Neurologisch bedingte Verhaltensänderungen und Muster zerebraler Entzündungsmediatoren im Laufe einer Toxocara spp.-induzierten Neuroinfektion

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Tierärztliche Hochschule Hannover

Institut für Parasitologie

Neurologisch bedingte Verhaltensänderungen und Muster zerebraler Entzündungsmediatoren im Laufe einer

Toxocara spp.-induzierten Neuroinfektion

THESE

Zur Erlangung des Grades eines

DOCTOR OF PHILOSOPHY (PhD)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

vorgelegt von Patrick Waindok

aus Hannover

Hannover 2019

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Supervisorin: Prof. Dr. med. vet. Christina Strube, PhD Betreuungsgruppe: Prof. Dr. med. vet. Christina Strube, PhD Apl. Prof. Dr. rer. nat. Dieter Steinhagen Prof. Dr. med. vet. Arwid Daugschies

1. Gutachten: Prof. Dr. med. vet. Christina Strube, PhD Institut für Parasitologie

Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

Apl. Prof. Dr. rer. nat. Dieter Steinhagen Abteilung Fischkrankheiten und Fischhaltung Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

Prof. Dr. med. vet. Arwid Daugschies Institut für Parasitologie

Veterinärmedizinische Fakultät der Universität Leipzig

2. Gutachten: Prof. Dr. Anja Joachim Institut für Parasitologie

Veterinärmedizinische Universität Wien

Datum der Disputation: 30.10.2019

Diese Arbeit wurde durch ein Promotionsstipendium der Karl-Enigk-Stiftung gefördert.

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In Liebe meinen Eltern gewidmet

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Teile dieser Arbeit wurden bereits auf folgenden Tagungen vorgestellt:

E. Janecek, P. Waindok, M. Bankstahl, W. Löscher, C. Strube (2015)

Assessment of neurobehavioral alterations in mice during Toxocara canis- and Toxocara cati- induced neurotoxocarosis

25^th International Conference of the World Association for the Advancement of Veterinary Parasitology, Liverpool, Großbritannien, 16.-20.08.2015

P. Waindok, E. Janecek, M. Bankstahl, W. Löscher, C. Strube (2016)

Assessment of neurobehavioral alterations in mice during Toxocara canis- and Toxocara cati- induced neurotoxocarosis.

Third N-RENNT Symposium on Neuroinfectiology, Hannover, 15.-16.02.2016

Impact of Toxocara-infections on mice - systematic assessment of health parameters and neurobehavioral alterations.

27th Annual Meeting of the German Society for Parasitology, Göttingen, 09.-12.03.2016

P. Waindok, E. Janecek, M. Bankstahl, W. Löscher, C. Strube (2016) Neurobehavioural alterations induced by Toxocara-brain infections.

Junior Scientist Zoonoses Meeting, Göttingen, 01.-03.06.2016

Neurologisch bedingte Verhaltensänderungen als Folge einer zerebralen Toxocara-Infektion.

Tagung der DVG-Fachgruppe ,,Parasitologie und parasitäre Krankheiten", Berlin, 02.-04.05.2016

P. Waindok, E. Janecek, K. M. Rund, N. H. Schebb, C. Strube (2017)

Profiling signalgebender zerebraler Oxylipine im Verlauf der Neurotoxokarose.

Tagung der DVG-Fachgruppe ,,Parasitologie und parasitäre Krankheiten", Hannover, 12.-14.06.2017

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Bioactive lipid mediator profiling of Toxocara canis- and T. cati-infected brains.

26th International Conference of the World Association for the Advancement of Veterinary Parasitology, Kuala Lumpur, Malaysia, 04.-08.09.2017

Multiplex profiling of inflammation-related mediators in Toxocara canis- and T. cati-infected brains.

28th Annual Meeting of the German Society for Parasitology, Berlin, 21.-24.03.2018

Zerebrale Zytokine im Laufe einer Toxocara spp.-induzierten Neuroinfektion.

Tagung der DVG-Fachgruppe ,,Parasitologie und parasitäre Krankheiten", Gießen, 02.-04.07.2018

A. Springer, P. Waindok, L. Heuer, E. Janecek-Erfurth, F. Lühder, A. Beineke, C. Strube (2019)

Neuroinflammation and neurodegeneration during Toxocara canis and T. cati-induced neurotoxocarosis in mice.

27th International Conference of the World Association for the Advancement of Veterinary Parasitology, Madison, USA, 07.-11.07.2019

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Inhaltsverzeichnis

Summary ... 1

Zusammenfassung ... 3

Einleitung ... 5

Lebenszyklus von Toxocara spp. und Umweltkontamination ... 5

Toxocara spp. im paratenischen Wirt ... 6

Mediatoren zur Regulation des inflammatorischen Geschehens ... 9

Zielsetzung ... 12

Publikationen ... 15

Neurologisch bedingte Verhaltensänderungen und vermindertes Erinnerungsvermögen als Folge einer zerebralen Toxocara-Infektion ... 15

Die Neuroinvasion von Toxocara canis- und Toxocara cati-Larven führt zu Veränderungen des zerebralen Zytokin- und Chemokinmusters ... 17

Profilierung immunregulatorischer Oxylipine im Verlauf der Toxocara canis- und der Toxocara cati-induzierten Neurotoxokarose ... 19

Übergreifende Diskussion ... 21

Neurologisch bedingte Verhaltensänderungen und vermindertes Erinnerungsvermögen als Folge einer zerebralen Toxocara-Infektion ... 21

Die Neuroinvasion von Toxocara canis- und Toxocara cati-Larven führt zu Veränderungen des zerebralen Zytokin- und Chemokinmusters ... 26

Profilierung immunregulatorischer Oxylipine im Verlauf der Toxocara canis- und der Toxocara cati-induzierten Neurotoxokarose ... 31

Verlauf der T. canis- und T. cati-induzierten NT ... 36

Fazit ... 39

Literaturverzeichnis ... 40

Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen ... 65

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Summary 1

Summary

Patrick Waindok (2019)

Neurobehavioural alterations and patterns of inflammation-related mediatorsinduced by Toxocara spp.-brain infections

The dog and cat roundworm, Toxocara canis and Toxocara cati, are worldwide distributed, frequently occurring intestinal parasites with high zoonotic potential. The so-called neurotoxocarosis (NT) is induced by larvae migrating and persisting in the central nervous system of paratenic hosts including humans and may be accompanied by severe neurological disorders and neuropsychological disturbances. The majority of studies concerning toxocarosis and NT have focused on T. canis as the causative agent, whereas data about T. cati-induced NT are scarce. Therefore, the presented work aimed to assess the impact of both T. canis and T. cati on neurobehaviour as well as the progression of neurological symptoms during the course of NT in mice as a model for paratenic hosts. To induce NT, C57BL/6J mice were orally infected with 2000 embryonated T. canis or T. cati eggs, respectively, while the control group received the vehicle only. Mice were screened weekly for general health as well as neurobehavioral symptoms. The systematic evaluation revealed an impact on general health by both T. canis and T. cati, but T. canis infection resulted in more severe neurobehavioural alterations such as ataxia, motoric impairments and cognitive dysfunctions in terms of memory impairments. In T. cati-infected mice, these parameters were only marginally affected, while reduced anxiety reaction and decreased response to assessed parameters on flight behaviour was observed.

A further topic of the work presented here was the paratenic host’s response to Toxocara.

Infections regarding immunoregulative molecules. Modulation of the host’s immune response by Toxocara larvae has been demonstrated, but detailed data on molecular pathogenic mechanisms and involvement of signalling molecules are lacking, particularly for brain infections with the parasite. Important molecules involved in the complex molecular signalling network in infection and inflammation are cytokines and chemokines as well as polyunsaturated fatty acid-derived bioactive regulatory lipids (e.g. oxylipins). To elucidate changes in brain patterns of these mediators, a comprehensive profiling in the mouse model was conducted at six different time points post infection (pi). Neuroinvasion of larvae apparently did not have a substantial effect on brain mediators in the acute phase of infection at day 7 pi. Concentrations of pro-inflammatory cytokines including TNF-α, IFN-γ, GM-CSF and IL-6, were only slightly altered in the subacute phase of infection in brains of T. canis- and T. cati-infected mice, but

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Summary 2

the chronic course of infection was characterised by a continuous decrease of these pro- inflammatory cytokines. Furthermore, only minor changes in the biosynthetic pathway of mostly pro-inflammatory prostaglandins (COX-pathway) were obvious. T. canis-induced NT resulted in increased levels of different prostaglandins in the cerebra at day 28 pi, while elevated concentrations of these mediators were only detected in cerebella of T. cati-infected mice at day 14 pi. In addition, an infection with T. canis led to a prominent increase of eotaxin and MIP-1α in both the cerebra and cerebella, while in T. cati-infected mice these chemokines were significantly elevated only in the cerebella. These results, together with the differentially regulated pro-inflammatory oxylipins in both brain areas, reflect the described species-specific tropism, with T. canis larvae preferring the cerebrum, while T. cati larvae are mainly located in the cerebellum.

Furthermore, T. canis-induced NT was characterized by significantly elevated levels of anti- inflammatory IL-4 and IL-5, as part of the TH2-polarised immune reaction, in the cerebra in the acute and subacute phase of the disease, whereas a comparable shift of anti-inflammatory cytokines in brains of T. cati-infected mice was missing. In contrast, different anti- inflammatory oxylipins, mostly derived by 12/15-LOX, were significantly increased in T. canis as well as T. cati-infected brains. This increase was predominantly observed in the subacute phase and at the beginning of the chronic phase of infection. Accordingly, the ratio of the 12/15- LOX-product 13-HODE to the non-enzymatically derived 9-HODE, was clearly shifted towards an anti-inflammatory, pro-resolution state. This was obvious by a significant increase of the 13-/9-HODE ratio, which represents a useful biomarker to indicate the immunological status of an active infection.

The findings of the presented work provide comprehensive insights into brain inflammatory reactions and immune responses during NT, contributing to further understanding of the largely unknown pathogenesis and mechanisms of host-parasite interactions during NT.

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Zusammenfassung 3

Zusammenfassung

Patrick Waindok (2019)

Neurologisch bedingte Verhaltensänderungen und Muster zerebraler Entzündungs- mediatoren im Laufe einer Toxocara spp.-induzierten Neuroinfektion

Die Spulwürmer des Hundes und der Katze, Toxocara canis und Toxocara cati, sind weltweit vorkommende intestinale Parasiten mit hohem zoonotischen Potential. Die Akkumulation persistierender Larven im zentralen Nervensystem paratenischer Wirte inklusive des Menschen kann zur Ausbildung der sogenannten Neurotoxokarose (NT) führen, welche neben verschiedenen neurologischen Symptomen auch psychische Störungen hervorrufen kann.

Während die T. canis-induzierte NT bereits mit einer Vielzahl verschiedener neurologischer Symptome und psychischen Störungen assoziiert wurde, liegen für eine Infektion mit T. cati keine vergleichbaren Informationen vor. Daher erfolgte im Rahmen der vorliegenden Arbeit eine systematische neurologische Evaluierung Toxocara-infizierter Mäuse, um das Auftreten und den Verlauf neurologischer Schädigungen und damit einhergehende Verhaltensänderungen detailliert zu charakterisieren und zwischen den beiden Pathogenen vergleichend zu analysieren. Hierfür wurden C57BL/6J Mäusen als paratenischem Wirtsmodell je 2000 infektiöse T. canis- oder T. cati-Eier oral appliziert, während die Kontrollgruppe nur das Vehikel erhielt. Die Evaluierung genereller Gesundheitsparameter und neurologisch bedingter Verhaltensänderungen erfolgte im wöchentlichen Abstand. In beiden Infektionsgruppen wurden neurologische Auffälligkeiten wie Ataxien oder Gleichgewichtsprobleme beobachtet.

Allerdings führte die Infektion mit T. canis vermehrt zu sensomotorischen Dysfunktionen, stereotypischem Verhalten und einer Verminderung der Gedächtnisleistung. Diese Parameter wurden von einer Infektion mit T. cati nur geringgradig beeinflusst, während verminderte Angstreaktionen sowie reduzierte Reaktionen auf Parameter des Fluchtverhaltens zu beobachten waren.

Ein weiterer Fokus dieser Arbeit war die paratenische Wirtsantwort auf eine Toxocara- Infektion hinsichtlich immunregulativer Mediatoren. Larven von Toxocara spp. sind in der Lage, die Immunantwort des paratenischen Wirtes zu modulieren, jedoch sind detaillierte Mechanismen sowie der Einfluss auf regulierende Signalmoleküle bislang, insbesondere für die ZNS-Infektion, weitgehend unbekannt. Regulatorische Lipide wie Oxylipine (z. B.

Eicosanoide) und Zytokine sowie Chemokine sind wichtige Signalmoleküle, die an der Koordination sowie Regulation des inflammatorischen Geschehens beteiligt sind. Um den

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Zusammenfassung 4

Einfluss der Infektion auf die Abundanz dieser Molekülgruppen zu analysieren, erfolgte wiederum im Mausmodell an sechs verschiedenen Zeitpunkten post infectionem (pi) ein qualitativer und quantitativer Nachweis verschiedener zerebraler Zytokine, Chemokine und Oxylipine. In der akuten Phase der Infektion scheint die Neuroinvasion der Larven noch keinen wesentlichen Einfluss auf das Muster verschiedener Mediatoren zu haben. In der subakuten Phase konnte ebenfalls kein prägnanter Einfluss auf den Gehalt pro-inflammatorischer Zytokine wie IL-6, TNF-α und INF-γ nachgewiesen werden, jedoch war die Konzentration dieser Zytokine ab Beginn der chronischen Phase signifikant supprimiert. Weiterhin konnten nur geringfügige Veränderungen im Biosyntheseweg vorrangig pro-inflammatorischer Prostaglandine (COX-Syntheseweg) festgestellt werden. Bei T. canis-infizierten Mäusen wiesen verschiedene Prostaglandine an Tag 28 in den Großhirnen und bei T. cati-infizierten Mäuse an Tag 14 pi in den Kleinhirnen signifikant höhere Konzentrationen auf. Darüber hinaus zeigten T. canis-infizierte Tiere im Laufe der Infektion in den Groß- und Kleinhirnen einen signifikanten Anstieg an MIP-1α und Eotaxin. Interessanterweise waren beide Analyte während der T. cati-Infektion nur in den Kleinhirnen signifikant erhöht. Sowohl dieser Unterschied als auch die differentielle Regulation pro-inflammatorischer Oxylipine in beiden Gehirnarealen zwischen den Infektionsgruppen spiegeln den artspezifischen Gewebstropismus von T. canis zum Großhirn und T. cati zum Kleinhirn paratenischer Wirte wider.

Der Infektionsverlauf der T. canis-induzierten NT zeichnete sich in der subakuten Phase und zu Beginn der chronischen Phase zudem durch einen signifikanten Anstieg der IL-4 und IL-5 Sekretion als Teil der TH2-polarisierten Immunantwort aus. Während die T. cati-induzierte NT zu keiner Beeinflussung dieser Zytokine führte, kam es in beiden Infektionsgruppen in der subakuten Phase und zu Beginn der chronischen Phase zu einer differentiellen Regulation anti- inflammatorischer Oxylipine, welche im Wesentlichen durch einen signifikanten Anstieg anti- inflammatorischer 12/15-LOX-basierter Metabolite charakterisiert war. Dies zeigt sich zudem in einem signifikanten Anstieg der Relation von 13-HODE zu 9-HODE, welche einen Biomarker für den Immunstatus einer Infektion darstellt und in beiden Infektionsgruppen zu Gunsten 13-HODE und damit einer anti-inflammatorischen Reaktion verschoben war.

Die in der vorliegenden Arbeit gewonnenen Erkenntnisse ermöglichen einen umfassenden Einblick in die Immunantwort im Verlauf der Neurotoxokarose und erweitern so das Verständnis dieser Zoonose hinsichtlich der komplexen Parasit-Wirt-Interaktion sowie der bislang weitgehend unbekannten Pathogenese.

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Einleitung 5

Einleitung

Lebenszyklus von Toxocara spp. und Umweltkontamination

Der Hundespulwurm Toxocara canis (Werner 1782) und der Katzenspulwurm T. cati (Schrank 1788) sind weltweit vorkommende, intestinale Helminthen, die Caniden bzw. Feliden als jeweilige Endwirte nutzen. Darüber hinaus können auch zahlreiche weitere Vertebraten inklusive des Menschen infektiöse Stadien von Toxocara spp. aufnehmen und als paratenische Wirte fungieren. In diesen persistiert das infektiöse Larvenstadium, kann sich jedoch nicht zum nächsten Stadium weiterentwickeln (BEAVER et al., 1952; BRUNASKA et al., 1995; FELLRATH

u. MAGNAVAL, 2014). Aufgrund ihrer globalen Verbreitung zählen Toxocara spp. zu den wichtigsten zoonotischen Parasiten (RUBINSKY-ELEFANT et al., 2010).

Im Dünndarm ihrer Endwirte lebend können adulte Weibchen bis zu 200.000 Eier pro Tag abgeben, welche mit den Fäzes in die Umwelt ausgeschieden werden (GLICKMAN u.SCHANTZ, 1981). Unter optimalen Umweltbedingungen entwickeln sich innerhalb von 3-6 Wochen infektiöse dritte Larven (L3), die in der Eihülle verbleiben und so geschützt lange Zeit überdauern können (GAMBOA, 2005; OVERGAAUW, 1997b; UGA u. KATAOKA, 1995). Die Infektion der Endwirte erfolgt durch die orale Aufnahme infektiöser Eier oder L3-haltigem rohen oder ungenügend gegartem Fleisch. Im Duodenum der Wirte schlüpfen die L3 und penetrieren die Darmwand, wodurch sie in die Blutzirkulation und über das Pfortaderblut in die Leber gelangen (WEBSTER, 1958). Die weitere Migration der Larven erfolgt über die Vena cava caudalis ins Herz und über die Arteria pulmonalis in die Lungen (WEBSTER, 1958). Während der trachealen Wanderung, welche hauptsächlich bei jungen Hunden und Katzen bis 3 Monaten erfolgt (DEPLAZES et al., 2013, S. 316), dringen die Toxocara-Larven in den Alveolarraum ein.

Über die Trachea gelangen die Larven zum Pharynx, werden anschließend abgeschluckt und erreichen so erneut den Darmtrakt, wo sie sich zu adulten Würmen entwickeln und somit den Lebenszyklus vervollständigen (SPRENT, 1956).

Im Gegensatz zur trachealen Wanderung können die Larven auch eine somatische Wanderung vollziehen, welche hauptsächlich bei älteren, immunkompetenten Endwirten auftritt. Dabei migrieren die Larven aus den Alveolen zurück in die Blutgefäße und werden über die Vena pulmonalis und das kardiovaskuläre System in verschiedene Organe transportiert, in welchen die L3 im hypobiotischen Zustand über mehrere Jahre persistieren können (SPRENT, 1956;

WEBSTER, 1958).

Neben der peroralen Infektion können Jungtiere zudem mittels vertikaler Übertragung von dem Muttertier mit Toxocara spp. infiziert werden. Bei Caniden kann die Trächtigkeit des

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Einleitung 6

Muttertieres zur Reaktivierung hypobiotischer L3 von T. canis führen, welche diaplazentar die Föten infizieren (ECKERT et al., 2004; WEBSTER, 1958). Zudem können die Larven in die Milchdrüsen säugender Hündinnen wandern und galaktogen auf die Welpen übertragen werden. Im Gegensatz dazu ist bei Feliden nur eine galaktogene Übertragung der Larven auf die Katzenwelpen beschrieben (SWERCZEK et al., 1971). Diese erfolgt allerdings nur dann, wenn sich die Kätzin kurz vor der Geburt oder zu Beginn der Laktation infiziert, da augenscheinlich nur somatisch migrierende L3 einer aktuellen Infektion übertragen werden (COATI et al., 2004).

Infizierte Hunde- und Katzenwelpen scheiden nach der Entwicklung der Larven zu geschlechtsreifen adulten Würmern meist große Mengen an Eiern aus und kontaminieren so die Umwelt. Zur Umweltkontamination tragen auch streunende Hunde und Katzen maßgeblich bei.

So waren in einer Studie aus Polen im Zeitraum 2011-2012 insgesamt 16,8 % der untersuchten streunenden Hunde mit T. canis und 27,9 % der streunenden Katzen mit T. cati infiziert (SZWABE u.BLASZKOWSKA, 2017). Die T. cati-Prävalenz bei streunenden Katzen in Lissabon, Portugal, betrug 38,3 % (WAAP et al., 2014), während streunende Hunde in Zentralitalien zu 20,6 % mit T. canis infiziert waren (DE LIBERATO et al., 2018). Aber auch als Haustiere gehaltene Hunde und Katzen sind an der Kontamination menschennaher Umgebungen involviert. In einer Studie an niederländischen Haushunden ergab die koproskopische Untersuchung eine T. canis-Prävalenz von 4,6 % (NIJSSE et al., 2015). Für Norddeutschland wiesen BECKER et al.(2012) eine Toxocara-Infektion bei 4,0 % der in Tierheimen abgegebenen Hunde und 27,1 % der aufgenommenen streunenden oder abgegebenen Katzen nach.

Die teilweise hohen Eiausscheidungsraten und die Tenazität der Toxocara-Eier führen zu einer nicht unerheblichen Kontamination von öffentlichen Plätzen. So wurden im Zeitraum von 2000 bis 2003 in 20,4 % der öffentlichen Parkanlagen in Prag, Tschechische Republik, Eier von Toxocara spp. gefunden (DUBNÁ et al., 2007), während 2014/2015 in Flandern, Belgien, 14,0 % der untersuchten Sandkästen auf Kinderspielplätzen mit Toxocara-Eiern kontaminiert waren (VANHEE et al., 2015). Die Kontaminationsrate für Sandkästen aus dem Stadtgebiet Hannover betrug bis zu 41,3 % und in bis zu 23,9 % der untersuchten Sandkästen wurden Eier mit bereits infektiösen Larven detektiert (KLEINE et al., 2017).

Toxocara spp. im paratenischen Wirt

Paratenische Wirte, auch Stapelwirte genannt, können infektiöse Stadien eines Parasiten aufnehmen, jedoch kann sich der Parasit im paratenischen Wirt weder zum nächsten Stadium weiterentwickeln noch vermehren. Im Fall von Toxocara spp. migrieren die Larven in

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Einleitung 7

somatische Gewebe und persistieren dort als infektiöse L3, bis sie vom Endwirt aufgenommen werden (MAGNAVAL et al., 2001; SPRENT, 1952; STRUBE et al., 2013). Beim paratenischen Wirt

„Mensch“ erfolgt die Aufnahme infektiöser Eier vor allem durch Kinder infolge noch inadäquater Hygiene oder Geophagie. Eine weitere Infektionsquelle stellen Lebensmittel dar, wenn z.B. kontaminiertes Gemüse nicht ausreichend gereinigt oder kontaminiertes Fleisch nur unzureichend gegart wurde (GLICKMAN u.SHOFER, 1987). Nach Aufnahme der infektiösen L3 durch den paratenischen Wirt penetrieren diese die Darmwand und erreichen, vergleichbar mit der somatischen Wanderung im Endwirt, über das kardiovaskuläre System im Laufe der ersten Woche die Leber und Lunge. Diese sogenannte hepato-pulmonale Phase spiegelt die akute Phase der humanen Toxokarose wider. Von der Lunge wandern die Larven stets wieder zurück in den Blutstrom und es folgt die sogenannte myotrope-neurotrope Phase, welche die subakute und chronische Phase der humanen Toxokarose repräsentiert.

Die globale Exposition des Menschen gegenüber Toxocara spp. wird durch die regional teils sehr hohen Seroprävalenzen deutlich. Da das feuchtwarme Klima tropischer Regionen optimale Bedingungen für die Entwicklung und das Überleben der infektiösen L3 im Ei bietet, resultiert ein hohes Infektionsrisiko und entsprechend sind Seroprävalenzen von bis zu 92,8 % beschrieben (FAN et al., 2004a;FAN et al., 2004b; MAGNAVAL et al., 1994; RUBINSKY-ELEFANT

et al., 2010). Zudem treten in diesen Regionen nicht selten sozioökonomische Nachteile auf, welche oftmals mit mangelnden Hygienemöglichkeiten und folglich einem höheren Infektionsrisiko verbunden sind (CHOMEL et al., 1993; MAGNAVAL et al., 1994). Aber auch in den USA wurden bei 13,9 % der getesteten Personen Antikörper gegen Toxocara spp.

nachgewiesen (JONES et al., 2008; WON et al., 2008). Diese hohe Prävalenz war einer der Gründe für die CDC (Centers for Disease Control and Prevention, USA), die Toxokarose als eine von fünf „neglected parasitic infections“ einzustufen, deren Bekämpfung im Zuge öffentlicher Gesundheitsmaßnahmen priorisiert wird (WOODHALL et al., 2014). In Europa variieren die Seroprävalenzen je nach klimatischer Region. So wurden beispielsweise in Spanien 28,6 % der getesteten Bevölkerung seropositiv für Toxocara spp. befundet (GONZALEZ-QUINTELA et al., 2006), während 16,0 % der untersuchten Bewohner der Region Attika in Griechenland Antikörper gegen Toxocara spp. aufwiesen (PAPAVASILOPOULOS et al., 2018). In einer landesweiten Studienkohorte in Österreich hingegen betrug die Seroprävalenz lediglich 6,3 % (POEPPL et al., 2013) und 4,2 % der Kinder im nordöstlichen Polen waren seropositiv für Toxocara spp. (KROTEN et al., 2016). Die Datenlage für Deutschland beschränkt

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Einleitung 8

sich auf den Großraum Stuttgart, in welchem KIMMIG et al.(1991) eine Seroprävalenz von 4,8 % in der gesunden Bevölkerung ermittelten. Jedoch wurde bei Risikogruppen wie beispielsweise Landwirten mit 22,6 % eine deutlich höhere Seroprävalenz nachgewiesen.

Die Migration der Larven im paratenischen Wirt kann durch die mechanische Penetration, aber auch durch die wirtseigene Immunantwort (z. B. eine starke Entzündungsreaktion) zu Schädigungen im Gewebe führen, welche im Krankheitsbild der Toxokarose resultieren können (JANECEK et al., 2014; OTHMAN et al., 2010). Basierend auf der Lokalisation der Larven im Körper und den auftretenden Symptomen wird die Toxokarose in vier verschiedene Formen unterteilt: die „verdeckte Toxokarose“, die viszerale Larva migrans (VLM), die okuläre Larva migrans (OLM) und die Neurotoxokarose (NT) (MAGNAVAL et al., 2001). Die „verdeckte Toxokarose“ ist durch milde und unspezifische Symptome wie Fieber, Anorexie, Lethargie und Pruritus gekennzeichnet (TAYLOR et al., 1987), weshalb die Krankheit oftmals nicht als solche diagnostiziert wird (MACPHERSON, 2013). Die Symptomatik der VLM wird unter anderem durch eine hypersensitive Reaktion des Immunsystems auf den Tod der Larven induziert, und umfasst Anorexie, Fieber, Hepatomegalie, Asthma, Diarrhoe, Leukozytose und Eosinophilie, zudem kann es in betroffenen Organen beispielsweise zu eosinophilen Abszessen und granulomatösen Läsion kommen (BEAVER et al., 1952; FILLAUX u.MAGNAVAL, 2013). Darüber hinaus können Parasiten-induzierte Pneumonien, Bronchitiden und respiratorische Symptome wie Husten und Asthma hervorgerufen werden (DESPOMMIER, 2003; KAYES, 1997; MAGNAVAL

et al., 2001).

Bei der OLM erfolgt eine Einwanderung der Larven in die Choroidea bzw. Retina. Dies kann zum Beispiel in granulomatösen Entzündungsreaktionen oder Distorsionen der Retina sowie Heterophorie oder einer Ablösung der Macula resultieren (FAN et al., 2013; GILLESPIE et al., 1993; WOODHALL et al., 2012). Des Weiteren können Patienten mit OLM Sehstörungen, Strabismus und Leukokorie-Symptome entwickeln, die mit Sekundärglaukomen und Sehverlust einhergehen können (BROWN, 1970; GILLESPIE et al., 1993).

Das Krankheitsbild der Neurotoxokarose (NT) wird durch Migration und Persistenz der T. canis und T. cati-Larven im zentralen Nervensystem (ZNS) paratenischer Wirte induziert und geht mit teils schweren neurologischen Symptomen einher. Bis dato wurden jedoch nur wenige Fallberichte zur NT publiziert. Die Unterrepräsentation beruht vermeintlich auf den begrenzten diagnostischen Möglichkeiten und den teils unspezifischen Symptomen bei idiopathischen ZNS-Störungen, wodurch die NT oftmals nicht als Differentialdiagnose in

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Einleitung 9

Betracht gezogen wird (FINSTERER u. AUER, 2007). Betroffene Patienten leiden an Kopfschmerzen, Fieber, Photophobie, Schwäche, Konfusionen und Müdigkeit. Klinisch manifestiert sich die NT oftmals als Meningitis, Enzephalitis, Myelitis, zerebrale Vaskulitis oder optische Neuritis (EBERHARDT et al., 2005; MOREIRA-SILVA et al., 2004). Zudem wird die NT kontrovers als eine mögliche Ursache für Epilepsie und neurodegenerative bzw.

psychologische Erkrankungen diskutiert (RICHARTZ u.BUCHKREMER, 2002). Weiterhin sind mit der NT kognitive Dysfunktion sowie Lernschwierigkeiten und Verhaltensänderungen assoziiert (COX u.HOLLAND, 2001b; FAN et al., 2015; FINSTERER u.AUER, 2007; HAMILTON et al., 2006; MARMOR et al., 1987; TAYLOR et al., 1987), welche bei Kindern zu geringeren Schulleistungen führen können (JAROSZ et al., 2010; WALSH u.HASEEB, 2012).

Während die Lokalisation der Larven im menschlichen Gehirn noch nicht geklärt ist, konnte für die Maus als Modellorganismus ein artspezifischer Tropismus festgestellt werden. Larven von T. canis zeigen eine insgesamt stärkere Affinität zu neuronalem Gewebe, insbesondere dem Großhirn, während T. cati-Larven vorwiegend im Kleinhirn, bevorzugt jedoch in der Muskulatur persistieren (JANECEK et al., 2014). In den meisten humanen Fällen wird von einer T. canis-induzierten NT ausgegangen. Jedoch sind auch Fallberichte verfügbar, in welchen Larven von T. cati als ätiologisches Agens nachgewiesen wurden, weshalb T. cati als Zoonoseerreger nicht unterschätz werden sollte (FISHER, 2003; FUKAE et al., 2012; SMITH et al., 2009).

Mediatoren zur Regulation des inflammatorischen Geschehens

Die Persistenz von Toxocara spp. im Gewebe paratenischer Wirte zeigt, dass die Larven einer Immunelimination entgehen können, jedoch sind die genauen Mechanismen der Parasit-Wirt- Interaktion in neuronalem Gewebe noch weitestgehend ungeklärt. Die Immunantwort ist ein komplexes Zusammenspiel verschiedener Zelltypen, welches durch diverse immunmodulatorische Mediatoren koordiniert wird. Wichtige immunmodulatorische Moleküle, die sowohl in inflammatorische Prozesse als auch die Koordination der Immunantwort während Infektionen involviert sind, sind unter anderem Zytokine, Chemokine sowie regulatorische Lipide (DENNIS u. NORRIS, 2015; TAKESHITA u. RANSOHOFF, 2012;

VILČEK, 2003; YANG et al., 2011). Die kontinuierliche Expression zytokinkodierender Gene im homöostatischen Gehirngewebe deutet darauf hin, dass diese Mediatoren unter anderem an der allgemeinen Gehirnentwicklung, der Modulation der Neuronen und der synaptischen Übertragung beteiligt sind (TAKESHITA u.RANSOHOFF, 2012). Im Zuge eines Schädel-Hirn-

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Einleitung 10

Traumas oder einer Infektion sezernieren immunkompetente Zellen wie Neuronen, Mikroglia, Astrozyten oder Oligodendrozyten unterschiedliche Zytokine und Chemokine mit pleiotropen immunmodulatorischen Effekten (LUCAS et al., 2006). So fördert eine erhöhte Sekretion von pro-inflammatorischen Zytokinen wie Interleukin-1 (IL-1), IL-6, Interferon-gamma (IFN-γ) oder des Tumornekrosefaktors-alpha (TNF-α) sowohl die Abwehr gegen invasive Pathogene als auch die Phagozytose von Zelldebris (BECHER et al., 2017; LUCAS et al., 2006). Eine überbordende Entzündungsreaktion kann jedoch zu erheblichen neuronalen Schäden bis hin zu neurodegenerativen Prozessen führen (BECHER et al., 2017; LUCAS et al., 2006). Im Gegensatz dazu regulieren anti-inflammatorische Zytokine wie beispielsweise IL-4, IL-5 und IL-10 auftretende inflammatorische Prozesse, in dem sie unter anderem die Produktion von IL-6, TNF-α oder IFN-γ reprimieren oder die alternative Aktivierung von M2-Makrophagen initiieren (BECHER et al., 2017; SUBRAMANIAM u.FEDEROFF, 2017). Somit ist das Ergebnis der zerebralen Entzündung abhängig vom komplexen Zusammenspiel pro- und anti- inflammatorischer Zyto- und Chemokine.

Auch wenn sich in den letzten Dekaden verschiedene Methoden der Genomik, Transkriptomik und Proteomik als Standardtechniken in der Infektionsforschung etabliert haben, wurde das Gebiet der Lipidomik, welche die Lipide in einer Zelle oder eines Organismus berücksichtigt und dabei deren Metabolismus und Funktion inkludiert, bislang weitgehend vernachlässigt (WATSON, 2006). Neben den Zyto- und Chemokinen stellen regulatorische Lipide, wie z. B.

Oyxlipine, wichtige endogene Botenstoffe zur Regulation des inflammatorischen Geschehens dar. Die Klasse der regulatorischen Lipide umfasst eine Vielzahl an Metaboliten verschiedener mehrfach ungesättigter Fettsäuren (polyunsaturated fatty acids, PUFAs) wie die ω-6-PUFAs Arachidonsäure (ARA), Dihomo-γ-linolensäure (DGLA) oder Linolsäure (LA) sowie die ω-3- PUFAs α-Linolensäure (ALA), Eicosapentaensäure (EPA) und Docosahexaensäure (DHA) (PFISTER et al., 2010; YANG et al., 2011). Diese werden hauptsächlich durch drei verschiedene Stoffwechselwege enzymatisch zu regulatorischen Lipiden oxigeniert. Aus ARA und EPA werden durch Cyclooxygenasen (COX-1 und COX-2) Prostanoide wie Prostaglandine, Prostazykline und Thromboxane synthetisiert. Verschiedene Lipoxygenasen (5-LOX, 8-LOX, 12-LOX und 15-LOX) generieren Leukotriene und zudem aus ARA verschiedene Hydroxyeicosanoide (HETEs). Die Superfamilie der Cytochrome P450 (CYP 450) katalysiert die Epoxidierung von ARA zu Epoxyeicosanoiden (EpETrEs), welche wiederum durch Epoxidhydrolasen (soluble epoxide hydrolases; sEHs) zu korrespondierenden Dihydroxy-

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Einleitung 11

Derivaten (DiHETrEs) umgesetzt werden. Zudem sind CYP 450-Enzyme an der Bildung von speziellen HETEs mittels ω-Hydroxylierung der PUFAs beteiligt (MIYATA u.ROMAN, 2005;

ROMAN et al., 2000). Im Gehirn sind Oxylipine in eine Vielzahl verschiedener physiologischer Prozesse eingebunden, wie zum Beispiel der Aufrechterhaltung neuronaler Funktionen und der zerebralen Homöostase, aber auch in das Lern- und Gedächtnisvermögen (O’BANION u.

OLSCHOWKA, 1999; SCHAAD et al., 1991; TASSONI et al., 2008). Zudem wurde bei neuronalen Traumata und neurodegenerativen Erkrankungen ein signifikanter Anstieg diverser regulatorischer Lipide, vor allem COX-basierte Prostanoide, festgestellt. Weiterhin sind 5-LOX-basierte Leukotriene unter anderem in Entzündungsreaktionen sowie Fieber, erhöhtem Schmerzempfinden, oxidativem Stress oder neuronalen Degenerationen involviert (FAROOQUI, 2011, S. 12). Im Gegensatz dazu werden 12-LOX- und 15-LOX-generierten Metaboliten anti- inflammatorische Eigenschaften zugeschrieben. So sind 12- und 15-HETE sowohl an der Modulation der Transkriptionsrate entzündungsspezifischer Gene als auch der Regulation der Zytokinsekretion oder der Ko-Aktivierung von Peroxisom-Proliferator-aktivierten Rezeptoren (PPAR) beteiligt (KRÖNKE et al., 2009; KÜHN u.O’DONNELL, 2006). EPA-basierte Eicosanoide und DHA-basierte Docosanoide weisen in der Regel anti-inflammatorische und neuroprotektive Eigenschaften auf (ARIEL et al., 2005; LUKIW et al., 2005). Beispiele hierfür bilden die sogenannten „specialized pro-resolving mediators (SPMs)“ wie Lipoxine, Resolvine und Protektine (SERHAN et al., 2008; SERHAN et al., 2006; SERHAN u.PETASIS, 2011). SPMs fördern unter anderem aktiv die Beendigung der Entzündungsreaktion durch die Inhibierung der Infiltration neutrophiler Granulozyten an den Entzündungsherd, Vermittlung der Phagozytose apoptotischer neutrophiler Granulozyten und Beteiligung an der Regulation der Leukozytenmigration (GRONERT et al., 1998; PATCHA et al., 2004; SERHAN et al., 2008; SERHAN

u.PETASIS, 2011).

Bezüglich der Neurotoxokarose ist bislang unklar, ob Toxocara-Larven die Homöostase dieser Molekülgruppen beeinflussen und somit die Immunreaktion des Wirtes supprimieren. Im Gegensatz zu den Oxylipinen liegen für Zytokine bezüglich deren Funktion und Beteiligung im Infektionsgeschehen bereits einige Daten vor. Studien beschreiben im Gehirn eine erhöhte Transkriptionsrate der Zytokine IL-5, IL-10, IFN-γ und TGF-βI als Folge einer T. canis- Infektion (HAMILTON et al., 2008; LIAO et al., 2008). Umfangreichere Studien unter Einbeziehung einer größeren Anzahl an Zytokinen sind jedoch bislang nicht verfügbar. Zudem liegen keine Daten über qualitative und quantitative Veränderungen des zerebralen Zytokinmusters bei einer T. cati-Infektion vor.

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Einleitung 12

Eine umfassende Analyse verschiedener Klassen an Mediatoren ist für eine weiterführende Darstellung der noch weitestgehend unbekannten Pathogenese der Neurotoxokarose sowie zugrundeliegende Mechanismen der Parasit-Wirt-Interaktion unerlässlich. So können parallel sezernierte Signalmoleküle sowohl synergistisch als auch antagonistisch interagieren.

Vorangegangene Studien weisen darauf hin, dass sowohl das Zytokin IL-5 als auch das Chemokin Eotaxin für die Akkumulation eosinophiler Granulozyten im Gewebe notwendig sind. Vermutlich wirkt Eotaxin lokal chemotaktisch, während IL-5 die Proliferation und Differenzierung eosinophiler Granulozyten stimuliert (COLLINS et al., 1995; MOULD et al., 1997). Die enge Interaktion und Assoziation von regulatorischen Lipiden und Zytokinen veranschaulicht das Beispiel PGE2, dessen in vivo Applikation die Regulation von TNF-α und IL-10 in murinen peritonealen Makrophagen moduliert (SHINOMIYA et al., 2001).

Zielsetzung

Evaluation der neurologischen Symptomatik im Verlauf der Neurotoxokarose

Die zerebrale Infektion mit Toxocara spp. wird mit diversen neurologischen Symptomen sowie psychischen Störungen assoziiert (DUPREZ et al., 1996; EPE et al., 1994; FAN et al., 2015;

GOFFETTE et al., 2000; HAMILTON et al., 2006). Der Großteil dieser Daten bezieht sich dabei entweder auf Beobachtungen während der humanen NT oder auf spezifische Verhaltenstest bei T. canis-infizierten Nagetieren. In diesem Kontext implizieren einige Studien, dass eine Toxocara-Infektion zu Beeinträchtigungen der Lern- und Gedächtnisleistung führt (COX u.

HOLLAND, 1998, 2001b). Jedoch lagen die Schwerpunkte der genannten Studien auf einer Infektion mit T. canis und unterschiedlichen Infektionsdosen. Vergleichende Studien über das das Auftreten bzw. den Verlauf neurologischer Schädigungen und damit einhergehende Verhaltensänderungen oder Änderungen in der Lern- und Gedächtnisleistung bei sowohl T. canis- als auch T. cati-infizierten Mäusen über den gesamten Infektionsverlauf wurden bislang nicht durchgeführt. Daher besteht ein Ziel dieser Arbeit in der systematischen Evaluierung neurologischer Parameter bei T. canis- und T. cati-infizierten Mäuse mittels eines modifizierten Irwin-Tests (IRWIN, 1968). Dieser Test umfasst eine Reihe von Beobachtungsparametern und Manipulationen, um das Auftreten neurologischer und motorischer Störungen sowie assoziierte Verhaltensänderungen bei Mäusen zu detektieren. Die Evaluation möglicher Änderungen in der Gedächtnisleistung infizierter Mäuse soll durch einen Labyrinth-Versuch erfolgen, in welchem die Mäuse einen im Vorfeld erlernten Weg rekonstruieren müssen.

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Einleitung 13

Zerebrale Zytokin- und Chemokinmuster im Verlauf der Neurotoxokarose

Zyto- und Chemokine zählen zu den immunmodulatorischen Mediatoren und koordinieren das dynamische und komplexe Zusammenspiel verschiedener Zelltypen des angeborenen Immunsystems (z. B. Makrophagen, polymorphkernige Granulozyten und dendritische Zellen) sowie die des adaptiven Immunsystems, welches unter anderem B- und T-Zellen ausbildet. Da bislang eine umfassende Studie unter Einbeziehung einer größeren Anzahl an Zyto- bzw.

Chemokinen weder für eine Infektion mit T. canis noch mit T. cati verfügbar ist, soll das Muster verschiedener Zyto- und Chemokine im Verlauf einer T. canis- bzw. T. cati-induzierten NT im Wirtsmodell „Maus“ im Vergleich zu einer nicht infizierten Kontrollgruppe analysiert werden.

Vorangegangene Studien zum Migrationsverhalten und begleitende histopathologische Analysen zeigen einen progressiven Verlauf der Neurotoxokarose (HEUER et al., 2015;

JANECEK et al., 2014; JANECEK et al., 2015, SPRINGER et al., 2019). Um die verschiedenen Phasen der Toxocara-Infektion möglichst umfassend abzudecken, soll das Zyto- und Chemokinprofil an den Tagen 7, 14, 28, 42, 70 und 98 post infectionem (pi) erfasst werden. Die Charakterisierung des Zyto- und Chemokinmusters trägt zu einer umfassenderen Darstellung der Pathogenese der Neurotoxokarose bei, hebt Unterschiede zwischen der T. canis- sowie T. cati-induzierten Erkrankung hervor, und stellt die Beeinflussung der Zyto- und Chemokin- vermittelten Immunabwehr durch Toxocara spp. dar.

Zerebrale Oxylipinmuster im Verlauf der Neurotoxokarose

Wie Zyto- und Chemokine weisen auch regulatorische Lipide immunmodulatorische Eigenschaften auf, jedoch liegen über Veränderungen in der Abundanz zerebraler Oxylipine im Zuge einer Toxocara-Infektion bislang keinerlei Daten vor. Daher bildet die umfassende Analyse regulatorischer Lipide ein weiteres Ziel dieser Arbeit. Um ein komplexes Bild über Änderungen verschiedener immunmodulatorischer Mediatoren im Laufe der NT zu erhalten, sollen die Daten aus demselben Infektionsverlauf wie die der Analyse des zerebralen Zyto- und Chemokinmusters stammen. Die Zusammenführung der Zyto- und Chemokin- sowie Oxylipinmuster vor dem Hintergrund eines gemeinsamen Regulationskomplexes während der Gehirninfektion mit Toxocara spp. dienen der weiterführenden Darstellung der noch weitgehend unbekannten Pathogenese der Neurotoxokarose sowie zugrundeliegenden Mechanismen der Parasit-Wirt-Interaktion. Deren konsekutive Aufklärung bildet die Grundlage für die Entwicklung verbesserter Diagnostikmethoden und die Identifizierung neuer Ansatzpunkte für spezifische Therapeutik

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Publikationen 15

Publikationen

Neurologisch bedingte Verhaltensänderungen und vermindertes Erinnerungsvermögen als Folge einer zerebralen Toxocara-Infektion

Elisabeth Janecek^1*, Patrick Waindok^1*, Marion Bankstahl^2,3, Christina Strube¹ (2017):

Abnormal neurobehaviour and impaired memory function as a consequence of Toxocara canis- as well as Toxocara cati-induced neurotoxocarosis

PLOS Neglected Tropical Diseases 11, e0005594 DOI 10.1371/journal.pntd.0005594

1Institut für Parasitologie, Zentrum für Infektionsmedizin, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

2Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

3Zentrum für Systemische Neurowissenschaften. Hannover

*die beiden Autoren haben gleichermaßen zu der Arbeit beigetragen

Abstract

Background: Neuroinvasive larvae of the worldwide occurring zoonotic roundworms Toxocara canis and T. cati may induce neurotoxocarosis (NT) in humans, provoking a variety of symptoms including cognitive deficits as well as neurological dysfunctions. An association with neuropsychological disorders has been discussed. Similar symptoms have been described in T. canis-infected mice, whereas data on T. cati-induced NT are rare. Therefore, it was aimed to obtain insights into the impact on neurobehaviour as well as progression of neurological symptoms and behavioural alterations during the course of NT directly comparing T. canis- and T. cati-infected mice as models for human NT.

Methodology/Principal findings: C57BL/6 mice were orally infected with 2000 embryonated T. canis or T. cati eggs, respectively, the control group received tap water. Mice were screened weekly for neurobehavioural alterations and memory function starting one day prior infection until 97 days post infection (pi; T. canis-infection) and day 118 pi (T. cati-infection, uninfected control). Mostly motoric and neurological parameters were affected in T. canis-infected mice starting day 20 pi with severe progression accompanied by stereotypical circling. In contrast, T. cati-infected mice mostly showed reduced response to sudden sound stimulus (indicator for excitability) and flight behaviour starting day 6 pi. Interestingly, enhanced grooming behaviour

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Publikationen 16

was observed exclusively in T. cati-infected mice, indicating a possible role of neurotransmitter dysregulation. Reduced exploratory behaviour and memory impairment was observed in both infection groups with delayed onset and less severe progression in T. cati-compared to T. canis- infected mice.

Conclusions/Significance: Results highlight the need to consider T. cati beside T. canis as causative agent of human NT. Findings provide valuable hints towards differences in key regulatory mechanisms during T. canis- and T. cati-induced NT, contributing to a comprehensive picture and consequently a broader understanding of NT, which will aid in developing strategies towards prevention in addition to novel diagnostic and therapeutic approaches.

Erklärung über den eigenen Anteil an der Publikation:

Konzept, Versuchsplanung: Christina Strube

Experimentelle Durchführung: Patrick Waindok, Elisabeth Janecek

Diskussion, Beratung: Patrick Waindok, Elisabeth Janecek, Marion Bankstahl, Christina Strube Manuskript, Korrespondenz: Elisabeth Janecek, Patrick Waindok, Christina Strube

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Publikationen 17

Die Neuroinvasion von Toxocara canis- und Toxocara cati-Larven führt zu Veränderungen des zerebralen Zytokin- und Chemokinmusters

Patrick Waindok¹, Christina Strube¹(2019):

Neuroinvasion of Toxocara canis- and T. cati-larvae mediates dynamic changes in brain cytokine and chemokine profile

Journal of Neuroinflammation 16, 147-159 DOI 10.1186/s12974-019-1537-x

1Institutfür Parasitologie, Zentrum für Infektionsmedizin, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

Abstract

Background: Neurotoxocarosis (NT) is induced by larvae of the dog or cat roundworm (Toxocara canis or T. cati) migrating and persisting in the central nervous system of paratenic hosts, including humans, and may be accompanied by severe neurological symptoms. Host- or parasite-induced immunoregulatory processes contribute to the pathogenesis, but detailed data on pathogenic mechanisms and involvement of signalling molecules during cerebral Toxocara spp.-infections are scarce.

Methods: To elucidate alterations in immunomodulatory mediator pattern, a comprehensive multiplex bead array assays profiling comprising 23 different cytokines and chemokines was performed during the course of T. canis- and T. cati-induced NT. To this end, cerebra and cerebella of experimentally infected C57BL/6J mice serving as paratenic host models were analysed at six different time points (days 7, 14, 28, 42, 70 and 98) post infectionem (pi).

Results: Brain-body mass ratios of T. canis and T. cati-infected mice were significantly lower than those of the uninfected control group at day 14 pi, and also at day 28 pi for T. canis-infected mice. Both infection groups showed a continuous decrease of pro-inflammatory cytokine concentrations, including TNF-α, IFN-γ, GM-CSF and IL-6, in the cerebrum over the course of infection. Additionally, T. canis but not T. cati-induced neurotoxocarosis was characterised by significantly elevated levels of anti-inflammatory IL-4 and IL-5 in the cerebrum in the acute and subacute phase of the disease. The higher neuroaffinity of T. canis led to a prominent increase of eotaxin and MIP-1α in both the cerebrum and cerebellum, while in T. cati-infected mice these chemokines were significantly elevated only in the cerebellum.

Conclusions: The direct comparison of T. canis- and T. cati-induced NT provides valuable insights into key regulatory mechanisms of Toxocara species in paratenic hosts. The cerebral

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Publikationen 18

cyto-/chemokine milieu is shifted to a predominantly anti-inflammatory immune response during NT, possibly enabling both survival of the parasite and the neuroinfected paratenic host.

Alteration of eotaxin and MIP-1α concentrations are congruent with the higher neuroaffinity of T. canis and species-specific tropism of T. canis to the cerebrum and T. cati to the cerebellum.

Konzept, Versuchsplanung: Christina Strube, Patrick Waindok Experimentelle Durchführung: Patrick Waindok

Diskussion, Beratung: Patrick Waindok, Christina Strube Manuskript, Korrespondenz: Patrick Waindok, Christina Strube

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Publikationen 19

Profilierung immunregulatorischer Oxylipine im Verlauf der Toxocara canis- und der Toxocara cati-induzierten Neurotoxokarose

Patrick Waindok¹, Elisabeth Janecek-Erfurth^1,2, Dimitri Lindenwald^1,3, Esther Wilk⁴, Klaus Schughart^4,5, Robert Geffers⁶,Laurence Balas⁷, Thierry Durand⁷, Katharina Maria Rund^8,9, Nils Helge Schebb^8,9, Christina Strube¹(2019):

Multiplex profiling of inflammation-related bioactive lipid mediators in Toxocara canis- and Toxocara cati-induced neurotoxocarosis in mice

PLOS Neglected Tropical Diseases, 13(9): e0007706.

DOI 10.1371/journal.pntd.0007706

1Institut für Parasitologie, Zentrum für Infektionsmedizin, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

2Institut für Experimentelle Infektionsforschung, TWINCORE, Zentrum für Experimentelle und Klinische Infektionsforschung, Hannover

3Arbeitsgruppe Immunologie und Research Center for Emerging Infections and Zoonoses, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

4Abteilung Infektionsgenetik, Helmholtz Zentrum für Infektionsforschung, Braunschweig

5University of Tennessee Health Science Center, USA

6Arbeitsgruppe Genomanalytik, Helmholtz Zentrum für Infektionsforschung, Braunschweig

7Institut des Biomolécules Max Mousseron (IBMM), UMR 5247 CNRS, ENSCM, Universität Montepellier, Frankreich

8Institut für Lebensmitteltoxikologie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

9Institut für Lebensmittelchemie, Bergische Universität Wuppertal

Abstract

Background: Somatic migration of Toxocara canis- and T. cati-larvae in humans may cause neurotoxocarosis (NT) when larvae accumulate and persist in the central nervous system (CNS). Host- or parasite-induced immunoregulatory processes contribute to the pathogenesis;

however, detailed data on involvement of bioactive lipid mediators, e.g. oxylipins or eico-/docosanoids, which are involved in the complex molecular signalling network during infection and inflammation, are lacking.

Methodology/Principal findings: To elucidate if T. canis- and T. cati-induced NT affects the homeostasis of oxylipins during the course of infection, a comprehensive lipidomic profiling in brains (cerebra and cerebella) of experimentally infected C57BL/6J mice was conducted at six

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Publikationen 20

different time points post infection (pi) by liquid-chromatography coupled to electrospray tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). Only minor changes were detected regarding pro-inflammatory prostaglandins (cyclooxygenase pathway). In contrast, a significant increase of metabolites resulting from lipoxygenase pathways was observed for both infection groups and brain regions, implicating a predominantly anti-inflammatory driven immune response.

This observation was supported by a significantly increased 13-hydroxyoctadecadienoic acid (HODE)/9-HODE ratio during the subacute phase of infection, indicating an anti-inflammatory response to neuroinfection. Except for the specialized pro-resolving mediator (SPM) neuroprotectin D1 (NPD1), which was detected in mice infected with both pathogens during the subacute phase of infection, no other SPMs were detected.

Conclusions/Significance: The obtained results demonstrate the influence of Toxocara spp. on oxylipins as part of the immune response of the paratenic hosts. Furthermore, this study shows differences in the alteration of the oxylipin composition between T. canis- and T. cati-brain infection. Results contribute to a further understanding of the largely unknown pathogenesis and mechanisms of host-parasite interactions during NT.

Konzept, Versuchsplanung: Christina Strube, Nils Helge Schebb

Experimentelle Durchführung: Patrick Waindok, Katharina Maria Rund, Elisabeth Janecek- Erfurth, Dimitri Lindenwald, Esther Wilk,Robert Geffers

Diskussion, Beratung: Patrick Waindok, Christina Strube, Nils Helge Schebb, Elisabeth Janecek-Erfurth, Katharina Maria Rund. Dimitri Lindenwald, Esther Wilk, Klaus Schughart, Robert Geffers, Laurence Balas, Thierry Durand

Manuskript, Korrespondenz: Patrick Waindok, Christina Strube

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Übergreifende Diskussion 21

Übergreifende Diskussion

Die Akkumulation persistierender Larven des Hundespulwurms Toxocara canis und des Katzenspulwurms T. cati im ZNS des paratenischen Wirtes kann zur Ausbildung der sogenannten Neurotoxokarose führen, welche neben verschiedenen neurologischen Symptomen auch psychische Störungen hervorrufen kann. Zudem zeigten subjektive Beobachtungen im Laufe einer T. canis-Infektion beim paratenischen Wirt „Maus“

neurologisch-bedingte Verhaltensänderungen, während die T. cati-induzierte NT bezüglich Symptomatik und Schweregrad abzuweichen scheint (JANECEK et al., 2014). Dies könnte unter anderem mit dem Gewebstropismus beider Erreger zusammenhängen. So zeigen T. canis- Larven eine stärkere Affinität zum ZNS, insbesondere dem Großhirn, während T. cati-Larven bezüglich des ZNS eher im Kleinhirn, bevorzugt jedoch in der Muskulatur, persistieren (JANECEK et al., 2014). Zudem sind Toxocara spp. in der Lage, während einer zerebralen Infektion die Immunantwort des paratenischen Wirtes zu modulieren, jedoch sind detaillierte Mechanismen wie auch der Einfluss auf regulierende Signalmoleküle bislang weitestgehend unbekannt. Zu solchen Signalmolekülen, welche sowohl in die Koordination der Immunantwort als auch in das Entzündungsgeschehen involviert sind, werden unter anderem Zytokine und Chemokine sowie regulatorische Lipide wie Oxylipine gezählt. Da die Beeinflussung der Homöostase dieser Molekülgruppen als potenzieller Mechanismus der Immunmodulation durch die Parasiten bislang nur ansatzweise bzw. noch nicht beschrieben ist, wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit Veränderungen im Muster von zerebralen Zytokinen und Chemokinen als auch zerebralen Oxylipinen in Laufe der T. canis- und T. cati-induzierten Neurotoxokarose ermittelt. Zudem fand eine systematische Charakterisierung über das Auftreten und den Verlauf neurologischer Störungen und damit einhergehender Verhaltensänderungen Toxocara-infizierter Mäuse statt.

Neurologisch bedingte Verhaltensänderungen und vermindertes Erinnerungsvermögen als Folge einer zerebralen Toxocara-Infektion

Die bisherigen Erkenntnisse über Toxocara-induzierte Verhaltensänderungen im Modellwirt

„Maus“ basieren auf Infektionsversuchen mit T. canis als verursachenden Erreger. Inwiefern T. cati das Verhalten paratenischer Wirte beeinflusst ist bislang noch ungeklärt. Die Ergebnisse dieser Arbeit geben umfassend Aufschluss über das Eintreten und den Verlauf auftretender Verhaltensänderungen sowie Verminderung der Gedächtnisleistung bei der T. canis- als auch

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der T. cati-induzierten NT, wodurch ein direkter Vergleich der beiden nahe verwandten Zoonoseerreger möglich wird.

Im Vergleich zu nicht-infizierten Kontrolltieren zeigten beide Infektionsgruppen Änderungen des allgemeinen Gesundheitszustandes. Diese traten größtenteils und unter zunehmender Intensität in der chronischen Phase der Infektion auf, jedoch unterschieden sich T. canis- und T. cati-infizierte Mäuse sowohl im Hinblick auf die neurologische Symptomatik als auch dem zeitlichen Auftreten, Verlauf und Intensität voneinander. Dies spiegelt Beobachtungen weiterer Studien wieder, welche unter anderem ein späteres Auftreten klinischer Symptome und histopathologischer Veränderungen im Gehirn T. cati-infizierter Mäuse beschreiben (HAVASIOVÁ-REITEROVÁ et al., 1995; HEUER et al., 2015; JANECEK et al., 2014; SPRINGER et al., 2019). Eine Infektion mit T. canis führte in erster Linie zu motorischen und neurologischen Störungen, welche sich durch Ataxien, eine verminderte Griffstärke und Taumelbewegungen bei der Fortbewegung äußerten. Diese wurden schon während der subakuten Phase ab Tag 20 pi beobachtet. Bereits zwei bis drei Tage nach der Infektion migrieren Toxocara-Larven in das Gehirn und durch die hierbei erfolgende Perforation der Gefäßwände resultieren Hämorrhagien und Schädigungen des Parenchyms (CARDILLO et al., 2009; JANECEK et al., 2014; KOLBEKOVÁ

et al., 2011; SPRINGER et al., 2019). Somit führt vermutlich schon die ganz frühe Migration der T. canis-Larven in das Gehirn zu ersten histopathologischen Veränderungen und zentralnervösen Störungen, wenn auch eine Demyelinisierung erst zu späteren Zeitpunkten der Infektion in der chronischen Phase sichtbar wurde (HEUER et al., 2015; JANECEK et al., 2014).

Weiterhin zeigten T. canis-infizierte Mäuse ab Tag 27 pi eine räumliche Desorientierung und ab Tag 34 pi wurden bei einigen infizierten Tieren stereotype Kreisbewegungen beobachtet.

Die beschriebenen neurologischen Dysfunktionen könnten eine mögliche Strategie des Parasiten darstellen, das Risiko einer Prädation der infizierten paratenischen Wirte durch den Endwirt zu erleichtern (CHIEFFI et al., 2010; COX u.HOLLAND, 2001a; HAMILTON et al., 2006;

HOLLAND u.COX, 2001). Jedoch bleibt die Frage offen, ob es sich hierbei um eine adaptive Manipulation handelt. Gegen die Hypothese einer adaptiven Manipulation sprechen allerdings die erhöhte Schreckhaftigkeit bis Tag 41 pi sowie die verminderte Exploration einer offenen Plattform bei T. canis-infizierten Mäusen, so dass die Verhaltensstörungen vermutlich eher Nebeneffekte histopathologischer Veränderungen darstellen, welche sich zufällig vorteilhaft für den Parasiten auswirken können (POULIN, 2010; THOMAS et al., 2005).

Im Vergleich zu einer Infektion mit T. canis ist eine T. cati-Infektion mit einem weitaus milderen Krankheitsverlauf assoziiert (HEUER et al., 2015; JANECEK et al., 2014). Auch wenn

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erste Larven von T. cati etwa zur gleichen Zeit in das Gehirn einwandern, lassen sich aufgrund der geringeren Neuroaffinität insgesamt weniger T. cati-Larven im zerebralen Gewebe finden (CARDILLO et al., 2009; JANECEK et al., 2014). Parasiten-induzierte Verhaltensänderungen bei Nagetieren als Modelorganismen sind bereits für Toxoplasma gondii, aber auch Toxocara canis beschrieben (EPE et al., 1994; HAVASIOVÁ-REITEROVÁ et al., 1995; HRDÁ et al., 2000; SANTOS

et al., 2015), wobei bei einer Infektion mit T. gondii die Reduktion der Lernleistung mit der Anzahl der im Gehirn nachgewiesenen Zysten korrelierte (WITTING, 1979). Die geringere Larvenzahl im Gehirn und der mildere Krankheitsverlauf der T. cati-induzierten NT spiegeln sich auch in den beobachteten Verhaltensänderungen wider. Während die T. canis-induzierte NT zu motorischen und neurologischen Störungen führte, wurde eine Beeinflussung dieser Parameter bei T. cati-infizierten Mäusen nur sporadisch beobachtet. Stattdessen zeigten entsprechende Mäuse hauptsächlich mit dem Angstverhalten assoziierte Abnormitäten. So war die Fluchtreaktion der T. cati-infizierten Mäuse beim Hochheben sowie die Wehrhaftigkeit während des Handlings vermindert. Zudem wurde eine reduzierte Schreckreaktion auf ein plötzliches Klickgeräusch beobachtet. Somit unterscheiden sich T. canis- und T. cati-infizierte Mäuse bezüglich der induzierten neurologischen Symptomatik und der möglichen Strategie des Parasiten, ihre Transmission in den Endwirt zu forcieren. Bei der reduzierten Schreck- und Fluchtreaktion im Laufe der T. cati-induzierten NT könnte es sich um eine adaptive Manipulation des paratenischen Wirtes handeln. Um Kriterien für eine adaptive Wirtsmanipulation zu erfüllen, muss jedoch durch weitere Studien noch abschließend geklärt werden, ob die Verhaltensänderungen wirklich nicht nur auf Nebeneffekten pathologischer Veränderungen basieren und ob die induzierten Verhaltensänderungen die Transmission der Larven in den Endwirt fördern (POULIN,1995, 2010).

Weiterhin war die Infektion mit T. cati durch ein extensives Putzverhalten charakterisiert, welches bereits in der subakuten Phase der Infektion an Tag 27 pi beobachtet wurde, obwohl das Fell erst ab Tag 62 pi einen zerzausten bzw. ungepflegten Eindruck aufwies. Eine derart extensive Selbstpflege kann multifaktoriell begründet sein und unter anderem Hinweise auf ein gestörtes Hormon- oder Neurotransmitterverhältnis geben (DRAGO et al., 1983; KALUEFF et al., 2016; KIM et al., 2016). Störungen des Neurotransmitterverhältnisses können ursächlich für eine Vielzahl neurologischer Erkrankungen wie z. B. Schizophrenie oder Depression sein (BLOOM, 2006, S. 332; OTHMAN et al., 2010), weshalb das Selbstpflegeverhalten auch als potentieller Indikator für psychische Erkrankungen diskutiert wird (KALUEFF et al., 2016).

Auch führte die Dysregulation verschiedener Neurotransmitter bei Nagetieren zu einem

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veränderten Stress- und Angstverhalten (KALUEFF et al., 2016; KIM et al., 2016).

Interessanterweise ist beim Menschen die Seropositivitätsrate für Toxocara spp. mit psychischen Erkrankungen korreliert (FAN et al., 2015; RICHARTZ u.BUCHKREMER, 2002), und eine erste Studie an Mäusen beschreibt Veränderungen im Neurotransmitterspiegel in Gehirnen T. canis-infizierter Mäuse, welche sich in reduzierten Dopamin-, Serotonin- und GABA- Konzentrationen äußerten (OTHMAN et al., 2010). Inwiefern die Toxocara-induzierten Veränderungen des Neurotransmitterspiegels mit der Ausprägung psychischer Erkrankungen in Verbindung stehen, konnte bislang jedoch noch nicht geklärt werden. Auch liegen noch keine Daten über ein gestörtes Neurotransmitterverhältnis in Gehirnen T. cati-infizierter Tiere vor, daher kann nur spekuliert werden, ob die Infektion mit T. cati die Neurotransmitter beeinflusst und somit eventuell zu der beobachteten extensiven Selbstpflege führt.

Weitere Beobachtungen im Zuge der durchgeführten Verhaltenstests weisen auf Toxocara- induzierte sensomotorische Dysfunktionen hin. Sowohl die Infektion mit T. canis als auch mit T. cati führte zu Defiziten in der Sensorik. Wie bereits in vorangegangenen Studien beschrieben, setzten auch hier bei T. canis-infizierten Mäusen die Störungen wesentlich früher ein als bei der T. cati-Infektionsgruppe (Tag 41 pi im Vergleich zu Tag 76 pi). Axonale Schäden, wie sie bei einer Infektion mit Toxocara beschrieben sind (HEUER et al., 2015;

JANECEK et al., 2014, SPRINGER et al., 2019), können zu Veränderungen in der sensorischen Wahrnehmung führen (MOSER, 2011). Zudem führt, wie bereits oben erläutert, eine Infektion mit T. canis zu schwerwiegenderen histopathologischen Veränderungen im Gehirn als eine T. cati-Infektion (BAILLIEUX et al., 2008; EPE et al., 1994; JANECEK et al., 2014; MORTON u.

BASTIAN, 2004). Diese strukturellen Schädigungen des Gewebes können die Ursache für die in dieser Arbeit beobachteten motorischen Defizite und Ataxien darstellen. Neben der veränderten sensorischen Wahrnehmung waren motorische Defizite bei T. canis-infizierten Mäuse ebenfalls früher zu beobachten als bei T. cati-infizierten Mäusen (Tag 41 pi im Vergleich zu Tag 76 pi) und zudem wesentlich stärker ausgeprägt. Menschen, bei denen eine Infektion mit Toxocara spp. diagnostiziert wurde, zeigten vergleichbare sensomotorische Dysfunktionen sowie neurologische Störungen wie Ataxie oder Gleichgewichtstörungen (DUPREZ et al., 1996; FUKAE

et al., 2012; GOFFETTE et al., 2000; KINČEKOVÁ et al., 2008). Dies deutet einerseits darauf hin, dass Toxocara spp. in unterschiedlichen paratenischen Wirten ähnliche oder gar identische Verhaltensänderungen induziert. Anderseits zeigt dieser Vergleich auch, dass Erkenntnisse

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entsprechender Verhaltenstests vermutlich durchaus von der Maus auf den Menschen extrapoliert werden können.

Ein eingeschränktes Erinnerungsvermögen ist eine erhebliche Beeinträchtigung der individuellen Fitness und beeinflusst z. B. die Nahrungssuche bzw. das Auffinden von Nahrungsressourcen. Es konnte bereits gezeigt werden, dass T. canis-infizierte Mäuse signifikant mehr Zeit benötigten als nicht-infizierte Kontrollen, um eine Wasserquelle zu relokalisieren (COX u.HOLLAND, 2001b; HAMILTON et al., 2006). In der vorliegenden Arbeit wurde die Beeinflussung der Gedächtnisleistung paratenischer Wirte durch Toxocara spp.

anhand eines Labyrinths mit einer Futterbelohnung analysiert, in welchem die Mäuse vor der Infektion auf den kürzesten Weg konditioniert wurden. Die Analyse ergab, dass eine Infektion mit Toxocara spp. die Gedächtnisleistung bzw. das Erinnerungsvermögen paratenischer Wirte beeinflusst. Auch hier zeigten T. canis- gegenüber T. cati-infizierten Mäusen wesentlich früher eine Beeinträchtigung der Gedächtnisleistung, und benötigten in der subakuten Phase ab Tag 27 pi signifikant mehr Zeit als die Kontrollmäuse bzw. zeigten ab Tag 20 pi eine signifikant höhere Anzahl an Fehleintritten in die Labyrinthgänge. Hinsichtlich T. canis bestätigt die vorliegende Arbeit somit die Ergebnisse von Hamilton et al. (2006), und zeigt eine Beeinflussung des explizierten Gedächtnisses, welches für den Abruf von Fakten und Erfahrungen wie dem Wiederfinden eben solcher Nahrungsressourcen essentiell ist (BAILLIEUX

et al., 2008). Bei T. cati-infizierten Mäusen hingegen dauerte die Bewältigung der Wegstrecke erst ab Tag 55 pi signifikant länger als bei den nicht-infizierten Kontrolltieren. Dies ist jedoch nicht zwangsläufig auf ein gestörtes Erinnerungsvermögen zurückzuführen, sondern kann auch durch die generell lethargischeren Bewegungen der T. cati-infizierten Mäuse bedingt sein, welche ab Beginn der chronischen Phase beobachtet wurden. Letzteres als Hauptursache der längeren Wiederfindungszeit wird durch die Anzahl an Fehleintritten, die bei T. cati-infizierten Tieren nur sporadisch beobachtet werden konnten, unterstützt, und weist auf einen geringeren Einfluss der T. cati-Infektion auf die Gedächtnisleistung hin.

Sowohl der zerebrale Kortex als auch das Kleinhirn und der Hippocampus sind in kognitive Prozesse involviert und insbesondere ein intaktes Kleinhirn ist für die Regulation dieser Funktionen bedeutend (MOSER, 2011). Inwiefern ein larvaler Tropismus gegenüber bestimmten Gehirnarealen innerhalb des Groß- oder Kleinhirns wie zum Beispiel dem Corpus callosum, Fornix cerebri oder dem Hippocampus vorliegt, wurde für die NT bislang noch nicht abschließend geklärt, jedoch verursachen migrierende und persistierende Toxocara-Larven neben histopathologischen Läsion in diesen Gehirnarealen auch schädigende Immunreaktionen.