Einfluß der Zufütterung von karotinoidem Astaxanthin auf die Spermaqualität und die Fruchtbarkeit von Warmbluthengsten
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Kristin Hildegard Heczko aus Warburg
Hannover 2004
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Dr. E. Klug
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Dr. E. Klug
2. Gutachter: apl. Prof. Dr. Dr. S. Meinecke-Tillmann
Tag der mündlichen Prüfung: 23. November 2004
Meiner Familie und Alexander
INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG ... 9
2. SCHRIFTTUM... 10
2.1 Spermien... 10
2.1.1 Entwicklung der Spermien ... 10
2.1.2 Spermienmorphologie ... 11
2.2 Reaktive Sauerstoffradikale (ROS) ... 15
2.2.1 Typen von ROS ... 15
2.2.2 Produktion von ROS ... 16
2.3 Wirkung von ROS auf Spermien... 17
2.3.1 Physiologische Effekte von ROS auf die Spermien... 17
2.3.2 Pathologische Effekte von ROS auf die Spermien... 18
2.4 Veränderungen an Spermien durch den Gefrier- und Auftauprozeß... 23
2.4.1 Schädigungen durch den Gefrier- und Auftauprozeß... 23
2.4.2 ROS im Sperma nach dem Gefrier-Auftau-Prozeß... 24
2.5 Körpereigene Antioxidantien ... 25
2.5.1 Superoxiddismutase... 26
2.5.2 Katalase ... 27
2.5.3 Glutathionperoxidase/ -reduktase... 27
2.5.4 Vitamin E... 28
2.5.5 Vitamin C ... 28
2.5.6 β-Karotin ... 29
2.6 Karotinoides Astaxanthin ... 30
2.6.1 Astaxanthin innerhalb der Gruppe der Karotinoide ... 30
2.6.2 Gewinnung von Astaxanthin ... 31
2.6.3 Wirkung von Astaxanthin ... 31
3. MATERIAL UND METHODE ... 33
3.1 Versuchstiere ... 33
3.1.1 Tierhaltung und Fütterung... 33
3.1.2 Tiergesundheit ... 33
3.1.3 Behandlungsgruppen ... 33
3.2 Versuchskonzeption ... 34
3.2.1 Gewinnung der Ejakulate ... 35
Inhaltsverzeichnis
3.2.2 Aufbereitung der Ejakulate... 35
3.2.3 Prüfung der Haltbarkeit des Frischspermas... 36
3.2.4 Spermienmorphologie des Frischspermas... 36
3.2.5 Beurteilung des Tiefgefrierspermas ... 39
3.2.6 Durchführung von Färbungen an aufgetautem Gefriersperma... 40
3.3 Ermittlung der Fertilitätsparameter ... 44
3.4 Statistische Auswertung ... 44
4. ERGEBNISSE... 46
4.1 Einfluß von karotinoidem Astaxanthin auf Dichte und Gesamtspermienzahl der Ejakulate ... 46
4.2 Einfluß von karotinoidem Astaxanthin auf die Spermienmotilität des Frischsamens ... 48
4.3 Einfluß von karotinoidem Astaxanthin auf die Haltbarkeit des Frischsamens ... 49
4.4 Einfluß von karotinoidem Astaxanthin auf den Anteil lebender Spermien im Frischsamen ... 51
4.5 Einfluß von karotinoidem Astaxanthin auf die Akrosomintegrität der Spermien im Frischsamen ... 52
4.6 Einfluß von karotinoidem Astaxanthin auf die Spermienmotilität des Tiefgefriersamens... 54
4.7 Einfluß von karotinoidem Astaxanthin auf den Anteil der lebenden Spermien des Tiefgefrierspermas ... 55
4.8 Einfluß von karotinoidem Astaxanthin auf die Peroxidation der Spermien des Tiefgefrierspermas... 56
4.9 Einfluß von karotinoidem Astaxanthin auf die Chromatinstruktur der Spermien des Tiefgefrierspermas ... 59
4.10 Einfluß von karotinoidem Astaxanthin auf die Fruchtbarkeitswerte der Hengste... 61
5. DISKUSSION ... 68
6. ZUSAMMENFASSUNG... 78
7. SUMMARY ... 80
8. LITERATURVERZEICHNIS... 82
9. ANHANG... 97
Abkürzungsverzeichnis
ADP Adenosindiphosphat ATP Adenosintriphosphat bzw. beziehungsweise
Ca Calcium
DCFH-DA Dichlorofluorescin-diacetat DFI DNA-Fragmentationsindex DHR Dihydrorhodamin
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonucleinacid
DNS Desoxyribonucleinsäure et al. und andere
Fe Eisen
FITC Fluorescenisothiocyanat FMP Forward Motility Protein GSH Glutathionsulfhydryl GSSG Glutathiondisulfid GSZ Gesamtspermienzahl h Stunde
H2O2 Hydrogenperoxid LPO Lipidperoxidation MDA Malondialdehyd Mio. Millionen ml Milliliter mM Millimolar
MMP Mitochondrienmembranpotential Mrd. Milliarden
NADH Nicotinamidadenindinukleotid
NADPH Nicotinamidadenindinukleotidphosphat
nm Nanometer
O2·_ Superoxidanionen OH· Hydroxylradikal
Abkürzungsverzeichnis
o. J. ohne Jahr
PI Propidiumiodid PNA Peanut Agglutinin RNA Ribonucleinacid ROO· Peroxylradikal
ROS Reactive oxygen species (Reaktive Sauerstoffradikale) SCSA Sperm Chromatin Structure Assay
SOD Superoxiddismutase
SYBR®14 DNA-Farbstoff für lebende Zellen SYTO®17 Lebendfarbstoff
u.u. und umgekehrt VA Varianzanalyse z.B. zum Beispiel
±SD Standardabweichung
X Mittelwert
µl Mikroliter
1. EINLEITUNG
Die Wirtschaftlichkeit der Pferdezucht hängt unmittelbar von einer guten Fruchtbarkeitsleistung ab. Die Qualität des Spermas spielt gerade bei der instrumentellen Samenübertragung zusammen mit der Qualität des Stutenmaterials und dem Deckmanagement eine wichtige Rolle. Die Qualität des Spermas wiederum steht deutlich mit der über die Zeit hinweg abnehmenden Befruchtungsfähigkeit der Spermien in Zusammenhang.
Die Befruchtungsfähigkeit der Spermien wird von spontaner Peroxidbildung beeinflußt, die hauptsächlich durch die Entstehung reaktiver Sauerstoffradikale hervorgerufen wird.
Diese freien Radikale sind sehr reaktionsfähige Teilchen, welche an den Plasmamembranen der Spermien zu einer Autooxidation der ungesättigten Fettsäuren führen können. Die Membranschädigungen durch Lipidperoxidation können zu einem Motilitätsverlust der Spermien und zu einer Schädigung der DNS führen.
Im Frischsperma kann es zu Spermienschäden kommen, da die im Sperma natürlicherweise vorhandenen Antioxidantien und Enzyme nicht immer genügend Schutz bieten, um die durch Peroxide entstehenden Schäden zu verhindern. Im Rahmen der Kryokonservierung läßt sich eine erhöhte Peroxidkonzentration sowohl durch das Entfernen des Seminalplasmas und der darin vorhandenen Antioxidantien als auch durch die gesteigerte Peroxidproduktion während des Aufbereitungsprozesses erklären.
Damit keine Schäden an den Spermien auftreten, werden Stoffe benötigt, die die Membranen der Spermien vor der Lipidperoxidation schützen. Karotinoides Astaxanthin ist ein solches Antioxidationsmittel, welches aufgrund seiner eigenen Oxidierbarkeit die reaktiven Sauerstoffradikale abfangen und damit die Lipidperoxidation verhindern kann.
Ziel der eigenen Untersuchungen war es, zu prüfen, inwieweit die Fütterung von karotinoidem Astaxanthin an Warmbluthengste einen positiven Effekt auf die Spermaqualität hat. Hierbei sollte insbesondere der Einfluß auf die Spermienmotilität und -morphologie bei Frisch- und Tiefgefriersperma und die Fruchtbarkeit untersucht werden.
Schrifttum
2. SCHRIFTTUM 2.1 Spermien
2.1.1 Entwicklung der Spermien
Spermatogenese bezeichnet den zyklisch ablaufenden Spermienbildungsprozeß, der mit der Geschlechtsreife einsetzt (SINOWATZ 2001). Jeder Spermatogenesezyklus dauert beim Hengst etwa 55 bis 57 Tage, wobei die Spermatozytogenese etwa 20 Tage, die primäre und sekundäre meiotische Teilung ebenfalls etwa 20 Tage und die Spermiogenese etwa 15 Tage dauert (MEYERS 2000).
Zu Beginn der Spermatozytogenese liegen Spermatogonien peripher an der Basalmembran der Samenkanälchen und erzeugen durch andauernde Mitosen neue Spermatogonien. Diese Spermatogonien durchlaufen die primäre und sekundäre meiotische Teilung, wodurch Spermatiden entstehen. Spermatiden besitzen einen haploiden Chromosomensatz (RÜSSE und SINOWATZ 1991). Danach folgt die Spermiogenese, bei der es zu Umformungs- und Reifungsprozessen unter Verdichtung der Chromatinsubstanz kommt (SINOWATZ 2001). Das Akrosom und die Geißel mit der Mitochondrienscheide des Mittelstücks bilden sich aus (SINOWATZ und WROBEL 1981).
Bei der epididymalen Spermienreifung erfahren die Spermien biochemische, physiologische und morphologische Veränderungen, durch die sie erst ihre Befruchtungs- fähigkeit erlangen (BAMBERG 1975). Es kommt zum Ablösen des zytoplasmatischen Tröpfchens vom Mittelstück der Spermien (FAWCETT und PHILIPPS 1969), das Akrosom verändert seine Größe und Form und der Inhalt des Akrosoms verdichtet sich (BEDFORD 1963). Die Motilität der Spermien nimmt während der Passage durch den Nebenhoden zu. Im Nebenhodenschwanz ist eine gerichtete Bewegung der Spermien zu erkennen, was auf eine Bildung zusätzlicher Disulfidbrücken in den Fibrillen des Spermienschwanzes zurückgeführt wird (SINOWATZ 2001). Beim Bullen konnte im Seminalplasma ein „Forward Motility Protein“ (FMP) nachgewiesen werden, welches die Motilität der Spermien stimuliert (ACOTT und HOSKINS 1981). Im Spermienstoffwechsel erfolgt eine Umstellung, die Stoffwechselleistungen nehmen zu: Es
kommt zu einer verstärkten Glykolyse und die Respiration erhöht sich (DACHEUX et al.
1979).
Die Spermienmembran erfährt während der epididymalen Reifung Modifikationen, die Lipidzusammensetzung der Plasmamembran ändert sich. Bei Studien über die akrosomale Plasmamembran bei Rattenspermien wurde während der Nebenhodenpassage eine Änderung des Sterol-Phospholipidverhältnisses und des Sättigungsgrades der Fettsäurereste festgestellt (PARKS und HAMMERSTEDT 1985). Gleichzeitig ändert sich die Zusammensetzung der Glykoproteine und die antigene Struktur der Plasmamembran (SINOWATZ 2001).
2.1.2 Spermienmorphologie 2.1.2.1 Grundstruktur der Spermien
Die Grundstruktur der Hengstspermien läßt sich – wie die anderer Säugetiere auch – in verschiedene Abschnitte unterteilen: den Kopf, der sich in einen akrosomalen und einen postakrosomalen Bereich gliedern läßt (DOTT 1975), und den Schwanz. Der Schwanz wiederum teilt sich in ein kurzes Halsstück und ein Mittel-, Haupt- und Endstück (SINOWATZ 2001). Hengstspermien haben eine abaxiale Position des Schwanzes und sind im Durchschnitt ca. 60-65 µm lang. Außerdem sind die Asymmetrie des Kopfes, das geringe Volumen des Akrosoms und die Anwesenheit von Mikrotubuli im Bereich des Halses hengstspezifisch (HANCOCK 1957, DOTT 1975).
Alle Teilbereiche der Samenzelle werden von einer gemeinsamen Plasmamembran überzogen, deren molekularer Bau regionale Unterschiede zeigt. Die Plasmamembran des Kopfes ist durch einen relativ hohen Cholesteringehalt, der die Fluidität der Membran stark herabsetzt, und durch einen relativ hohen Anteil an ungesättigten Fettsäuren in den Phospholipiden gekennzeichnet (ROVAN 2001).
Das Zytosol ist im Bereich des Kopfes auf schmale Abschnitte beschränkt und besteht vorwiegend aus Zytoplasma und dem Zytoskelett. An den schmalen Saum des Zytoplasmas schließt sich das Akrosom an. Es wird in den Spermatiden vom Golgi- Apparat gebildet. Die dem Zellkern nahe Membran wird als innere Membran, die der Plasmamembran nahe Membran als äußere Membran bezeichnet (SINOWATZ et al.
Schrifttum
1989). Beide Membranen weisen strukturelle und molekulare Unterschiede auf (NOLAND et al. 1983). Das Akrosom läßt sich in drei Abschnitte unterteilen: in das Apikalsegment, das Hauptsegment und das Äquatorialsegment (FAWCETT 1975). Das Akrosom enthält vor allem Proteine mit enzymatischer Funktion, die bei der Interaktion von Spermium und Oozyte mitwirken (ROVAN 2001). Der Zellkern macht den Großteil des Kopfes aus. Das Chromatin des Kerns liegt in sehr kompakter Form vor und wird von der Kernmembran umschlossen. Der Teil des Kerns, der nicht vom Akrosom bedeckt wird, ist von der postakrosomalen Scheide eingehüllt (RÜSSE und SINOWATZ 1991).
Den basalen Abschluß des Kopfes bildet die Basalplatte. Durch feine Filamente mit der Basalplatte verbunden schließt sich das Kapitulum an. Basalplatte, Filamente und Kapitulum bilden eine gelenkige Verbindung zwischen Spermienkopf und Spermienschwanz. Im dahinter folgenden Streifenkörper, der aus neun segmentierten Säulen besteht, liegt das proximale Zentriol. Dieses besteht aus 9 x 3 Mikrotubuli, welche kreisförmig angeordnet sind. Aus dem distalen Zentriol entwickelt sich während der Spermienreifung der zentrale Achsenfaden, das Axonema (FAWCETT 1975).
Im Mittelstück des Schwanzes umlaufen die Mitochondrien, die die Energie für die Fortbewegung des Spermiums bereitstellen, den axonemalen Komplex und die Mantelfasern spiralig (ROVAN 2001). Das Axonema besitzt zwei zentrale, voneinander getrennte Mikrotubuli in einer gemeinsamen Zentralscheide, die von neun Mikrotubulipaaren umgeben werden. Diese setzen sich aus einem A- und einem B- Tubulus zusammen, welche teilweise miteinander verschmolzen sind. Der etwas kleinere Tubulus A trägt einen äußeren und einen inneren Dyneinarm (ein ATPase-aktives Protein) (FAWCETT 1975). Über Auf- und Abbau der Dyneinarme werden die peripheren Doppeltubuli gegeneinander verschoben, wodurch die Vorwärtsbewegung des Spermiums zustandekommt (RÜSSE und SINOWATZ 1991). Jedem Mikrotubulipaar ist eine elektronendichte Mantelfaser zugeordnet, die artspezifische Variationen in Form und Größe zeigt. Mit einem Schlußring (Anulus) endet das Mittelstück (ROVAN 2001).
Im Hauptstück der Geißel liegt direkt unter der Zellmembran das System der Ringfasern. Es besteht aus einer Vielzahl feiner Rippen, die durch eine dorsale und eine ventrale Längsleiste miteinander verbunden sind und das Axonema und die Mantelfasern umschließen (RÜSSE und SINOWATZ 1991). Sie werden als „striated fibres“ oder
„fibrous sheath“ bezeichnet (ROVAN 2001).
Im Endstück der Geißel fehlen die „fibrous sheath“, die Mantelfasern und zum Teil auch das zentrale Mikrotubulipaar, so daß die äußeren Mikrotubuli des axonemalen Komplexes nur noch ungeordnet verlaufen (ROVAN 2001).
Kopf
Plasmamembran
Äußere Akrosomenmembran Innere Akrosomenmembran Akrosomeninhalt
Kernmembran Chromatinsubstanz Postakrosomales Zentriol
Mitochondrien Halsregion
Mittelstück
Hauptstück
Endstück
Schwanz
Akrosomaler Bereich
Post- akrosomaler
Bereich
Abb.1: Schematische Darstellung der Spermienmorphologie, Sagittalschnitt (modifiziert nach GADELLA et al. 2001).
2.1.2.2 Plasmamembran der Spermien
Es handelt sich um eine dreilagige Membran, deren äußere Schicht 5 nm, deren mittlere Schicht 3 nm und deren innere Schicht 2 nm dick ist (BACCETTI und AFZELIUS 1976).
Die Zellmembran besteht aus einer Lipid-Doppelschicht. Die Lipidmoleküle sind aus Phospholipiden, Glykolipiden und nichtverestertem Cholesterin zusammengesetzt. In die Lipiddoppelschicht sind Proteine, Glykoproteine und in geringem Umfang Kohlenhydrate eingelagert (GREGER 1996).
Die Flexibilität der Membran hängt von der Lipid- und der Proteinzusammensetzung sowie der Proteinverteilung und -funktion ab. Cholesterin festigt den Zusammenhalt der Membran. Die Lipidzusammensetzung ist in verschiedenen Regionen der Membran unterschiedlich (AMANN und GRAHAM 1993). Die Struktur der Plasmamembran wird als „Flüssig-Mosaik-Modell“ bezeichnet, da die Lipidmoleküle in der Membran
Schrifttum
Transversalbewegungen ausführen können (SINGER und NICHOLSON 1972). Spermien von Säugetieren enthalten einen hohen Anteil an ungesättigten Fettsäuren (SIKKA 2001).
Die Relation von ungesättigten zu gesättigten Fettsäuren in der Zellmembran beträgt bei Hengstspermien 0,9. Die wichtigste Komponente der Phospholipide ist das Phosphatidylcholin mit 27,1% (CHOW et al. 1986). Die Fettsäuren der Spermienphospholipide bestehen zum großen Teil aus Palmitin-, Docosapentaenon- und ungesättigter Arachidonsäure (POULOS et al. 1973).
In der Membranmitte stehen sich die apolaren Fettsäurereste gegenüber, während die polaren hydrophilen Teile der Membran nach außen ragen. Transmembranöse Proteine durchziehen die Membran vollständig und dienen als Transportproteine. In die Gruppe der Transportproteine gehören Ionenkanäle, Carrierproteine und Pumpen (GREGER 1996).
Membran-assoziierte Proteine sind an die Oberfläche gebunden, können sich aber leicht von ihr lösen. Zu dieser Gruppe gehören Rezeptoren und Zelladhäsionsproteine. Sie spie- len z. B. bei der Zona-Bindung und der nachfolgenden Akrosomreaktion eine wesentliche Rolle (ROVAN 2001). Membranproteine von Samenzellen besitzen im Gegensatz zu Membranproteinen anderer Zellen antigene Eigenschaften (GURAYA 1987).
Abb. 2: Schematische Darstellung einer Plasmamembran (nach SCHRÖDER und DIENER 2000)
2.1.2.3 Die Mitochondrien
Als Energieträger und Energiespeicher des Spermiums fungiert Adenosintriphosphat (ATP). Die Samenzelle des Pferdes ist, im Gegensatz zu Bullen-, Schafbock- oder Humanspermien, in hohem Maß auf die Gewinnung von ATP durch aerobe Phosphory- lierung angewiesen (AMANN und GRAHAM 1993).
Die Mitochondrien der Spermien haben eine längsovale Form. Sie liegen schrauben- förmig angeordnet im Mittelstück des Schwanzes. Sie besitzen eine äußere glatte und eine innere, stark gefaltete Membran. Die innere Membran umschließt die Mitochondrien- matrix. Wenn bei der oxidativen Phosphorylierung Protonen aus der Matrix abgegeben werden, entsteht an der inneren Membran ein elektrochemischer Gradient (das Mitochon- drienmembranpotential (MMP)) (LEHNINGER et al. 1994). Dieser elektrochemische Gradient zwischen Innen- und Außenseite der Membran dient der Synthese der ATP- Moleküle (COSSARIZZA et al. 1993). Da die ATP-Moleküle fast ausschließlich bei der Fortbewegung der Spermien verbraucht werden (GRAVANCE et al. 2000), ist die Motilität der Spermien größtenteils von der korrekten Funktionsweise der Mitochondrien abhängig (AUGER et al. 1989).
2.2 Reaktive Sauerstoffradikale (ROS) 2.2.1 Typen von ROS
ROS (reactive oxygen species) sind stark oxidierende Reaktionspartner, die ein oder mehrere ungebundene Elektronen enthalten. Sie sind sehr kurzlebig (10-11 bis 10-9 sec) und reagieren bereitwillig mit den meisten organischen Verbindungen, um ihre Elektronenstrukturen zu stabilisieren. Bei solchen Reaktionen bewirken die freien Radikale entweder eine Oxidation oder Reduktion ihrer Reaktionspartner (GRIVEAU und LE LANNOU 1997). Zu den ROS zählt man die Superoxidanionen (O2·_), Hydrogenperoxide (H2O2), Peroxylradikale (ROO·) und die sehr reaktiven Hydroxylradikale (OH·) (SIKKA 2001).
Spermien reagieren besonders empfindlich auf reaktive Sauerstoffradikale. Abhängig davon, um welche Radikale es sich handelt, von ihrer Menge und der Zeit, in welcher sie
Schrifttum
produziert werden, rufen sie unterschiedliche Wirkungen hervor. Wenn sie in niedrigen Konzentrationen vorhanden sind, wirken sie als Mediatoren normaler Spermienfunktion;
in großen Mengen jedoch sind sie hoch toxisch für die Zellen (GRIVEAU und LE LANNOU 1997). Von Leukozyten freigesetzte ROS sorgen für die Zellzerstörung bei der Phagozytose (BAUMBER et al. 2000).
2.2.2 Produktion von ROS
ROS werden von einer Vielzahl von Zellen produziert. Zu diesen Zellen gehören Leukozyten, unbewegliche oder morphologisch abnormale Spermien und morphologisch normale, aber funktionell abnormale Spermien (PLANTE et al. 1994). Weiterhin können Endothelzellen, Mesangialzellen, Fibroblasten, Schilddrüsenzellen, B-Lymphozyten, Fettzellen (CROSS und JONES 1991) und Osteoklasten (SILVERTON et al. 1995) ROS produzieren. Im Sperma sind die Spermien selbst oder kontaminierende Leukozyten die Quellen von ROS (AITKEN und WEST 1990), wobei die Spermien bei verschiedenen Spezies vor allem O2·_ zu produzieren scheinen (BALL et al. 2001).
Zwei Wege der ROS-Produktion werden diskutiert. Zum einen wird beschrieben, daß Spermien und Leukozyten den gleichen Mechanismus für die ROS-Produktion besitzen.
Dieses ist eine reduzierte Nicotinamidadenindinukleotidphosphat (NADPH)-Oxidase, welche in der Zellmembran lokalisiert zu sein scheint (vgl. BAUMBER et al. 2002). Zum anderen könnte eine Spermiendiaphorase (eine NAD(P)H-abhängige Oxidoreduktase) ROS herstellen. Letztere ist im Mittelstück der Spermien lokalisiert und an der mito- chondrialen Atmungskette beteiligt. Da bei unfruchtbaren Männern nur ein kleiner Teil der ROS außerhalb der Spermien aufzufinden ist, geht man davon aus, daß das mitochondriale System die Hauptquelle der Spermien-ROS-Produktion ist. Bei den Wiederkäuern wurde eine spezifische aromatische Aminosäure-Oxidase entdeckt, welche bei toten Spermien ROS produzierte (SHANNON und CURSON 1982).
Abnormale Spermien, vor allem solche, die Residualzytoplasma behalten haben, zeigen eine signifikant höhere Kapazität für die Produktion von ROS. Dieser Sachverhalt wird dadurch erklärt, daß Spermien mit Zytoplasmatropfen einen höheren Anteil an zytoplasmatischen Enzymen besitzen. Das Enzym Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase wirkt an der Produktion von NADPH mit. Es wird vermutet, daß NADPH, welches über
diesen Weg synthetisiert wird, eine der Hauptquellen für die Elektronen ist, die für die Superoxidanionen-Produktion bei menschlichen Spermien benötigt werden (BAUMBER et al. 2000).
Die Menge an ROS, die von beschädigten menschlichen Spermien produziert wird, reicht jedoch nicht aus, um die Motilität der unbeschädigten Spermien zu beeinflussen.
Anders verhält es sich bei den von Leukozyten stammenden ROS. Aktivierte und in hohen Konzentrationen vorkommende polymorphkernige Leukozyten produzieren z. B. solch hohe ROS-Spiegel, daß die Spermienmotilität normaler menschlicher Spermien beeinflußt wird (PLANTE et al. 1994). Im Pferdesperma sind Leukozyten jedoch normalerweise nicht in großen Mengen anzutreffen, es sei denn, der Hengst leidet an einer Genitaltraktinfektion. Bei In-vitro-Versuchen mit Pferdespermien war erst ab einer Kon- zentration von 5 × 106 Neutrophilen/ml die H2O2-Produktion signifikant erhöht und die Spermienmotilität beeinflußt. Bei menschlichen Spermien zeigten sich vergleichbare Effekte bereits bei einer zehnfach geringeren Konzentration (zitiert nach BAUMBER et al.
2002).
2.3 Wirkung von ROS auf Spermien
Bei der Untersuchung der Wirkung von reaktiven Sauerstoffgruppen muß zwischen physiologischen und pathologischen Effekten unterschieden werden.
2.3.1 Physiologische Effekte von ROS auf die Spermien
Physiologisch wirken Radikale bei Elektronentransferreaktionen, Regulationsprozessen und bei der unspezifischen Bakterienabwehr (AITKEN und FISCHER 1994) mit. ROS sind in niedrigen Konzentrationen Mediatoren bei wichtigen Prozessen der Spermienfunktion (GRIVEAU und LE LANNOU 1997), wie z. B. der Hyperaktivierung der menschlichen Spermien (KIM und PARTHASARATHY 1998). DE LAMIRANDE et al. (1997) gehen davon aus, daß bei menschlichen Spermien Kapazitation und Akrosomreaktion oxidative Prozesse sind, welche H2O2, O2·_ oder beide involvieren.
Diese ROS werden wahrscheinlich von den Spermien selber produziert. H2O2 scheint für
Schrifttum
die Kapazitation von Goldhamsterspermien verantwortlich zu sein (BIZE et al. 1991). Bei Rinderspermien wird ein niedriger Spiegel von ROS als notwendig erachtet, um die Fusion von Spermium und Oozyte zu ermöglichen (BLONDIN et al. 1997). Bei den menschlichen Spermatozoen regulieren NADPH-abhängige endogene ROS durch Tyrosinphosphorilierung die Akrosomreaktion (AITKEN et al. 1994). Normalerweise steigern gute Oxidationsbedingungen die Tyrosinphosphorilierung, während Reduktions- bedingungen den gegenteiligen Effekt haben. Es ist allerdings noch nicht geklärt, wie Membranveränderungen durch exogene ROS die Spermienfunktionen durch die Tyrosinphosphorylierung beeinflussen (SIKKA 2001).
2.3.2 Pathologische Effekte von ROS auf die Spermien
Der hohe Anteil an ungesättigten Fettsäuren gibt der Plasmamembran die Beweglichkeit, die sie für die Spermienbewegung und die Teilnahme an der Membranfusion bei der Befruchtung braucht. Gleichzeitig gibt sie ihr die strukturelle Integrität, die für die Le- bensfähigkeit benötigt wird. Ein Verlust der Integrität – hervorgerufen durch ROS – kann zu einer gesteigerten Membranpermeabilität und Regulationsverlusten der intrazellulären Ionenkonzentrationen führen, welche in die Kontrolle der Spermienbewegung mit eingebunden sind (BAUMBER 2000).
Normalerweise besteht ein Gleichgewicht zwischen den ROS, die produziert, und denen, welche durch Antioxidantien abgefangen werden. Steigt jedoch der Anteil reaktiver Sauerstoffradikale im Vaginalsekret oder im Sperma an, entsteht oxidativer Streß für die Spermien (DANDEKAR et al. 2002). Hierdurch verändert sich der zelluläre Meta- bolismus der Zelle, wobei Bewegung und Funktion der Spermien beeinflußt werden können (SIKKA 2001). Der oxidative Streß kann außerdem zu Schäden an DNS, Genen und Proteinen führen. Schäden an der DNS können entweder durch Oxidation von DNS- Basen und –SH-Gruppen von Proteinen oder durch kovalente Bindungen entstehen, durch die es zu Strangbrüchen oder „Cross-Linking“ kommen kann (ERNSTER und YAGI 1993). Zahlreiche Studien bei menschlichen Spermien haben gezeigt, daß die DNS der Samenzellen durch ROS geschädigt werden kann, wodurch es zu negativen Effekten auf die korrekte Weitergabe der Erbinformation kommt (SIKKA et al 1995).
Leider gibt es nur wenig veröffentlichte Informationen über den Einfluß von ROS auf Pferdesperma. Bei In-vitro-Versuchen mit Pferdespermien führte eine erhöhte Produktion von ROS zu einem Motilitätsverlust der Spermien, wohingegen kein meßbarer Abfall der Lebensfähigkeit oder der Akrosomintegrität der Spermien festgestellt werden konnte (BAUMBER et al. 2000). Hydrogenperoxide scheinen die am meisten toxischen ROS unter In-vitro-Konditionen zu sein (KIM und PARTHASARATHY 1998) und haben auch beim Pferddie gravierendsten zytotoxischen Effekte auf die Spermien (BALL et al. 2001).
Infektion Entzündung
↑Reaktive Sauerstoffradikale
(O2.-, H2O2, OH.)
Beschädigte Spermien
↓Antioxidantien (SOD, Katalase, Vitamine E, C,
β-Karotin)
↑Oxidativer Stress
↑Beschädigung an DNA, Proteinen,
Lipiden
↑Chemokine ↑LPO im Sperma
Veränderte Ca2+
Regulierung
Spermienfunktionsstörung
↓Fertilität
[↓GSH, NAD(H)]
(↑Fe3+)
Abb. 3: Schema der zusammenhängenden Mechanismen zwischen oxidativem Stress, Antioxidantien und Fruchtbarkeitsaussicht (modifiziert nach SIKKA et al. 1995)
Schrifttum
2.3.2.1 Effekt auf Mitochondrien
Bei unfruchtbaren Männern mit einem hohen Anteil an O2·- in den Samenproben ist die verringerte Spermienmotilität wahrscheinlich auf eine Behinderung der mitochondrialen Funktion der Spermien durch ROS zurückzuführen (AITKEN et al. 1992;
KESSOPOULOU et al.1992; ARMSTRONG et al. 1999).
SIKKA (2001) schreibt nach Versuchen mit menschlichen Spermien, daß das – im Gegensatz zum Kopf – sehr zarte Mittelstück der Spermien einen Hauptangriffspunkt der reaktiven SauerstofVGruppen darstellt, da es besonders viele Mitochondrien besitzt. Die Spermien verlieren in einem solchen Fall einen großen Teil ihrer Motilität, was wahrscheinlich durch einen starken Verlust von intrazellulärem ATP zu erklären ist, welcher zu Schäden am Axon führt. Neben dem Motilitätsverlust kommt es zu einer verringerten Lebensfähigkeit und vermehrten morphologischen Veränderungen am Mittelstück. Diese Defekte haben schädliche Auswirkungen auf die Kapazitation und die Akrosomreaktion (DE LAMIRANDE und GAGNON 1992). Es ist vor allem H2O2, welches direkt mit dem mitochondrialen ATP reagiert.
Ein weiterer möglicher Mechanismus, durch den ROS die Spermienmotilität beeinflussen können, ist eine Änderung der mitochondrialen Funktion: Die Motilität der Spermien beruht auf der Integrität der mitochondrialen Hülle. Der Hauptbestandteil dieser Hülle sind Phospholipide, welche durch ROS oxidiert werden können (ALVAREZ und STOREY 1982).
2.3.2.2 Lipidperoxidation
Lipidperoxidation (LPO) der Spermienmembranen kann durch ROS hervorgerufen wer- den. Bei der LPO kommt es zur Autooxidation ungesättigter Fettsäuren. Die Bildung der Lipidperoxide wird von einem Verlust der Spermienmotilität begleitet und die Spermien beginnen, aneinander zu kleben (KIM und PARTHASARATHY 1998). Die beiden bekannten Typen der Lipidperoxidation sind die nicht-enzymatische und die enzymatische (NADPH- und ADP-abhängige) Peroxidation. Der enzymatische Weg führt schließlich zu Malondialdehyd (MDA), welches als diagnostischer Meßwert für die Lipidperoxidation der Spermien gemessen werden kann. Die Umwandlungsprodukte der LPO, die
zytotoxischen Aldehyde, sind auch für die Spermien hoch toxisch und führen zu einem irreversiblen Motilitätsverlust (ALVAREZ et al. 1987; SELLEY et al. 1991).
Der hohe Anteil an Doppelbindungen erlaubt den ROS, die Kohlenstoffketten der ungesättigten Fettsäuren anzugreifen, wodurch ein Lipidradikal produziert wird. Diese Umwandlung ist der erste Schritt einer Kettenreaktion. Das geformte Alkylradikal wandelt sich in ein gebundenes Dien, welches mit Sauerstoff reagiert und ein Peroxylradikal (LOO·) bildet. Alkyl- und Peroxylradikale können wiederum mit den intakten ungesättigten Fettsäuren reagieren. Wenn der Prozeß der Lipidperoxidation erst einmal begonnen hat, laufen die Reaktionen je nach Dichte der ungesättigten Fettsäuren an der Membran entlang und führen zu ihrer Desorganisation und zur Verschlechterung ihrer funktionellen Eigenschaften. Das Vorhandensein von Übergangsmetallen führt durch das Starten neuer Reaktionsketten, die von Lipidhydroperoxiden ausgehen, zu einem Ansteigen der Lipidperoxidation. Die Kettenreaktion kommt erst zum Stillstand, wenn Radikalgruppen miteinander oder mit abfangenden Gruppen reagieren (GRIVEAU und LE LANNOU 1997). Die Veränderung der Membraneigenschaften ist nicht zuletzt deshalb extrem schädlich, da mit ihr die Fähigkeit der Spermien abnimmt, die Fusion – welche mit der Akrosomreaktion verbunden ist – (AITKEN et al. 1993) und die Oozytenpenetration (AITKEN et al. 1991, 1993) einzuleiten. Metaboliten der LPO können durch Glutathion-Peroxidase entfernt werden, was zu einem niedrigen NADH- und veränderten Ca+-Level der Zelle führt.
Spermien scheinen in gewissem Grade Reparaturmechanismen für durch ROS verursachte Schäden zu besitzen. Das Vorkommen dieser Mechanismen ist vereinzelt beobachtet worden. Die Art und Weise, wie diese Reparaturen durchgeführt werden, müßte noch genauer untersucht werden (DE LAMIRANDE und GAGNON 1992).
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Superoxid- Dismutase
Fe 2+ Fentonreaktion Protonation Fe 3+
Intrazelluläre Quelle z.B. NADPH-Oxidase
Extrazelluläre Quelle
z.B. neutrophile Granulozyten H2O2 Hydrogenperoxid O2-. Superoxid
HO. HO2.
Hydroxylradikal Hydroperoxydradikal
W
Übergangsmetall
Hitze Metallionen Säure
Initiation der Lipidoxidation
RH assertoffabspaltung R.
Lipid Lipidradikal O2
ROO.
Lipidperoxylradikal Antioxidative Mechanismen
ROOH Lipidperoxid
Lipidperoxidation in der Spermienplasmamembran
Vermehrung der Lipidperoxidation ROOH RO. Alkoxylradikal
ROO. Peroxylradikal
Lipidradikale R. RH O2
Malondialdehyd
Abb. 4: Schematische Darstellung der Wege der Lipidperoxidation bei Spermien (modifiziert nach SHARMA u. AGARWAL 1996)
2.4 Veränderungen an Spermien durch den Gefrier- und Auftauprozeß
Neben den Schäden, die durch den Gefrier- und Auftauprozeß allgemein hervorgerufen werden, interessieren hier besonders die Auswirkungen dieses Prozesses auf den ROS- Gehalt im Sperma.
2.4.1 Schädigungen durch den Gefrier- und Auftauprozeß
Die Schädigung der Samenzellen durch den Gefrier- und Auftauprozeß kommt durch ein zweimaliges Durchlaufen einer für die Spermien kritischen Temperaturzone (-15°C bis -60°C) zustande (MAZUR 1985). Bei -5°C bis -15°C setzt im extrazellulären Raum – je nach Abhängigkeit der Gefrierrate und Zusammensetzung des Verdünners – die Eisbildung ein. Es kommt zu einem osmotischen Gefälle zwischen Extrazellularraum und Zellinnerem der Spermien, da durch die Plasmamembran die Eisbildung im Spermium verzögert wird (MAZUR 1977).
Gleichzeitig setzen strukturelle Veränderungen der Plasmamembran ein. Nach QUINN (1981) befindet sich die Fluidität der Membran nur bei Körpertemperatur im dynamischen Zustand. Abkühlung führt zu einem Phasenwechsel der Phospholipide vom flüssigen zum kristallinen Stadium. Die Phospholipide bilden Aggregate, sogenannte hexagonale Strukturen, und in Restbereichen flüssiger Lipide sammeln sich Proteine an. Bei manchen Phospholipiden bleibt dieser Zustand auch nach der Wiedererwärmung bestehen. Durch die hexagonale Struktur der Phospholipide wird der Ionentransport durch die Membran gestört, da zusätzliche Kanäle für die Passage durch die Membran entstehen (AMANN und PICKETT 1987).
Durch das osmotische Gefälle zwischen Zellinnerem des Spermiums und Extra- zellularraum sowie durch die zusätzlichen Kanäle in der Plasmamembran kommt es in der Samenzelle zu einer pH-Wert-Verschiebung und einer darauf folgenden Denaturierung von Membranen und Proteinen (MAZUR 1977). Der beschriebene Prozeß findet analog beim Auftauvorgang statt.
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2.4.2 ROS im Sperma nach dem Gefrier-Auftau-Prozeß
Die Behandlung von Sperma im Rahmen von Reproduktionstechniken kann zu ungewoll- ten Spermienschäden führen, z. B. bei der Zentrifugation oder der Kryokonservierung von Spermien. Dies kann entweder durch irreversibles Entfernen der Antioxidantien im Seminalplasma oder durch eine unerwünschte Steigerung der ROS-Produktion geschehen (SIKKA et al. 1995). Der Anstieg des ROS-Spiegels bei der Zentrifugation ist abhängig von der Zeit und der Zentrifugationsgeschwindigkeit, wobei die Zentrifugationszeit mehr Einfluß als die Geschwindigkeit hat (SHEKARRIZ et al. 1995).
Bei Hunden etwa zeigte sich, daß der Tiefgefrier-Auftau-Prozeß bei den Spermien zu einem signifikanten Anstieg der extrazellulären Produktion von O2·_ führt und es dadurch zu negativen Effekten auf die Motilität, hypoosmotischen Schwellungen und sekundären morphologischen Abnormalitäten der Spermien kommt. Allerdings war es nicht möglich, einen kausalen Zusammenhang zwischen diesen Veränderungen der Spermienqualität und einem massenhaften Vorkommen von ROS im Sperma herzustellen. Die gesteigerte Produktion von O2·_ im Sperma nach dem Tiefgefrier-Auftau-Prozeß im Vergleich zum frischen Samen wird entweder durch die Abschwächung der Antioxidantien im Tiefgefrierprozeß oder durch eine (völlige oder teilweise) Inaktivierung von enzymatischen Systemen durch die Zugabe der Verdünnerbestandteile erklärt (TSELKAS et al. 2000). Bei Bullensperma sind die Spermien nach dem Gefrier-Auftau-Prozeß empfindlicher gegenüber Lipidperoxidation als im frischen Samen. Durch Zugabe von Vitamin A zum Samen kann die Plasmamembran vor Lipidperoxidation während der Kapazitation geschützt werden (O'FLAHERTY et al. 1997). In einer Studie von AURICH et al. (1997) zeigte sich, daß das Antioxidans Vitamin C einen Schutz für die Membranintegrität der Pferdespermien nach einer Tiefgefrierlagerung darstellt, wobei angenommen wurde, daß der durch ROS verübte Schaden zu einem Verlust der Spermienfunktion während der Tiefgefrierlagerung geführt hat. Bei Pferdesperma steigt die Menge des produzierten H2O2 im Frischsperma sowie im Tiefgefriersperma nach dem Auftauen signifikant mit der Zeit und der Spermienkonzentration an. Nach dem Auftauprozeß ist die Menge an H2O2, die produziert wird, wiederum signifikant größer als die im Frischsperma aufzufindende Menge (BALL et al. 2001).
2.5 Körpereigene Antioxidantien
Substanzen, die aufgrund ihrer Oxidierbarkeit andere Stoffe vor spontaner Oxidation schützen, gehören zu der Gruppe der Antioxidantien. Wie alle lebenden Zellen, die Sauer- stoff zur aeroben Respiration nutzen, sind auch die Samenzellen der Gefahr einer Schädi- gung durch hoch reaktive Sauerstoffradikale ausgesetzt. Im Seminalplasma und den Spermien gibt es verschiedene regulatorische Systeme für ROS. Diese Systeme können – enzymatisch oder nicht-enzymatisch – eine Balance zwischen Produktion und Verstoffwechselung von ROS herstellen. Es ist wenig aussagekräftig, die Effektivität eines Antioxidans unabhängig von anderen zu messen, da eine Wechselwirkung zwischen verschiedenen Antioxidantien besteht.
Zu den wichtigsten körpereigenen Enzymen, welche als Antioxidantien ROS beim Menschen inaktivieren, gehören z. B. Superoxiddismutase (SOD), Katalase, Glutathion- Peroxidase und -Reduktase. BLONDIN et al. (1997) schreiben, daß intrazellulär SOD, Katalase und Glutathion-Peroxidase vorhanden sind. Mit den Membranen verbunden kommen α-Tocopherol und Karotinoide vor und extrazellulär sind Vitamin C sowie Proteine zu finden, welche mit Eisen- und Kupferionen Komplexe bilden, um die Bildung von Hydroxylradikalen zu verhindern. Weitere Antioxidantien befinden sich im Seminal- plasma (BAUMBER et al. 2002), wie z. B. Glutathion-Peroxidase, Taurin und Cholin- Derivate (KIM und PARTHASARATHY 1998). Die Stärke des ROS-Abfang-Systems wird durch physiologische und Umweltfaktoren bestimmt.
Superoxiddismutasen katalysieren die Reaktion von Superoxidradikalen zu Sauerstoff (O2) und Wasserstoffperoxid (H2O2) (SIKKA 2001). Wasserstoffperoxid wird als entscheidend für die Schädigung der Spermien angesehen, da es einen Abfall des ATP- Gehaltes, einen Motilitätsverlust, eine Schädigung des Chromatins und eine Membranschädigung durch Lipidperoxidation verursachen kann (DE LAMIRANDE et al.
1997; BALL et al. 2000). Hydrogenperoxide reagieren entweder mit Superoxidanionen (Haber-Weiss-Reaktion) oder mit freiem Eisen (Fenton-Reaktion) und formen dann stark reaktive Hydroxylradikale. Diese haben eine kurze Halbwertzeit, sind sehr energiereich und ausgesprochen toxisch. Enzyme mit Peroxidase-ähnlichen Aktivitäten, wie z. B.
Katalase, und weitere zelluläre Antioxidationsmittel, wie z. B. Glutathion-Peroxidase (GSH), metabolisieren H2O2 zu H2O. Die Glutathion-Reduktase reduziert die oxidierte Form der GSH mit Hilfe von NADPH wieder (SIKKA 2001). NADPH scheint daher eine
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Doppelrolle einzunehmen: bei der Produktion durch die NADPH-Oxidase und bei der Entgiftung von ROS (FORD et al. 1997).
2.5.1 Superoxiddismutase
Das Enzym Superoxiddismutase ist ein körpereigenes Antioxidans. Es ist ein Metalloprotein und kommt im menschlichen Hoden in verschiedenen Formen vor, z. B.
als zytosolische Kupfer-Zink-SOD, mitochondriale Mangan-SOD oder extrazelluläre Kupfer-SOD (FRIDOVICH 1985). Jede vermehrte Aktivität der intrazellularen Oxidasen in den Hodenkompartimenten oder den Spermien kann zu einem Anstieg von O2·- führen, welches mit Hilfe von SOD über HO2· zu H2O2 wird. H2O2 ist eine relativ stabile Verbindung, welche leicht durch das Plasma und die Kernmembran diffundieren kann.
Während die Katalase-Aktivität bei den Spermien nur schwach ausgeprägt, aber wesentlich im Seminalplasma ist, scheinen Superoxiddismutase und Glutathionperoxidase wichtig für das Überleben der Spermien zu sein (GRIVEAU und LE LANNOU 1997).
Superoxiddismutase ist im Sperma von verschiedenen Spezies gefunden worden, z. B. bei Hasen und Mäusen (SHARMA und AGARWAL 1996). Auch ALVAREZ et al. (1987) stellen eine Superoxiddismutaseaktivität im Sperma verschiedener Säugetierspezies fest, wobei Pferdesperma eine höhere Enzymaktivität als Rinder-, Schweine- oder Schafsperma aufweist. Die höchste Aktivität wurde im Esel-Sperma nachgewiesen. Bei den meisten Spezies befindet sich die Superoxiddismutase intrazellulär; bei Eber- und Equiden- Ejakulaten ist sie aber auch extrazellulär gefunden worden (MENELLA und JONES 1980), da sie dort über Sekretion der akzessorischen Geschlechtsdrüsen in das Seminalplasma gelangt (MANN 1964).
Bei der Tiefgefrierung von Spermien kommt es unter anderem zu einem Anstieg der Lipidperoxidation, da die Superoxiddismutase durch den Tiefgefrierprozess fast vollständig inaktiviert wird (MENELLA und JONES 1980). DE LAMIRANDE et al.
(1993) haben gezeigt, daß durch Superoxidanionen ausgelöste Hyperaktivierung und Kapazitation von Spermien durch Superoxiddismutase gestoppt werden kann.
2.5.2 Katalase
Die Katalase ist eine Peroxidase, welche die Spaltung von Wasserstoffperoxid zu Wasser und Sauerstoff katalysiert. Sie ist durch ein dreiwertiges Eisenatom im Zentrum ihres Coenzyms (Hämin) zur Übertragung von Elektronen befähigt (BUDDECKE 1994).
Katalase schützt die Enzymaktivität der Antioxidantien Superoxiddismutase und Glutathionperoxidase (GRIVEAU et al. 1995). Pferdesperma weist eine hohe Katalaseaktivität (989,3 ± 167,8 U/ml) auf, die stark zwischen verschiedenen Hengsten variiert (BALL et al 2000). Obwohl die Katalase hauptsächlich aus Sekreten der Prostata des Hengstes stammt, ist die spezifische Enzymaktivität in extrahierten Samenzellen höher als im Seminalplasma. Daher wird vermutet, daß Katalase sich bevorzugt an Samenzellen anlagert. Es konnte jedoch keine Korrelation zwischen der Katalaseaktivität im Sperma und der Spermaqualität in Bezug auf Vorwärtsmotilität und Morphologie festgestellt werden (BALL et al. 2000).
2.5.3 Glutathionperoxidase/ -reduktase
Das Vorkommen des Glutathion-Peroxidase-Reduktase-Systems im Samen ist bei verschiedenen Säugetieren nachgewiesen (zitiert nach TSELKAS et al. 2000), jedoch ist die Aktivität des Glutathion-Peroxidase-Reduktase-Systems für Pferdesperma bisher noch nicht beschrieben worden (BAUMBER et al. 2000). Bei Ratten dagegen ist eine Glutathion-Peroxidase in Spermienmitochondrien entdeckt worden (SIKKA et al. 1995).
Glutathion, ein Bestandteil des Redoxsystems Glutathionperoxidase/ -reduktase, ist ein Tripeptid aus Glutaminat, Cystein und Glyzin. Es liegt in reduzierter Form als Glutathion- Sulfhydryl (GSH) und in oxidierter Form als Glutathiondisulfid (GSSG) vor (BUDDECKE 1994). Der Abbau von Wasserstoffperoxid und Lipidhydroperoxiden durch die Glutathion-Peroxidase erfolgt intrazellulär und ist stark vom Selengehalt der Zelle abhängig (SLAWETA et al. 1988). Die Reduktion des oxidierten Glutathion durch die Glutathion-Reduktase ist NADPH-abhängig. Ein Mangel an NADPH führt zum Wirkungsverlust dieses Schutzsystems (GRIVEAU et al. 1995).
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2.5.4 Vitamin E
Als weiteres Antioxidans kann Vitamin E Lipidradikale neutralisieren. Vitamin E (α-, β- oder γ-Tokopherol) ist ein fettlösliches Vitamin. Da ein Mangel an Vitamin E zu Fertili- tätsstörungen führt, wird es auch als Antisterilitätsvitamin bezeichnet. Es wird über die Nahrung aufgenommen und ist in Lipidmembranen von Zellen und Zellorganellen lokalisiert (SCOTT 1980; BUETTNER 1993). Wenn Peroxidradikale aus der wäßrigen Phase in die Plasmalipidschicht der Membranen eindringen (DEL MAESTRO 1980), fängt Vitamin E die Radikale ab und bewahrt die ungesättigten Fettsäuren und Sulfhydrylgruppen vor Oxidation. SHARMA und AGARWAL (1996) schreiben, daß Vitamin E auch als kettenbrechendes Antioxidans wirken kann. AGUERO et al. (1994) vermuten, daß Vitamin E Pferdespermien beim Tiefgefrierprozeß durch Erhöhung der Zellatmung vor den schädlichen Auswirkungen der Abkühlung und der Lipidperoxidation schützt. Ein durch Fütterungsversuche mit Vitamin E erreichter hoher Serumspiegel von α-Tocopherol hat die Leistung von Spermien im Zona-Bindungstest verbessert (KESSOPOULOU et al. 1994).
2.5.5 Vitamin C
Ascorbinsäure (Vitamin C), eine hitzelabile Hexuronsäure, gehört zu den wasserlöslichen Vitaminen und wird bei Säugetieren – außer bei Primaten und Meerschweinchen - in der Leber synthetisiert. Sie ist mit zwei Hauptfunktionen im Stoffwechsel integriert, nämlich als Redoxsystem und als Radikalfänger (DRESSLER, o.J.). Bei der Neutralisation von reaktiven Sauerstoffspezies geht Ascorbinsäure reversibel in Ascorbat und Dehydroascorbat über (DAVIES et al. 1991). Vitamin C kann Superoxidanionen, einzelne Sauerstoffatome, reduziertes Glutathion, Taurin und Hypotaurin sowie Pyruvat abfangen und das oxidierte Vitamin E regenerieren (GRIVEAU und LE LANNOU 1997).
Weiterhin ist Ascorbinsäure in der Lage, die Aktivität der Superoxiddismutase zu schützen (BECONI et al. 1993) und es verbessert die intestinale Selen-Absorption und damit die Aktivität der Glutathionperoxidase (DRESSLER, o.J.).
AEHNELT (1950) fand heraus, daß der Ascorbinsäuregehalt im Pferdesperma individuell sehr stark schwankt und mit der Veranlagung des Spenderhengstes in
Zusammenhang steht, da Ejakulate mit hoher natürlicher Ascorbinsäurekonzentration bessere Vitalitäts- und Motilitätswerte der Spermien zeigten als Ejakulate mit niedriger Konzentration. THIELE et al. (1995) ermittelten an Humansperma eine positive Korrelation zwischen Ascorbinsäurekonzentration und normaler Spermienmorphologie und eine reziproke Korrelation zur Produktion von ROS. Bei einer gekühlten Lagerung von Pferdesperma hat der Zusatz von Ascorbinsäure einen Einfluß auf den Anteil membranintakter Samenzellen nach 24, 48 und 72 Stunden Lagerung (SCHÖNHERR 1996).
Beim Pferd konnte bisher nicht mit Sicherheit nachgewiesen werden, daß orale Vitamin C-Gaben die Fruchtbarkeit verbessern, außerdem ist die gastro-intestinale Aufnahme beim Pferd im Vergleich zu anderen Spezies sehr gering. Nur bei intravenöser Applikation ist die Verfügbarkeit im Körper zufriedenstellend (LÖSCHER et al. 1984).
2.5.6 β-Karotin
Karotine sind Pflanzenfarbstoffe und gehören zu der Gruppe der Karotinoide. Sie besitzen ein Kohlenstoffgerüst aus acht Isoprenresten und enthalten viele konjugierte Doppelbindungen. Im Tierorganismus werden sie zu Farbstoffen des Gewebes umgewandelt. β-Karotin ist ein hydrophobes Antioxidans. Es reagiert mit Singulett- Sauerstoff und geht dabei in einen Triplettzustand über, aus dem es durch Wärmeabgabe wieder in den Grundzustand zurückkehren kann. Reagieren Karotine mit Sauerstoffradikalen, oxidieren sie diese zu Polyencarbonylen (DEL MAESTRO 1980;
BUDDECKE 1994).
ß-Karotin ist die Vorstufe von Vitamin A. Es wird lokal durch das Enzym Karotinase in Vitamin A umgewandelt. ß-Karotin stimuliert die Synthese des Progesterons und beeinflußt – wahrscheinlich Vitamin A unabhängig – durch seine antioxidativen Eigenschaften zellschädigende Lipidradikale.
Bei Versuchen mit Jungbullen traten bei fehlender Karotinzulage vermehrt Veränderungen an den Spermien im Bereich des Spermienkopfes und des Plasmatropfens im Verbindungsstück auf, die eine ungenügende Ausreifung in den Nebenhoden aufzeigten. Volumen und Spermiengehalte der Ejakulate wurden nicht beeinflußt (zitiert nach HOFFMANN LA ROCHE 1997). Bei Zufütterung von ß-Karotin während der
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Aufzuchtperiode von Ebern wurde ein günstiger Einfluß auf die Hodenentwicklung und spätere Spermaqualität ausgeübt (KAWECKA et al. 1993). Auch KLUG et al. (1976) folgerte in seinen Versuchen mit Jungbullen, daß ß-Karotin eine spezifische Funktion in den Samenbildungs- und Samenreifungsprozessen zukommt.
Bei Verabreichung von ß-Karotin an Eber wurde die Beweglichkeit der Spermien nach zweitägiger Lagerung bei 16 ºC beeinflußt; die Anzahl Spermien mit proximalem Zytoplasmatropfen nahm ab (zitiert nach HOFFMANN LA ROCHE 1997). Durch Zufütterung von ß-Karotin zeigte sich ein deutlich positiver Effekt auf die Anfangsmotilität der Samenzellen bei Besamungsebern (STEINBRINK 1996).
WEMHEUER et al. (1996) fanden in einer Studie bei Besamungsebern heraus, daß ß-Karotin bei vollständiger Abdeckung des Vitamin A-Bedarfes die antioxidative Kapazität des Stoffwechsels steigert; allerdings konnte ß-Karotin unter Stress nicht zum antioxidativen Schutz der mehrfach ungesättigten Fettsäuren der Samenzellen beitragen.
KUPFER et al. (1986) stellten bei einer Zufütterung von ß-Karotin an Jungbullen keinen spezifischen Einfluß auf die Fruchtbarkeit fest.
2.6 Karotinoides Astaxanthin
2.6.1 Astaxanthin innerhalb der Gruppe der Karotinoide
Astaxanthin (ein 3,3'-Dihydroxy-4,4'-Diketo-β-Karotin) gehört zur Gruppe der Karotinoide, die sich in zwei Untergruppen teilen läßt. Die erste Untergruppe bilden die primären Karotinoide, welche für den pflanzlichen Organismus von großer Bedeutung sind, da sie eine Hauptrolle bei den oxidativen Prozessen innerhalb der Photosynthese spielen. Sie dienen der Aufnahme des Lichtes und schützen durch Energieverbrauch die photosynthetisch aktiven Zellen vor Lichtüberschuß. Die zweite Untergruppe stellen die sekundären Karotinoide dar. Diese sind nicht obligatorisch für die Photosynthese und auch nicht – wie die primären Karotinoide – in den Thylakoidmembranen der Chloroplasten lokalisiert (GRÜNEWALD et al. 2001). Sekundäre Karotinoide kommen nur in spezifischen Entwicklungsstadien vor, wie zum Beispiel bei Pflanzen oder Früchten für die Farbgebung oder unter speziellen Umwelteinflüssen.
Astaxanthin wird der Gruppe der sekundären Karotinoide zugeordnet. Es ist insofern besonders auffällig, als es sich um ein Karotinoid ohne Vitamin A-Funktion handelt.
Astaxanthin ist ein deutlich stärkeres Antioxidationsmittel als β-Karotin oder α- Tocopherol (TERAO 1989; PALOZZA und KRINSKY 1992).
2.6.2 Gewinnung von Astaxanthin
Gewonnen wird Astaxanthin vor allem aus der grünen unizellulären Mikroalge Haematoccocus pluvialis (H. pluvialis). Diese Alge produziert als Antwort auf Streßsituationen eine Vielzahl von Ketokarotinoiden, hauptsächlich jedoch Astaxanthin und seine Acetylesther. Derartige Streßsituationen bestehen z. B. in Nahrungsmangel oder besonders hoher Lichteinstrahlung. H. pluvialis ist nicht zuletzt deshalb eine der bevorzugten Quellen für die biotechnologische Gewinnung von Astaxanthin, da die Alge bis zu 4 % ihrer Trockenmasse an sekundären Karotinoiden ansammeln kann (BOUSSIBA 2000). Es werden unterschiedliche Funktionen diskutiert, welche die sekundären Karotinoide bei H. pluvialis übernehmen könnten: als Sonnenschutz bzw. um vor photodynamischem Schaden zu schützen (GRÜNEWALD et al. 2001) oder um die Oxidation der gespeicherten Lipide zu minimieren (SUN et al. 1998).
2.6.3 Wirkung von Astaxanthin
Die hohe Aktivität von Astaxanthin als Antioxidans ist wahrscheinlich auf die polaren Gruppen des terminalen Ringstückes zurückzuführen. Astaxanthin besitzt Ketogruppen an der 4 und 4'-Position des β-Ionenrings. Durch ADP und Fe2+ aktiviert, verhindert Astaxanthin die Produktion von Lipidperoxiden, wobei Astaxanthin doppelt so effektiv wie β-Karotin ist (GOTO et al. 2001). In-vitro-Versuche haben ergeben, daß Astaxanthin ein starkes Antioxidationspotential hat. Die In-vivo-Mechanismen sind noch nicht vollständig geklärt, wobei die Antioxidationsfähigkeit der Karotinoide stark von der Sauerstoffkonzentration und von Interaktionen mit anderen Antioxidantien – wie z. B. α- Tocopherol – abhängig zu sein scheint (PALOZZA und KRINSKY 1992). Außerdem wurde festgestellt, daß die Mechanismen und Abfangraten stark von der Natur der
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Radikale und weniger von der Karotinoidstruktur beeinflußt werden (MORTENSEN et al.
1997). TINKLER et al. (1994) haben herausgefunden, daß Karotinoide an die Zelloberfläche gebunden werden und erst dann die Zelle vor Peroxidation schützen.
Die Gabe von Astaxanthin hat in Feldstudien bei männlichen Tieren, wie z. B. Ebern oder Hengsten, zu einer Verbesserung der Fruchtbarkeit im Sinne verbesserter Konzeptionsraten und einer gesteigerten Anzahl an lebend geborenen Nachkommen geführt. Bei einer Studie mit unfruchtbaren Männern führte die Gabe von Astaxanthin zu einer Verbesserung der Spermienmotilität und –morphologie (zitiert nach GAREM et al.
2002) und zu verbesserten Konzeptionsraten nach spontaner oder intrauteriner Besamung (COMHAIRE und MAHMOUD 2003).
3. MATERIAL UND METHODE 3.1 Versuchstiere
3.1.1 Tierhaltung und Fütterung
Für die Untersuchungen standen 44 Hengste des Niedersächsischen Landgestütes Celle zur Verfügung. Die Hengste wurden unter einheitlichen Bedingungen gehalten und gefüttert.
Die Tiere waren nebeneinander in Einzelboxen aufgestallt, wobei ein Sozialkontakt der Pferde untereinander durch die Gitterstäbe möglich war. Die Einstreu der Boxen bestand aus Stroh oder Hobelspänen, die Rauhfuttergaben aus 2 × täglich je ca. 3 kg Heu oder Boxgras. Zusätzlich wurden 3 × täglich je 2 kg Hafer sowie insgesamt 1 kg Zusatzfutter (Derby-Zusatzkorn®, Fa. Derby, Hannover) verfüttert. Wasser stand den Hengsten ad libitum zur Verfügung. Mitarbeiter des Landgestüts Celle haben die Hengste intensiv betreut, gepflegt und tiergerecht bewegt.
3.1.2 Tiergesundheit
Durch die Mitarbeiter des Landgestüts Celle erfolgte täglich eine visuelle Kontrolle der Hengste zur Erfassung des Allgemeinbefindens und des Gesundheitszustandes. Traten Krankheitssymptome oder der Verdacht auf eine Krankheit auf, erfolgte eine weitergehende klinische Untersuchung der Pferde. Erkrankte Tiere wurden bei der Auswertung der Versuche nicht berücksichtigt.
3.1.3 Behandlungsgruppen
Im Rahmen der Untersuchung wurden zwei Gruppen gebildet, denen die Tiere nach dem Zufallsprinzip zugeordnet wurden. Die Versuchsgruppe bestand aus 24 Hengsten, die Kontrollgruppe aus 20 Hengsten. Die Hengste wurden bereits in der vorangegangenen Decksaison unter gleichen Voraussetzungen zur Spermagewinnung herangezogen.
Material und Methode
Das mittlere Alter der Versuchsgruppe lag bei 8,6 Jahren (± SD 4,42), das mittlere Alter der Kontrollgruppe bei 8,7 Jahren (± SD 3,47). Die mittlere Stutenanzahl pro Hengst der Versuchsgruppe betrug 146 (± SD 115) Stuten, die mittlere Stutenanzahl pro Hengst der Kontrollgruppe bestand im Vergleich dazu aus 117 (± SD 113) Stuten.
Der Versuchsgruppe wurde das Standardfutter und 2 × täglich je 5 g karotinoides Astaxanthin pro Tag, der Kontrollgruppe lediglich das Standardfutter verabreicht.
3.2 Versuchskonzeption
Nach der Eingewöhnung der Hengste auf den verschiedenen Stationen, in denen sie während der Decksaison ab Anfang Februar aufgestallt waren, begannen die Versuche.
Die Hengste der Kontrollgruppe befanden sich auf den Stationen Adelheidsdorf, Ankum, Aurich, Bargstedt, Oberndorf, Roydorf, Schillerslage, Süstedt, Unterweser und Verden.
Die Hengste der Versuchsgruppe standen auf den Stationen Adelheidsdorf, Ankum, Aurich, Bargstedt, Landesbrück, Oberndorf, Roydorf, Schillerslage, Süstedt, Unterweser und Verden. Nach Beendigung der Decksaison wurden die Hengste für die Nachsaison (01.07.-31.07.2002) im Landgestüt Celle bzw. der Hengstprüfungsanstalt Adelheidsdorf aufgestallt.
- Beginn der Vorphase: 01.02.2002
- Beginn der Zufütterung von karotinoidem Astaxanthin: 15.03.2002 - Beginn der Versuchsphase: 01.04.2002
- Ende der Zufütterungsphase von karotinoidem Astaxanthin: 31.07.2002
Das verfütterte karotinoide Astaxanthin (Hersteller Fa. AstaCarotene AB, Gustavsberg, Schweden), Handelsname: ASTAEQUUS®, wurde aus der Alge Haematococcus pluvialis hergestellt. Die Plasmakonzentration nach Verfütterung des karotinoiden Astaxanthins wurde vom Hersteller bei einer Studie an Hengsten überprüft. Das karotinoide Astaxanthin mußte bis zur Verfütterung kühl (unter 0ºC) in einer Tiefkühltruhe gelagert werden. Das Pulver war in Packungsgrößen à 5 g erhältlich.
3.2.1 Gewinnung der Ejakulate
Das Ejakulat der Hengste wurde von Montag bis Samstag einmal am Tag zwischen 6.00 und 7.00 Uhr morgens in den Sprunghallen der Stationen des Landgestüts Celle entnommen. Die Samenentnahme erfolgte auf einem Phantom (Modell „Celle“, KLUG 1990, Fa. Minitüb, Landshut) mit Hilfe einer künstlichen Scheide (Modell Hannover, Fa.
Minitüb, Landshut). Vor dem Phantom wurde in einem Untersuchungsstand eine rossige Stute fixiert. In die künstliche Scheide wurde für jede Entnahme eine Einmalschlauchfolie (Fa. Minitüb, Landshut) eingezogen. Der Samen wurde in sterilen, graduierten Glasflaschen aufgefangen, die mit einem Gazefilter (Fa. Minitüb, Landshut) versehen waren, um Verunreinigungen oder evtl. Schleimanteile des Ejakulates abzutrennen. Die Kennzeichnung der Proben erfolgte ohne einen Hinweis auf die Zugehörigkeit der Hengste zu einer der beiden Gruppen und war den untersuchenden Personen nicht bekannt.
3.2.2 Aufbereitung der Ejakulate
Untersuchung und Aufbereitung der Ejakulate wurden anhand eines Samenaufbereitungs- protokolls des Landgestüts Celle durchgeführt. Die Bestimmung der Spermienparameter des Frischsamens erfolgte durch die jeweiligen Besamungsbeauftragten des Landgestüts Celle direkt nach der Samenabnahme.
Die Libido des Hengstes und die Anzahl der Aufsprünge bis zur Ejakulation wurden notiert. Nach der Entnahme wurde das Ejakulatvolumen mittels eines graduierten Meßzylinders bestimmt, die Farbe (grau, weiß, gelb) und die Konsistenz (wäßrig, molkig, milchig, rahmig) des Spermas beurteilt.
Bei der mikroskopischen Untersuchung wurde die Spermienmotilität mittels eines Mikroskops (Olympus CH-II, Fa. Minitüb, Landshut, Okular 10fach, Objektiv 20fach) auf einem Heiztisch bei 37°C beurteilt. Die dafür benutzten Objektträger und Deckgläschen wurden auf einem weiteren Heiztisch auf 37°C vorgewärmt. Die Motilität wurde in Prozent vorwärts-, orts- und unbeweglicher Samenzellen angegeben.
Material und Methode
Mittels eines Photometers („Spermacue®“, Fa. Minitüb, Landshut) wurde die Dichte des Ejakulates ermittelt. Durch Multiplikation des schleimfreien Ejakulatvolumens mit der Samenzelldichte wurde die Gesamtspermienzahl berechnet.
Das Sperma wurde mit Magermilchverdünner (INRA 82, siehe Anhang) auf 25 × 106 vorwärtsbewegliche Spermien/ml verdünnt. Der verdünnte Frischsamen wurde mit einer Laborfolie (Fa. Minitüb, Landshut) abgedeckt und bis zur Verwendung im Kühlschrank bei 5°C aufbewahrt. Die Besamungsdosis betrug 300 × 106 vorwärtsbewegliche Spermien, was bei der genannten Verdünnungsrate einer Besamungsportion von 12 ml entspricht.
Die Anzahl der abgegebenen Spermaportionen wurde festgehalten.
3.2.3 Prüfung der Haltbarkeit des Frischspermas
Die Spermienmotilität wurde ab März einmal im Monat nach einer 24-, 48- und 96- stündigen Kühlung im Kühlschrank bei 4°C mittels eines Mikroskops (Olympus CH-II, Fa. Minitüb, Landshut, Okular 10fach, Objektiv 20fach) bei 37°C von einer Person beurteilt. Die dafür benutzten Objektträger und Deckgläschen wurden auf einem weiteren Heiztisch auf 37°C vorgewärmt. Die Motilität wurde in Prozent vorwärts-, orts- und unbeweglicher Samenzellen festgehalten.
3.2.4 Spermienmorphologie des Frischspermas
Die Spermienmorphologie wurde im März zweimal und danach jede vierte Woche untersucht:
Zur Unterscheidung von lebenden und toten Spermien wurden die kombinierte SYBR-14®/PI-Färbung, modifiziert nach GARNER und JOHNSON (1995), und die FITC-PNA-Färbung zur Beurteilung des akrosomalen Status, modifiziert nach BLOTTNER et al. (1998), herangezogen. Die Färbungen wurden an frischem, verdünnten Samen durchgeführt. Die Spermiensuspensionen enthielten jeweils 25 × 106 Samen- zellen/ml. 1 ml der Spermiensuspension wurde in ein Eppendorf-Gefäß (10 ml, Fa.
Greiner, Frickenhausen) gegeben, auf 4 ml mit PBS (nach MARTINSSON 1995) aufgefüllt und zweimalig durch Zentrifugation (Labofuge, Heraeus, Osterode) für 10
Minuten bei 700 x g gewaschen. Eine Resuspension erfolgte mit PBS-Lösung (nach MARTINSSON 1995) auf 1 ml. Aus dieser Spermiensuspension wurden die benötigten Mengen für alle Färbungen entnommen. Zur Auszählung und Beurteilung von 400 Zellen diente ein Fluoreszenzmikroskop (Axioskop®, Carl Zeiss Co., Oberkochen) bei 1000facher Vergrößerung mit Ölimmersion. Es wurde ein Filter mit dem Wellenlängenbereich 450-490 nm eingesetzt.
3.2.4.1 SYBR-14®/PI-Färbung
Die SYBR-14®/PI-Färbung ist eine Lebend/Tot-Färbung, wobei der PI-Farbstoff nur in membrangeschädigte, tote Spermien eindringen kann. PI färbt dort die zelluläre DNA und RNA an und läßt diese rot erscheinen. SYBR-14® legt sich außen an die intakte Membran und lässt die Zellen grün erscheinen.
Zur Herstellung der Färbelösung wurden 500 µl Samensuspension mit 0,27 µl SYBR- 14® und 5 µl PI-Farbstoff zusammengegeben (LIVE/DEAD® Sperm Viability Kit, Molecular Probes, Fa. Mo Bi Tec, Göttingen). Diese Lösung wurde 15 Minuten bei 37°C und Dunkelheit inkubiert. Anschließend wurde ein Ausstrich angefertigt. Nach Lufttrocknung und Zugabe eines Tropfens Immersionsöls erfolgte die Beurteilung von 400 Zellen bei Raumverdunkelung mittels des Fluoreszenzmikroskops. Die Spermien wurden nach lebend (grün) und tot (rot) ausgewertet.
3.2.4.2 FITC-PNA/PI- Färbung
Die FITC/PNA-PI-Färbung dient zur Auswertung des akrosomalen Status und wurde unter Auszählung von 400 Zellen bei Raumverdunkelung mit dem Fluoreszenzmikroskop (Axioskop®, Carl Zeiss, Oberkochen) bei 1000facher Vergrößerung und Ölimmersion unter Verwendung eines Fluoreszenzfilters mit einer Wellenlänge von 450-490 nm analysiert.
Die Färbung wurde nach dem Färbeprotokoll für FITC-PNA, modifiziert nach BLOTTNER et al. (1998), ohne Heparinzugabe (zur Induktion der Akrosomreaktion) durchgeführt. Die Lösungen für die FITC/PNA-PI-Färbung wurden von Sigma Chemical Co., Deisenhofen, bezogen (L-7381).
Material und Methode
Färbeprotokoll für FITC-PNA modifiziert nach BLOTTNER et al. (1998):
Aus der zuvor gewaschenen und resuspendierten Spermienlösung werden 100 µl entnommen und in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß (1,5 ml, Fa. Greiner, Frickenhausen) gefüllt:
1. 100 µl Spermiensuspension 20 min bei 37°C im Wärmebad inkubieren
2. Eisgekühltes Ethanol 80 % 1:1 hinzugeben, 30 min inkubieren bei Raumtemperatur 3. Auffüllen mit PBS auf 1,5 ml und Waschen (6 min bei 700 x g)
4. Resuspendieren des Pellets mit wenigen Tropfen PBS
5. 10 µl FITC-PNA dazugeben und 20 min bei Raumtemperatur inkubieren
6. Auffüllen mit PBS auf 1,5 ml und waschen (6 min bei 700 x g) zur Entfernung von ungebundendem Lektin
7. Resuspension des Pellets mit wenigen Tropfen PBS
8. 2µl PI dazugeben und für 2 min bei Raumtemperatur inkubieren 9. Ausstrich anfertigen, Beurteilung mit 100er Objektiv + Immersionsöl
Es erfolgte eine Einteilung in vier Klassen:
1: helle grüne Fluoreszenz über die gesamte Kopfkappe 2: unterbrochene helle grüne Fluoreszenz
3: Reste von Fluoreszenz in der Äquatorialgegend 4: keine Fluoreszenz
I II III IV
Abb.2: Schematische Darstellung des akrosomalen Status der FITC-PNA/PI-Färbung (nach REINSTORF 2003)
Die Klassen 1 und 2 werden als akrosomintakt und die Klassen 3 und 4 als akrosomreagiert angesehen.
3.2.5 Beurteilung des Tiefgefrierspermas
Die Herstellung des verwendeten Tiefgefrierspermas erfolgte in der Pferdebesamungsstation des Landgestüts Celle. Zweimal im März und danach einmal pro Monat wurde eine Frischsamenprobe von jedem Hengst - wie oben beschrieben - aufbereitet und ein bis zwei Stunden gekühlt in einem Samenversandbehälter (Fa.
Minitüb, Landshut) von den Außenstationen des Landgestüts nach Celle transportiert.
Diese Probe wurde dort mit Magermilchverdünner (INRA 82) auf eine Spermienkonzentration von 50 x 106 Spermien/ml verdünnt und zentrifugiert (10 Minuten, 700 x g). Nach Dekantieren des Überstandes wurde das spermienreiche Retentat mit Tiefgefrierverdünner (INRA 82 + 2 % Eidotter + 2,5 % Glycerol) vermischt. Die Spermienkonzentration wurde mittels Hämozytometerverfahren (Thoma neu, Fa. Hecht, Sontheim) ermittelt. Unter weiterem Zusatz von Tiefgefrierverdünner wurde das Sperma auf eine Dichte von 200 x 106 Spermien/ml dosiert und in 0,5 ml-Pailletten (Fa. Minitüb, Landshut) abgefüllt. Die Abfüllung erfolgte automatisiert. Die Pailletten wurden dann für zwei Stunden im Kühlschrank gelagert, um das Sperma auf +5°C abzukühlen. Die Tiefgefrierung im Gefrierautomaten (Minidigitcool, Fa. IMV, L'Aigle, Frankreich) erfolgte mit einer Einfriergeschwindigkeit von 60°C/min. Bei –140°C wurde das Sperma ca. 15 Minuten gehalten und dann in flüssigen Stickstoff überführt. Die Pailletten wurden bis zur weiteren Verwendung in entsprechenden Lagerungsbehältnissen aufbewahrt. Nach Entnahme aus dem flüssigen Stickstoff wurden die Pailletten für 30 sec. im Wasserbad bei 37°C aufgetaut.
Für die Motilitätsanalyse wurde das aufgetaute Sperma auf 25 x 106 Samenzellen/ml mit auf 37°C vorgewärmten INRA 82 verdünnt. Die Spermienmotilität wurde mittels eines Mikroskops (Olympus CH-II, Fa. Minitüb, Landshut, Okular 10fach, Objektiv 20fach) bei 37°C von einer Person beurteilt. Die dafür benutzten Objektträger und Deckgläschen wurden auf einem weiteren Heiztisch auf 37°C vorgewärmt. Die Motilität wurde in Prozent vorwärts-, orts- und unbeweglicher Samenzellen angegeben.
Material und Methode
3.2.6 Durchführung von Färbungen an aufgetautem Gefriersperma
Die Untersuchungen zur Überprüfung der Lebensfähigkeit der Spermien, die Bestimmung der Chromatinstruktur der Spermien und die Messungen der Lipidperoxidation wurden mit Hilfe durchflußzytometrischer Verfahren unter Verwendung spezifischer Färbemethoden durchgeführt. Bei den Analyseverfahren wurden 10.000 Spermien pro Probe analysiert. Für die Färbung mit SYTO®17/FITC-PNA/PI wurde das Sperma nach dem Auftauen mit TALP-Medium (nach PARRISH et al. 1988) auf eine Endkonzentration von 5 x 106 Spermien/ml gebracht. Bei der Durchführung des SCSA™-Tests erfolgte die Probenaufbereitung nach den Angaben von EVENSON und JOST (2000). Um die verschiedenen Tests miteinander vergleichen zu können, wurden die Inkubationszeiten der verschiedenen Färbungen vereinheitlicht. Beim SYTO®17/FITC-PNA/PI-Test wurden die Proben nach der Zugabe der entsprechenden Farbstoffe im abgedunkelten Raum 15 Minuten bei 37°C in einem Thermostat (Typ 5320, Fa. Eppendorf) inkubiert.
Für die Untersuchungen wurde ein Durchflusszytometer FACScan™ (Fa. Becton Dickinson, Heidelberg), das mit einem luftgekühlten Argonionenlaser mit einer Wellenlänge von 488 nm und einer Leistung von 15 mW ausgestattet war, verwendet. Zur Messung standen drei verschiedene Filter zur Auswahl: FL-1 (530/30 nm) für die grüne Fluoreszenz, FL-2 (585/42 nm) für die orange Fluoreszenz und FL-3 (650LP nm) für die rote Fluoreszenz. Für die Datenanalyse war ein Power Mac G4-Computer der Fa. Apple Computer Inc. an dieses Gerät angeschlossen. Die Bearbeitung und Auswertung der Daten erfolgte mit dem Software-Programm Cellquest™ (Fa. Becton Dickinson, Heidelberg).
Die Auswertung der SCSA™-Daten wurde mit dem Software-Programm DAS Version 4.40 (BEISKER 1994) vorgenommen.
Für die Untersuchungen mit der Färbung SYTO®17/FITC-PNA/PI wurden eine einheitliche Geräteeinstellung am Durchflußzytometer gewählt. Die Geräteeinstellung wurde beim SCSA™-Test entsprechend den Angaben von EVENSON und JOST (2000) zu Beginn einer jeden Meßreihe neu eingestellt und nach jeder zehnten Probe überprüft. Für die Untersuchungen mit der Bodipy-, DCFH- und DHR-Färbung (siehe Kapitel 3.2.6.3) wurde jeweils eine einheitliche Geräteeinstellung am Durchflußzytometer gewählt.
