Durchführung von Färbungen an aufgetautem Gefriersperma

Die Untersuchungen zur Überprüfung der Lebensfähigkeit der Spermien, die Bestimmung der Chromatinstruktur der Spermien und die Messungen der Lipidperoxidation wurden mit Hilfe durchflußzytometrischer Verfahren unter Verwendung spezifischer Färbemethoden durchgeführt. Bei den Analyseverfahren wurden 10.000 Spermien pro Probe analysiert. Für die Färbung mit SYTO^®17/FITC-PNA/PI wurde das Sperma nach dem Auftauen mit TALP-Medium (nach PARRISH et al. 1988) auf eine Endkonzentration von 5 x 10⁶ Spermien/ml gebracht. Bei der Durchführung des SCSA^™-Tests erfolgte die Probenaufbereitung nach den Angaben von EVENSON und JOST (2000). Um die verschiedenen Tests miteinander vergleichen zu können, wurden die Inkubationszeiten der verschiedenen Färbungen vereinheitlicht. Beim SYTO^®17/FITC-PNA/PI-Test wurden die Proben nach der Zugabe der entsprechenden Farbstoffe im abgedunkelten Raum 15 Minuten bei 37°C in einem Thermostat (Typ 5320, Fa. Eppendorf) inkubiert.

Für die Untersuchungen wurde ein Durchflusszytometer FACScan™ (Fa. Becton Dickinson, Heidelberg), das mit einem luftgekühlten Argonionenlaser mit einer Wellenlänge von 488 nm und einer Leistung von 15 mW ausgestattet war, verwendet. Zur Messung standen drei verschiedene Filter zur Auswahl: FL-1 (530/30 nm) für die grüne Fluoreszenz, FL-2 (585/42 nm) für die orange Fluoreszenz und FL-3 (650LP nm) für die rote Fluoreszenz. Für die Datenanalyse war ein Power Mac G4-Computer der Fa. Apple Computer Inc. an dieses Gerät angeschlossen. Die Bearbeitung und Auswertung der Daten erfolgte mit dem Software-Programm Cellquest™ (Fa. Becton Dickinson, Heidelberg).

Die Auswertung der SCSA^™-Daten wurde mit dem Software-Programm DAS Version 4.40 (BEISKER 1994) vorgenommen.

Für die Untersuchungen mit der Färbung SYTO^®17/FITC-PNA/PI wurden eine einheitliche Geräteeinstellung am Durchflußzytometer gewählt. Die Geräteeinstellung wurde beim SCSA^™-Test entsprechend den Angaben von EVENSON und JOST (2000) zu Beginn einer jeden Meßreihe neu eingestellt und nach jeder zehnten Probe überprüft. Für die Untersuchungen mit der Bodipy-, DCFH- und DHR-Färbung (siehe Kapitel 3.2.6.3) wurde jeweils eine einheitliche Geräteeinstellung am Durchflußzytometer gewählt.

3.2.6.1 Bestimmung des Anteils der lebenden Spermien mittels SYTO^® 17/FITC-PNA/PI-Färbung

Es wurde mithilfe der Fluoreszenzfarbstoffe SYTO^®17 und PI die Plasmamembranintegrität und damit die Vitalität der Spermien bestimmt.

Zur Bestimmung der Vitalität der Spermien wurden die Samenproben nach dem bei GARNER et al. (1999) beschriebenen Verfahren durchflußzytometrisch analysiert, wobei die verwendeten Farbstoffmengen modifiziert wurden. Zur Anwendung kamen die Farbstoffe SYTO^®17 von Molecular Probes (Katalog-Nr.: S-7579), FITC-PNA von Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Katalog-Nr.: L-7381) und Propidium Iodide 95-98% von Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Katalog-Nr.: P-4170). Es wurden 500 µl der zu untersuchenden Spermaprobe (ca. 2,5 x 10⁶ Spermien in 500µl TALP) mit 2 µl SYTO^®17 (0,5 mM), 3 µl PI (2,99 mM) und 5 µl FITC-PNA (100 µg/ml Aqua dest.) gemischt und entsprechend inkubiert.

Bei der Auswertung wurden die Spermienköpfe hinsichtlich ihrer Plasma-membranintegrität und der Unversehrtheit des Akrosoms in vier verschiedene Populationen eingeteilt: membranintakte Spermien mit intaktem Akrosom (orange angefärbte Spermien), membrangeschädigte Spermien mit intaktem Akrosom oder völligem Verlust des Akrosoms (rot angefärbte Spermien), membrangeschädigte Spermien mit geschädigtem Akrosom (rot angefärbte Spermien mit grün angefärbtem Akrosom) und membranintakte Spermien mit geschädigtem Akrosom (orange angefärbte Spermien mit grün angefärbtem Akrosom).

Die Eingrenzung der einzelnen Spermienpopulationen nach der Messung erfolgte subjektiv mit Hilfe des Analyseprogramms der Cellquest™-Software (Fa. Becton Dickinson, Heidelberg).

3.2.6.2 Spermienchromatinstrukturanalyse (SCSA^™)

Zweimal im März und danach einmal pro Monat wurde eine Probe Nativsperma (2 ml) entnommen, in ein verschraubbares Röhrchen (Fa. Greiner, Frickenhausen) gefüllt und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. An den später aufgetauten Spermaproben wurde mithilfe eines Durchflußzytometers eine Spermienchromatinanalyse durchgeführt

Material und Methode

Die Probenaufbereitung und die Messung erfolgten nach der bei EVENSON und JOST (2000) beschriebenen Methode. Für die Messungen wurden die Filter FL-1 für die grüne Fluoreszenz und FL-3 für die rote Fluoreszenz eingesetzt. Zu Beginn und nach jeder zehnten Probe wurde eine Referenzprobe gemessen. Für die weitere computergestützte Auswertung der Messdaten wurde die in die Auswertung eingehende Spermienpopulation eingegrenzt. Nach EVENSON et al. (1991) galt für Spermien, daß entweder die grüne oder die rote Fluoreszenzintensität mindestens 200 betragen mußte und die grüne Fluoreszenzintensität maximal 800 und die rote Fluoreszenzintensität maximal 1000 betragen durfte.

Durch eine computergestützte Auswertung der Punktwolkendiagramme wurde für jedes einzelne Spermium der Anteil der Rotfluoreszenz an der Gesamtfluoreszenz (rot + grün) ermittelt und nach EVENSON und JOST (2000) als DFI-Wert (DNA-Fragmentations-Index) bezeichnet. Alle DFI-Werte der analysierten Spermien einer Samenprobe wurden in Abhängigkeit ihrer Höhe in einem Verteilungshistogramm dargestellt. Anhand dieses Histogramms wurden der Mittelwert der DFI-Werte und die Standardabweichung (SD) errechnet. Beide Parameter wurden zur besseren Darstellung mit dem Faktor 1000 multipliziert.

Den prozentualen Anteil der Spermien mit erhöhten DFI-Werten an der Gesamtpopulation errechnete das Computerprogramm nach einer zuvor durchgeführten subjektiven Abgrenzung der Spermien mit niedrigen DFI-Werten von solchen mit erhöhten Werten. Diese Spermien werden nach EVENSON et al. (2002) als DFI-Spermien (%) bezeichnet.

3.2.6.3 Messung der Peroxidation (Bodipy, DHR, DCFH)

Bodipy

Zur Bestimmung der Lipidperoxidation der Spermien wurden die Samenproben nach dem bei BALL und VO (2002) beschriebenen Verfahren durchflußzytometrisch analysiert.

Durch die Bodipy-Färbung kann die Lipidperoxidation in lebenden Zellen gemessen werden.

Das Sperma wurde 1:1 mit Tyrode vermischt und 10 Minuten bei 500 x g zentrifugiert;

das Seminalplasma wurde abgetrennt. Die Dichte des Spermas wurde bestimmt und das Sperma mit Tyrodemedium auf 5 x 10⁶ Spermien verdünnt. 242,5 µl der Spermien-suspension wurden auf 2 Durchflußzytometer-Röhrchen verteilt. In beide Röhrchen wurden 2,5 µl Bodipy-Lösung und 2,5 µl PI-Lösung zugegeben. Danach wurden in Röhrchen 1 2,5 µl Tyrode und in Röhrchen 2 2,5 µl BP (Benzoylperoxid)-Lösung gegeben. Beide Röhrchen wurden bei 37°C für 30 Minuten inkubiert.

Die Messung erfolgte mit „Oxidativestress“-Settings und die Auswertung der Daten mit der „CellQuest software“. Die Differenz der grünen Fluoreszenz mit und ohne Induktion der Lipidperoxidation wurde als ein Maß für die Zunahme der Lipidperoxidation in der Zelle genommen.

DCFH und DHR

Zur Bestimmung der Peroxidation der Spermien wurden die Samenproben nach dem bei OSTROVIDOV et al. (2000) beschriebenen Verfahren durchflußzytometrisch analysiert.

Durch die DCFH- und DHR-Färbung können Wasserstoffperoxid und Peroxide gemessen werden.

DHR-Test: ein sensibler Test für die Messung von Wasserstoffperoxid und Peroxiden mit der Färbung Dihydrorhodamine.

Das Sperma wurde 1:1 mit Tyrode vermischt und 10 Minuten bei 500 x g zentrifugiert;

das Seminalplasma wurde abgetrennt. Die Dichte des Spermas wurde bestimmt und das Sperma mit Tyrodemedium auf 5 x 10⁶ Spermien verdünnt. 242,5 µl der Spermiensuspension wurden auf 2 Durchflußzytometer-Röhrchen verteilt. In beide Röhrchen wurden 5 µl DHR123-Lösung zugegeben und die Röhrchen wurden bei 37˚C für 15 Minuten inkubiert. Danach wurden in Röhrchen 1 2,5 µl Tyrode und in Röhrchen 2 2,5 µl BP-Lösung gegeben. Beide Röhrchen wurden bei 37°C für 15 Minuten inkubiert.

Die Messung erfolgte mit „Oxidativestress“-Settings und die Auswertung der Daten mit der „CellQuest software“. Die Differenz der grünen Fluoreszenz mit und ohne Induktion der Peroxidation wurde als ein Maß für die Zunahme der Peroxidation genommen.

DCFH-Test: ein Test für die Messung von Wasserstoffperoxid und Peroxiden mit der Färbung Dichlorofluorescin-diacetat (weniger empfindlich als DHR123).

Material und Methode

Das Sperma wurde 1:1 mit Tyrode vermischt und 10 Minuten bei 500 x g zentrifugiert;

das Seminalplasma wurde abgetrennt. Die Dichte des Spermas wurde bestimmt und das Sperma mit Tyrodemedium auf 5 x 10⁶ Spermien verdünnt. 242,5 µl der Spermiensuspension wurden auf 2 Durchflußzytometer-Röhrchen verteilt. In beide Röhrchen wurden 5 µl DCFH-Lösung zugegeben und die Röhrchen wurden bei 37˚C für 15 Minuten inkubiert. Danach wurden in Röhrchen 1 2,5 µl Tyrode und in Röhrchen 2 2,5 µl BP-Lösung gegeben. Beide Röhrchen wurden bei 37°C für 15 Minuten inkubiert.

Die Messung erfolgte mit „Oxidativestress“-Settings und die Auswertung der Daten mit der „CellQuest software“. Die Differenz der grünen Fluoreszenz mit und ohne Induktion der Peroxidation wurde als ein Maß für die Zunahme der Peroxidation genommen.