Tierärztliche Hochschule Hannover Institut für Parasitologie
Migrationsverhalten von Toxocara-Larven und resultierende Transkriptregulation im Zuge der Toxocara-Infektion des paratenischen Wirtes
THESE
Zur Erlangung des Grades eines
DOCTOR OF PHILOSOPHY (PhD)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
vorgelegt von Elisabeth Janecek aus Seeheim-Jugenheim
Hannover 2015
Supervisorin: Prof. Dr. med. vet. Christina Strube, PhD
Betreuungsgruppe: Prof. Dr. med. vet. Christina Strube, PhD Prof. Dr. med. vet. Andreas Beineke Prof. Dr. med. vet. Arwid Daugschies
1. Gutachten: Prof. Dr. med. vet. Christina Strube, PhD Institut für Parasitologie
Tierärztliche Hochschule Hannover
Prof. Dr. med. vet. Andreas Beineke Institut für Pathologie
Tierärztliche Hochschule Hannover
Prof. Dr. med. vet. Arwid Daugschies Institut für Parasitologie
Veterinärmedizinische Fakultät der Universität Leipzig
2. Gutachten: Prof. Dr. med. vet. Carlos Hermosilla Institut für Parasitologie
Justus-Liebig-Universität Gießen
Datum der Disputation: 04.05.2015
Teile dieser Arbeit wurden bereits auf folgenden Tagungen vorgestellt:
Janecek, E., Beineke, A., Schnieder, T., Strube, C.: Larvenverteilung und neuropathologische Veränderungen im Gehirn des paratenischen Wirtes in Folge von Toxocara spp.-Infektionen.
Tagung der Deutschen Veterinärmedizinische Gesellschaft, Fachgruppe Parasitologie und Parasitäre Krankheiten; Hannover, 02.-04.07.11; 2012
Janecek, E., Beineke, A., Schnieder, T., Strube, C.: Larval distribution and neuropathological changes in brains of paratenic hosts after Toxocara spp. infection.
ESCCAP Toxocara2012, Budapest, Ungarn, 04.-05.10.2012
Janecek, E., Beineke, A., Schnieder, T., Strube, C.: Neuropathologie der Toxocara- Infektion im paratenischen Wirtsmodell „Maus“.
Tagung der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft (DVG), Fachgruppe Parasitologie und parasitäre Krankheiten, Gießen, 08.-10.07.2013
Janecek, E., Beineke, A., Schnieder, T., Strube, C.: Brain larval distribution and neuropathological changes in the paratenic mouse host model after Toxocara spp.
infection.
24th International Conference of the World Association for the Advancement of Veterinary Parasitology (WAAVP), Perth, Australien, 25.-29.08.2013
Janecek, E., Wilk, E., Schughart, K., Geffers, R., Strube, C.: Microarray-Analyse der Neurotoxokarose im Wirtsmodell Maus.
Tagung der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft (DVG), Fachgruppe Parasitologie und parasitäre Krankheiten, Leipzig, 30.06.-02.07.2014
Janecek, E., Wilk, E., Schughart, K., Geffers, R., Strube, C.: Gene expression analysis of neurotoxocarosis in the mouse model.
Paratrop 2014, Joint Society Meeting on Parasitology and Tropical Medicine, Zürich, Schweiz, 16.-19.07.2014
In Liebe meiner Familie gewidmet
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis ... II
Summary ... 1
Zusammenfassung ... 3
Einleitung ... 7
Toxocara spp. im paratenischen Wirt ... 10
Zielsetzung ... 12
Somatische Larvenmigration und pathohistologische Untersuchungen ... 12
Microarray-Genexpressionsanalyse ... 12
Publikationen ... 14
1. Migrationsverhalten von Toxocara-Larven im paratenischen Wirtsmodell Maus 14 2. Genregulation im Zuge der Neurotoxokarose ... 14
Diskussion ... 15
Larvenwanderung im paratenischen Wirt ... 15
Microarray-Genexpressionsanalyse ... 20
Fazit ... 25
Referenzen ... 26
Danksagung ... 41
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
AD Alzheimer’s disease
ApoD Apolipoprotein D
APP amyloid precursor protein
B6 Mausstamm C57Bl/6J
CNS central nervous system
Dhcr24 24-Dehydrocholesterol-Reduktase
DTG differentiell transkribiertes Gen
Fdft1 farnesyl-diphosphate farnesyltransferase Gfap glial fibrillary acidic protein
GO Gene Ontology
Hoxa1 homeobox A1
Isl2 insuline related protein 2
Myh10 myosin heavy chain 10
OLM okuläre Larva migrans
pi post infectionem
Tgfb1 transforming growth factor beta 1
tTg tissue transglutaminase
VLM viszerale Larva migrans
ZNS zentrales Nervensystem
Summary
Summary
Elisabeth Janecek
Migration pattern of Toxocara larvae and associated transcriptional changes during Toxocara-infection of the paratenic host
Toxocara canis and T. cati are worldwide occurring roundworms of dogs and cats with a high zoonotic potential. Migrating larvae of T. canis in paratenic hosts, including humans, exhibit a strong affinity to the CNS and may cause neurotoxocarosis accompanied by a variety of neurological symptoms. T. cati larvae have been rarely found in nervous tissues, therefore, T. canis larvae are considered the causative agents of human neurotoxocarosis. However, direct comparison of previously published studies is not feasible as larval migration is influenced by a variety of factors like mouse strains and inoculation doses. Additionally, pathomechanisms of T. canis or T. cati induced neurotoxocarosis as well as host reactions towards the respective parasite have not been sufficiently examined. The present study aimed to directly compare T. canis and T. cati larval migration behaviour in the mouse as model for paratenic hosts with focus on the central nervous system (CNS) during the course of infection. Furthermore, microarray analysis of infected mouse brains was conducted to provide data on the molecular level for the characterization of host reactions towards T. canis- or T. cati-infection and to possibly elucidate underlying pathomechanisms. Microarray data also allows identification of differences between T. canis- and T. cati-infections on transcriptional level. For the examination of larval migration, C57Bl/6J (B6) mice were infected with 2000 embryonated T. canis and T. cati eggs, respectively. Additionally, Balb/c mice were infected with T. cati eggs. Obtained organs were microscopically examined to determine presence of larvae at eight time points post infectionem (pi). The main focus was put on the CNS which included analysis of larval distribution in cerebra and cerebella (divided in right and left hemispheres), spinal cord and eyes.
Histopathological analysis of brains of all infection groups was conducted to characterize neurostructural damage. For microarray analysis, B6 mice were infected as described. Cerebra as well as cerebella were obtained day 42 pi and processed for further analysis. Significant differences in larval distribution were observed between and within the infection groups during the course of infection. Recovery
Summary
rates of T. canis in the brain were significantly higher than those of T. cati larvae.
Surprisingly, T. canis larvae were significantly more frequently found in cerebra of infected mice, whereas T. cati showed a preference to cerebella. Structural damage in brain tissue was most severe in T. canis-infected mice, even though observed in all infection groups during the course of infection. Microarray analysis underlined these differences and resulted in more differentially transcribed genes (DTGs) for T. canis- than T. cati-infected brains. A strong immune reaction in terms of up- regulated immune associated genes was observed in both infection groups with the most prominent up-regulation observed in T. canis-infected brains. Additionally, genes associated with the Gene Ontology (GO) terms “sensory perception” as well as “behaviour/taxis” were significantly enriched. In contrast, significant enrichment of the biological module “lipid/cholesterol biosynthetic process” was observed in down- regulated genes of T. canis-infected brain regions. Cholesterol is a highly abundant component of the brain and has been assigned to several functions. Dysfunction of cholesterol synthesis and resulting concentration changes may lead to disturbances in signal transduction or even neurodegenerative disease.
Direct comparison of transcriptional changes revealed only minor DTG overlap between brains of T. canis- and T. cati-infected mice. This demonstrates major differences in gene regulation between the infection groups, additionally underlining the evident differences between T. canis and T. cati larval behaviour as observed previously on a molecular level.
Overall, obtained data provides insights into T. canis and T. cati induced neurotoxocarosis in terms of larval behaviour within the paratenic host as well as the host’s reaction towards migrating or arrested larvae in the brain on a transcriptional level. Even though to a lesser extent than T. canis, T. cati larvae are able to cause structural damage and provoke a well detectable host reaction towards migrating larvae. Therefore, T. cati should not be underestimated as a zoonotic agent.
Microarray data delivers a comprehensive basis for future analyses over the course of infection as well as functional tests to identify gene regulatory circuits that are crucial for pathogenesis of neurotoxocarosis. Such further analyses will allow a detailed characterization of the pathogenesis of neurotoxocarosis and help to identify potential therapeutic targets.
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Elisabeth Janecek
Migrationsverhalten von Toxocara-Larven und resultierende Transkriptregulation im Zuge der Toxocara-Infektion des paratenischen Wirtes
Toxocara canis und T. cati sind weltweit vorkommende, zoonotische Spulwürmer von Hunden und Katzen. In paratenischen Wirten, zu denen auch der Mensch zählt, weisen T. canis-Larven eine hohe Affinität zum zentralen Nervensystem (ZNS) auf und können somit die sogenannte Neurotoxokarose hervorrufen. Diese kann von einer Vielzahl von neurologischen Symptomen begleitet sein. Da T. cati-Larven bislang nur vereinzelt im Gehirn nachgewiesen wurden, werden T. canis-Larven als die hauptsächlichen Erreger der humanen Neurotoxokarose vermutet. Bisherige Studien bezüglich der T. canis- und T. cati-Larvenmigration im paratenischen Wirt lassen sich jedoch nur bedingt vergleichen, da die Larvenmigration von verschiedenen Faktoren wie dem infizierten Mausstamm sowie der Infektionsdosis beeinflusst wird. Des Weiteren sind die Pathomechanismen der T. canis- und T. cati- induzierten Neurotoxokarose sowie die Wirtsreaktion auf den jeweiligen Parasiten bislang nur unzureichend aufgeklärt. In der vorliegenden Arbeit erfolgte ein direkter Vergleich des Migrationsverhaltens von T. canis- und T. cati-Larven im paratenischen Wirtsmodell „Maus“ über den Infektionsverlauf, wobei das Hauptaugenmerk auf das ZNS gelegt wurde. Weiterhin wurde eine Microarray- Analyse der infizierten Mausgehirne durchgeführt, um molekulare Daten zur Wirtsreaktion auf den jeweiligen Parasiten zu generieren und zugrunde liegende Pathomechanismen aufzuklären. Für die Untersuchungen bezüglich der Larvenwanderung wurden C57Bl/6J (B6)-Mäuse mit je 2000 embryonierten T. canis- oder T. cati-Eiern infiziert. Des Weiteren wurde eine Infektionsgruppe von mit T. cati- infizierten Balb/c-Mäusen mitgeführt. An acht verschiedenen Zeitpunkten post infectionem (pi) wurden die Organe entnommen und die Larvenzahlen mittels mikroskopischer Untersuchung bestimmt. Hierbei wurde der Fokus auf das ZNS gelegt, was die Analyse von Großhirn und Kleinhirn, jeweils unterteilt in die rechte und linke Hemisphäre, sowie dem Rückenmark und den Augen inkludierte.
Neurostrukturelle Schädigungen wurden in den Gehirnen aller Infektionsgruppen anhand histopathologischer Analysen charakterisiert. Für die Microarray-Analyse
Zusammenfassung
wurden B6-Mäuse wie beschrieben infiziert, die Groß- und Kleinhirne wurden an Tag 42 pi entnommen und für die weitere Verwendung prozessiert. Im Zuge des Infektionsverlaufs konnten signifikante Unterschiede in der Larvenverteilung zwischen sowie innerhalb der Infektionsgruppen beobachtet werden. Die Wiederfindungsraten von T. canis-Larven im Gehirn waren signifikant höher als die von T. cati-Larven, welche jedoch signifikant häufiger im Kleinhirn nachgewiesen wurden, während T. canis eine Präferenz zum Großhirn zeigte. Die strukturelle Schädigung war in T. canis-infizierten Gehirnen stärker ausgeprägt als in T. cati- infizierten Gehirnen. Die Microarray-Analyse bestätigte diese Ergebnisse, da eine höhere Anzahl an differentiell transkribierten Genen (DTGs) in T. canis- als in T. cati- infizierten Gehirnen identifiziert wurde. In beiden Infektionsgruppen resultierten die aufregulierten Gene hauptsächlich aus einer ausgeprägten Immunantwort. Des Weiteren wurden signifikante Anreicherungen von Genen in den Gene Ontonolgy (GO)-Kategorien „Sinneswahrnehmung“ sowie „Verhalten und Taxis“ festgestellt. Im Gegensatz hierzu waren abregulierte Gene in T. canis-infizierten Gehirnen in der GO-Kategorie „Lipid-/Cholesterinbiosynthetische Prozesse“ statistisch signifikant angereichert. Da Cholesterin ein wichtiger Bestandteil des Gehirns mit diversen Funktionen ist, können Synthesedysfunktionen und daraus resultierende Konzentrationsänderungen zu fehlerhafter Signalübertragung oder gar neurodegenerativen Krankheitsprozessen führen.
Der direkte Vergleich der Transkripte zeigte lediglich eine geringe Überschneidung der DTGs in den Gehirnen der T. canis- und T. cati-infizierten Mäusen, was die Unterschiede der Genregulierung zwischen beiden Infektionsgruppen verdeutlicht.
Diese Daten betonen ebenfalls die offensichtlichen Unterschiede zwischen dem Migrationsverhalten von T. canis und T. cati auf molekularer Ebene.
Die in dieser Arbeit erhobenen Daten geben einen Einblick in die T. canis- bzw.
T. cati-induzierte Neurotoxokarose im Sinne der Larvenmigration im paratenischen Wirt sowie dessen genregulatorische Reaktion auf die Parasitierung des Gehirns.
Auch wenn T. cati-Larven weniger strukturelle Schäden im Gehirn verursachen und zudem eine schwächere Wirtsreaktion als T. canis-Larven hervorrufen, sollte ihr zoonotisches Potential nicht unterschätzt werden. Die vorliegende Arbeit bietet eine umfangreiche Grundlage für weitere Analysen des Infektionsverlaufs oder funktionelle Untersuchungen. Solche Folgestudien würden dazu beitragen, die
Zusammenfassung
Pathogenese der Neurotoxokarose detailliert zu charakterisieren und mögliche therapeutische Zielmoleküle zu identifizieren.
Einleitung
Einleitung
Toxocara canis und T. cati sind weltweit vorkommende, zoonotische Helminthen (GLICKMAN u. SCHANTZ 1981). Neben den jeweiligen Endwirten, den Kaniden bzw.
Feliden, können verschiedene andere Spezies, unter anderem der Mensch, als sogenannte paratenische Wirte fungieren.
Der Lebenszyklus von Toxocara spp. beginnt mit der Ausscheidung von Eiern in den Fäzes der infizierten Endwirte. Diese Eier sind zunächst nicht infektiös. In der Umwelt entwickelt sich unter optimalen Umweltbedingungen innerhalb von 3-6 Wochen die infektiöse dritte Larve, die lange Zeit im Ei überdauern kann (OVERGAAUW 1997). Werden diese infektiösen Eier nun vom Endwirt aufgenommen, schlüpfen die Larven nach ca. 2-4 Stunden im Duodenum, wo sie die Darmwand penetrieren und über das Kreislaufsystem in die Leber gelangen (WEBSTER 1958).
Der weitere Wanderweg erfolgt über das Herz in die Lunge. Nach Penetration der Alveolen wandern die Larven durch die Bronchiolen und gelangen über die Trachea in den Pharynx. Durch Verschlucken erreichen sie wieder den Darm und entwickeln sich dort zum adulten Stadium (SPRENT 1958). Die Weibchen beginnen nach der Paarung Eier zu legen, die wiederrum mit den Fäzes ausgeschieden werden. Hierbei ist das massive Reproduktionspotential zu beachten, da ein Weibchen pro Tag bis zu 200.000 Eier ausscheiden kann, deren Akkumulation in der Umwelt zu einem insgesamt hohen Infektionsrisiko führt (GLICKMAN u. SCHANTZ 1981).
Als zusätzliche Migrationsroute zum oben beschriebenen sogenannten trachealen Wanderweg wird die Wanderung der Larven von der Lunge zurück in den großen Kreislauf beschrieben. Hierbei werden sie passiv im Gewebe verteilt und persistieren dort als infektiöses, drittes Stadium bis aufgrund von verschiedenen Stimuli wie z.B.
Hormonen eine Reaktivierung während der Trächtigkeit erfolgt (SPRENT 1956;
WEBSTER 1958, 1958a).
Nehmen paratenische Wirte die infektiösen dritten Larven auf, schlüpfen diese im Dünndarm und vollziehen ebenfalls eine Körperwanderung. Jedoch findet keine Rückwanderung zum Dünndarm mit Entwicklung zum adulten Stadium statt, sondern die Larven persistieren für bis zu 10 Jahre als infektiöses Stadium an speziesspezifischen Prädilektionsstellen (BEAVER 1969; BRUNASKÁ et al. 1995; ORYAN
et al. 2010;TAIRA et al. 2011).
Einleitung
Bei Reaktivierung der Larven während der Trächtigkeit der Hündin können T. canis- Larven die Plazentaschranke überschreiten und die Feten intrauterin infizieren. In diesen verharren die Larven in der Leber und setzten ihre Wanderung und nachfolgende Entwicklung zu Adulten post partum fort (SHILLINGER u. CRAM 1923;
YUTUC 1949, WEBSTER 1958a; SCOTHORN et al. 1965; SCHNIEDER et al. 2011). Diese sogenannte pränatale Übertragung spielt bei mit T. cati-infizierten Katzen keine Rolle. Erfolgt die Infektion bei trächtigen Muttertieren, migrieren die Larven beider Spulwurmarten unter anderem direkt in die Milchdrüsen und werden post partum galaktogen auf die Welpen übertragen (SWERCZEK et al. 1971; COATI et al. 2004;
Schnieder et al. 2011). Diese galaktogene Übertragung findet bei T. canis zusätzlich auch dann statt, wenn die Hündin bereits vor der Trächtigkeit infiziert wurde, da analog zur pränatalen Infektion reaktivierte Larven auch in die Milchdrüsen einwandern.
Infizierte Welpen können durch hohe Eiausscheidungen erheblich zur Umweltkontamination beitragen und somit das Infektionsrisiko für den Menschen als paratenischen Wirt erhöhen. Prävalenzen sind in Europa mit 6-31 % bei Hunden und 11-27 % in Katzen verhältnismäßig hoch (MARTÎNEZ-CARRASCO et al. 2007; NIKOLIć et al. 2008; LEE et al. 2010; BECKER et al. 2012; BARUTZKI u. SCHAPER 2013), was auf ein hohes Expositionsrisiko schließen lässt.
Der Mensch infiziert sich meist über die infektiösen Eier aus der Umwelt. Hierbei sind Kinder aufgrund ihres mangelnden Hygienebewusstseins und Geophagie besonders gefährdet. Zusätzlich spielt die Kontaminationsrate von Kinderspielplätzen und öffentlichen Grünflächen eine Rolle, da Katzen vermehrt in Sandkästen und Hunde auf Rasenflächen Kot absetzen, wo die Eier akkumulieren (JANSEN et al. 1993).
Neben der Aufnahme infektiöser Eier können mit rohem oder ungenügend gekochtem Fleisch aufgenommene Larven eine Infektion des Menschen bedingen.
Daher sollten Fleisch oder Innereien vor dem Verzehr ausreichend gegart werden.
Tiefgefrieren ist meist nicht ausreichend, da die Larven über einen langen Zeitraum auch bei niedrigen Temperaturen vital bleiben und nach Verzehr des Fleisches Infektionen auslösen können (ITO et al. 1986; NAGAKURA et al. 1989; MAGNAVAL et al.
2001; SOMMERFELT et al. 2004; TAIRA et al. 2004; SASMAL et al. 2008; ORYAN et al.
2010; TAIRA et al. 2011; TAIRA et al. 2012). Das hohe Infektionsrisiko spiegelt sich auch in humanen Seroprävalenzen wieder. Diese variieren zwischen 2-44 % in
Einleitung
Europa und zwischen 63-93 % in tropischen Regionen (CHOMEL et al. 1993;
MAGNAVAL et al. 1994; UHLIKOVÁ u.HÜBNER 1998; DEUTZ et al. 2005; STENSVOLD et al.
2009).
Im Menschen können durch die migrierenden Larven vier verschiedene Formen der Toxokarose ausgelöst werden. Es werden die viszerale Larva migrans (VLM), die okuläre Larva migrans (OLM) sowie die Verlaufsformen der „verdeckten“ Toxokarose und der neuronalen Toxokarose unterschieden (MAGNAVAL et al. 2001).
Die VLM wird auf eine hypersensitive Reaktion auf den Tod der Larven zurückgeführt (DESPOMMIER 2003). Meist sind jüngere Kinder betroffen, welche Symptome wie Fieber und Bauchschmerzen, die auf Hepato- und Splenomegalien zurückzuführen sind, zeigen. Des Weiteren werden respiratorische Symptome wie Husten und Asthma beschrieben, welche durch parasitische Pneumonien und Bronchitiden hervorgerufen werden (KAYES u. OAKS 1978; MAGNAVAL et al. 2001; DESPOMMIER
2003). Die OLM wird durch in die Augen migrierende Larven ausgelöst, woraufhin sich ein eosinophiler Entzündungsherd bildet. Infolgedessen etablieren sich granulomatöse Entzündungsreaktionen, in einigen Fällen können Netzhautblutungen auftreten (SHIELDS 1984). Diese Reaktionen gehen unter anderem mit Symptomen wie Sehstörungen, Strabismus und Leukokorie einher, die in Sekundärglaukomen und Sehverlust resultieren können (BROWN 1970; GILLESPIE et al. 1993; DESPOMMIER
2003). Die „verdeckte“ Toxokarose wird mit unspezifischen Symptomen wie Fieber, Appetitlosigkeit, Übelkeit, Erbrechen und Bauchschmerzen in Verbindung gebracht.
Des Weiteren können Schlaf- und Verhaltensstörungen oder Pneumonien mit respiratorischen Symptomen auftreten (TAYLOR et al. 1987; MAGNAVAL et al. 2001).
Die neuronale Toxokarose oder Neurotoxokarose wird durch in das zentrale Nervensystem migrierenden Larven und deren Persistenz im neuronalen Gewebe verursacht. Obwohl es bislang nur wenige Fallbeschreibungen gibt, wird angenommen, dass eine Neurotoxokarose oftmals nicht als solche erkannt wird und die Erkrankung daher häufiger vorkommt, als es die Literatur vermuten lässt (FINSTERER u. AUER 2007). Dieser Unterschätzung könnten die begrenzten diagnostischen Mitteln und die teils unspezifischen Symptomen zugrunde liegen. Die Neurotoxokarose geht mit klinischen Symptomen wie Kopfschmerzen, Fieber, Photophobie, Schwäche, Dorsalgien, Verwirrung, Müdigkeit, fokalen oder generalisierten epileptiformen Anfällen, neuropsychologischen Störungen, Demenz
Einleitung
bzw. Depressionen einher. Zusätzlich können kognitive Störungen sowie Lernschwierigkeiten und Verhaltensänderungen auftreten (MARMOR et al. 1987;
TAYLOR et al. 1987; FORTENBERRY et al. 1991; SOMMER et al. 1994; MAGNAVAL et al.
2001; RICHARTZ u. BUCHKREMER 2002; BACHLI et al. 2004; FINSTERER u. AUER 2007).
Des Weiteren wurden motorische Beeinträchtigungen wie Ataxien, Rigor, Paresen, Dysästhesie sowie Harnretention beschrieben (WANG et al. 1983; RUSSEGGER u.
SCHMUTZHARD 1989; FORTENBERRY et al. 1991; VILLANO et al. 1992; SOMMER et al.
1994; GOFFETTE et al. 2000; MOREIRA-SILVA et al. 2004).
Toxocara spp. im paratenischen Wirt
In der Literatur wird eine Vielzahl von paratenischen Wirten beschrieben, wobei das Mausmodell am häufigsten für Untersuchungen bezüglich des Migrationsverhaltens der Toxocara-Larven oder verschiedener Verlaufsformen der Toxokarose eingesetzt wird. Hierbei wurde bislang der Fokus auf die Larven von T. canis gelegt, während das Migrationsverhalten und die Auswirkungen von T. cati-Larven auf den Modellorganismus nur unzureichend untersucht sind (FISHER 2003).
Im paratenischen Wirtsmodell „Maus“ konnte die Larvenwanderung in zwei verschiedene Phasen unterteilt werden, nämlich die akute Phase oder sogenannte hepato-pulmonale Migrationsphase sowie die chronische oder sogenannte myotrope- neurotrope Phase. Während der akuten Phase penetrieren die Larven nach Ingestion durch den paratenischen Wirt die Darmschleimhaut und erreichen durch das Gefäßsystem die Leber und die Lunge. Über den systemischen Kreislauf gelangen die Toxocara-Larven in der Maus hauptsächlich in das Muskel- und neuronale Gewebe, wo sie über Jahre hinweg persistieren können (SPRENT 1952; BURREN
1968; ABO-SHEHADA u. HERBERT 1984; MAGNAVAL et al. 2001). Dabei weisen T. canis- Larven eine ausgeprägte Affinität zum neuronalen Gewebe auf, während T. cati- Larven primär in der Skelettmuskulatur nachgewiesen wurden. Im neuronalen Gewebe wurden bislang wenige oder keine T. cati-Larven detektiert (DUBEY 1968;
PROKOPIC u. FIGALLOVÁ 1982; HAVASIOVÁ-REITEROVÁ et al. 1995; CARDILLO et al.
2009). Die Gründe für dieses unterschiedliche Migrationsverhalten sind weitestgehend unbekannt, da beide Toxocara-Arten vergleichbare Antigenfraktionen sowie Migrationsrouten während der akuten Phase der Infektion aufweisen (FISHER
2003; CARDILLO et al. 2009). Die bislang zu T. cati erhobenen Daten sind nur bedingt
Einleitung
mit denen von T. canis-Infektionen vergleichbar, da meist entweder unterschiedliche Mausstämme oder unterschiedliche Infektionsdosen für die Infektion genutzt wurden.
In bisherigen Studien wurde nachgewiesen, dass verschiedene Mausstämme unterschiedliche Suszeptibilitäten gegenüber T. canis aufweisen und die Infektionsdosis das Migrationsverhalten und den Krankheitsverlauf wesentlich beeinflusst. Aufgrund dessen kann ein Vergleich nur bei gleichen Infektionsparametern angestellt werden (KAYES et al. 1985; HAVASIOVÁ-REITEROVÁ et al. 1995; COX u. Holland 2001; OLLERO et al. 2008). Die bislang beschriebenen Affinitäten der Toxocara-Larven lassen vermuten, dass es sich bei Fällen der humanen Neurotoxokarose hauptsächlich um T. canis-induzierte Erkrankungen handelt (FISCHER 2003). Nichtsdestotrotz konnten Fälle von T. cati-induzierter Neurotoxokarose nachgewiesen werden, die von Symptomen wie geringgradigen spastischen Paraplegien, sensorischen Beeinträchtigungen und Harnretention begleitet wurden. Somit sollte diese Toxocara-Spezies als Zoonoseerreger nicht unterschätzt werden (FISCHER 2003, FUKAE et al. 2012). Die Maus wird als geeigneter Modellorganismus für die Charakterisierung der humanen T. canis-induzierten Neurotoxokarose angesehen, da die klinische Manifestation in der Maus vergleichbar mit der im Menschen ist. Bei T. canis-infizierten Mäusen wurden unter anderem Verhaltensänderungen, Gedächtnisverlust und beeinträchtigtes Lernverhalten beschrieben, was auch bei einem Teil der humanen Patienten beobachtet werden konnte (HILL et al. 1985; SKERRETT u. HOLLAND 1997; COX u. HOLLAND 2001a;
MOREIRA-SILVA et al. 2004; HAMILTON et al. 2006). Weiterhin geht die Toxocara- Infektion der Maus ähnlich wie beim Menschen mit Symptomen wie Koordinationsstörungen, Kyphosen, Mattigkeit, Paresen und Tremor einher. Diese klinischen Symptome wurden von pathologischen Veränderungen wie Demyelinisierungen, fokalen Malazien sowie Zellinfiltrationen begleitet, was auf eine destruktive Einwirkung der Toxocara-Larven auf das Gehirngewebe schließen lässt (EPE et al. 1994; KAYES 1997; COX u. HOLLAND 2001). Detaillierte Pathomechanismen der Neurotoxokarose wurden jedoch bislang nicht beschrieben.
Einleitung
Zielsetzung
Somatische Larvenmigration und pathohistologische Untersuchungen
Aufgrund des unterschiedlichen Migrationsverhaltens der Toxocara-Larven in verschiedenen Mausstämmen sowie der Auswirkung der Infektionsdosis auf den Verlauf der Infektion ist es wesentlich, das Migrationsverhaltens beider Toxocara- Arten unter gleichen Bedingungen vergleichend darzustellen. Der chronische Verlauf der T. cati-Infektion im Vergleich zu einer T. canis-Infektion mit Augenmerk auf das zentrale Nervensystem wurde bislang nur unzureichend charakterisiert. Aufgrund dessen sollte das Migrationsverhalten von T. canis- und T. cati-Larven in C57Bl/6J (B6)-Mäusen sowie von T. cati-Larven in Balb/c-Mäusen vergleichend betrachtet werden. Hierbei sollten besonders die Neuroaffinität sowie mögliche neuropathologische Schäden im Zuge der Larvenmigration beurteilt werden. Die zusätzliche Infektionsgruppe der Balb/c-Mäuse wurde gewählt, da in der Literatur viele Daten bezüglich T. canis-Infektionen von Balb/c-Mäusen zu finden sind, jedoch nur wenige Daten zu T. cati-Infektionen. Somit dient diese Infektionsgruppe der Vervollständigung vorhandener Daten, da zwischen den Mausstämmen verschiedene Suszeptibilitäten beschrieben sind. Die ansonsten verwendeten B6- Mäuse wurden gewählt, da die spätere Microarray-Genexpressionsanalyse auf dem Genom der B6-Mäuse basiert. Diese im Modell „Maus“ erhobenen Daten dienen der Extrapolation auf die humane Neurotoxokarose und als parasitologische sowie klinisch-pathologische Grundlage für die nachfolgenden molekularen Untersuchungen.
Microarray-Genexpressionsanalyse
Die der Pathogenese der Neurotoxokarose zugrunde liegenden Mechanismen sind bislang nur unzureichend geklärt. Des Weiteren ist die Ursache für die Affinität der T. canis-Larven zum ZNS im Gegensatz zu der Akkumulation der T. cati-Larven in der Muskulatur unklar, da beide Toxocara-Spezies ein ähnliches Migrationsverhalten bezüglich der Wanderwege im paratenischen Wirt sowie gemeinsame Antigenfraktionen aufweisen. Demnach ist es von Interesse, ob die Unterschiede im Migrationsverhalten auch Unterschiede in der Wirtsreaktion auf die Infektion des
Einleitung
Gehirns bedingen. Um diese Fragestellung auf molekularbiologischer Ebene zu bearbeiten, wurden Änderungen des Transkriptionsmusters in Gehirnen von T. canis- und T. cati-infizierten Mäusen anhand einer genomweiten Microarray-Analyse charakterisiert. Hierzu wurde Tag 42 pi ausgewählt, da zu diesem Zeitpunkt die Larvenzahlen in Gehirnen von T. canis- und T. cati-infizierten Mäusen ansteigen und bei T. cati-infizierten Mäusen erste histologische Veränderungen auftreten. Mit den erhobenen Microarray-Daten wurden Änderungen der Genregulation während der T. canis- und T. cati-induzierten Neurotoxokarose charakterisiert und kennzeichnende Wirtsreaktionen auf den jeweiligen Parasiten analysiert.
Unterschiede sowie Gemeinsamkeiten in biologischen sowie regulatorischen Prozessen während der jeweiligen Toxocara-Infektion im paratenischen Wirt dienen als wichtige Hinweise auf die zugrunde liegenden molekularen Pathogeneseprozesse und darüber hinaus als Grundlage für mögliche zukünftige therapeutische Ansätze.
Publikationen
Publikationen
1. Migrationsverhalten von Toxocara-Larven im paratenischen Wirtsmodell Maus
JANECEK, E., A.BEINEKE, T. SCHNIEDER u. C. STRUBE (2014):
Neurotoxocarosis: marked preference of Toxocara canis for the cerebrum and T. cati for the cerebellum in the paratenic model host mouse.
Parasit Vector 7, 194
doi: 10.1186/1756-3305-7-194.
2. Genregulation im Zuge der Neurotoxokarose
JANECEK,E.,E.WILK,K.SCHUGHART,R.GEFFERS u. C.STRUBE (2015):
Microarray gene expression analysis reveals major differences between Toxocara canis and Toxocara cati neurotoxocarosis and involvement of T. canis in lipid biosynthetic processes.
Int. J. Parasitol. 45, 495-503 doi: 10.1016/j.ijpara.2015.02.009.
Diskussion
Diskussion
Toxocara spp. sind weltweit vorkommende Zoonose-Erreger, deren dritte Larven im Menschen verschiedenste Verlaufsformen der Toxokarose verursachen können.
Eine dieser Verlaufsformen ist die sogenannte Neurotoxokarose, welche durch die Migration der Toxocara-Larven in das ZNS sowie deren Persistenz im neuronalen Gewebe ausgelöst wird. Die resultierende Schädigung des Gewebes kann mit verschiedenen Symptomen und zentralnervösen Störungen einhergehen. Bislang wurde gemutmaßt, dass die humane Neurotoxokarose hauptsächlich von T. canis- Larven verursacht wird, während das zoonotische Potential von T. cati nur unzureichend beurteilt wurde. In vorangegangenen Studien wurde T. canis-Larven eine ausgeprägte Affinität zum ZNS zugeschrieben, während T. cati-Larven primär in der Skelettmuskulatur gefunden wurden (BURREN 1972; GLICKMAN u. SUMMERS 1983;
ALBA-HURTADO et al. 2000; AKAO et al. 2003). Jedoch sind diese Daten aufgrund unterschiedlicher Empfänglichkeit des gewählten Modellorganismus und der gewählten Infektionsdosis nur bedingt vergleichbar (KAYES et al. 1985; EPE et al.
1994; HAVASIOVÁ-REITEROVÁ et al. 1995; COX u. HOLLAND 2001; GOOD et al. 2001;
OLLERO et al. 2008). Daher wurde in der vorliegenden Arbeit das Migrationsverhalten beider Toxocara-Spezies im direkten Vergleich untersucht. Hierbei wurde auf das neurotrope Migrationsverhalten und die durch die Larven entstehenden Gewebsschäden während der akuten und chronischen Phase des Krankheitsverlaufs fokussiert.
Larvenwanderung im paratenischen Wirt
Die primär an Tag 7 pi auftretenden hämorrhagischen Läsionen im Gehirn konnten sowohl auf makroskopischer als auch auf histopathologischer Ebene beobachtet werden. Die larvale Penetration der Arterien im Kortex scheint als mögliche Ursache für diese Läsionen in Betracht zu kommen, da diese mechanischen Schäden in Mikroläsionen der Arterien und nachfolgenden Blutungen resultieren könnten (BISSERU 1969). Vergleichbare Läsionen und anschließende Resorptionsvorgänge im Verlauf der Infektion wurden bereits von verschiedenen Autoren beschrieben (BISSERU 1969; OLSON u. PETTEWAY 1972; CARDILLO et al. 2009). In einer Studie von DUBEY (1968) werden diese Läsionen jedoch nicht angeführt. Auf histologischer
Diskussion
Ebene konnten Malazien sowie Cholesterinkristalle in den Gehirnen der T. canis- infizierten Mäusen nachgewiesen werden. Zusätzlich traten in den Gehirnen der T. canis- und T. cati-infizierten Tieren aktivierte Mikroglia, Gitterzellen sowie Sphäroide auf, wobei die Gitterzellen auf eine beginnende Demyelinisierung hinweisen könnten. Die Sphäroide gelten als Merkmale für axonale Schäden.
Während der akuten Phase der Infektion wurden in der vorliegenden Arbeit signifikante Unterschiede bezüglich der allgemeinen Larvenwanderung zwischen den Infektionsgruppen festgestellt. Die an Tag 2 pi erhobenen Daten demonstrieren eine verzögerte Migration der T. canis-Larven im Vergleich zu T. cati-Larven, da T. canis- Larven signifikant häufiger in der Leber nachgewiesen wurden als T. cati-Larven.
Letztere hingegen wurden signifikant häufiger in der Lunge nachgewiesen. Die Migrationsroute der Toxocara-Larven im paratenischen Wirt konnte basierend auf vorherigen Untersuchungen in zwei Phasen unterteilt werden, nämlich die hepato- pulmonale und die viszerale Phase. Während der hepato-pulmonalen Phase penetrieren die Larven nach dem Schlupf die Darmwand und wandern zur Leber.
Von dort aus gelangen sie über das Kreislaufsystem in die Lunge (ABO-SHEHADA u.
HERBERT 1984). Folglich lässt das an Tag 2 pi vermehrte Auftreten von T. canis- Larven in der Leber auf eine verzögerte Migration der T. canis-Larven schließen, da sich die T. cati-Larven bereits in der Lunge aufhalten. Dieses verzögerte Wanderverhalten von T. canis in Mäusen konnte bereits in einer vorangegangenen Studie gezeigt werden (PROKOPIC u. FIGALLOVÁ 1982), wohingegen Untersuchungen an Wüstenrennmäusen auf eine verzögerte Migration von T. cati-Larven hinwiesen (AKAO et al. 2003).
In der vorliegenden Studie wurde eine plötzliche Abnahme der Gesamtwiederfindungsraten von T. cati-Larven in Balb/c-Mäusen an Tag 14, 28 und 35 pi beobachtet. Des Weiteren konnte die Abnahme der T. cati-Wiederfindungsraten an Tag 28 und 35 pi in B6-Mäusen beobachtet werden. Auch in einer anderen Untersuchung ergab sich eine stark variierende Wiederfindungsrate von 25 % bis 65 %, jedoch umfasste der Untersuchungszeitraum lediglich Tag 1-28 pi (DUBEY
1968). Die chronische Phase der T. cati-Infektion war demnach nur unzureichend untersucht und ließ somit keinen Rückschluss auf einen eventuellen Wiederanstieg im späteren Infektionsverlauf zu.
Diskussion
Zunächst könnte spekuliert werden, dass die Larven durch eine entsprechende Immunantwort des Wirtes eliminiert werden, die Wiederfindungsraten stiegen jedoch ab Tag 42 pi nochmals an, was auf eine aktive Migration der Larven schließen lässt.
Eine Umverteilung der Larven im Körper des Wirtes findet vermutlich zwischen Tag 28 und 35 pi statt, da zu diesen Zeitpunkten die Larvenzahl in Leber und Lunge wieder ansteigt. Des Weiteren erhöht sich die Larvenanzahl im Gehirn ab Tag 42 pi erneut. Dennoch verbleiben die Migrationsroute sowie die Lokalisierung der Larven zwischen Tag 14 und 35 pi weiterhin unklar.
Die Gesamtwiederfindungsraten der T. cati-Larven betrugen insgesamt bis zu 16,0 %. Dies ist vergleichbar mit Wiederfindungsraten von 15,9 % bei Wüstenrennmäusen und deutlich höher als eine mit 2,0 % angegebene Wiederfindungsrate bei Ratten (ZIBAEI et al. 2010). Die höchste beschriebene Wiederfindungsrate betrug 65,7 % in T. cati-infizierten Mäusen, jedoch wurden diese mit 1000 infektiösen Eiern, also nur der Hälfte der in der vorliegenden Arbeit verwendeten Infektionsdosis infiziert. Auch wurden lediglich 2 Mäuse pro Zeitpunkt untersucht, was zu einer Verzerrung der Ergebnisse geführt haben könnte (CARDILLO
et al. 2009). Im Vergleich zu den Wiederfindungsraten von T. cati-Larven konnte mit 3,75 % nur eine sehr niedrige Wiederfindungsrate von T. canis-Larven erzielt werden. Dieses Ergebnis weicht wesentlich von bislang beschriebenen Wiederfindungsraten von bis zu 43,4 % in B6-Mäusen nach Infektion mit 1000 infektiösen T. canis-Larven ab (EPE et al. 1994; HAVASIOVÁ-REITEROVÁ et al. 1995).
Andererseits deuten Studien auf Mechanismen in B6-Mäusen hin, die den Eintritt von T. canis-Larven in den Kreislauf zu verhindern scheinen (DUNSMORE et al. 1983;
PARSONS u. GRIEVE 1990). Möglicherweise führte die höhere Infektionsdosis der vorliegenden Arbeit zu einer effizienteren Wirtsreaktion, somit zur Hemmung der Larvenmigration mit anschließender Eliminierung der Larven. Zusätzlich könnte vermutet werden, dass der Schlupf der Larven im Darm wenig effizient war und somit die aufgenommenen Eier mit den Fäzes ausgeschieden wurden (DUBEY 1968;
PROKOPIC u. FIGALLOVÁ 1982).
Trotz der niedrigen Gesamtwiederfindungsraten von T. canis-Larven konnte deren Affinität zum ZNS bestätigt werden. Obwohl an einigen Zeitpunkten der Infektion mehr als 50 % der Gesamtlarvenzahl in der Muskulatur nachgewiesen wurden, muss bedacht werden, dass die Muskelmasse im Vergleich zur Masse des Gehirns
Diskussion
wesentlich höher ist und trotzdem zu keinem Zeitpunkt signifikant höheren Larvenzahlen in der Muskulatur als im Gehirn nachgewiesen wurden. Im Gegensatz dazu wurden über den gesamten Infektionsverlauf signifikant mehr T. cati-Larven im Muskelgewebe als im Gehirn nachgewiesen. Als möglicher Grund für die unterschiedliche Lokalisierung der Toxocara-Spezies im Wirtskörper wird von verschiedenen Autoren die Größe der Larven spekuliert. Hierbei wird aufgeführt, dass T. cati-Larven kleiner als T. canis-Larven sind, weshalb letztere die Kapillaren des Gehirns obliterieren und somit im Gehirn verbleiben. (BISSERU 1969; BURREN
1971; DUNSMORE et al. 1983). Diese Argumentationsführung kann jedoch nur dann Gültigkeit haben, wenn das Kapillargeflecht im Gehirn feiner ist als das in der Muskulatur. Daher bleibt es fraglich, ob diese Größenhypothese die unterschiedliche Larvenverteilung von T. canis- und T. cati-Larven im Gehirn erklären kann. Im Gegensatz zu vorherigen Studien, in denen sehr wenige oder keine T. cati-Larven im Gehirn nachgewiesen werden konnten (DUBEY 1968; BURREN 1971; HAVASIOVÁ- REITEROVÁ et al. 1995), war es in der vorliegenden Arbeit möglich, die Persistenz von T. cati-Larven im Gehirn nachzuweisen. Während hierbei ein Anstieg ab Tag 42 pi vermerkt werden konnte, wurde in einer anderen Studie erst ab Tag 70 pi ein Anstieg der T. cati-Larven im Gehirn verzeichnet (ZIBAEI et al. 2010).
Bezüglich der rechten und der linken Hemisphäre konnten signifikante Unterschiede zwischen den T. canis- und T. cati-infizierten Gruppen ermittelt werden, jedoch nicht innerhalb dieser Infektionsgruppen. Auch die strukturellen Veränderungen im Gehirn scheinen gleichmäßig über beide Hemisphären verteilt zu sein.
Erstaunlicherweise wurden T. cati-Larven häufiger im Kleinhirn nachgewiesen, während T. canis-Larven häufiger im Großhirn zu finden waren. Vorherige Studien beschrieben eine vorrangige Lokalisierung beider Toxocara-Spezies im Kleinhirn (BISSERU 1969; BURREN 1971; BURREN 1972; AKAO et al. 2003). Möglicherweise könnte dies an den unterschiedlichen Modellorganismen, wie z.B. den in vorherigen Studien verwendeten Wüstenrennmäuse, Ratten und Hamstern liegen, da der gewählte Modellorganismus einen großen Einfluss auf die Larvenwanderung ausübt.
Die bezüglich der Migration erhobenen Daten entsprechen den histopathologischen Ergebnissen insofern, als dass die meisten strukturellen Unterschiede in Großhirnen von T. canis-infizierten Mäusen nachgewiesen wurden, während diese bei T. cati- infizierten Mäusen hauptsächlich im Kleinhirn auftraten. Da das Kleinhirn komplexe
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motorische Funktionen kontrolliert, könnte die Präsenz von T. cati-Larven mit klinischen Folgeerscheinungen wie z. B. zunehmender Immobilität und Aufenthalt des Wirtes in offenen Umgebungen assoziiert werden, was die Prädation von infizierten paratenischen Wirten für den Endwirt erleichtert. Diese klinischen Folgeerscheinungen könnten ebenfalls bei T. canis-infizierten paratenischen Wirten eine Rolle spielen (OLSON u. ROSE 1966; HOLLAND u. COX 2001; HAMILTON et al.
2006; CHIEFFI et al. 2010).
Die vorliegende Untersuchung ergab weiterhin den Nachweis von T. canis- und T. cati-Larven in den Augen und dem Rückenmark der Wirtstiere, während in vorherigen Studien in den Augen infizierter Mäuse lediglich T. canis-Larven nachgewiesen wurden (BURREN 1971; PROKOPIC u. FIGALLOVÁ 1982). Die geringe Anzahl an okulären Larven lässt auf eine mäßige Eignung der B6-Mäuse als Modellorganismen für das Krankheitsbild der OLM schließen. Jedoch können die OLM und mögliche resultierenden Symptome nach Infektion nicht gänzlich ausgeschlossen werden. Die Beteiligung des Rückenmarks wurde ebenfalls bei T. canis-infizierten Mäusen (BURREN 1971; OLSON u. PETTEWAY 1972) sowie Ratten, Wüstenrennmäusen und Hamstern beschrieben (BURREN 1972), jedoch liegen bislang keine Daten bezüglich der Parasitierung des Rückenmarks mit T. cati-Larven vor.
Trotz eines niedrigen prozentualen Anteils an T. cati-Larven im Gehirn konnten im Vergleich mit der T. canis-Infektion teils ähnliche absolute Larvenzahlen nachgewiesen werden. Demzufolge sollte das Risiko bezüglich einer T. cati- induzierten Neurotoxokarose nicht unterschätzt werden. So wurde an T. canis- infizierten Tieren gezeigt, dass die Schädigung des Gehirns nicht zwangsläufig mit der Larvenanzahl im Gehirn korreliert. Aus einer hohen Anzahl an Larven kann somit nicht auf den Schweregrad der Symptome geschlossen werden. Basierend auf diesen Beobachtungen wird angenommen, dass unerwünschte Immunreaktionen und nicht die migrierenden Larven für die Pathologie der Infektion verantwortlich sind (EPE et al. 1994). Auch werden indirekte Einwirkungen der Larven auf das umliegende Gewebe vermutet, da Läsionen hauptsächlich räumlich getrennt von den migrierenden Larven auftraten (AKAO et al. 2003). Somit könnten die niedrigen Wiederfindungsraten der T. cati-Larven augenscheinlich eine milde oder gar fehlende Schädigung im Gehirn implizieren, jedoch könnten die immunologischen Reaktionen
Diskussion
des Wirtes eine deutliche pathologische Reaktion hervorrufen. Diese Vermutung wird von den im zweiten Teil der Arbeit erhobenen Transkriptionsdaten unterstützt, welche im Kleinhirn T. cati-infizierter Mäuse eine deutliche Immunantwort des Wirtes zeigen.
Microarray-Genexpressionsanalyse
Da auf molekularer Ebene keine Daten zur Wirtsreaktion auf den jeweiligen Parasiten bzw. induzierte Pathomechanismen zur Verfügung stehen, wurde in der vorliegenden Arbeit eine Microarray-Analyse durchgeführt. Diese auf Transkriptebene generierten Daten dienen einerseits der Charakterisierung der jeweiligen individuellen Infektion sowie zur Charakterisierung der Unterschiede der T. canis- und T. cati-Infektion im Wirtsmodell Maus.
Übergreifend lässt sich sagen, dass die erhobenen Transkriptdaten mit denen der oben diskutierten Larvenverteilung korrelieren. Die Hauptkomponentenanalyse der biologischen Replikate sowie die Anzahl der differentiell transkribierten Gene (DTGs) zeigten die deutlichsten Unterschiede zwischen den T. canis-infizierten Tieren versus den Kontrolltieren, wobei insgesamt mehr DTGs in den Großhirnen als in den Kleinhirnen identifiziert wurden. Wesentlich geringere Unterschiede wurden zwischen T. cati-infizierten Gehirnregionen und denen der Kontrolltiere nachgewiesen, wobei in den Kleinhirnen eine höhere Anzahl an DTGs identifiziert werden konnte als in den Großhirnen. Diese Daten unterstreichen auf der Transkriptionsebene die Präferenz der T. cati-Larven zum Kleinhirn, während T. canis-Larven das Großhirn präferieren.
Die funktionelle Annotationsanalyse konnte die aufregulierten Gene in T. cati- infizierten Großhirnen keinen biologischen Modulen zuordnen, während die aufregulierten Gene in T. cati-infizierten Kleinhirnen sowie in T. canis-infizierten Groß- und Kleinhirnen hauptsächlich mit Immun- und Abwehrmechanismen assoziiert werden konnten. Dies lässt auf eine akute oder persistierende Reaktion des Wirtes auf die migrierenden Larven schließen. Die Funktionsanalyse der Gene in T. cati-infizierten Großhirnen resultierte ebenfalls in Genen, die hauptsächlich mit Immun- und Abwehrmechanismen involviert sind. Die generelle Immunantwort kann in T. cati-infizierten Gehirnen jedoch als schwächer als in T. canis- infizierten Gehirnen beurteilt werden, was auf die vor allem im Großhirn niedrigeren Larvenzahlen zurückzuführen sein könnte.
Diskussion
Auch bei den abregulierten Genen wurden Unterschiede zwischen den beiden Infektionsgruppen detektiert. Während die DTGs der T. cati-infizierten Großhirne hauptsächlich mit der GO-Kategorie „Entwicklung der Sinnesorgane“ assoziiert waren, wurden in T. canis-infizierten Groß- und Kleinhirnen erstaunlicherweise hauptsächlich solche Gene identifiziert, die der GO-Kategorie „Lipidbiosynthetische Prozesse“ zugeordnet werden konnten, wobei insbesondere die Cholesterinsynthese beeinflusst zu sein scheint. Ungefähr 70 % des Cholesterins im Gehirn werden dem Myelin zugeordnet, welches die Myelinscheiden um die neuronalen Axone formt, um die saltatorische Erregungsleitung zu gewährleisten. Des Weiteren ist Cholesterin ein Bestandteil der Plasmamembranen der Astrozyten und Neuronen. Insgesamt ist Cholesterin im Gehirn essentiell für verschiedenste neuronale Funktionen und Schwankungen in dessen Konzentration können unter anderem eine Neurodegeneration bedingen (BJÖRKHEM u. MEANEY 2004). Interessanterweise wurde in T. canis-infizierten Groß- und Kleinhirnen eine signifikante Aufregulierung von verschiedenen Biomarkern detektiert, die üblicherweise mit Gehirnverletzungen sowie neurodegenerativen Krankheiten wie der Alzheimer-Krankheit (AD) assoziiert werden. Unter anderem wurde die Aufregulierung des transformierenden Wachstumsfaktor ß1 (Tgfb1), des sauren Gliafaserprotein (Gfap) und von Gewebe- Transglutaminasen (tTgs) detektiert. Die Aufregulierung der genannten Gene im Verlauf einer T. canis-induzierten Neurotoxokarose wurde bereits auf Proteinebene anhand eines Immunblots gezeigt (LIAO et al. 2008). TGFB1 hingegen wurde in amyloiden Plaques in AD-Gehirnen nachgewiesen. Vermutlich steigert dieses Protein die extrazelluläre Matrixproduktion und spielt so eine Rolle in der Ablagerung des ß- Amyloid-Vorläuferproteins (APP) (WYSS-CORAY et al. 1997). Die Gewebe- Transglutaminasen hingegen werden mit der zellulären Pathogenese von AD assoziiert (LESORT et al. 2000), während GFAP mit der Aufregulierung von TGFB1 assoziiert ist (LAPING et al. 1994). In der vorliegenden Studie wurde die APP- Ablagerung in Axonen von T. canis-infizierten Mäusen an Tag 70 pi nachgewiesen (unveröffentlichte Daten), wobei die Aufregulierung der genannten Gene an Tag 42 pi die neuronale Schädigung initiieren könnte.
In einer vorangegangenen Studie wurde bereits die Demyelinisierung der Nervenfasern im Zuge der T. canis-induzierten Neurotoxokarose beschrieben (EPE et al. 1994). Möglicherweise führt die Abregulierung von essentiellen Genen, die in die
Diskussion
Cholesterinsynthese involviert sind, zur Demyelinisierung und anderen pathogenetischen Prozessen der Neurotoxokarose. Demnach könnten die beschriebenen neurologischen Symptome bei T. canis-infizierten Mäusen auf ein Ungleichgewicht der Cholesterinkonzentration zurückzuführen sein, da diese die Signalübertragung beeinflusst (BJÖRKHEM u. MEANEY 2004). Beispielsweise wiesen Mäuse mit einer konditionalen Mutation des Fdft1 (Farnesyldiphosphat- Farnesyltransferase-1)-Genes Störungen in der Myelinsynthese auf, was sich in neurologischen Symptomen wie Ataxien und beeinträchtigter Kontrolle über die Hintergliedmaßen äußerte (SAHER et al. 2005). Das exprimierte Enzym Fdft1 ist in den ersten spezifischen Schritt der Sterolbiosynthese involviert. In vivo ist die vollständige Inaktivierung während der Embryonalentwicklung letal (BRADFUTE et al.
1992; TOZAWA et al. 1999). Das oben beschriebene phänotypische Bild konnte auch in der vorliegenden Arbeit beobachtet werden, ebenso wurde eine Abregulierung von Fdft1 in den Kleinhirnen T. canis-infizierter Mäuse festgestellt, was den entsprechenden Phänotyp bedingt haben könnte.
Im vorliegenden Datensatz wurden auch weitere mit der Cholesterinsynthese assoziierte Gene als differentiell transkribiert identifiziert, was die Vermutung unterstützt, dass T. canis-Larven neurodegenerative Prozesse auslösen könnten.
Beispielhaft soll die Abregulierung von Dhcr24 als langfristige Reaktion auf oxidativen Stress genannt werden. Dieses Gen spielt ebenfalls eine wichtige Rolle in der Cholesterinsynthese und wird in AD-Patienten vermindert transkribiert (GREEVE
et al. 2000; KUEHNLE et al. 2008). Wie oben erwähnt, ist Cholesterin essentiell für verschiedene Gehirnfunktionen einschließlich Lernverhalten und Erinnerungsvermögen, wobei hier die komplexen Interaktionen der Cholesterinsynthese, -metabolismus sowie -ausscheidung eine wichtige Rolle spielen (ORTH u. BELLOSTA 2012). In vorangegangenen Studien wurde bereits der Einfluss von T. canis-Infektionen auf Lernverhalten und Erinnerungsvermögen in Nagetieren beschrieben (OLSON u. ROSE 1966; COX u. HOLLAND 2001a; HAMILTON et al. 2006; CHIEFFI et al. 2010). Hinsichtlich der vorliegenden Daten könnten diese kognitiven Störungen den dysfunktionalen Cholesterin-Signalwegen zuzuschreiben sein. Die signifikant gehäuften, aufregulierte Gene in T. canis- und T. cati-infizierten Kleinhirnen konnten weiterhin der GO-Kategorie „Verhalten und Taxis“ zugeordnet werden, wobei die ermittelten „Enrichment Score“-Werte bei T. cati-infizierten
Diskussion
Mäusen niedriger waren. Der Einfluss der T. cati-Larven auf Lernverhalten sowie Erinnerungsvermögen im paratenischen Wirt ist bislang nur unzureichend untersucht.
Kognitive Defizite sowie Demenz wurden jedoch bereits in humanen Toxocara- infizierten Patienten beschrieben (RICHARTZ u. BUCHKREMER 2002; FINSTERER u.
AUER 2007).
Die Aufregulierung verschiedener Apolipoproteine in den Groß- und Kleinhirnen T. canis-infizierter Mäuse unterstreicht nochmals die Bedeutung des lipidbiosynthetischen Signalwegs, da Apolipoproteine zum Transport und Metabolismus von Lipiden innerhalb des ZNS beitragen. Zudem wird eine mögliche Assoziation mit neurologischen und psychiatrischen Erkrankungen diskutiert (ELLIOTT et al. 2010; ORTH u. BELLOSTA 2012). Symptome der Neurotoxokarose könnten möglicherweise den Symptomen von neurologischen und psychiatrischen Erkrankungen ähneln, da vergleichbare Genregulierungen beobachtet werden können. Weiterhin konnte in einer Seroprävalenzstudie bei psychiatrischen Patienten gezeigt werden, dass diese signifikant häufiger mit Toxocara spp. infiziert waren als Patienten einer Kontrollgruppe. Diese Ergebnisse könnten auf eine mögliche Korrelation zwischen den psychiatrischen Erkrankungen und einer Toxocara- Infektion hindeuten (MOREIRA-SILVA et al. 2004; KAPLAN et al. 2008; ALVARADO- ESQUIVEL 2013). So konnte eine Aufregulierung von Apolipoprotein D (APOD) im dorsolateralen präfrontalen Kortex in Patienten mit Schizophrenie oder AD und in Nagern nach einer traumatischen Gehirnverletzung nachgewiesen werden (MORAIS
CABRAL et al. 1995; TERRISSE et al. 1998; FRANZ et al. 1999; THOMAS et al. 2001;
THOMAS et al. 2003). Bei T. cati-infizierten Mäusen hingegen konnte keine signifikante Häufung von Genen festgestellt werden, die mit der GO-Kategorie
„Cholesterinsynthese“ assoziiert waren. Dies hebt nochmals die qualitativen Unterschiede in der Wirtsreaktion gegenüber dem jeweiligen Parasiten hervor. Die abregulierten Gene bei T. cati-infizierten Mäusen wurden in biologische Module der GO-Kategorien „Entwicklung der Sinnesorgane“ in den Großhirnen und
„Transkription“ oder „Axonogenese“ in den Kleinhirnen zusammengefasst. Lediglich drei Gene konnten mit dem Überbegriff „Axonogenese“ assoziiert werden, nämlich Isl2, Myh10 und Hoxa1, wobei Myh10 eine Rolle im APP-Transport zugeschrieben wird. Die Aufregulierung von Myh10 in neuronalen Zellkulturen resultierte in Änderung der subzellulären Lokalisierung von APP, welches als Biomarker für AD
Diskussion
zählt (MASSONE et al. 2007). Demnach könnte ein ähnlicher, jedoch zeitverzögerter Verlauf wie bei der T. canis-Neurotoxokarose vorliegen. Des Weiteren ist der Prozess der Neurodegeneration bei der T. cati-induzierter Neurotoxokarose weniger offensichtlich, was in einer nur geringen Zahl an dysregulierten Genen resultiert.
Weitere in den Kleinhirnen der T. cati-infizierten Mäuse und den Großhirnen der T. canis-infizierten Mäuse differentiell transkribierten Gene konnten der GO- Kategorie „Sinneswahrnehmung“ zugeordnet werden. Diese Gene repräsentieren eine Vielzahl an Geruchsrezeptoren, während Rezeptoren anderer Sinneswahrnehmungen wie z.B. Geschmacksrezeptoren seltener differentiell reguliert waren. Für Toxoplasma gondii-infizierte Ratten konnte gezeigt werden, dass diese die Furcht vor Katzenurin verlieren und somit potentiell leichtere Beute für den Endwirt des Parasiten, nämlich Katzen, sind (BERDOY et al. 2000; WEBSTER et al.
2006). Die veränderte Geruchswahrnehmung der paratenischen Wirte wäre für Toxocara spp. von Vorteil, da diese dann vermutlich leichter vom Endwirt erjagt werden könnten und der Parasit so besser in der Lage wäre, seinen Lebenszyklus zu vollenden. Ob jedoch die veränderte Transkription der Geruchsrezeptoren, die sich je nach individuellem Gen als verstärkt oder vermindert darstellte, die Geruchswahrnehmung bei T. canis- und T. cati-infizierten Mäusen tatsächlich so beeinflusst, dass eine verstärkte Prädation durch die Endwirte resultiert, muss durch weiterführende Untersuchungen geklärt werden.
Die Unterschiede zwischen der T. canis- und T. cati-induzierten Neurotoxokarose werden einerseits durch die signifikante Genhäufung in den verschiedenen GO- Kategorien und andererseits durch den geringen Überschneidungsgrad der DTGs hervorgehoben. Die Schnittmenge der aufregulierten Gene in den Großhirnen sowie die der abregulierten Gene in den Kleinhirnen konnte keinen gemeinsamen funktionellen Gruppen zugeordnet werden. Dies ist der geringen Anzahl an gemeinsam regulierten Genen und unterschiedlichen Pathomechanismen zuzuschreiben. Ebenfalls dürfte die geringe Anzahl an aufregulierten DTGs in T. cati- infizierten Großhirnen eine Rolle spielen. Die Schnittmenge der abregulierten Gene in den Großhirnen beider Infektionsgruppen konnte in die GO-Kategorien
„Sinneswahrnehmung“ und „Regulierung der Transkription“ eingeordnet werden, während die aufregulierte Gene - wie auch schon in den individuellen Analysen -
Diskussion
hauptsächlich in „Immun- und Abwehrmechanismen“ sowie in „Sinneswahrnehmung“
und „Verhalten und Taxis“ kategorisiert werden konnten.
Fazit
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit erbrachten neue Erkenntnisse bezüglich der Verteilung der Toxocara-Larven im ZNS und zeigen die molekularen Auswirkungen der T. canis- sowie T. cati-induzierten Neurotoxokarose. Die Schnittmenge der DTGs zwischen den beiden Infektionsgruppen zeigte sich als gering, was auf eine unterschiedliche Pathogenese bzw. Wirtsreaktion schließen lässt. Diese Unterschiede können auf die geringere T. cati-Larvenzahl im Gehirn zurückzuführen sein oder auch auf eine höhere neuronale Pathogenität von T. canis. Jedoch zeigten sich auch in T. cati-infizierten Gehirnen pathohistologische sowie transkriptionelle Veränderungen. Daher sollte T. cati als ätiologisches Agens der humanen Neurotoxokarose nicht vernachlässigt werden. Auch wenn die vorliegende Arbeit ein erstes Fundament in der Charakterisierung der Neurotoxokarose darstellt, ist eine den gesamten Infektionsverlauf erfassende Genexpressionsanalyse ein wichtiger zukünftiger Schritt. Nur so kann der Prozess der Neuropathogenese während der akuten und der chronischen Phase verfolgt und somit genauere Pathomechanismen der jeweiligen Toxocara-Spezies charakterisiert werden. Gewonnene Erkenntnisse können ferner dazu dienen, neue Ansätze zur Therapie und Prophylaxe der Neurotoxokarose zu entwickeln.
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