Färbung wurde ebenfalls ein Doppelansatz von stimulierten und unstimulierten Proben durchgeführt. Des Weiteren wurde hier bei den kryokonservierten Proben je ein 0h- und 3h- Wert erhoben.

Die Farbstoffe und Tyrode sowie die Eppendorf-Cups wurden auf 37°C im Thermoblock oder Wasserbad vorgewärmt. Es wurden vier Flow-Röhrchen mit der unter 3.2.4 beschriebenen Spermaverdünnung mit Tyrode vorbereitet. Zu den ersten beiden (0h-Wert) wurde unverzüglich 4,8 µl Bodipy sowie 2,5 µl PI zugesetzt. Zu dem zweiten Röhrchen wurde außerdem als Stimulator 5 µl tertiäres Butylhydroperoxid (BUT) zugesetzt. Es folgte eine 15-minütige Inkubation im Wärmeschrank bei 37°C. Zeitgleich wurden die Proben für die 3h-Werte angesetzt. Dies geschah wie bei den 0h-3h-Werten, mit dem Unterschied, dass PI erst nach 2 Stunden 45 Minuten zugesetzt wurde. Die Inkubation über drei Stunden erfolgte ebenfalls bei 37°C im Wärmeschrank.

Bei der Messung kamen der FL-1-Filter für die Grünfluoreszenz (C11-Bodipy^581/591) und der FL-3-Filter für die Rotfluoreszenz (Propidium-Iodid) zum Einsatz (Abb. 3.4). Für die Auswertung wurde die Differenz zwischen den mittleren Grünfluoreszenzintensitäten der stimulierten und unstimulierten lebenden Spermien gebildet.

B A

Abb. 3.4: Punktwolkendiagramm der Spermienpopulationen nach C11-Bodipy/PI-Färbung und anschließender durchflusszytometrischer Analyse

A= Anteil an toten Spermien und B= Anteil an lebenden Spermien

Auf der X-Achse (FL1) wird die Grünfluoreszenzintensität von C11-Bodipy dargestellt. Auf der Y-Achse (FL3) wird die Intensität der Rotfluoreszenz von Propidiumjodid dargestellt. Je höher der oxidative Stress ist, desto weiter rechts befindet sich die Punktwolke.

3.2.4.5 Analyse der Spermachromatinstruktur (SCSA™)

Beim SCSA™ (Sperm Chromatin Structure Assay) wird mit Hilfe des metachromatischen Farbstoffes Akridinorange einsträngige von doppelsträngiger DNA unterschieden. Erstere fluoresziert rot und letztere grün (EVENSON et al. 1991; EVENSON et al. 1995). Mit Hilfe einer computergestützten Auswertung der Punktwolkendiagramme wurde für jedes einzelne Spermium der Anteil der Rotfluoreszenz an der Gesamtfluoreszenz, welche sich aus der Summe der roten und grünen Fluoreszenz zusammensetzt, errechnet und nach EVENSON et al. (1999) als DFI (DNA-Fragmentationsindex) bezeichnet. In einem Verteilungshistogramm wurden alle DFI-Werte einer Samenprobe in Abhängigkeit von ihrer Höhe dargestellt und

Spermien mit niedrigen und hohen DFI-Werten (DFI%) unterschieden. Außerdem wurde die Standardabweichung des DFI-Wertes (SD-DFI) als Maß für die Streuung um den Mittelwert berechnet (Abb. 3.6). Damit lässt sich eine Aussage über die Höhe des Anteils an chromatingeschädigten Spermien treffen (EVENSON et al. 2002).

Der SCSA wurde nur an kryokonservierten Spermien nach dreistündiger Inkubation bei 37°C durchgeführt. Es wurde dazu nach der Inkubation eine Spermiensuspension mit 1xTNE-Puffer mit einer Konzentration von 2 Mio Spermien/ml hergestellt. Alle Medien standen bei einer Temperatur von 4°C auf Eiswasser.

Es wurden 200 µl der mit TNE verdünnten Spermiensuspension mit 0,4 ml Säuredetergenz versetzt und genau 30 Sekunden auf dem Vortexer gemischt. Danach wurden 1,2 ml Akridinorange-Gebrauchslösung dazugegeben und exakt nach 3 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur gemessen (Rezepte siehe Anhang Nr. 9.2.2).

Jede Probe wurde im Doppelansatz gemessen und nach jeder fünften Probe wurde bei einer frisch aufgetauten Referenzprobe die Grünfluoreszensintensität der Spermien auf 500 und die Rotfluoreszenz auf 130 eingestellt. Bei der Messung kamen der FL-1-Filter für die Grünfluoreszenz und der FL-3-Filter für die Rotfluoreszenz zum Einsatz (Abb. 3.5).

Bei der Auswertung wurden die DFI-Spermien von Spermien mit intakter DNA und Zelldebris unterschieden (Abb. 3.5).

Abb. 3.5: Punktwolkendiagramm bei der Spermachromatinstrukturanalyse (SCSA™) 1.) Spermien der Hauptpopulation mit doppelsträngiger DNA (Grünfluoreszenz) 2.) Spermien mit hohen DNA-Fragmentationsindices (DFI% ; erhöhte Rotfluoreszenz) 3.) Zelldebris

1

2

3

FL3 (Rotfluoreszenz) FL1

(Grün- fluor-eszenz)

Spermien mit niedrigem DFI-Wert (Hauptpopulation)

Spermien mit hohem DFI-Wert (%DFI)

DNA-Fragmentationsindex Zellzahl

0 1

Abb.3.6: Häufigkeitsverteilung der Spermien in Abhängigkeit von der Höhe der DNA-Fragmentationsindices (DFI)

(modifiziert nach EVENSON et al. 2002)

3.2.5 Bestimmung des Vitamin E-Status

Der Vitamin E-Gehalt der Bullen wurde aus dem Blutserum bestimmt. Die Analyse wurde nach der in der Dissertation von MUDRON (1994) beschriebenen Methode durchgeführt.

3.2.6 Bestimmung der Fettsäure-Methyl-Ester (FAME) in Spermienzellen

Die gaschromatographische Fettsäurenanalyse wurde im Institut für Physiologische Chemie der Tierärztlichen Hochschule Hannover durchgeführt. Pro Bulle wurde in der 1. und 16.

Woche des Versuchs die Fettsäurenzusammensetzung der Spermien untersucht. Besonders wurde dabei auf die Anteile der Omega-3- und Omega-6-Fettsäuren in den Spermien geachtet.

3.2.6.1 Prinzip der Methode

Die in der Probe enthaltenen Fettsäuren wurden mit Hilfe von Acetylchlorid zu Methylestern umgeestert (LEPAGE u. ROY 1986). Durch Zugabe von Kaliumcarbonat wurde das Acetylchlorid neutralisiert, anschließend wurde die Probe gaschromatographisch aufgetrennt und die Anteile der Fettsäuren wurden bestimmt.

3.2.6.2 Probenaufbereitung

Direkt nach der Samengewinnung wurde das Ejakulat in 15 ml-Greiner-Röhrchen überführt und für 10 Minuten bei 2500 x g in einer Hermle Laborfuge (Typ Z200A, Fa. Hermle Labortechnik, Wehningen) zentrifugiert. Das überstehende Seminalplasma wurde mittels Pasteurpipetten abgenommen. Das verbleibende Spermienpellet wurde bei –20°C eingefroren.

Die Lipidisolation erfolgte nach der Methode von BLIGH u. DYER (1959).

3.2.6.3 Lipidisolation

Das tiefgefrorene Spermapellet wurde bei Raumtemperatur etwa 10 Minuten aufgetaut und im Anschluss auf 5 ml mit PBS aufgefüllt und danach auf dem Vortexer geschüttelt. Von diesem Ansatz wurden 500 µl entnommen und mit 300 µl Aqua bidest in einem Potterkolben eine Minute gepottert. Nach der Zugabe von 2 ml Methanol erfolgte eine 2-minütige Inkubation.

Danach wurde 1 ml Chloroform dazugegeben und wieder für 1 Minute gepottert. Das Gemisch wurde in ein Glasschraubröhrchen (10 ml) überführt und nach Verschließen des Deckels 30 Minuten bei Raumtemperatur in einem Rotationsmixer gemischt. Danach folgte eine Zentrifugation für 5 Minuten bei 2500 x g in einer Kühlzentrifuge bei 7°C. Der Überstand wurde in ein hitzestabiles 10 ml Pyrex-Röhrchen mit dreifachem Schraubring überführt und mit 1 ml Chloroform und 1 ml Aqua bidest versetzt und kurz aufgeschüttelt.

Danach folgte eine Zentrifugation für 10 Minuten bei 2500 x g in einer Kühlzentrifuge bei 7°C. Es bildeten sich zwei Phasen, wobei die obere Phase mit einer Wasserstrahlpumpe abgesaugt wurde. Zur weiteren Aufreinigung wurde noch einmal für 5 Minuten bei 2500 x g und 7°C zentrifugiert und die restliche obere Phase vorsichtig mit einer Wasserstrahlpumpe abgesaugt. Die gewonnenen gelösten Lipide konnten nun bei –20°C eingefroren oder direkt weiterverarbeitet werden.

Die nach der Lipidisolation gewonnene Probe wurde unter Stickstoffdampf getrocknet, bis die gesamte Flüssigkeit verdampft war (ca. 15 Minuten). Zu dem übrigbleibenden Pellet wurden 50 µl n-Hexan und 2 ml Methanol zugegeben. Dann wurden 0,5 ml Hexan mit dem Standard C17:0 in der Endkonzentration von 100 ng/µl und tropfenweise 0,2 ml Acetylchlorid in einem Reagenzglas mit dem Ansatz vermischt und für 60 Minuten bei 100°C im Heizblock inkubiert. Nach 5-minütigem Abkühlen im Eisbad wurden 4 ml 6%iges Kaliumcarbonat zugegeben und bei 250 x g für 1 Minute zentrifugiert. Danach wurde die obere Hexanphase inklusive der Fettsäuremethylester abgenommen und in Eppendorfcups überführt. Bei Bedarf wurde die Probe von etwa 500 µl auf etwa 100 µl unter Stickstoffdampf konzentriert.

3.2.6.4 Kalibrierung

Die Kalibrierung der Gaschromatographie-Säule erfolgte anhand der Peakflächen des FAME-Standards (siehe Anhang Nr. 9.3). Die Kalibrationskurve wurde durch den Nullpunkt gelegt.

3.2.6.5 Probenmessung und Auswertung

Mittels einer 5-µl-Präzisionsspritze wurden 2 µl des Ansatzes auf die Kapillarsäule des Gaschromatographen aufgespritzt. Die Auftrennung in der Säule erfolgte mit Hilfe eines Temperaturprogrammes: In den ersten 2 Minuten wurde eine Temperatur von 120°C gehalten, danach erfolgte ein Anstieg um 25°C pro Minute bis zu einer Temperatur von 190°C.

Anschließend stieg die Säulentemperatur um 10°C pro Minute bis zu einer Temperatur von 250°C. Diese Temperatur wurde für 30 Minuten gehalten. Insgesamt dauerte die Auftrennung 40,8 Minuten (Gaschromatographische Bedingungen siehe Anhang Nr. 9.3).

Die Auswertung erfolgte mittels eines Chromatographie-Datensystems (APEX Chromato- graphie Workstation, Modell CSI 625-1, Version 2.04, Fa. Autochrom Inc., Milford, USA).

Die Probenpeakflächen wurden mit den Peakflächen eines Standardgemisches bekannter Zusammensetzung (FAME-Standard) verglichen. Dadurch konnte der prozentuale Anteil der Einzelfettsäuren am Gesamtfettsäurenmuster bestimmt werden.

3.2.7 Statistische Auswertung:

Für die statistische Auswertung wurden die Programme Statistica (Fa. StatSoft, Tulsa, USA) und Statview (Fa. SAS, Cary, USA) verwendet. In der deskriptiven Statistik wurden

normalverteilte Daten durch den Mittelwert und die Standardabweichung beschrieben. Es wurden bei der statistischen Analyse der Spermaqualitätsparameter für jeden Bullen die Mittelwerte aus den jeweils acht während vierwöchiger Phasen gewonnenen Ejakulaten herangezogen. Für die statistische Analyse der Fettsäuremuster wurden von jedem Bullen die Mittelwerte von je zwei in den Wochen 1 und 16 gewonnenen Ejakulaten errechnet. Alle Daten wurden mit dem Shapiro-Wilk-Test auf Normalverteilung getestet. Da alle Werte normalverteilt waren, wurden einfaktorielle Varianzanalysen und der Fisher´s PLSD-Test eingesetzt, um zu überprüfen, ob innerhalb bzw. zwischen den Tiergruppen Unterschiede in den Parametern vor und nach Beginn der Fütterung bestanden. Nur Unterschiede zwischen Parametern mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von (p) ≤ 0,05 wurden als signifikant bezeichnet.

4. ERGEBNISSE

4.1 Ergebnisse der Analyse der Fettsäuren in den Spermien

Aus den Spermien konnten sowohl gesättigte als auch einfach und mehrfach ungesättigte Fettsäuren gaschromatographisch bestimmt werden (Abb. 4.1). Die nachfolgend aufgeführten Werte stellen Mittelwerte von den V-und K-Bullen zu Beginn des Versuches (Woche 1) dar.

Den größten Anteil mit 40,13% machte dabei die mehrfach ungesättigte Omega-3-Fettsäure DHA (C22:6n3) aus. Sie war außerdem die einzige nachweisbare Omega-3-Fettsäure. Die im Futter eingesetzte Alpha-Linolensäure (C18:3n3) konnte gaschromatographisch nicht erfasst werden. Als gesättigte Fettsäuren wurden mit abfallenden Anteilen C16:0 (22,38%), C14:0 (12,12%) und C18:0 (8,63%) nachgewiesen. Als einzige einfach ungesättigte Fettsäure wurde C18:1n9 (6,01%) bestimmt. Bei den mehrfach ungesättigten Fettsäuren konnten die beiden Omega-6-Fettsäuren C18:2n6 und C20:3n6 dargestellt werden. Ihre Anteile betrugen 3,51%

(C18:2n6) und 3,28% (C20:3n6). Außerdem wurde die Fettsäure C20:2 (1,11%) erfasst.

0 10 20 30 40 50 60

C22:6n3 C16:0 C14:0 C18:0 C18:1n9 C18:2n6 C20:3n6 C20:2

%

Abb. 4.1 Prozentuale Anteile der gaschromatographisch bestimmten Fettsäuren aus den Spermien. Die Werte stellen die Mittelwerte und Standardabweichungen von insgesamt 17 Ejakulaten (9 V-Bullen bzw. 8 K-Bullen) aus Woche 1 dar.

Durch die Fütterung kam es zu folgenden Veränderungen im Fettsäurenmuster der Spermien:

Bei der Omega-3-Fettsäure Docosahexaensäure (C22:6n3) zeigte sich bei den V-Bullen ein Anstieg um 30,75% (p<0,03). Bei den K-Bullen hingegen zeigte sich keine Änderung

(p>0,05). Weder in Woche 1 noch in Woche 16 waren Unterschiede zwischen den Tiergruppen zu verzeichnen (p>0,05).

Die gesättigte Fettsäure Palmitinsäure (C16:0) zeigte bei den V-Bullen eine nicht signifikante Reduzierung (p>0,05) und bei den K- Bullen eine nicht signifikante Zunahme (p>0,05) im Verlauf des Versuches. Jedoch war der C16:0-Anteil in Woche 16 bei den K-Bullen um 38,11% (p<0,05) höher als bei den V-Bullen. Keine Differenzen waren zwischen den Phasen (p>0,05) sowie zwischen den Gruppen (p>0,05) bei der gesättigten Fettsäure Myristinsäure (C14:0) festzustellen. Bei der Stearinsäure (C18:0) blieb der relative Gehalt bei den V-Bullen unverändert, bei den K-Bullen hingegen nahm er um 10,07% (p<0,04) ab. Zu keiner Zeit waren Unterschiede zwischen den Tiergruppen zu verzeichnen (p>0,05).

Während der Anteil der Ölsäure (C18:1n9) bei den V-Bullen unverändert blieb, sank dessen Anteil bei den K-Bullen um 35,53% (p<0,03). Es waren keine Unterschiede zwischen den Tiergruppen zu beobachten (p>0,05).

Bei der zweifach ungesättigten Fettsäure Linolsäure (C18:2n6) traten weder Änderungen zwischen den Phasen (p>0,05) noch Unterschiede zwischen den Tiergruppen auf (p>0,05).

Gleiches galt für die dreifach ungesättigte Eicosatriensäure (C20:3n6). Auch hier waren keine Änderungen zwischen den Phasen (p>0,05) und den Gruppen (p>0,05) zu verzeichnen. Bei der Zikosadiensäure (C20:2) nahm der Anteil bei den V-Bullen um 44,59% (p<0,01) ab. Bei den K-Bullen änderte sich der relative Gehalt dieser Fettsäure nicht (p>0,05). Es waren auch keine Unterschiede zwischen den Tiergruppen zu verzeichnen (p>0,05).

0 10 20 30 40 50

V K V K V K V K V K V K V K V K

C22:6n3 C16:0 C14:0 C18:0 C18:1n9 C18:2n6 C20:3n6 C20:2

%

Woche 1 Woche 16

a b a b

a b a b

* #

Abb. 4.2.: Prozentuale Anteile der gaschromatographisch bestimmten Fettsäuren in den Wochen 1 und 16 des Versuches bei den Versuchs- (V)- und Kontrollbullen (K). Pro Zeitpunkt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen von 9 (V-Bullen) bzw. 8 (K-Bullen) Ejakulaten dargestellt.

a,b: Werte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich (p<0,05) zwischen den Wochen; *,#:Werte mit unterschiedlichen Asteriks unterscheiden sich (p<0,05) zwischen den Gruppen.

4.2 Vergleich der Spermaparameter zwischen den Versuchsphasen und den Tier-gruppen

4.2.1 Konventionelle Spermaparameter Spermakonzentration

Die Spermakonzentration (Konz.) änderte sich weder bei den V- noch bei den K-Bullen (p>0,05). Zu keinem Zeitpunkt waren Unterschiede (p>0,05) zwischen den Tiergruppen zu erkennen (Abb. 4.3).

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

Phase I Phase II Phase III Phase IV

Konz. [Mrd./ml]

V K

Abb. 4.3 Spermakonzentration (Konz.) der V- und K-Bullen in den Nativejakulaten 1 bis 4 Wochen vor Beginn der Fütterung (Phase I) und 1 bis 4 Wochen (Phase II), 5 bis 8 Wochen (Phase III) sowie 9 bis 12 Wochen (Phase IV) nach Beginn der Fütterung. Die Werte stellen jeweils die Mittelwerte und Standardabweichungen aus 8 Ejakulaten von je 9 Versuchsbullen (= V) bzw. 8 Kontrollbullen (= K) dar.

Ejakulatvolumen

Hinsichtlich des Ejakulatvolumens (Volumen) waren bei den V- und K-Bullen (Abb. 4.4) ebenfalls keine Unterschiede (p>0,005) zwischen den Phasen festzustellen. Außerdem bestanden keine Unterschiede (p>0,05) zwischen den Tiergruppen in den einzelnen Phasen der Untersuchungen.

0 2 4 6 8 10

Phase I Phase II Phase III Phase IV

Volumen [ml]

V K

Abb. 4.4 Ejakulatvolumen (Volumen) der V- und K-Bullen in den Nativejakulaten 1 bis 4 Wochen vor Beginn der Fütterung (Phase I) und 1 bis 4 Wochen (Phase II), 5 bis 8 Wochen (Phase III) sowie 9 bis 12 Wochen (Phase IV) nach Beginn der Fütterung.

Die Werte stellen jeweils die Mittelwerte und Standardabweichungen aus 8 Ejakulaten von je 9 Versuchsbullen (= V) bzw. 8 Kontrollbullen (= K) dar.

Spermiengesamtzahl

Auch die Spermiengesamtzahl (Zahl) in den Ejakulaten änderte sich nicht (p>0,05) während des Untersuchungszeitraumes, weder bei den V- noch bei den K-Bullen (Abb. 4.5). Zwischen den Tiergruppen traten zu keinem Zeitpunkt Unterschiede (p>0,05) auf.

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Phase I Phase II Phase III Phase IV

Zahl [Milliarden]

V K

Abb. 4.5 Spermiengesamtzahl (Zahl) der V- und K-Bullen in den Nativejakulaten 1 bis 4 Wochen vor Beginn der Fütterung (Phase I) und 1 bis 4 Wochen (Phase II), 5 bis 8 Wochen (Phase III) sowie 9 bis 12 Wochen (Phase IV) nach Beginn der Fütterung.

Die Werte stellen jeweils die Mittelwerte und Standardabweichungen aus 8 Ejakulaten von je 9 Versuchsbullen (= V) bzw. 8 Kontrollbullen (= K) dar.

Progressive Motilität

Die progressive Motilität (Motilität) änderte sich weder bei den V-Bullen noch bei den K-Bullen (Abb. 4.6) während des Untersuchungszeitraumes (p>0,05). Unterschiede zwischen den Tiergruppen bestanden zu keinem Zeitpunkt (p>0,05).

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Phase I Phase II Phase III Phase IV

Motilität [%]

V K

Abb. 4.6 Progressive Motilität (Motilität) der V- und K-Bullen in den Nativejakulaten 1 bis 4 Wochen vor Beginn der Fütterung (Phase I) und 1 bis 4 Wochen (Phase II), 5 bis 8 Wochen (Phase III) sowie 9 bis 12 Wochen (Phase IV) nach Beginn der Fütterung.

Die Werte stellen jeweils die Mittelwerte und Standardabweichungen aus 8 Ejakulaten von je 9 Versuchsbullen (= V) bzw. 8 Kontrollbullen (= K) dar.

4.2.2 Durchflusszytometrisch ermittelte Spermaparameter Plasmamembranintegrität

Die PMI-Werte im flüssigkonservierten Sperma vor dem Einfrieren (PMIvK) waren bei den V- und bei den K-Bullen (Abb. 4.7) in den einzelnen Phasen konstant (p>0,05). Zu keiner Zeit unterschieden sich diese Werte zwischen den beiden Fütterungsgruppen (p>0,05).

0 20 40 60 80 100

Phase I Phase II Phase III Phase IV

PMIvK [%]

V K

Abb. 4.7 Prozentuale Anteile plasmamembranintakter Spermien vor dem Einfrieren (PMIvK) der V- und K-Bullen 1 bis 4 Wochen vor Beginn der Fütterung (Phase I) und 1 bis 4 Wochen (Phase II), 5 bis 8 Wochen (Phase III) sowie 9 bis 12 Wochen (Phase IV) nach Beginn der Fütterung. Die Werte stellen jeweils die Mittelwerte und

Standardabweichungen aus 8 Ejakulaten von je 9 Versuchsbullen (= V) bzw. 8 Kontrollbullen (= K) dar.

Nach der Kryokonservierung (PMInK) war in beiden Tiergruppen (Abb. 4.8) eine zeitliche Änderung hinsichtlich der Plasmamembranintegrität festzustellen (V-Bullen: p<0,0006; K-Bullen: p<0,0014). Die PMI-Spermien hatten gegenüber den Ausgangswerten in Phase I in allen drei Phasen sowohl bei den V-Bullen (PII: p<0,0016; PIII: p<0,0004; PIV: p<0,0002) als auch bei den K-Bullen (PII: p<0,008; PIII: p<0,0051; PIV: p<0,0004) zugenommen. Der Anstieg in den Phasen II bis IV betrug bei den V-Bullen 11,12% bis 13,42% und bei den K-Bullen 8,93% bis 11,71%. Es waren über den gesamten Untersuchungszeitraum keine Unterschiede (p>0,05) zwischen den Tiergruppen zu erkennen.

0 10 20 30 40 50 60

Phase I Phase II Phase III Phase IV

PMInK [%]

V K

a a b b b b b b

Abb. 4.8 Prozentuale Anteile plasmamembranintakter Spermien nach dem Einfrieren (PMInK) der V- und K-Bullen 1 bis 4 Wochen vor Beginn der Fütterung (Phase I) und 1 bis 4 Wochen (Phase II), 5 bis 8 Wochen (Phase III) sowie 9 bis 12 Wochen (Phase IV) nach Beginn der Fütterung. Die Werte stellen jeweils die Mittelwerte und

Standardabweichungen aus 8 Ejakulaten von je 9 Versuchsbullen (= V) bzw. 8 Kontrollbullen (= K) dar.

a,b: Werte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich (p<0,05) zwischen den Phasen.

Akrosomale Schädigung

Bezüglich der Spermien mit akrosomaler Schädigung im flüssigkonservierten Sperma vor dem Einfrieren (ASvK) zeigten sich weder bei den V- noch bei den K-Bullen Veränderungen (Abb. 4.9) in den einzelnen Phasen (p>0,05). Zu keinem Zeitpunkt waren Unterschiede zwischen den V- und K-Bullen nachzuweisen (p>0,05).

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Phase I Phase II Phase III Phase IV

ASvK [%]

V K

Abb. 4.9 Prozentuale Anteile von Spermien mit akrosomaler Schädigung vor dem Einfrieren (ASvK) der V- und K-Bullen 1 bis 4 Wochen vor Beginn der Fütterung (Phase I) und 1 bis 4 Wochen (Phase II), 5 bis 8 Wochen (Phase III) sowie 9 bis 12 Wochen (Phase IV) nach Beginn der Fütterung. Die Werte stellen jeweils die Mittelwerte und

Standardabweichungen aus 8 Ejakulaten von je 9 Versuchsbullen (= V) bzw. 8 Kontrollbullen (= K) dar.

Nach der Kryokonservierung (Abb. 4.10) änderte sich in beiden Tiergruppen der Anteil der Spermien mit akrosomaler Schädigung (AsnK). Bei den V-Bullen hatten die ASnK-Werte im Vergleich zu den Ausgangswerten in Phase I um 13,11% in Phase II (p<0,002), um 17,83% in Phase III (p<0,0001) und um 15,15% in Phase IV (p<0,0001) abgenommen. Auch bei den K-Bullen war eine Abnahme im Vergleich zum Ausgangswert in Phase I zu beobachten. In Phase II betrug die Differenz 10,36% (p<0,0019), in Phase III lag sie bei 12,58% (p<0,0002) und in Phase IV bei 13,12% (p<0,0002). In Phase I waren die ASnK-Werte bei den V-Bullen um 7,10% (p<0,0403) höher als bei den K-Bullen. Ansonsten waren keine Unterschiede zwischen beiden Bullengruppen festzustellen (p>0,05).

0

Phase I Phase II Phase III Phase IV

ASnK [%]

Abb. 4.10 Prozentuale Anteile von Spermien mit akrosomaler Schädigung nach dem Einfrieren (ASnK) der V- und K-Bullen 1 bis 4 Wochen vor Beginn der Fütterung (Phase I) und 1 bis 4 Wochen (Phase II), 5 bis 8 Wochen (Phase III) sowie 9 bis 12 Wochen (Phase IV) nach Beginn der Fütterung. Die Werte stellen jeweils die Mittelwerte und

Standardabweichungen aus 8 Ejakulaten von je 9 Versuchsbullen (= V) bzw. 8 Kontrollbullen (= K) dar.

a,b: Werte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich (p<0,05) zwischen den Phasen; *,#: Werte mit unterschiedlichen Asteriks unterscheiden sich (p<0,05) zwischen den Gruppen.

DNA-Integrität

Die DFI%-Werte (Abb. 4.11) blieben in beiden Tiergruppen über den Versuchszeitraum unverändert (p>0,05). Zu keinem Zeitpunkt waren Unterschiede zwischen den V- und K-Bullen nachzuweisen (p>0,05).

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Phase I Phase II Phase III Phase IV

DFI [%]

V K

Abb. 4.11 DFI%-Werte der V- und K-Bullen nach der Kryokonservierung und 3-stündiger Inkubation 1 bis 4 Wochen vor Beginn der Fütterung (Phase I) und 1 bis 4 Wochen (Phase II), 5 bis 8 Wochen (Phase III) sowie 9 bis 12 Wochen (Phase IV) nach Beginn der Fütterung. Die Werte stellen jeweils die Mittelwerte und Standardabweichungen aus 8 Ejakulaten von je 9 Versuchsbullen (= V) bzw. 8 Kontrollbullen (= K) dar.

Auch die SD-DFI-Werte (Abb. 4.12) änderten sich über den gesamten Untersuchungszeitraum weder bei den V-Bullen noch bei den K-Bullen (p>0,05). Zwischen den Tiergruppen waren keine Differenzen hinsichtlich dieses Parameters (p>0,05) feststellbar.

0 5 10 15 20 25

Phase I Phase II Phase III Phase IV

SD-DFI

V K

Abb. 4.12 SD-DFI-Werte der V- und K-Bullen nach der Kryokonservierung und 3-stündiger Inkubation 1 bis 4 Wochen vor Beginn der Fütterung (Phase I) und 1 bis 4 Wochen (Phase II), 5 bis 8 Wochen (Phase III) sowie 9 bis 12 Wochen (Phase IV) nach Beginn der Fütterung. Die Werte stellen jeweils die Mittelwerte und Standardabweichungen aus 8 Ejakulaten von je 9 Versuchsbullen (= V) bzw. 8 Kontrollbullen (= K) dar.

Lipidperoxidation

Die Fluoreszenzintensität nach C11-Bodipy-Färbung (Abb. 4.13) vor der Kryokonservierung (BodipyvK) änderte sich bei den V-Bullen nicht (p>0,05). Im Gegensatz dazu hatte die Fluoreszenz bei den K-Bullen in Phase II im Vergleich zu Phase I um 61,25% abgenommen (p<0,018). In Phase III und IV hatten die BodipyvK-Werte bei den K-Bullen wieder zugenommen und unterschieden sich nicht mehr von den in Phase I gemessenen Werten (p>0,05). Zu keinem Zeitpunkt bestanden Unterschiede zwischen den Tiergruppen (p>0,05).

0 1 2 3 4 5

Phase I Phase II Phase III Phase IV

BodipyvK [Kanäle]

V K

a a a b a ab a ab

Abb. 4.13 Differenz der Fluoreszenzintensität (stimulierte (tert. Butylhydroperoxid) minus unstimulierte Werte) der plasmamembranintakten Spermien nach Färbung mit C11 Bodipy^581/591 in flüssigkonserviertem Sperma vor der Kryokonservierung (BodipyvK) 1 bis 4 Wochen vor Beginn der Fütterung (Phase I) und 1 bis 4 Wochen (Phase II), 5 bis 8 Wochen (Phase III) sowie 9 bis 12 Wochen (Phase IV) nach Beginn der

Fütterung. Die Werte stellen jeweils die Mittelwerte und Standardabweichungen aus 8 Ejakulaten von je 9 Versuchsbullen (= V) bzw. 8 Kontrollbullen (= K) dar.

a,b: Werte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich (p<0,05) zwischen den Phasen.

Die Bodipy-Fluoreszenz direkt nach der Kryokonservierung (BodipynK0h) änderte sich ebenfalls nur bei den K-Bullen (p<0,041). Hier nahm die Fluoreszenzintensität von Phase II zu Phase III um 56,06% (p<0,0058) ab. Zwischen den Phasen II und IV betrug die Differenz 39,32% (p<0,045). In Phase III waren die BodipynK0h-Werte bei den V-Bullen um 82,63%

(p<0,016) höher als bei den K-Bullen (Abb. 4.14).

0 1 2 3 4 5 6

Phase I Phase II Phase III Phase IV

BodipynK0h [Kanäle]

V K

a ab a a a b* # a b

Abb. 4.14 Differenz der Fluoreszenzintensität (stimulierte (tert. Butylhydroperoxid) minus unstimulierte Werte) der plasmamembranintakten Spermien nach Färbung mit C11 Bodipy^581/591 in kryokonserviertem Sperma direkt nach dem Auftauen (BodipynK0h) 1 bis 4 Wochen vor Beginn der Fütterung (Phase I) und 1 bis 4 Wochen (Phase II), 5

Abb. 4.14 Differenz der Fluoreszenzintensität (stimulierte (tert. Butylhydroperoxid) minus unstimulierte Werte) der plasmamembranintakten Spermien nach Färbung mit C11 Bodipy^581/591 in kryokonserviertem Sperma direkt nach dem Auftauen (BodipynK0h) 1 bis 4 Wochen vor Beginn der Fütterung (Phase I) und 1 bis 4 Wochen (Phase II), 5

Im Dokument Einfluss der Fütterung von Omega-3-Fettsäuren auf die Spermaqualität von Bullen (Seite 41-0)