ZNS-Schädigung durch Toxocara spp. - in vivo- und in vitro-Untersuchungen zur
Demyelinisierung und Zytotoxizität
THESE
Zur Erlangung des Grades eines
DOCTOR OF PHILOSOPHY (PhD)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
vorgelegt von Lea Katharina Heuer
aus Gütersloh
Hannover 2015
Betreuungsgruppe: Prof. Dr. med. vet. Christina Strube, PhD Prof. Dr. med. vet. Andreas Beineke
Prof. Dr. med. vet. Wolfgang Baumgärtner, PhD Prof. Dr. med. vet. Peter Deplazes
1. Gutachten: Prof. Dr. med. vet. Christina Strube, PhD Institut für Parasitologie
Tierärztliche Hochschule Hannover
Prof. Dr. med. vet. Andreas Beineke Institut für Pathologie
Tierärztliche Hochschule Hannover
Prof. Dr. med. vet. Wolfgang Baumgärtner, PhD Institut für Pathologie
Tierärztliche Hochschule Hannover
Prof. Dr. med. vet. Peter Deplazes Institut für Parasitologie
Universität Zürich, Schweiz
2. Gutachten: Dr. med. vet. Caroline Frey, PhD
Vetsuisse Fakultät und Medizinische Fakultät Universität Bern, Schweiz
Datum der Disputation: 02.11.2015
Diese Arbeit wurde durch ein Promotionsstipendium der Gesellschaft der Freunde der Tierärztlichen Hochschule Hannover e.V. (GdF) und der Hannover Graduate School for Veterinary Pathobiology, Neuroinfectiology, and Translational Medicine (HGNI) gefördert.
Si sapis, alterum alteri misce:
nec speraveris sine desperatione nec desperaveris sine spe.
(Seneca)
Meiner Familie gewidmet
Heuer, L., Beineke, A., Strube, C. (2013)
Transkriptionsmuster von Myelinmarkergenen im Verlauf der Neurotoxocarose Tagung der DVG-Fachgruppe „Parasitologie und Parasitäre Krankheiten“
Gießen, 08.-10.07.2013
Heuer, L., Beineke, A., Strube, C. (2013)
Neurotoxocarosis influences myelin marker gene transcriptions National Symposium on Zoonoses Research
Berlin, 19.-20.09.2013
Heuer, L., Beyerbach, M., Beineke, A., Strube, C. (2014)
Neurotoxocarosis: Effects of migrating roundworm larvae on myelin gene expression and CNS cell survival
Junior Scientist Zoonosis Meeting Hannover, 02.-04.06.2014
Heuer, L., Janecek, E., Beineke, A., Strube, C. (2014)
Histologische Untersuchungen und in vitro Studien zur Neurotoxokarose Tagung der DVG-Fachgruppe „Parasitologie und Parasitäre Krankheiten“
Leipzig, 30.06.-02.07.2014
Heuer, L., Beyerbach, M., Strube, C. (2014)
Myelin marker gene transcriptions are influenced by migrating larvae of Toxocara canis and Toxocara cati
ParaTrop 2014, Joint Society Meeting on Parasitology and Tropical Medicine Zürich, Schweiz, 16.-19.07.2014
Heuer, L., Beyerbach, M., Beineke, A., Strube, C. (2014)
Effects of the zoonotic roundworm larvae Toxocara canis and Toxocara cati on myelin marker gene transcriptions and CNS cell survival
Joint conference: German Symposium on Zoonoses research and 7th International Conference on Emerging Zoonoses
Berlin, 16.-17.10.2014
Heuer, L., Händel, S., Beyerbach, M., Lühder, F., Beineke, A., Strube, C. (2015)
Myelin gene transcriptions and in vitro murine neuronal cell survival are influenced by the neuroinvasive, zoonotic roundworm larvae Toxocara canis and T. cati
Second N-RENNT Symposium on Neuroinfectiology Hannover, 16.-17.02.2015
Summary ... 1
Zusammenfassung ... 3
Einleitung ... 5
Publikationen ... 15
1. Analyse Myelin-assoziierter Gentranskription und -expression sowie histopathologische Untersuchungen im Verlauf der Neurotoxokarose ... 15
2. In vitro-Untersuchungen zum Einfluss vitaler Larven von Toxocara canis und T. cati auf murine ZNS-Zelllinien und Brain Slice-Kulturen ... 17
Diskussion ... 19
Molekulare Veränderungen und Demyelinisierung in vivo ... 19
Effekte lebender Toxocara-Larven auf ZNS-Zellen und Brain Slices in vitro ... 26
Fazit ... 30
Literaturverzeichnis ... 31
Abkürzungsverzeichnis ... 59
Danksagung ... 61
Summary
Lea Heuer (2015)
“CNS damage by Toxocara spp. - in vivo and in vitro investigations on demyelination and cytotoxicity”
Neuroinvasive larvae of the common dog and cat roundworms, Toxocara canis and T. cati, may cause serious central nervous disturbances in humans. Such CNS involvement in the course of infection with Toxocara spp. has been termed neurotoxocarosis. In mouse models of neurotoxocarosis, degeneration of white brain matter, i. e. demyelination, has frequently been described. Despite these severe findings, worldwide prevalence of these parasites and their association with epilepsy, neurodegenerative and neuropsychiatric diseases, neuropathological and molecular investigations on neurotoxocarosis are scarce and focus predominantly on T. canis. Therefore, one objective of this study was the molecular characterisation of nerve fibre demyelination associated with T. canis- and T. cati-induced neurotoxocarosis. Additionally, this study aimed to elucidate the pathogenetic background of Toxocara-induced demyelination, which might be due to mechanical damage, immune reactions or direct cytotoxic effects of migrating larvae. As data on parasite-cell interaction and Toxocara-mediated cytotoxicity is limited, a novel co-culture system of vital Toxocara- larvae and murine neuronal (CAD), oligodendrocytal (BO-1) and microglial (BV-2) cell lines as well as brain tissue slices was established to address these questions in vitro. For molecular investigation on demyelination, transcription of eight myelin-associated genes (Cnp, Mag, Mbp, Mog, Mrf-1, Nogo-A, Plp1, Olig2) was analysed during six time points of the chronic phase of infection in C57Bl/6J (B6) mice using quantitative real-time PCR. Immunoblotting or immunohistochemistry were employed to determine expression of selected myelin proteins. Additionally, parenchymal damage, e.g. demyelination, was monitored histologically. Significant differences between transcription rates of T. canis-infected and uninfected control mice were detected for all analysed genes while T. cati affected five of eight investigated genes. Some transcriptional changes coincided with expectations, such as the down-regulation of Mbp in cerebra and cerebella of T. canis-infected mice on day 120 post infection (pi), when extensive demyelination was histologically evident. Other changes like up-regulation of Cnp and Mog in both T. canis- and T. cati-infected mice prior to the
onset of demyelination, appear to reflect other processes than de- and remyelination alone.
Therefore, the recorded myelin transcription patterns might reflect direct traumatic and hypoxic effects of larval migration as well as secondary processes including host immune reactions alongside demyelination and attempts to remyelinate damaged areas. In co-culture experiments, enzymatic and microscopic methods were carried out to analyse potential cytotoxic effects of larval presence on CNS-cells or brain slices. Microscopic evaluation using trypan blue exclusion assay revealed to be less reliable and sensitive than the lactate dehydrogenase (LDH) activity assay. Interestingly, vital Toxocara larvae did not impair the viability of oligodendrocytal and microglial cells in cell cultures as well as brain slices.
Conclusively, trauma or immune-mediated mechanisms induced by migrating larvae might cause in vivo pathology rather than acute cytotoxic effects. In contrast, even low numbers of both T. canis and T. cati larvae impaired survival in the primary neuron-like, differentiated CAD cells. This highlights their destructive potential and raises new questions regarding the significance of this finding in an in vivo context, particularly concerning T. cati. As T. canis and not T. cati is considered the major cause of human neurotoxocarosis, these findings shed a different light on the pathogenic potential of T. cati-larvae and the consequences of their prolonged presence in the human brain.
Zusammenfassung
Lea Heuer (2015)
„ZNS-Schädigung durch Toxocara spp. - in vivo- und in vitro-Untersuchungen zur Demyelinisierung und Zytotoxizität“
Neuroinvasive Larven des Hunde- und Katzenspulwurms Toxocara canis bzw. T. cati können beim Menschen schwere zentralnervöse Störungen auslösen. Eine solche Beteiligung des zentralen Nervensystems (ZNS) im Rahmen einer Toxocara spp.-Infektion wird als Neurotoxokarose bezeichnet. Im Mausmodell wurden hierbei Degenerationen der weißen Substanz, sogenannte Demyelinisierungen, beobachtet. Doch trotz dieser gravierenden Schadwirkung der Parasiten, ihrer weltweiten Prävalenz sowie ihrer Assoziation mit Epilepsie, neurodegenerativen und neuropsychiatrischen Erkrankungen, gibt es nur wenige neuropathologische oder molekulare Untersuchungen zur Neurotoxokarose. Die vorhandenen Studien beschränken sich darüber hinaus auf T. canis als Krankheitserreger. Daher war ein Ziel dieser Arbeit die molekulare Untersuchung der mit T. canis- und T. cati-induzierter Neurotoxokarose verbundenen Demyelinisierung. Ein weiteres Ziel war die Beleuchtung des pathogenetischen Hintergrundes dieser Demyelinisierungen. Hierbei könnten durch wandernde Gewebslarven hervorgerufene mechanische Schäden, Immunreaktionen oder direkte zytotoxische Effekte eine Rolle spielen. Da Daten zu Parasit-Zell-Interaktionen und Toxocara-vermittelter Zytotoxizität nur begrenzt verfügbar sind, wurde ein Ko-Kultursystem von lebenden Toxocara-Larven und murinen neuronalen (CAD), oligodendrozytären (BO-1) und mikroglialen (BV-2) Zelllinien sowie Hirngewebekulturen etabliert, um sich diesen Fragestellungen in vitro zu nähern. Zur molekularen Untersuchung der Demyelinisierung wurden die Transkriptionsraten von acht Myelin-assoziierten Genen (Cnp, Mag, Mbp, Mog, Mrf-1, Nogo-A, Plp1, Olig2) in der chronischen Phase der Infektion an sechs Zeitpunkten bei C57Bl/6J (B6)-Mäusen mittels quantitativer real-time PCR analysiert. Die Expression ausgewählter Myelinproteine wurde mittels Immunoblots oder Immunohistochemie untersucht. Darüber hinaus wurden Parenchymschädigungen, insbesondere Demyelinisierungsprozesse, histologisch beurteilt. Bei jedem der untersuchten Gene konnten signifikante Unterschiede zwischen den Transkriptionsraten T. canis-infizierter und nicht infizierter Kontrollmäuse festgestellt werden. Im Gegensatz dazu beeinflusste T. cati lediglich
fünf von acht untersuchten Genen. Einige Veränderungen des Transkriptionsmusters entsprachen den Erwartungen, wie etwa die Abregulierung von Mbp in Groß- und Kleinhirnen T. canis-infizierter Mäuse an Tag 120 post infectionem (pi), an dem histologisch ausgedehnte Demyelinisierungen nachweisbar waren. Andere Veränderungen, wie die Aufregulierung von Cnp und Mog bei sowohl T. canis- als auch T. cati-infizierten Mäusen im Vorwege der Demyelinisierung sind offenbar Ausdruck anderer Prozesse als der De- oder Remyelinisierung. Daher scheinen direkte traumatische und hypoxische Effekte der Larvenwanderung sowie sekundäre Vorgänge, insbesondere Immunreaktionen des Wirtes, in den ermittelten Transkriptionsmustern ebenso Ausdruck zu finden wie Demyelinisierungen und Prozesse der Remyelinisierung geschädigter Bereiche. In den Ko-Kulturexperimenten wurde das zytotoxische Potential der Larven für die ZNS-Zellen bzw. Brain Slices sowohl mikroskopisch als auch enzymatisch untersucht. Dabei erwies sich die mikroskopische Beurteilung mittels Trypanblaufärbung als weniger verlässlich und sensitiv als der Laktat- Dehydrogenase (LDH)-Test. Interessanterweise beeinträchtigten lebende Toxocara-Larven die Vitalität von oligodendrozytären bzw. mikroglialen Zellen in den Zellkulturen sowie Brain Slices nicht. Vermutlich ist die in vivo-Pathologie daher eher Folge traumatischer oder immunvermittelter Vorgänge als das Ergebnis eines direkten zytotoxischen Effekts. Im Gegensatz dazu verminderten jedoch bereits niedrige Zahlen von T. canis- und T. cati-Larven das Überleben differenzierter CAD-Zellen, die morphologisch primären Neuronen gleichen.
Dies unterstreicht das pathogene Potential beider Toxocara-Spezies und wirft neue Fragen bezüglich der Bedeutung dieser Ergebnisse im in vivo-Kontext, insbesondere im Hinblick auf T. cati, auf. Da T. canis und nicht T. cati allgemein als Hauptauslöser der Neurotoxokarose betrachtet wird, sollte angesichts der erhobenen Daten die pathogenetische Bedeutung von T.
cati-Larven sowie die Konsequenzen ihrer fortgesetzten Präsenz im menschlichen Gehirn nicht unterschätzt werden.
Einleitung
Die Toxokarose ist eine der häufigsten zoonotischen Infektionen weltweit (NICOLETTI 2013) und gilt in den USA als die häufigste humane Helminthose (HOTEZ u. WILKINS 2009).
Verursacht wird sie durch die orale Aufnahme embryonierter Eier oder infektiöser Larven von Toxocara canis (WERNER 1782) oder Toxocara cati (SCHRANK 1788), dem Hunde- bzw.
Katzenspulwurm. Mäuse und eine Vielzahl weiterer Vertebraten inklusive des Menschen sowie Invertebraten können diesen Parasiten als paratenische Wirte dienen (GLICKMAN u.
SCHANTZ 1981). Die Larven verhalten sich in diesen Wirten zunächst ähnlich wie im Endwirt
„Fleischfresser“, können jedoch ihre Entwicklung zum adulten Spulwurm nicht abschließen.
Nehmen Endwirte infektiöse, embryonierte Toxocara-Eier auf, so schlüpfen die Larven im Dünndarm, durchdringen die Darmwand und gelangen über die Lymphgefäße und das Portalvenensystem innerhalb von 24 Stunden post infectionem (pi) zur Leber. Während ein kleiner Teil der Larven hier in Granulomen eingeschlossen zurückbleibt, wird der Großteil mit der Vena cava ins Herz und über die Pulmonalarterien in die Lungen transportiert (WEBSTER 1958). Von dort können sie, abhängig vom Alter und Immunstatus des Wirtes sowie der aufgenommenen Infektionsdosis, entweder den somatischen oder den trachealen Migrationsweg einschlagen. Bei Welpen bis zu einem Alter von 5 Wochen folgen fast alle Larven dem trachealen Weg (SPRENT 1958). Die Larven verlassen das Gefäßsystem und gelangen in die Bronchien. Mit dem Flimmerstrom der Trachea werden sie in die Maulhöhle transportiert und anschließend abgeschluckt. So erreichen sie erneut den Darmtrakt, wo sie ihre Entwicklung zu adulten Spulwürmern abschließen (WEBSTER 1958). Diesem trachealen Migrationsweg steht der somatische gegenüber. Bei älteren, immunkompetenten Endwirten wie auch im paratenischen Wirt gelangen die Larven von der Lunge über die Vena pulmonalis zurück zum Herzen und werden in den großen Kreislauf verbracht, wodurch sie letztendlich in Endstromgebieten wie den Nieren, der Muskulatur und dem Gehirn angelangen und dort als somatische Larven überdauern (SPRENT 1952; SPRENT 1958; WEBSTER 1958). Jungtiere infizieren sich vor allem vertikal mit den somatischen Larven des Muttertieres. Der epidemiologisch besonders bedeutsame pränatale Übertragungsweg somatischer T. canis- Larven wurde bereits 1921 von FÜLLEBORN beschrieben und schon kurz darauf von anderen Autoren bestätigt (FÜLLEBORN 1921; AUGUSTINE 1927; SHILLINGER u. CRAM 1923).
Intrauterine Infektionen können sowohl durch Aufnahme infektiöser, embryonierter T. canis-
Eier während der Trächtigkeit, als auch durch (hormonelle) Reaktivierung somatischer Larven erfolgen (WEBSTER 1958). Eine postnatale, galaktogene Übertragung ist beim Hund demgegenüber von untergeordneter Bedeutung (BURKE u. ROBERSON 1985a; BURKE u.
ROBERSON 1985b). Bei Feliden hingegen wird T. cati ausschließlich auf diese Weise vertikal übertragen (SWERCZEK et al. 1971), allerdings nur dann, wenn sich die Kätzin in der späten Trächtigkeit infiziert (COATI et al. 2004). Es handelt sich bei der Kätzin demnach nicht um eine Reaktivierung somatischer Larven während der Trächtigkeit, sondern um eine transplazentare Infektion im Rahmen der Infektion des Muttertieres. Mit Ausnahme des vertikalen Übertragungsweges gleicht das Verhalten von T. cati im Endwirt jedoch dem von T. canis (SPRENT 1956).
Im paratenischen Wirt hingegen akkumulieren Toxocara-Larven im Anschluss an die viszerale Phase mit Migration durch Leber und Lunge im Zuge der myotropisch- neurotropischen Phase schließlich in inneren Organen und der Muskulatur (SPRENT 1952;
ABO-SHEHADA u. HERBERT 1984). Sowohl T. canis- als auch T. cati-Larven dringen im Laufe dieser Phase in das zentrale Nervensystem (ZNS) ein. Während bei T. canis jedoch eine ausgeprägte Neuroaffinität belegt ist, akkumuliert T. cati hauptsächlich in der Muskulatur (SPRENT 1955; SPRENT 1956; SPRENT 1958; CARDILLO et al. 2009; JANECEK et al. 2014).
Auch innerhalb des ZNS weisen die beiden Toxocara-Spezies unterschiedliche Prädilektionsstellen auf: T. canis-Larven zeigen eine Migrationspräferenz für das Cerebrum, wohingegen T. cati-Larven überwiegend im Cerebellum anzutreffen sind (JANECEK et al 2014). Im paratenischen Wirt kann der Parasit die Entwicklung zum adulten, reproduktionsfähigen Stadium nicht vollziehen, sondern verbleibt mitunter jahrelang als infektiöses Larvenstadium im Wirtsgewebe (BEAVER 1956; GLICKMAN u. SCHANTZ 1981).
Solche Larvenstadien von T. canis sind sogar nach 6 Monaten im gefrorenen Gewebe noch infektiös (SPRENT 1953). Durch die Aufnahme der Gewebelarven können sich sowohl Caniden und Feliden als Endwirte als auch paratenische Wirte infizieren (SPRENT 1956;
SPRENT 1958; OKOSHI u. USUI 1968; GLICKMAN u. SCHANTZ 1981). Die Infektiösität von gewebsständigen Larvenstadien für paratenische Wirte wurde von OKOSHI und USUI (1968) durch die Übertragung von T. canis- und T. cati-Gewebelarven von Mäusen auf Mäuse und von Hühnern auf Mäuse sowie von Regenwürmern auf beide Tierarten belegt. Auch für den Menschen besteht daher ein Infektionsrisiko beim Konsum nicht ausreichend gegarter Innereien oder rohen Fleisches infizierter Tiere (HOFFMEISTER et al. 2007; YOSHIKAWA et al.
2008; YANG et al. 2014) wie beispielsweise Hühner (NAGAKURA et al. 1989; MORIMATSU et al. 2006). Durch Aufnahme von Invertebraten, wie Schnecken oder Regenwürmern ist ebenfalls eine Übertragung möglich (ROMEU et al. 1991; CIANFERONI et al. 2006). Als Hauptinfektionsquelle gelten jedoch embryonierte Spulwurmeier, die mit dem Kot der Endwirte in die Umwelt gelangen. Zwar sind die Eier zunächst nicht infektiös (GLICKMAN u.
SCHANTZ 1981), unter optimalen Bedingungen (25 °C, feuchte Umgebung) entwickelt sich in ihrem Inneren jedoch innerhalb von 7-15 Tagen die dritte Larve (UHLÍKOVÁ u. HÜBNER 1982;
BRUŇASKÁ et al. 1995; AZAM et al. 2012). Erst dann kann die orale Aufnahme dieser Eier zur Infektion eines neuen Wirtes führen. Sie können jedoch lange Zeit in der Umgebung überdauern und auch tiefe Temperaturen unbeschadet überstehen, so dass beispielsweise nach Exposition der Eier bei einer Temperatur von -2 °C über einen Zeitraum von 6 Wochen noch immer eine Embryonierung möglich ist (AZAM et al. 2012). Auf Grund ihrer Widerstandsfähigkeit, sowie des hohen Reproduktionspotentials der adulten Spulwürmer akkumulieren Toxocara-Eier in der Umgebung. Ein weiterer Faktor ist das weltweite Auftreten patenter Infektionen bei Hunden und Katzen, insbesondere bei Streunern. So wurden beispielsweise Prävalenzen von 4,6 % bei niederländischen Haushunden (NIJSSE et al.
2015), 9,7 % bei Zwingerhunden in Norditalien (SIMONATO et al. 2015) sowie 4,6-7,5 % bei Hauskatzen (GATES u. NOLAN 2009; OVERGAAUW et al. 2009; BARUTZKI u. SCHAPER 2011), 11,3 % bei diversen Katzen aus Deutschland und Frankreich (COATI et al. 2003) und 27,1- 38,3 % bei streunenden Katzen (MILLAN u. CASANOVA 2009; BECKER et al. 2012; WAAP et al. 2014) nachgewiesen. Auch Wildtiere müssen epidemiologisch berücksichtigt werden, da sie zum Teil hohe Prävalenzen aufweisen. So wurden in einem polnischen Nationalpark 6,9 % der Wölfe positiv beprobt. Füchse wiesen in der vorgenannten Studie eine Prävalenz von 11,1 % auf (BORECKA et al. 2013), wohingegen in Genf, Schweiz, 44,3 % (REPERANT et al.
2007) und in Großbritannien bis zu 61,6 % der Füchse Toxocara-positiv waren (SMITH et al.
2003). Angesichts der Verbreitung der Parasiten überrascht es nicht, dass auch viele öffentlich zugängliche Grün- und Erholungsflächen mit Toxocara-Eiern kontaminiert sind. So wurden beispielsweise in São Paulo, Brasilien, in 96 % der untersuchten Parks Toxocara-Eier nachgewiesen (SANTARÉM et al. 2012). Da Umzäunungen eine Kontamination der Parks mit Toxocara-Eiern wirksam zu verhindern scheinen (AVCIOGLU u. BALKAYA 2011), der Pflegezustand eines Parks oder Auflagen bezüglich des Mitführens von Haushunden jedoch keinen solchen Effekt haben (LUDLAM u. PLATT 1989), scheinen vor allem streunende Hunde,
aber auch Katzen und Wildtiere wie Stadtfüchse (vgl. REPERANT et al. 2007) maßgeblich zur Belastung öffentlicher Flächen mit Toxocara spp.-Eiern beizutragen. Katzen spielen darüber hinaus eine große Rolle bei der Kontamination von Sandkästen auf Spielplätzen. Per Videoüberwachung konnte gezeigt werden, dass hauptsächlich Katzen und nicht etwa Hunde oder Füchse Sandkästen zur Defäkation nutzen (UGA et al. 1996). Spielplätze sind in ähnlichem Ausmaß mit Toxocara-Eiern belastet wie öffentliche Grünflächen, wobei es sich aus vorgenannten Gründen hierbei vermutlich hauptsächlich um T. cati-Eier handelt (KLEINE
2014). Beispielsweise waren in Hannover maximal 41 % (KLEINE 2014), in Łódź, Polen, 50 % (BŁASZKOWSKA et al. 2015) und auf der Malaiischen Halbinsel 100 % (MOHD ZAIN et al. 2015) der untersuchten Spielplätze kontaminiert. Infolge dessen sind insbesondere Kinder und besonders solche mit Neigung zur Geophagie und mangelndem Hygienebewusstsein einem erhöhten Infektionsrisiko ausgesetzt (BEAVER 1956; MAGNAVAL et al. 2001;
CASSENOTE et al. 2014). Als weitere Risikofaktoren wurden ein geringes Alter, mangelnde Bildung der Kindesmutter und enger Kontakt mit Hunden oder Katzen identifiziert (MENDONÇA et al. 2013). Das erhöhte Infektionsrisiko spiegelt sich auch in einer höheren Morbidität bei Kindern wieder. So zeigten EHRHARD und KERNBAUM (1979) in einer retrospektiven Analyse von über 350 klinischen Fällen, dass 56 % der Betroffenen Kleinkinder (≤3 Jahre alt) und nur 17,7 % Erwachsene waren. Mittels serologischer Techniken wie einem ELISA, der auf exkretorisch/sekretorischem Antigen (TES) von Toxocara canis beruht oder Immunoblots lässt sich die Infektion beim Menschen nachweisen (DE SAVIGNY et al. 1979; MAGNAVAL et al. 1991). Aktuelle Seroprävalenzstudien zeigen, dass zwischen 0,7 % der Untersuchten in Neuseeland (ZARKOVIC et al. 2007), 4,8 % in Süddeutschland (KIMMIG et al. 1991), 6,3 % in Österreich (POEPPL et al. 2013), 13,9 % in den USA (WON et al. 2008) und 36,3 % in Kamerun (NKOUAWA et al. 2010) seropositiv sind. In älteren Untersuchungen wiesen bis zu 63,2 % der Untersuchten auf Bali, Indonesien, (CHOMEL et al. 1993) und 92,8 % auf La Réunion, Frankreich, Antikörper gegen Toxocara spp. auf (MAGNAVAL et al. 1994).
Vermutlich verlaufen zahlreiche dieser humanen Infektionen asymptomatisch. Es können sich jedoch klinisch manifeste Krankheitsbilder entwickeln, wobei vier verschiedene Krankheitsbilder unterschieden werden: Die Larva migrans visceralis (VLM), die larva migrans ocularis (OLM), die sog. „verdeckte“ (covert) Toxokarose und die Neurotoxokarose (MAGNAVAL et al. 2001). Die Identifizierung und Klassifizierung der Erkrankung wird vor
allem durch fehlende pathognomonische Symptome erschwert, insbesondere zeigt sich bei der
„verdeckten“ Toxokarose in der Regel nur ein unspezifischer Symptomkomplex. Hierbei hängen Art und Schwere der Symptome von der Höhe der Infektionsdosis, also der Anzahl der Wanderlarven, und dem Alter des Patienten ab (GLICKMAN u. SCHANTZ 1981). Eine akute Überempfindlichkeitsreaktion auf den Tod der Larven scheint Hauptursache für das VLM- Syndrom zu sein (DESPOMMIER 2003). VLM ist eine akute Erkrankung, die vor allem Kinder betrifft (EHRHARD u. KERNBAUM 1979; GLICKMAN u. SCHANTZ 1981). In dem ersten Fallbericht aus dem Jahr 1952 beschreiben BEAVER et al. (1952) eine multisystemische Erkrankung mit Hypereosinophilie und Hepatomegalie bei drei Kindern als „visceral larva migrans“. Erkrankte Kinder werden typischerweise mit Abgeschlagenheit, Fieber, Bauchschmerzen, Husten und einer Vorgeschichte von Geophagie bzw. Pica vorgestellt (MOK
1968; MAGNAVAL et al. 2001). Neben Hepato- und Splenomegalien können Patienten durch parasitäre Pneumonien und Bronchitiden bedingte respiratorische Symptome wie Husten, Bronchospasmen und Asthma aufweisen (BEAVER et al. 1952; MOK 1968; EHRHARD u.
KERNBAUM 1979; ARANGO 1998; STOICESCU et al. 2011). Schwerwiegende Pneumonien mit Atemstillstand sind selten (BESHEAR u. HENDLEY 1973). Labordiagnostisch fallen betroffene Patienten mit Leukozytose, persistenter Eosinophilie und Hypergammaglobulinämie auf (MOK 1968; CYPESS 1978; SCHANTZ 1989). Im Zuge einer VLM können Patienten auch eine Nephritis (SHETTY u. AVILES 1999), Arthritis (DROMER et al. 1993), Endokarditis (PRUNIER et al. 2001), Myokarditis (FRIEDMAN u. HERVADA 1960; ENKO et al. 2009) oder Myositis (WALSH et al. 1988) ausbilden. Zusätzlich können dermatologische Veränderungen bei Patienten mit VLM auftreten, wie beispielsweise Hautausschläge, Urtikaria, hypodermale Knoten, Pruritus, atopische Dermatitis und Prurigo (EHRHARD u. KERNBAUM 1979; BAHNEA
et al. 2009). Weitere ätiologische Zusammenhänge zwischen VLM und anderen, oft als idiopathisch eingestuften Krankheitsbildern, werden vermutet. Denn obwohl die meisten T. canis-Infektionen inapparent zu verlaufen scheinen, korreliert Seropositivität signifikant mit dem Auftreten anderer Erkrankungen wie Allergien (BUIJS et al. 1997) und Asthma (COBZARU et al. 2012; LI et al. 2014). Bei irischen Kindern haben TAYLOR et al. (1987) die
„verdeckte“ (covert) Toxokarose beschrieben, bei der eine Infektion mittels Antikörper-Titer- Bestimmung bestätigt wurde, die Patienten aber teilweise keine Eosinophilie und unspezifische Symptome wie Fieber, Anorexie, Kopf-, Bauch- und Gliederschmerzen, Übelkeit, Erbrechen, Lethargie, Schlaf- und Verhaltensstörungen, Pharyngitis, respiratorische
Beschwerden, zervikale Lymphadenitis und Hepatomegalien aufwiesen (TAYLOR et al. 1987).
Diese „verdeckten“ Formen der Toxokarose treten vermutlich deutlich häufiger auf, als es die Fallberichte in der Literatur vermuten lassen, da von einer routinemäßigen diagnostischen Berücksichtigung der Toxokarose bei Kindern mit den oben genannten unspezifischen Symptomen nicht auszugehen ist.
Migrieren Larven in die Augen infizierter Personen, spricht man von okulärer Toxokarose.
Dieses Phänomen wurde erstmals 1950 von WILDER beschrieben, der bei der histopathologischen Untersuchung von Augäpfeln, die wegen vermeintlicher Retinoblastome enukleiert worden waren, „Hakenwurmlarven“ auffielen. Diese Larven wurden später morphologisch als T. canis identifiziert (NICHOLS 1956). Bei OLM können in seltenen Fällen beide Augen betroffen sein, meist handelt es sich aber um eine unilaterale Erscheinung (SHIELDS 1984). Im Zuge der OLM können sich um die Larven eosinophile Granulome bilden (SHIELDS 1984). Teilweise sind in diesen Granulomen keine Larven mehr nachweisbar, was vermutlich entweder mit ihrer Zerstörung im Rahmen der Immunantwort oder ihrem Wanderverhalten zu begründen ist (WILDER 1950; LYNESS et al. 1987). Betroffene Personen können in der Folge unter anderem Sehstörungen bis hin zur Erblindung, Strabismus, Leukokorie, Netzhautablösung, Katarakt, Uveitis, Endophtalmitis, Papillitis oder Sekundärglaukome entwickeln (BROWN 1970; SHIELDS 1984; GILLESPIE et al. 1993;
DESPOMMIER 2003).
Die Fähigkeit der Toxocara-Larven, in das menschliche Gehirn einzudringen, wurde erstmals 1951 bei der Sektion eines Kindes mit Poliomyelitis nachgewiesen (BEAUTYMAN u. WOOLF
1951). Bis heute sind nur etwa 50 Fallberichte zur Neurotoxokarose publiziert (FINSTERER u.
AUER 2007). Es ist davon auszugehen, dass der geringen Präsenz in der Literatur eine hohe Dunkelziffer unerkannter Fälle gegenübersteht, da die Neurotoxokarose bei idiopathischen ZNS-Störungen differentialdiagnostisch wohl häufig keine Berücksichtigung findet. Zudem wird angenommen, dass der Befall des menschlichen Gehirns im Rahmen der Toxokarose meist asymptomatisch verläuft (MOREIRA-SILVA et al. 2004). Im Gegensatz dazu wird in Tierversuchen regelmäßig ein Auftreten der Neurotoxokarose beobachtet und epidemiologische Studien zur Korrelation von Toxocara-Infektionen und neurologischen Erkrankungen geben konkrete Hinweise auf die mögliche Rolle dieser Parasitose bei deren Entstehung. So konnten verschiedene Autoren Zusammenhänge zwischen Toxocara- Seropositivität und Epilepsie nachweisen (WOODRUFF et al. 1966; GLICKMAN et al. 1979;
ARPINO et al. 1990; NICOLETTI et al. 2007; NICOLETTI et al. 2008). QUATTROCCHI et al.
(2012) bestätigten diese Korrelation in einer Metaanalyse von sieben Fall-Kontrollstudien.
Kognitive Dysfunktion und geringere Schulleistungen bei Kindern sind ebenfalls mit Toxocara-Seropositivität assoziiert worden (JAROSZ et al. 2010; WALSH u. HASEEB 2012).
Der Nachweis der Kausalität lässt sich allerdings bei derartigen Studien nicht erbringen. So konnten GLICKMAN et al (1979) zeigen, dass Antikörper-Titer von Patienten mit Epilepsien bekannter Genese und von solchen mit idiopathischen, also möglicherweise Toxocara- assoziierten, Epilepsien sich nicht signifikant unterschieden. Die Autoren stellten daher die Hypothese auf, dass betroffene Personen auf Grund ihrer Erkrankung, durch die sie häufiger Verhalten wie beispielsweise Hyperaktivität, mentale Retardierung oder Pica aufweisen, vermutlich auch einem erhöhten Infektionsrisiko ausgesetzt sind (GLICKMAN et al. 1979;
GLICKMAN u. SCHANTZ 1981). Obwohl Larven im menschlichen ZNS oft Zufallsbefunde darstellen (MOREIRA-SILVA et al. 2004), können sie auch histopathologische Veränderungen wie eosinophile Meningitiden, Enzephalitiden, Myelitiden oder Kombinationen der vorgenannten Befunde, Schädigungen der Kopfnerven und zerebrale Vaskulitiden hervorrufen (ENGEL et al. 1971; MIKHAEL et al. 1974; WANG et al. 1983; GOULD et al. 1985; OTA et al.
1994; SOMMER et al. 1994; GOFFETTE et al. 2000; VIDAL et al. 2003; MOREIRA-SILVA et al.
2004; HELBOK et al. 2007; LOMPO et al. 2012). Zerebrale Läsionen können mit Gefäßverschlüssen einhergehen und sind vorwiegend in der weißen Substanz lokalisiert (SOMMER et al. 1994; XINOU et al. 2003). Je nach induzierter pathohistologischer Veränderung können Patienten mit Neurotoxokarose ein umfangreiches Spektrum an neurologischen und kognitiven Symptomen entwickeln. Die klinische Symptompalette reicht von Kopfschmerzen und Fieber, Nackensteife, Schwäche, Lethargie und Schwindel bis hin zu Nystagmus, Sehstörungen, Verwirrungszuständen, epileptischen Anfällen, neuropsychiatrische Störungen, Demenz und Depression (MARMOR et al. 1987;
FORTENBERRY et al. 1991; SOMMER et al. 1994; RICHARTZ u. BUCHKREMER 2002; MOREIRA- SILVA et al. 2004; FINSTERER u. AUER 2007; QUATTROCCHI et al. 2012; CALDERA et al. 2013;
SICK u. HENNERICI 2014). Außerdem traten bei Neurotoxokarose Bewegungsstörungen wie Ataxien, Rigor, Para- oder Tetraparesen, sowie Dysästhesien auf (RUSSEGGER u.
SCHMUTZHARD 1989; FORTENBERRY et al. 1991; VILLANO et al. 1992; SOMMER et al. 1994;
GOFFETTE et al. 2000). Harnverhalten und Stuhlinkontinenz wurden ebenfalls beschrieben (WANG et al. 1983; MOREIRA-SILVA et al. 2004). Im Mausmodell wurden nach Infektion mit
T. canis vergleichbare neurologische Ausfallserscheinungen beobachtet. Betroffene Tiere zeigten zunehmende Immobilität, Trägheit bis zur Somnolenz, Defizite im Lern-und Erinnerungsvermögen, verminderte Aggressivität, Kyphose, Gleichgewichtsstörungen, Inkoordination, Tremor und Paresen (EPE et al. 1994; COX u. HOLLAND 2001a; COX u.
HOLLAND 2001b; JANECEK et al. 2014). Anders als in anderen Organen werden Larven im ZNS nicht von Granulomen eingeschlossen, sondern liegen frei und nahezu reaktionslos im Gewebe (SPRENT 1955; BURREN 1968). Pathohistologische Veränderungen zeigen sich auch bei der Maus vornehmlich in stark myelinisierten Hirnbereichen, wie dem Corpus callosum, der Capsula interna und der Capsula externa, den zerebellären Pedunkeln und dem Kleinhirnmark (SUMMERS et al. 1983; DOLINSKY et al. 1985). Hier traten im späten Infektionsverlauf bei T. canis-infizierten Mäusen massive Demyelinisierungen bis hin zur vollständigen Entmarkung von Hirnabschnitte, fokale Malazien, Gemischtzellinfiltrate sowie aktivierte Mikrogliazellen und Gitterzellakkumulationen auf (PEPPERSACK 1981; HORN 1983;
LOHMANN et al. 1989; EPE et al. 1994; JANECEK et al. 2014). Schwammartige Transformationen des Neuropils mit Gitterzellen bis hin zu dem vollständigen Verlust des neuronalen Parenchyms sind ebenfalls beschrieben worden (SUMMERS et al. 1983). Die Lokalisation der neuropathologischen Veränderungen spricht für eine Affinität der Toxocara- Larven zur weißen Substanz. Diese könnte einerseits Ausdruck eines Tropismus der Larven für das lipidreiche Myelin sein oder andererseits lediglich den Weg des geringsten mechanischen Widerstandes markieren (SUMMERS et al. 1983). Die Affinität der Larven zur weißen Substanz sowie die Sequenzhomologie des von Toxocara exprimierten TES-26 mit Phosphatidylethanolamin-bindendem Protein (PEBP) (GEMS et al. 1995), welches von humanen Oligodendrozyten und Schwann-Zellen exprimiert wird (MOORE et al. 1996), regen Spekulationen über eine mögliche ätiologische Rolle der Toxocara-Infektion bei der Entstehung von Multipler Sklerose an (SÖNDERGAARD u. THEORELL 2004). Darüber hinaus sind Störungen der Myelin-Proteinexpression mit neuropsychiatrischen Erkrankungen in Verbindung gebracht worden (GEORGIEVA et al. 2006; HUANG et al. 2008; HAGEMEYER et al.
2012). Auch die Entstehung anderer neurodegenerativer Erkrankungen wie Alzheimer könnte durch Neurotoxokarose gefördert werden, da eine erhöhte Durchlässigkeit der Blut-Hirn- Schranke sowie erhöhte Expression Hirntrauma-assoziierter Biomarker wie des transforming growth factor-β1 (TGF-β1), S100B, glial fibrillary acidic protein (GFAP), neurofilament light chain (NF-L), tissue transglutaminase (tTG), β-amyloid precursor protein (β-APP) und tau
im Zuge der Toxocara canis-Infektion nachgewiesen wurden (LIAO et al. 2008a; LIAO et al.
2008b). Microarray-Analysen zeigten ebenfalls eine Aufregulierung von Tgfβ-1 in Groß-und Kleinhirnen T. canis-infizierter Mäuse. Außerdem konnte gezeigt werden, dass im Zuge der T. canis-induzierten Neurotoxokarose eine größere Anzahl von Genen differentiell transkribiert wird als während der T. cati-induzierten Neurotoxokarose. Die meisten der aufregulierten Gene wurden in beiden Infektionsgruppen immunassoziierten Vorgängen zugeordnet. Interessanterweise wurde ein Großteil der abregulierten Gene in der T. canis- Gruppe jedoch mit Prozessen der Lipid/Cholesterol-Synthese in Verbindung gebracht und betrifft damit Vorgängen, die Konsequenzen für diese Bestandteile des Myelins haben könnten (JANECEK et al. 2015). Dennoch wurden die spezifischen Auswirkungen der Neurotoxokarose auf die besonders betroffene myelinreiche, weiße Substanz bisher nicht auf molekularer Ebene untersucht.
Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war daher die Untersuchung der Transkriptions- und Expressionsmuster verschiedener Myelin-assoziierter Gene im Verlauf der Neurotoxokarose.
Hieraus lassen sich neben genaueren Einblicken in die Pathogenese der Demyelinisierung auch Anhaltspunkte für klinische Aspekte der Neurotoxokarose ableiten.
Die genaue Pathogenese der Parenchymschädigungen und Demyelinisierungen im Rahmen der Neurotoxokarose ist nach wie vor unklar. Mechanische Schäden durch die Wanderung der Larven, immunvermittelte Vorgänge oder zytotoxische Effekte des TES könnten eine Rolle spielen. Mit Hilfe ihres TES und verschiedener Enzyme gelingt Toxocara-Larven eine effiziente Immunevasion (MAIZELS 2013). Dies konnte in Ko-Kulturversuchen mit eosinophilen Granulozyten gezeigt werden. Obwohl sich die Eosinophilen in der Gegenwart spezifischer Antikörper sofort an die Oberfläche der Larven anheften, sind sie nicht in der Lage, diese mittels Superoxiden und anderer Noxe abzutöten. Erstaunlicherweise entkommen die Larven den anheftenden Zellen innerhalb von 3 Stunden unversehrt (FATTAH et al. 1986).
Dies gelingt ihnen unter anderem durch Produktion des TES, welches ihre Oberfläche mantelartig umhüllt und gemeinsam mit den Abwehrzellen abgestreift wird. So bleiben die Abwehrzellen funktionslos an das TES gebunden hinter der Larve zurück (BADLEY et al.
1987b). Das TES ist reich an Muzinen und Glykanen und wird von der Larve sowohl in einer Speiseröhrendrüse als auch in der sogenannten „mid-body secretory column“ gebildet (PAGE
et al. 1992). In vitro-Kultivierung lebender Toxocara-Larven hat gezeigt, dass die Parasiten
über Monate hinweg kontinuierlich TES in Mengen von circa 8 ng pro Tag abgeben (BADLEY
et al. 1987a). Es ist daher möglich, dass dies auch während ihrer u.U. jahrelangen Persistenz im Körper eines paratenischen Wirtes der Fall ist. Über die Wirkung dieser Substanz auf verschiedene Gewebe, insbesondere aber auf die hochsensiblen Zelltypen des ZNS, ist wenig bekannt. In vitro konnte bei Astrozyten durch Zugabe von T. canis-TES eine Apoptose der Zellen induziert werden (HSIAO et al. 2013). Astrozyten gelten im Vergleich zu anderen Zelltypen des ZNS wie Neuronen als widerstandsfähig gegenüber Ischämie und anderen Stressoren (CHEN u. SWANSON 2003). Die Untersuchung zusätzlicher ZNS-Zelltypen ist deshalb von besonderem Interesse.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Arbeit war daher die Etablierung einer Ko-Kultur von lebenden T. canis- und T. cati-Larven mit verschiedenen murinen ZNS-Zelllinien bzw.
Hirngewebekulturen. Diese Ko-Kulturen ermöglichen erste Analysen einer möglicherweise spezifischen Zytotoxizität des TES bzw. der metabolischen Produkte der Larven. Darüber hinaus sollte die Eignung der sogenannten Brain Slice-Kultur als tierexperimentelles
„Replacement“ für Untersuchungen zur Neurotoxokarose evaluiert werden.
1) Analyse Myelin-assoziierter Gentranskription und -expression sowie histopathologische Untersuchungen im Verlauf der Neurotoxokarose
Heuer, L.1, Beyerbach, M.2, Lühder, F.3, Beineke, A.4, Strube, C.1 (2015): Neurotoxocarosis alters myelin protein gene transcription and expression. Parasitology Research 114, 2175- 2186
doi: 10.1007/s00436-015-4407-1
1Institut für Parasitologie, Tierärztliche Hochschule Hannover
2Institut für Biometrie, Epidemiologie und Informationsverarbeitung, Tierärztliche Hochschule Hannover
3Abteilung Neuroimmunologie, Institut für Multiple Sklerose Forschung, Hertie Stiftung;
Max Planck Institut für Experimentelle Medizin, Universitätsmedizin Göttingen
4Institut für Pathologie, Tierärztliche Hochschule Hannover
Abstract:
Neurotoxocarosis is an infection of the central nervous system (CNS) caused by migrating larvae of the common dog and cat roundworms (Toxocara canis and T. cati), which are zoonotic agents. As these parasites are prevalent worldwide and neuropathological and molecular investigations on neurotoxocarosis are scarce, this study aims to characterise nerve fibre demyelination associated with neurotoxocarosis on a molecular level. Transcription of eight myelin associated genes (Cnp, Mag, Mbp, Mog, Mrf-1, Nogo-A, Plp1, Olig2) was determined in the mouse model during six time points of the chronic phase of infection using qRT-PCR. Expression of selected proteins was analysed by Western Blotting or immunohistochemistry. Additionally, demyelination and neuronal damage were investigated histologically. Significant differences (p≤0.05) between transcription rates of T. canis- infected and uninfected control mice were detected for all analysed genes while T. cati affected five of eight investigated genes. Interestingly, 2’, 3’-cyclic nucleotide 3’- phosphodiesterase (Cnp) and myelin oligodendrocyte glycoprotein (Mog) were up-regulated in both T. canis- and T. cati-infected mice preceding demyelination. Later CNPase expression was additionally enhanced. As expected, myelin basic protein (Mbp) was down-regulated in cerebra and cerebella of T. canis-infected mice when severe demyelination was present 120
to reflect direct traumatic and hypoxic effects of larval migration as well as secondary processes including host immune reactions, demyelination and attempts to remyelinate damaged areas.
Erklärung über den eigenen Anteil an der Publikation:
Konzept, Versuchsplanung: Christina Strube
Experimentelle Durchführung: Lea Heuer, Martin Beyerbach, Fred Lühder
Diskussion, Beratung: Lea Heuer, Martin Beyerbach, Andreas Beineke, Fred Lühder, Christina Strube
Manuskript, Korrespondenz: Lea Heuer, Christina Strube
auf murine ZNS-Zelllinien und Brain Slice-Kulturen
Heuer, L.1, Händel, S.1, Beineke, A.2, Strube, C.1 (2015): Effects of Toxocara larvae on brain cell survival by in vitro model assessment. Parasitology 142, 1326-1334
doi: 10.1017/S0031182015000694
1Institut für Parasitologie, Tierärztliche Hochschule Hannover
2Institut für Pathologie, Tierärztliche Hochschule Hannover
Abstract:
Neuroinvasive larvae of the common dog and cat roundworms, Toxocara canis and T. cati, may cause severe neurological and neuropsychological disturbances in humans. Despite their pathogenic potential and high prevalence worldwide, little is known about their cell-specific influences and cerebral host-pathogen interactions in neurotoxocarosis. To address this discrepancy, a co-culture system of viable larvae with murine neuronal (CAD), oligodendrocytal (BO-1) and microglial (BV-2) cell lines has been established. Additionally, murine adult brain slices have been co-cultured with Toxocara larvae to consider complex organotypic cell-cell interplay. Cytotoxicity of larval presence was measured enzymatically and microscopically. Microscopic evaluation using trypan blue exclusion assay revealed to be less reliable and sensitive than the lactate dehydrogenase (LDH) activity assay. Ultimately, even low numbers of both T. canis and T. cati larvae impaired survival in differentiated CAD cells, which morphologically resemble primary neurons. In contrast, viability of oligodendrocytal and microglial cells as well as brain slices was not impaired by larval presence. Therefore, immune-mediated mechanisms or trauma by migrating larvae presumably induce the in vivo pathology rather than acute cytotoxic effects. Conclusively, the helminthic larvae co-culture system presented here is a valuable in vitro tool to study cell specific effects of parasitic larvae and their products.
Erklärung über den eigenen Anteil an der Publikation:
Konzept, Versuchsplanung: Christina Strube, Andreas Beineke Experimentelle Durchführung: Lea Heuer, Sabine Händel
Diskussion, Beratung: Lea Heuer, Andreas Beineke, Christina Strube Manuskript, Korrespondenz: Lea Heuer, Christina Strube
Diskussion
Die Neurotoxokarose ist eine Erkrankung, die als Folge einer Infektion mit dem zoonotischen Hunde- bzw. Katzenspulwurm (Toxocara canis bzw. T. cati) auftreten kann. Als Konsequenz der Persistenz und Wandertätigkeit der dritten Larven im menschlichen Gehirn können Parenchymschäden und infolge dessen neurologische, neuromotorische sowie kognitive Ausfallserscheinungen auftreten. Histopathologisch ist die Demyelinisierung im Zuge chronischer, T. canis-induzierter Neurotoxokarose wiederholt im Mausmodell beschrieben worden (DOLINSKY et al. 1985; LOHMANN et al. 1989; EPE et al. 1994; JANECEK et al. 2014).
Darüber hinaus wird die ätiologische Beteiligung dieser Erkrankung bei neurodegenerativen Erkrankungen diskutiert (SÖNDERGAARD u. THEORELL 2004; LIAO et al. 2008b). Dennoch sind umfassende histopathologische und molekulare Untersuchungen, die sich nicht nur auf T. canis-induzierte Neurotoxokarose beschränken, sondern auch T. cati als möglichen Auslöser dieser Erkrankung berücksichtigen, bislang nur unzureichend erfolgt. Zur molekularen Charakterisierung der Demyelinisierung im Rahmen der T. canis- und T. cati- induzierten Neurotoxokarose wurden daher Transkriptions- und Expressionsmuster ausgewählter Myelingene im Infektionsverlauf ermittelt.
Molekulare Veränderungen und Demyelinisierung in vivo
Neben den zwei Haupt-Myelinproteinen myelin basic protein (MBP) und proteolipid protein (PLP), die zusammen etwa 80 % aller ZNS-Myelinproteine ausmachen (BAUMANN u.PHAM- DINH 2001), wurden in der vorliegenden Arbeit auch quantitativ untergeordnete Myelinkomponenten wie 2’, 3’-cyclic nucleotide 3’-phosphodiesterase (CNPase), myelin- associated glycoprotein (MAG) und myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) analysiert.
Ermittelte Differenzen in Transkriptions- und Expressionsmustern der Infektions- und Kontrollgruppen erscheinen auf den ersten Blick gering. Dabei muss jedoch berücksichtigt werden, dass Gesamthemisphären und nicht nur veränderte Areale der Analyse zugeführt wurden. Da Neurotoxokarose-assoziierte Läsionen fokal oder multifokal auftreten, aber nicht das gesamte Hirngewebe in Mitleidenschaft ziehen, war der Anteil an unverändertem Hirngewebe im Vergleich zu den pathologisch veränderten Arealen überrepräsentiert. Auf Grund der ermittelten Transkriptions- und Expressionsmuster der Myelingene sollte in
Betracht gezogen werden, dass die beobachteten Veränderungen auf Gen- und Proteinebene pathogenetisch eventuell nicht allein auf Prozesse der De- bzw. Remyelinisierung zurückgeführt werden können. Beispielsweise war die Cnp-Transkription in Groß- und Kleinhirnen T. canis- und T. cati-infizierter Mäuse an Tag 28 pi erhöht und ging damit der histologisch manifesten Demyelinisierung (Tag 70 pi) deutlich voraus. Zwar ist anzunehmen, dass die molekularen vor den histopathologischen Veränderungen evident werden, dennoch können diese Veränderungen auch in einem kausalen Zusammenhang mit anderen, der Demyelinisierung zeitlich vorangegangenen Ereignissen, stehen. Solche Ereignisse könnten multifokale Traumen, Hypoxien und die Akkumulation von Makrophagen darstellen, denn bereits circa zwei bis drei Tage nach oraler Infektion erreichen Toxocara-Larven durch Perforation von Gefäßwänden das Gehirn (KOLBEKOVÁ et al. 2011; JANECEK et al. 2014).
Infolge dessen auftretende Hämorrhagien und Migration der Larven im Gewebe führen zur Schädigung des Parenchyms (PEPPERSACK 1981; HORN 1983; LOHMANN et al. 1989;
CARDILLO et al. 2009; JANECEK et al. 2014). Zusätzlich ist die Blut-Hirn-Schranke über Wochen nach einer T. canis-Infektion geschädigt und hirnverletzungsassoziierte Biomarker sind auf mRNA und Proteinebene aufreguliert (LIAO et al. 2008a; LIAO et al. 2008b). Im Zusammenhang mit traumatischen Hirnverletzungen ist außerdem ein Anstieg der CNPase- Expression in Mikrogliazellen beschrieben worden (YANG et al. 2014). Es wird angenommen, dass CNPase das Neuroparenchym nach traumatischen Hirnverletzungen schützt, indem dieses Enzym das mitochondriale Toxin 2‘, 3‘-cAMP zu Adenosin, einem Neuroprotektor, umsetzt (VERRIER et al. 2013). Eine gesteigerte Cnp-Transkriptionsaktivität, wie hier für Neurotoxokarose beschrieben, ist auch bei Mäusen nach Infektion mit Angiostrongylus cantonensis - wie T. canis und T. cati ein zoonotischer, parasitischer Nematode - an Tag 20 und 25 pi beschrieben worden (LIN u. LAI 2009). Gleichzeitig trat dabei eine erhöhte CNPase- Expression im Liquor cerebrospinalis auf. Daher stellten die Autoren die Hypothese auf, dass CNPase nach Zerstörung der Myelinscheiden freigesetzt werde und infolge dessen vermehrt vorhanden sei. Ab Tag 70 pi ist die Demyelinisierung bei T. canis-infizierten Mäusen in der vorliegenden Arbeit histologisch nachweisbar. Initial tritt im Zuge von Demyelinisierungen ein starkes Absinken der mRNA-level von Myelinproteinen wie MBP und MAG (MORELL et al. 1998) sowie der Expressionslevel von MBP, PLP, CNPase und MOG auf (LINDNER et al.
2008). Gleichzeitig wurde gezeigt, dass die Expression von MBP, PLP und CNPase während der Remyelinisierung schnell wieder ansteigt (LINDNER et al. 2008). Eine Aufregulierung von
Mbp an Tag 70 pi mit gleichzeitiger Abregulierung von Plp1 und Mog in den Kleinhirnen T.
canis-infizierter Mäuse könnte daher Ausdruck einer Demyelinisierung mit beginnender Remyelinisierung sein. Remyelinisierungsprozesse könnten sich auch in den beobachteten Proteinexpressionsprofilen widerspiegeln. Diese Profile korrespondierten nicht direkt mit den entsprechenden Transkriptionsmessungen, da post-transkriptionale, translationale Regulationsvorgänge und Prozesse der Proteindegeneration ebenfalls die messbaren Proteinmengen beeinflussen (VOGEL u. MARCOTTE 2012). So war an Tag 98 und 120 pi, als Demyelinisierungen bei T. canis-, nicht aber bei T. cati-infizierten Mäusen histologisch evident waren, MBP in den Großhirnen T. canis- und T. cati-infizierter Mäuse angereichert.
Da auch die CNPase-Expression an Tag 98 pi in den Kleinhirnen T. cati-, nicht aber T. canis- infizierter Mäuse erhöht war, kann vermutet werden, dass T. cati-induzierte Prozesse zwar stattfinden, jedoch in den untersuchten Gewebeschnitten histologisch noch nicht nachweisbar waren. An Tag 150 pi war das CNPase-Expressionsniveau deutlich erhöht, während gleichzeitig in beiden Infektionsgruppen histologisch eine Myelinzerstörung bestätigt wurde.
Neben De- und Remyelinisierung könnte eine erhöhte Mbp-Transkription und -Expression auch durch multifokale Ischämien, bedingt durch migrierende Larven oder immunvermittelte Mechanismen, hervorgerufen werden. So ist der Verschluss zerebraler Gefäße bei humaner Toxokarose beschrieben worden (SOMMER et al. 1994) und MBP wird in Peri-Infarkt- Regionen während fokaler zerebraler Ischämien nachweislich aufreguliert (GREGERSEN et al.
2001). Myelingene sind zudem während der Mikroglia-Makrophagen-Aktivierung und deren Akkumulation in Peri-Infarkt-Regionen maximal exprimiert. Entzündungszellen und Mediatoren stimulieren daher möglicherweise die Transkription von Myelingenen (GREGERSEN et al. 2001). Im Einzelnen wurde die Ansammlung von Mikroglia und Makrophagen mit einer Aufregulierung von Mbp- und Mag-mRNA assoziiert (MORELL et al.
1998). Auch im Zuge der Neurotoxokarose wurden in der vorliegenden Arbeit solche Ansammlungen von Makrophagen (Gitterzellen) bei T. canis-infizierten Mäusen ab Tag 70 pi beobachtet und waren von erhöhten Mbp- und Mag-Transkriptionsraten begleitet. In Assoziation mit Gitterzell-Ansammlungen wurden hier immunhistologisch auch β-APP- positive Axone detektiert, wodurch Ergebnisse von LIAO et al. (2008b) bestätigt werden konnten. Die Autoren hatten nach T. canis-Infektion bei B6-Mäusen einen Anstieg von β-APP auf mRNA- und Proteinebene nachgewiesen. Solche intraaxonalen β-APP-Akkumulationen sind etablierte Marker zur Frühdiagnostik von Axonopathien. Sie werden beispielsweise bei
forensischen Fällen von diffusen Axonverletzungen im Rahmen des sogenannten „shaken baby“-Syndroms detektiert (GLECKMAN et al. 1999; BLENNOW et al. 2012). Darüber hinaus ist eine vermehrte Expression von β-APP funktionell in die posttraumatische Regeneration involviert (BLENNOW et al. 2012). Interessanterweise ist bei T. canis-infizierten Mäusen auch Tgfβ-1, der die Neuritenregeneration in vitro fördert (KNÖFERLE et al. 2010) und während der Rekrutierungsphase der Remyelinisierung ansteigt (HINKS u. FRANKLIN 1999), aufreguliert (LIAO et al. 2008b; JANECEK et al. 2015). Bemerkenswert ist auch, dass in der vorliegenden Arbeit oligodendrocyte transcription factor 2 (Olig2), ein Marker von Oligodendrozyten- Vorläuferzellen [oligodendrocyte precursor cells (OPCs)], in Kleinhirnen T. cati-infizierter Mäuse an Tag 70 pi auf-, in den Großhirnen beider Infektionsgruppen hingegen an Tag 98 pi ab- und schließlich an Tag 120 pi in Kleinhirnen T. canis-infizierter Mäuse (2000 Eier) wieder aufreguliert war. An Zeitpunkt 120 pi zeigten Mäuse, die mit nur 1000 embryonierten T. canis-Eiern infiziert worden waren, eine signifikant geringere Olig2-Transkriptionsrate als solche, die mit der höheren Dosis von 2000 Eiern infiziert worden waren. Dies könnte das Resultat einer möglichen, untenstehend näher diskutierten, „Dosisabhängigkeit“ Toxocara- vermittelter Hirnschädigung sein. Alternierende Auf- und Abregulierungen der Olig2- Transkription bei infizierten Mäusen illustrieren möglicherweise De- und Remyelinisierung im Verlauf der Neurotoxokarose, denn eine Aufregulation von Olig2 könnte auf eine vermehrte Proliferation der OPCs im Gehirn oder auf ein gesteigertes Transkriptionsniveau dieses Markers in OPCs hindeuten. Dies wurde häufig in Tiermodellen der Demyelinisierung beobachtet, in denen die Anzahl der OPCs und die Expression von Olig2-mRNA als Konsequenz der Demyelinisierung massiv ansteigt und während der Remyelinisierung wieder abfällt, was auf die Reifung der OPCs zu myelinisierenden Oligodendrozyten zurückgeführt wird (BLAKEMORE u. KEIRSTEAD 1999; KUHLMANN u. BRÜCK 2010; ZHAO et al. 2005). An Tag 98 pi ist gleichzeitig auch der myelin gene regulatory factor-1 (Mrf-1), ein Regulator der MBP-Expression in Oligodendrozyten (HAQUE et al. 1994), in Großhirnen aufreguliert.
Zusammengenommen scheinen diese Ergebnisse eine fortwährende Rekrutierung und Differenzierung von OPCs in reife Oligodendrozyten während der Demyelinisierungsphase der Neurotoxokarose widerzuspiegeln. Überraschenderweise wurden erste Veränderungen der Olig2-Transkription in Kleinhirnen T. cati-infizierter Mäuse beobachtet, während klinisch und histologisch T. canis-infizierte Mäuse deutlich stärker von Demyelinisierungen betroffen zu sein schienen. Eine mögliche Erklärung für diesen frühen Effekt auf OPCs im Kleinhirn
T. cati-infizierter Tiere, könnte die kürzlich beschriebene zerebellare Migrationspräferenz T. catis sein (JANECEK et al. 2014). Darüber hinaus könnte eine frühere Aktivierung der OPCs während der T. cati-Infektion histologische oder klinische Zeichen einer Demyelinisierung reduzieren oder ihnen vorbeugen, wodurch zu erklären wäre, warum diese Tiere im Vergleich zu T. canis-infizierten Tieren erst später im Infektionsverlauf klinische Symptome und histologisch nachweisbare Demyelinisierungen entwickeln. Eine andere, naheliegende Begründung für diese Unterschiede zwischen den Infektionsgruppen könnte die geringere Anzahl von T. cati-Larven im Gehirn der Mäuse sein, da die Larven hauptsächlich in der Muskulatur akkumulieren (SPRENT 1955; SPRENT 1956; SPRENT 1958; CARDILLO et al. 2009;
JANECEK et al. 2014). Hieraus resultieren im Vergleich zu T. canis weniger ausgeprägte neuropathologische Effekte. Andere Gene, wie Mag, sind ausschließlich in Groß- und Kleinhirnen T. canis-infizierter Mäusen differentiell transkribiert. Aufregulierungen von Mag wurden sieben Tage nach traumatischen Hirnverletzungen nachgewiesen (ISRAELSSON et al.
2014). Da MAG eine Tyrosinkinase namens Fyn aktiviert, die in Myelinsynthese und Oligodendrozytendifferenzierung involviert ist (UMEMORI et al. 1994; OSTERHOUT et al.
1999), scheint seine Aufregulierung zu verstärkter Myelinproduktion beizutragen. Außerdem hemmt MAG das Auswachsen von Neuriten nach ZNS-Läsionen (BAUMANN u. PHAM-DINH
2001). Gemeinsam mit der Aufregulierungen der Cnp-Transkription und -Expression unterstützt die Aufregulierung von Mag die Annahme, dass Traumata eine Rolle im Prozess der chronischen Neurotoxokarose spielen könnten. Die Transkription des neurite outgrowth inhibitor-A (NOGO-A), eines weiteren wichtigen Neuriten-Auswuchsinhibitors, war nur zu einem Zeitpunkt, nämlich an Tag 98 pi, in Kleinhirnen T. canis-infizierter Mäuse abreguliert.
Da NOGO-A ein verlässlicher Marker für reife Oligodendrozyten ist (KUHLMANN et al.
2007), könnte diese verminderte Transkription das Resultat einer Depletion dieser Zellen im Zuge der Demyelinisierung sein. Eine solche Depletion von reifen Oligodendrozyten konnte parallel zur Transkriptionsänderung immunhistologisch in Demyelinisierungsherden bestätigt werden. Zur Ätiologie dieser fortschreitenden Demyelinisierung lassen sich verschiedene Hypothesen formulieren: Da Larven jahrelang im Wirtsgewebe vital sind, nicht vom Immunsystem eliminiert werden und mobil bleiben (SPRENT 1955; BEAVER 1956; HORN
1983; PEPPERSACK 1981;LOHMANN et al. 1989; KAYES 1997), könnte sich die Gesamtfläche, die von Primärläsionen, nachfolgenden Immunreaktionen und Demyelinisierung betroffen ist, mit der Zeit progressiv ausweiten. Andererseits wäre auch das eigentliche Ausmaß der
Demyelinisierungen, die als Folge initialer Prozesse wie Gefäßwandzerstörungen beim Eindringen der Larven ins ZNS entstehen könnten, erst später im histologischen Schnitt sichtbar. Ungeachtet dessen scheint die Abregulierung von Cnp, Mbp und Mog zum Zeitpunkt 120 pi bei T. canis-infizierten Mäusen die Folge ausgedehnter Demyelinisierungen zu sein. In Klein- und Großhirnen T. cati-infizierter Mäuse ist Cnp später, nämlich an Tag 150 pi, abreguliert. Da T. cati-Larven hauptsächlich in der Muskulatur und nur zu geringen Anteilen im Gehirn akkumulieren (CARDILLO et al. 2009; JANECEK et al. 2014), kann davon ausgegangen werden, dass histologische und klinische Zeichen der Demyelinisierung erst später im Verlauf der Infektion evident werden. Ausmaß und zeitlicher Verlauf der Hirnschäden scheinen also direkt mit der Anzahl der Larven im ZNS zu korrelieren. Diese
„Dosis-Wirkungsbeziehung“ konnte in der Vergangenheit bereits mit verschiedenen Infektionsdosen von T. canis in Mäusen demonstriert werden (LOHMANN et al. 1989) und zeigt sich auch darin, dass die Neurotoxokarose bei T. canis-infizierten Mäusen deutlich schneller voranschreitet als bei T. cati-infizierten. Denn T. canis-Larven migrieren erwiesenermaßen in größerer Zahl in das murine Gehirn (SPRENT 1955; JANECEK et al. 2014).
Andere Autoren konnten die Dosisabhängigkeit klinischer Symptome im Rahmen der Neurotoxokarose nicht bestätigen, da im Vergleich verschiedener In- und Auszuchtstämme von Mäusen, derjenige Stamm mit der größten Larvenbelastung im Gehirn die niedrigste Morbidität und Mortalität aufwies (EPE et al. 1994). Der Einfluss stammabhängiger immunassoziierter Mechanismen ist somit evident, die Autoren führten jedoch keine graduellen Dosis-Versuche innerhalb eines Stammes analog zu LOHMANN et al. (1989) durch.
Eine Dosis-Wirkungsbeziehung innerhalb einer immunologisch identischen Population bleibt somit durchaus wahrscheinlich. Histologisch sind Demyelinisierungen im Zuge der Neurotoxokarose ab Tag 42 pi beschrieben worden (JANECEK et al. 2014). In der vorliegenden Studie waren Demyelinisierungen im Kleinhirn und im Corpus callosum an Tag 70 pi nachweisbar. Die Dosisabhängigkeit der Toxocara-induzierten ZNS-Pathologie zeigt sich in der vorliegenden Arbeit auch in Unterschieden der Myelinprotein-Expression zwischen den Gruppen, die mit 2000 und jenen, die mit 1000 infektiösen T. canis-Eiern infiziert worden sind. In der mit der höheren Dosis infizierten Gruppe war die Transkription von Mog im Großhirn, der Prädilektionsstelle der T. canis-Larven (JANECEK et al. 2014), an Tag 120 pi geringer. Dies deutet auf einen stärkeren Verlust reifer Oligodendrozyten hin. Gleichzeitig ist die Transkription von Olig2 in Groß- und Kleinhirnen dieser Gruppe im Vergleich zu allen
anderen Gruppen inklusive jener mit der geringeren T. canis-Infektionsdosis aufreguliert.
Vermutlich ist dies Ausdruck der verstärkten Rekrutierung von OPCs parallel zur fortschreitenden Demyelinisierung. Eine allgemeine, gleichsinnige Auf- oder Abregulierung aller untersuchten Myelingene kann zu keinem Zeitpunkt erwartet werden, da die Neurotoxokarose eine chronische Erkrankung mit multifokalen Mikroläsionen unterschiedlicher Entstehungszeitpunkte darstellt. De- und Remyelinisierungen laufen somit zeitlich parallel ab. Zusätzlich sind die in der vorliegenden Arbeit erhobenen Daten vermutlich auch Ausdruck anderer, unbekannter Funktionen der Myelinproteine, die mehr als nur bloße Bausteine der Myelinscheiden sind. So wurde kürzlich ein möglicher ätiologischer Zusammenhang zwischen einer abnormalen Myelinexpression von Cnp und Olig2 und neuropsychiatrischen Erkrankungen wie Depression und Schizophrenie hergestellt (GEORGIEVA et al. 2006; HUANG et al. 2008; HAGEMEYER et al. 2012). Da sowohl T. canis als auch T. cati die Transkription und Expression dieser Gene beeinflussen, bleibt Raum für Hypothesen bezüglich der Rolle dieser Parasiten im Hinblick auf psychiatrische Erkrankungen. Ein solcher möglicher Zusammenhang wurde bereits in verschiedenen Arbeiten diskutiert (vgl. RICHARTZ u. BUCHKREMER 2002; MARMOR et al. 1987).
Jedoch sind nicht nur die Folgen der Toxocara-induzierten Demyelinisierungen und ZNS- Schädigungen, sondern auch ihre genauen Ursachen noch immer unklar. Mechanische Effekte der larvalen Migration durch das Parenchym spielen dabei sicherlich ebenso eine Rolle wie immunvermittelte Prozesse (PEPPERSACK 1981; HORN 1983; LOHMANN et al. 1989; JANECEK
et al. 2015). Mögliche Auswirkungen larvaler exkretorisch/sekretorischer (TES) Produkte auf Zellen des ZNS wurden in diesem Zusammenhang bislang jedoch vernachlässigt. Zwar stellten schon DOLINSKY et al. (1985) Spekulationen über die Produktion neurotoxischer Substanzen durch Toxocara-Larven an, Untersuchungen hierzu sind allerdings bis heute nur marginal existent. Durch Etablierung einer Ko-Kultur lebender Toxocara-Larven mit verschiedenen murinen ZNS-Zelllinien und Brain Slices wurde im zweiten Teil dieser Arbeit die Grundlage zur Beurteilung zytotoxischer und anderer zellspezifischer Effekte dieser Nematoden geschaffen. Tatsächlich verdichteten sich bei Vitalitätsprüfung der ko-kultivierten Zellen die Hinweise auf mögliche neurotoxische Effekte des larvalen ES-Antigens, was nachfolgend ausgeführt werden soll.
