Einfluss einer gepulsten Magnetfeldtherapie auf das Deckverhalten und die Spermaqualität von Warmbluthengsten

Tierärztliche Hochschule Hannover

Einfluss einer gepulsten Magnetfeldtherapie auf das Deckverhalten und die Spermaqualität von

Warmbluthengsten

INAUGURAL – DISSERTATION

zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -

( Dr. med. vet. )

vorgelegt von Holger Tesche aus Braunschweig

Hannover 2013

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. H. Sieme Klinik für Pferde

Reproduktionsmedizinische Einheit der Kliniken

1. Gutachter: Prof. Dr. H. Sieme

2. Gutachter: Prof. Dr. H. Bollwein

Tag der mündlichen Prüfung: 24.05.2013

Ein Beitrag aus dem Virtuellen Zentrum für Reproduktionsmedizin Niedersachsen

Meiner Familie

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung... 11

2 Literaturübersicht... 13

2.1 Magnetfeldtherapie unter medizinischen Gesichtspunkten... 13

2.1.1 Historische Entwicklung... 13

2.1.2 Physikalische Grundlagen... 15

2.1.3 Anwendungsgebiete und mögliche Wirkmechanismen... 16

2.2 Methodik und Verfahren der Spermauntersuchung und Qualitätsbeurteilung... 17

2.2.1 Samenuntersuchung... 17

2.2.2 Makroskopische Untersuchungen... 18

2.2.3 Mikroskopische Untersuchungen... 19

2.2.3.1 Computerassistierte Spermienanalyse (CASA)... 20

2.2.4 Durchflusszytometrie... 21

2.2.4.1 Sperm-Chromatin-Structure-Assay (SCSA)………... 22

2.3 Variabilität der Qualitätsmerkmale von Hengstsperma und der Sexualparameter... 22

2.3.1 Deckverhalten... 22

2.3.2 Einfluss des Alters... 23

2.3.3 Einfluss der Jahreszeit... 24

3 Material und Methoden... 29

3.1 Versuchshengste... 29

3.2 Medithera Vet-System M-1000………... 29

3.3 Versuchsaufbau... 30

3.4 Samengewinnung und Untersuchung des Deckverhaltens... 30

3.4.1 Untersuchung des Deckverhaltens... 30

3.4.2 Samengewinnung...31

3.6 Eosin-Nigrosin Ausstrichpräparate... 32 3.7 Flowzytometrische Bestimmung der Chromatinintegrität (SCSA)... 33 3.7.1 Geräte und Geräteeinstellungen... 33 3.7.2 Messprinzip und Durchführung der

Spermienchromatinstrukturanalyse (SCSA)...33 3.8 Durchführung der computerassistierten

Spermienmotilitätsanalyse (CASA)... 34 3.9 Statistische Auswertungen... 35

4 Ergebnisse... 41

4.1 Bestimmung des Einflusses einer gepulsten Magnetfeldtherapie auf das Deckverhalten durch Zeitmessung bei der

Samenentnahme... 41 4.2 Untersuchungen zum Einfluss gepulster Magnetfelder auf die

Spermaqualität... 49 4.2.1 Ergebnisse zum Einfluss der Magnetfeldtherapie auf die

Gesamtspermienzahl, den Anteil Plasmamembranintakter Spermien und den Anteil progressiv motiler Spermien unter zusätzlicher

Berücksichtigung des Alters und der Saisonalität... 49 4.2.2 Ergebnisse zum Einfluss der Magnetfeldtherapie auf die

Spermienmorphologie und die Chromatinintegrität unter zusätzlicher Berücksichtigung des Alters und der Saisonalität... 61

5 Diskussion... 69

5.1 Darstellung der Versuchsziele... 69 5.2 Effekte der gepulsten Magnetfeldtherapie, des Alters und des

Behandlungsabschnitts auf das Deckverhalten von Hengsten... 69 5.3 Effekte der gepulsten Magnetfeldtherapie auf die untersuchten

spermatologischen Parameter... 71 5.4 Effekte des Alters und des Behandlungsabschnitts auf die

untersuchten spermatologischen Parameter... 72

6 Zusammenfassung... 74

7 Summary... 76

8 Literaturverzeichnis... 78

9 Anhang... 91

9.1 Abbildungsverzeichnis... 91

9.2 Tabellenverzeichnis... 96

10 Danksagung... 97

® eingetragenes Warenzeichen

™ registered Trademark

°C Temperatur in Grad Celsius

% Prozent

Abb. Abbildung

ALH Amplitude of lateral Head Displacement (Amplitude seitlicher Kopfauslenkung)

B magnetische Flussdichte

BCF Beat-Cross-Frequency (Frequenz des seitlichen Kopfausschlages)

ca. circa

CASA Computer assisted sperm analysis bzw. beziehungsweise

d.h. das heißt

DAP Distance Average Path (Mittlere Strecke auf der geglätteten Bahn) DCL Distance Curve Line (Kurvolineare Strecke)

DFI DNA-Fragmentationsindex DNA Desoxyribonukleinsäure

DSL Distance Straight Line (Strecke der direkten Verbindung vom Anfangs- zum Endpunkt)

EDTA Ethylen-Diamin-Tetra-Acetat EMF elektromagnetische Felder et al. et alii

Fa. Firma

FDA Food and Drug Administration Fig. Figur

FITC Fluoreszeinisothiocyanat

FN Fédération Equestre Nationale (Deutsche Reiterliche Vereinigung) FSH Follikel-stimulierendes Hormon

G Gauß (physikalische Einheit)

g Gramm ggr. geringgradig

GnRH Gonadotropin-Releasing Hormon

h Stunde

H Vektor der magnetischen Feldstärke

Hz Hertz

Ie elektrische Stromstärke i.d.R. in der Regel

Jh.v.Chr. Jahrhundert vor Christus KB künstliche Besamung

kg Kilogramm

I Liter

L Länge

LH Luteinisierendes Hormon LIN Linearity (VSL/VCL)

M Molar

MfT Magnetfeldtherapie Min. Minute

ml Milliliter mM Millimolar mOsm Milliosmol mW Milliwatt µI Mikroliter

µT Mikrotesla

µ0 magnetische Induktionskonstante

n Probandenzahl

N Anzahl der Spulenwindungen

nM Nanometer

NSAID nonsteroidal antiinflammatory drugs (nichtsteroidale Antiphlogistika) PBS Phosphate buffered saline

PEMF pulsierende elektromagnetische Felder

s. siehe

SCSA Sperm-Chromatin-Structure-Assay (Spermachromatinstrukturanalyse)

sec. Sekunde

SI Système international d‘ unités (Internationales Einheitensystem) STR Straightness (VSL/VAP)

T Tesla

Tab. Tabelle

VAP Velocity Average Path (Mittlere Geschwindigkeit auf der geglätteten Bahn)

VCL Velocity Curve Line (Kurvolineare Geschwindigkeit)

VSL Velocity Straight Line (Geschwindigkeit auf direkter Strecke vom Anfangs- zum Endpunkt)

z.B. zum Beispiel

Einleitung

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1. Einleitung

In den vergangenen Jahren ist in der deutschen Pferdezucht (Warmblut) ein nicht unerheblicher, stetiger Abfall der Bedeckungszahlen von durchschnittlich ca. 45.000 Bedeckungen in den Jahren 2000 bis 2009 auf noch 35.642 Bedeckungen im Jahr 2011 (Jahresbericht FN 2011) zu verzeichnen. Dabei liegt der Besamungsanteil (Frischsamen und Tiefgefriersamen) bei über 80%. In der Warmblutzucht besteht daher weiterhin großes Interesse daran Hengste zur Verfügung zu stellen, die sich durch eine gute Spermaqualität auszeichnen, da oft nur wenige vielversprechende Hengste genutzt werden, die sich bereits züchterisch bewährt oder sich durch sportliche Erfolge ausgezeichnet haben. Weiterhin ist es wichtig Hengstsperma innerhalb kürzester Zeit, zum Teil über große Entfernungen, zur Verfügung zu stellen. Dies wird einerseits durch die Herstellung von Tiefgefriersperma möglich, andererseits durch den Versand flüssigkonservierten Spermas (+5°C, KB 24-36 h nach Samengewinnung), dessen Verwendung sowohl höhere Erfolgsaussichten bietet als auch den Versand in das Ausland ermöglicht und daher das aktuell überwiegend eingesetzte Verfahren ist.

Die Existenz des Magnetismus war den Griechen bereits im 5. Jh. v. Chr. bekannt. In China nutzte man magnetische Mineralien bereits im 11. Jh. v. Chr. zur allgemeinen Behandlung von körperlichen Gebrechen und Krankheiten jeglicher Art (HOHLOCH 2009). Im letzten Jahrhundert führte dann die Entdeckung der piezoelektrischen Eigenschaften von Knochen, d.h. dass messbare elektrische Potentiale bei mechanischer Belastung in Knochengewebe entstehen, durch FUKADA und YASUDA (1957) zu einem Neubeginn der Arbeit mit Magnetfeldern in der Humanmedizin. Betrachtet wurden dabei zunächst die Behandlungsmöglichkeiten von Frakturen, Arthrosen (besonders Knie- und Hüftgelenksarthrosen) und die Behandlung von Wundheilungsstörungen. In der Veterinärmedizin ist der Einsatz gepulster, d. h. frequenzmodulierter Magnetfelder aktuell eher von untergeordneter Bedeutung. Firmen die Magnetfeldsysteme ursprünglich für die Anwendung im humanmedizinischen Bereich hergestellt haben, stellen ähnliche Systeme jedoch

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zunehmend für den Einsatz in der Veterinärmedizin her. Bisher sind viele Untersuchungen in der Humanmedizin durchgeführt wurden, die in einigen Bereichen (z. B. Schmerzreduktion, schnellere Frakturheilung) einen positiven Einfluss dieser Therapieform zeigen. In Bezug zu den Wirkmechanismen auf zellulärer oder molekularer Ebene sind die Aussagen vieler Autoren wissenschaftlicher Studien jedoch oft widersprüchlich. Häufig wird die mangelhafte wissenschaftliche Erforschung und Dokumentation kritisiert (SCHUFRIED et al. 2005, PIEBER et al.

2007, HUG und RÖÖSLI 2012), bzw. werden Wirkmechanismen als nicht bekannt beschrieben (CHENG 1985, FARNDALE et al. 1987, BLANK und GOODMANN 1997, SMITH et al. 2004).

Ziel der vorliegenden Arbeit war es zum einen festzustellen, ob eine bei Hengsten angewandte Magnetfeldtherapie eine positive Beeinflussung der Tiere in Bezug auf ihre Deckfähigkeit bewirkt. Diese wurde durch Zeitmessung im Sprungraum und durch zusätzliche Beurteilung der Anzahl der Aufsprünge, die bis zur Ejakulation benötigt wurden, bestimmt. Zum anderen sollte eine Aussage über den Einfluss der Magnetfeldtherapie auf die Spermaqualität anhand ausgewählter spermatologischer Parameter getätigt werden. Da bekannt ist, dass Reproduktionsparameter wie z.B.

das Sexualverhalten oder die Spermaqualität und -quantität durch das Alter der Tiere und die Jahreszeit beeinflusst werden (PICKETT et al. 1976, JOHNSON und NEAVES 1981, JOHNSON und THOMSON 1983, JANETT et al. 2003, BLANCHARD et al. 2012), wurde auch untersucht, ob diesbezüglich Effekte in dieser Arbeit festgestellt werden können.

Literaturübersicht

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2. Literaturübersicht

2.1 Magnetfeldtherapie unter medizinischen Gesichtspunkten 2.1.1 Historische Entwicklung

Bezüglich der Verwendung von Magnetfeldern zu therapeutischen Zwecken kann bereits auf eine lange geschichtliche Entwicklung zurückgeblickt werden. Schon in der Antike, vornehmlich in China und Griechenland, kamen magnetische Mineralien zum Einsatz, denen allgemein wohltuende Wirkungen zugesagt wurden (SALOMONOWITZ et al. 2011, MARKOV 2007b). Im 18. Jahrhundert geriet das Verfahren jedoch durch die zu dieser Zeit wissenschaftlich umstrittenen Anwendungsmethoden des deutschen Arztes und Theologen Franz Anton Mesmer in Verruf und wurde von der damaligen Schulmedizin als unwirksam angesehen (AMMER 2004). Ende der fünfziger Jahre des letzten Jahrhunderts wurde durch FUKADA UND YASUDA (1957) der piezoelektrische Effekt in Knochengewebe nachgewiesen. Diese zeigten, dass es unter mechanischer Belastung zu Ladungsverschiebungen innerhalb der kollagenen Knochenmatrix kommt und somit elektrische Potentiale gemessen werden können (BASSET et al. 1974, CRUESS et al. 1983). Die Bedeutung dieser Ladungsverschiebungen ist nicht abschließend geklärt. Dennoch wird ihnen eine gewisse Rolle bei der Heilung von Frakturen zugesprochen, da auch beim natürlichen Heilungsprozess von Frakturen elektrische Ströme messbar sind (SCHMIDT-ROHLFING et al. 2000). Seit den 1970er Jahren wuchs vermehrt das Interesse daran, elektromagnetische Felder (EMF) zu therapeutischen Zwecken einzusetzen (MARKOV 2007b). Die frühen Arbeiten befassten sich hauptsächlich mit der beschleunigten Heilung von Frakturen durch elektromagnetische Felder im Gegensatz zu einer Behandlung mittels konservativer Therapie, beispielsweise durch Ruhigstellung mit Hilfe von Gips- oder Cast- Verbänden (BASSETT et al. 1974). Die FDA (Food and Drug Administration), die in Amerika für die Zulassung neuer Verfahren im Gesundheitswesen zuständig ist, lies 1979 erstmals die Anwendung von pulsierenden elektromagnetischen Feldern

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(PEMF) als medizinische Therapieform für die Heilung von Frakturen zu (BASSETT 1982, 1993, JAHNS et al. 2007, MARKOV 2007b).

Wesentliche Schwerpunkte der Forschung bezüglich der klinischen Nutzung von pulsierenden Magnetfeldern lagen in den letzten zwanzig Jahren sowohl in der Behandlung von Frakturen, Knochennekrosen und Pseudarthrosen, als auch in der Behandlung von Wundheilungsstörungen und Erkrankungen des Bewegungsapparates (MARKOV 2007a, HUG und RÖÖSLI 2012). Seit den achtziger Jahren des letzten Jahrhunderts wurden auch vereinzelt Studien im Bereich der Veterinärmedizin durchgeführt. Dabei erschien unter anderem eine Studie von WATKINS et al. (1985), die den Einfluss von PEMF bezüglich des Heilungsverlaufs bei Verletzungen der oberflächlichen Beugesehne bei Pferden überprüften. Dabei konnten sie keine positive Beeinflussung durch die PEMF- Behandlung bezüglich des generellen Heilungsverlaufs und der Reorganisation des geschädigten Sehnengewebes feststellen. Die Vaskularisation im behandelten Gewebe stellte sich geringgradig verbessert dar. KOLD et al. (1987) begutachteten bei Ponys wie sich die Wiedereingliederung von Knochentransplantaten unter dem Einfluss von PEMF entwickelte. Hierbei trat keine signifikante Verbesserung der Heilungsrate in der mit PEMF behandelten Versuchstiergruppe auf. SANDERS- SHAMIS et al. (1989) untersuchten den Heilungsverlauf chirurgisch induzierter Osteotomien des Metakarpus bzw. des Metatarsus bei Pferden unter PEMF Einfluss.

Auch in dieser Studie konnte keine positive Beeinflussung der Heilungsrate der behandelten Tiere gegenüber den Tieren der unbehandelten Kontrollgruppe gefunden werden. SHAFFORD et al. (2002) untersuchten, ob die Anwendung von PEMF bei Hunden nach einer Ovariohysterektomie zu einer Schmerzreduktion führt.

Dies konnte unter den Bedingungen der Studie nicht nachgewiesen werden. PINNA et al. (2012) überprüften die Beeinflussbarkeit der funktionellen Beweglichkeit und des Schmerzempfindens bei Hunden mit Osteoarthritis. Dabei führte sowohl die Behandlung mit PEMF als auch die Behandlung der Kontrollgruppe mit einem nichtsteroidalen Antipholgistikum (NSAID) zu einer Besserung der Bewegungsfähigkeit der Tiere und somit auch zu einer Reduktion des

Literaturübersicht

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Schmerzempfindens. Zudem stellte sich ein verbesserter Langzeiteffekt der PEMF- Therapie gegenüber der Behandlung mit einem NSAID heraus.

2.1.2 Physikalische Grundlagen

Um die Wirkungsweise niederfrequenter pulsierender („gepulster“) Magnetfelder bezüglich ihrer physikalischen Eigenschaften zu charakterisieren, gilt es einige physikalische Parameter (s. Tab. 2.1) zu betrachten (SCHMIDT-ROHLFING et al.

2000). Die Erzeugung eines Magnetfeldes wird erreicht, indem Drahtspulen von elektrischem Strom durchflossen werden. Die Feldlinien die dabei die Magnetspule umgeben werden durch den Vektor der magnetischen Feldstärke H beschrieben, der in Henry (in Ampere/Meter) gemessen wird (QUITTAN 2004). Die Feldstärke H erzeugt einen magnetischen Fluss. Die magnetische Flussdichte B (in Tesla) wird auch als magnetische Induktion bezeichnet. Sie lässt sich unter Einbeziehung der magnetischen Induktionskonstante µo (4 10^-7 Newton/Ampere²) aus der Stromstärke Ie (in Ampere), der Länge des Spulendrahtes L (in Metern) und der Anzahl der Spulenwindungen N berechnen: B = N x Ie x µo/L (FISCHER et al. 2002). Die frühere Einheit der magnetischen Flussdichte war das Gauß (G), die heutige SI-Einheit wird in Tesla (T) angegeben. Dabei entspricht 1 Tesla 10.000 Gauß bzw. 1 Gauß 0,1 Millitesla. Die magnetische Flussdichte B nimmt mit dem Quadrat des Abstandes vom Entstehungsort ab (PIEBER et al. 2007, QUITTTAN 2004). Die magnetische Flussdichte des Erdmagnetfeldes liegt in etwa bei 30-60 µT. Handelsübliche Geräte verwenden i.d.R. Magnetfeldstärken die ebenfalls im Mikroteslabereich liegen, wenige gehen darüber hinaus bis in den Milliteslabereich (FISCHER et al. 2002, QUITTAN 2004, HUUG und RÖÖSLI 2012). Für die Wirksamkeit der Magnetfeldtherapie (MFT) ist der einzelne magnetische Impuls auschlaggebend. Er ist gekennzeichnet durch die Impulsamplitude und die Impulsdauer. In Kombination mit einer entsprechenden Impulsfrequenz, die die Anzahl der Impulse pro Zeiteinheit angibt und in Hertz (Hz) gemessen wird, können verschiedene Impulsformen entstehen. Abb. 2.2 zeigt unterschiedliche Impulsformen, die in bisherigen Studien verwendet wurden (WATKINS et al. 1985, MARKOV 2007b). Die Höhe der am häufigsten verwendeten Frequenzen liegt nach HUUG und RÖÖSLI (2012) bei ca.

5-300 Hz und nach FISCHER et al. (2002) bei 1-100 Hz. Bei der MFT handelt es sich

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um ein nicht thermisches Verfahren (BASSETT 1987), d.h. das induzierte Gewebe wird keiner Erwärmung ausgesetzt. Zur Induktion von Hitze kommt es nur bei der Anwendung hochfrequenter, nicht-ionisierender Wellen (10⁹-10¹¹ Hz) (BLANK 1995).

Als wesentlicher Faktor bezüglich einer tatsächlichen biologischen Beeinflussbarkeit des behandelten Gewebes wird die Anstiegs- bzw. Abfallszeit der einzelnen Impulse benannt, da es nur in diesem Zeitraum zu Ladungsverschiebungen innerhalb des Gewebes kommen kann. Dabei fällt die im Gewebe induzierte Feldstärke umso höher aus, je steiler der Flankenanstieg oder –abfall ist (SCHMIDT-ROHLFING et al.

2000, MARKOV 2007b). BASSETT (1987), CHENG (1985) und MARKOV (2007b) erwähnen in diesem Zusammenhang den Begriff der „biologischen Fenster“. Hiermit sind der Frequenzbereich, die Frequenzform, die Amplitude und die Magnetfeldstärke gemeint, in denen ein nachweislicher Effekt tatsächlich erzielt wird.

2.1.3 Anwendungsgebiete und mögliche Wirkmechanismen

Seit ca. fünfzig Jahren ist die Magnetfeldtherapie in ihren verschiedenen Formen als Heilmethode bekannt. Sie gilt als alternative Behandlungstechnik gegenüber der Schulmedizin und verspricht als sichere, nicht invasive und einfach anzuwendende Methode Besserung bei einer Vielzahl von Erkrankungen (BASSETT 1993, MARKOV 2007b, SALOMONOWITZ et al. 2011). Ein konkreter wissenschaftlich abgesicherter Nachweis zur Wirksamkeit der Magnetfeldtherapie auf zellulärer bzw.

molekularer Ebene wurde bisher noch nicht erbracht (BLANK und GOODMAN 1997, CHENG 1985, FARNDALE et al. 1987, GOODMANN und HENDERSON 1988, AMMER 2004, SMITH et al. 2004).

Die am häufigsten erforschten Wirkmechanismen und Anwendungsgebiete gepulster magnetischer Felder sind: (1) der Einfluss auf die Osteogenese und die damit in Zusammenhang stehende Anwendung bei der Behandlung von Frakturen (BASSETT et al. 1974, BASSETT 1987, HANNAY et al. 2005), (2) der Einfluss bezüglich einer Schmerzreduktion mit einhergehender Bewegungseinschränkung und (3) der Einfluss bezüglich einer möglichen verbesserten Wundheilung (SCHUHFRIED et al.

2005). Die wohl am häufigsten auf zellulärer und molekularer Ebene erforschten Gebiete der Wirkmechanismen der Magnetfeldtherapie sind: (1) die Beeinflussung von Membraneigenschaften, hauptsächlich der Na⁺/K⁺-ATPase (FARNDALE et al.

Literaturübersicht

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1987, MARKOV 2007b), die für die Aufrechterhaltung des Membranpotentials verantwortlich ist; (2) die direkte Einwirkung auf die DNA (BLANK und GOODMAN 1997, CHENG 1985); und (3) die Beeinflussung der Proteinbiosynthese (BLANK und GOODMAN 2004, GOODMAN und HENDERSON 1988).

2.2 Methodik und Verfahren der Spermauntersuchung und Qualitätsbeurteilung

2.2.1 Samenuntersuchung

Die Untersuchung des Spermas stellt ein wichtiges Kriterium bei der Beurteilung der Zuchttauglichkeit dar. Anhand qualitativer und quantitativer spermatologischer Parameter soll eine Prognose bezüglich der Befruchtungsfähigkeit des Samens abgegeben werden (WABERSKI et al. 1999) Dabei sind an das Ejakulat eines Hengstes gewisse Mindestanforderungen zu stellen (MERKT und KLUG 1989).

Routinemäßig werden daher Parameter untersucht, die bereits seit einigen Jahrzehnten zur konventionellen Beurteilung von Ejakulaten eingesetzt werden.

Dazu gehören die Bestimmung von Konzentration und Volumen des Ejakulates, sowie die mikroskopische Bestimmung von Motilität und Morphologie (VARNER 2008). Die so bestimmten Parameter lassen jedoch nur bedingt eine Aussage über die Befruchtungsfähigkeit eines Ejakulates zu. Daher werden vermehrt moderne Verfahren wie beispielweise die computerassistierte Spermienanalyse zur Motilitätsbestimmung oder die flowzytometrische Spermauntersuchung zur Bestimmung der Plasmamembranintegrität, des akrosomalen Status oder der Chromatinintegrität eingesetzt (PETRUNKINA et al. 2008).

Das Alter der Hengste und die Jahreszeit haben zudem einen Einfluss auf das Sexualverhalten und die Spermaqualität (PICKETT et al. 1976, JOHNSON und NEAVES 1981, JOHNSON und THOMPSON 1983). Das Ejakulat von Deckhengsten sollte daher routinemäßig überprüft werden: einmal im Jahr vor der Decksaison, bei Verdacht auf beeinträchtigte Zuchttauglichkeit, bei abnormalem sexuellem Verhalten und beim Verkauf eines Hengstes (ENGLAND 1996).

18 2.2.2 Makroskopische Untersuchungen

Die makroskopische Beurteilung des Ejakulats sollte nach Filtration durch einen Gazefilter durchgeführt werden, damit der Schleimanteil der Samenblasendrüsen vom Ejakulat separiert wird. Die Farbe des normalen Hengstejakulates ist weiß bis gräulich-weiß, bei einer molke- bis milchähnlichen Konsistenz. Aus der Betrachtung von Farbe und Konsistenz des Ejakulates kann bereits eine grobe Schätzung der Spermienkonzentration im Ejakulat erfolgen. Eine rötliche Farbabweichung deutet auf Beimengungen durch Blut hin, eine gelbliche Verfärbung auf Urin. Flockige Bestandteile geben einen Hinweis auf Eiter (HOOGEWIJS 2010). Das Volumen eines Hengstejakulats beträgt zwischen 30 und 300 ml (ENGLAND 1996). Der Geruch sollte neutral sein. Der pH-Wert des Hengstejakulats liegt in der Regel zwischen 6,7 und 7,5. Zur Bestimmung der Spermienkonzentration kann generell ein Haemozytometer verwendet werden. Dieses Verfahren wird auf Grund seiner Spezifität als Standardmethode angegeben. Nachteilig jedoch ist die geringe Anzahl an Spermien die hierdurch erfasst wird (LOVE 2012). Verschiedene Zählkammern können bei dieser Methode eingesetzt werden. Zur Bestimmung der Samenzellkonzentration bei Pferden hat sich besonders die Neubauer-Zählkammer bewährt. Da der Aufwand diese Methode anzuwenden jedoch relativ hoch ist, hat sich das Verfahren in der Tiermedizin als relativ ungeeignet erwiesen, da hier meist eine hohe Anzahl an Proben zu untersuchen ist. In der Routinediagnostik werden meist Photometer benutzt (HOOGEWIJS 2010). Diese erzielen innerhalb eines gewissen Messbereichs (100-300 x 10⁶ Zellen/ml) relativ schnell gute Messergebnisse (BRINSKO et al. 2011). Die Spermienkonzentrationsbestimmung durch die Nutzung computerassistierter Spermienanalysesysteme wird aufgrund ihrer Ungenauigkeit nicht empfohlen (VANTMANN et al. 1988, BRITO 2010). Alternativ kann zur Bestimmung der Spermienkonzentration die Untersuchung fluoreszenzfarbstoffmarkierter Spermien mittels Durchflusszytometrie (EVENSON 1993b, HANSEN et al. 2002, CHRISTENSEN et al. 2004) oder mit Hilfe eines NucleoCounter^® (BRITO 2010, ANZAR et al. 2009, HANSEN et al. 2006) durchgeführt werden. Der Vorteil bei der Benutzung dieses Gerätes liegt darin, dass eventuelle Verunreinigungen durch Zelldebris nicht zu einer Verfälschung der

Literaturübersicht

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Messergebnisse führen (BRINSKO et al. 2011). Gleichzeitig kann mit diesem Gerät der Anteil plasmamembrangeschädigter Zellen bestimmt werden.

2.2.3 Mikroskopische Untersuchungen

Durch die mikroskopische Betrachtung der Samenprobe werden die Motilität und die Morphologie der Spermien beurteilt (WABERSKI et al. 1999), wobei standardisierte Bedingungen und Methoden einzuhalten sind. Nativsamen sollte auf Grund seiner Agglutinationsneigung nicht verwendet werden. Eine Samenprobe mit einer Konzentration von 25 bis 50 Millionen Samenzellen pro Milliliter sollte durch Verdünnung hergestellt und verwendet werden. Für die mikroskopische Untersuchung wird ein Phasenkontrastmikroskop bei 150 bis 200-facher Vergrößerung mit einem beheizbaren Objekträgertisch (37°C) verwendet. Es sollten dabei 4 bis 5 Gesichtsfelder in der Mitte eines Deckgläschens untersucht werden.

Pro Ejakulat sollten mindestens zwei unterschiedliche Proben betrachtet werden (SIEME et al. 2001).

Die mikroskopische Beurteilung der Spermienmorphologie wird anhand von Eosin- Nigrosin gefärbter Ausstrichpräparate durchgeführt (DOTT und FOSTER 1972).

Genauso dient die Eosin-Nigrosin Färbung der Unterscheidung zwischen lebenden und toten Spermien (BLOM 1950). Nach neueren Erkenntnissen gilt die Beurteilung der Spermienmorphologie mit Hilfe von Nasspräparaten („wet-mount preperation“) jedoch als exaktere Methode, wobei die Herstellung der Präparate zudem einfacher und schneller zu handhaben ist. Die zur Beurteilung benötigten Phasenkontrastmikroskope gehören zudem mittlerweile zur Standardausrüstung in den entsprechenden Untersuchungeinrichtungen (BRITO et al. 2011). Die Betrachtung unter einem Phasenkontrastmikroskop sollte mindestens mit einer 1000- fachen Vergrößerung vorgenommen werden (BRITO 2007, BRITO et al. 2011).

Ursprünglich sollten 200 Samenzellen begutachtet werden (DOWSETT et al. 1984, CROSS und MEIZEL 1989, JASKO et al. 1990, KAVAK et al. 2004, CARD 2005), neuere Studien geben eine Mindestanzahl von 100 Samenzellen an (BRITO 2007, BRITO et al. 2011). Im Durchschnitt sollte das Ejakulat eines Hengstes mindestens 50% morphologisch normale Spermien aufweisen (BRITO 2007).

Spermienanomalien werden in primäre, sekundäre und tertiäre Veränderungen

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gegliedert (BLOM 1977): primäre Veränderungen (z.B. Kopfveränderungen) entstehen durch Störungen während der Spermatogenese, sekundäre Anomalien (z.B. abgelöster Kopf, proximaler oder distaler Plasmatropfen) entstehen während der Nebenhodenpassage und tertiäre Missbildungen entstehen während der Samengewinnung und Samenuntersuchung (STOLLA 1984). Unter einem kompensatorischen Defekt wird eine Spermienanomalie verstanden, die zwar zu keiner Befruchtung durch das veränderte Spermium führt, aber durch eine ausreichende Anzahl intakter Spermien kompensiert werden kann.

Nichtkompensatorische Defekte führen zunächst zu einer Befruchtung der Eizelle, werden dann jedoch durch Störungen in der Embryonalentwicklung gefolgt.

Spermiendefekte mit einem starken Einfluss auf die Fruchtbarkeit werden als „Major Defects“ bezeichnet, Defekte mit einem weniger starken Einfluss als „Minor Defects“

(PARLEVLIET und COLENBRANDNER 1999). Auch in neueren Studien werden vermehrt bestimmte Qualitätsparameter, wie beispielsweise die Motilität und die Morphologie der Spermien untersucht, um deren Einfluss auf die Fertilität zu bestimmen. LOVE (2011) bestimmte dafür Motilitätsparameter mittels computerassistierter Spermienanalyse (CASA) und die Spermienmorphologie mit Hilfe der Differentialinterferenzkontastmikroskopie (DIC). Dabei fanden sich die höchsten Korrelationen zwischen der Gesamtmotilität der Spermien und zwischen dem prozentualen Anteil morphologisch intakter Spermien in Bezug zu den ermittelten Fertilitätsparametern.

2.2.3.1 Computerassistierte Spermienanalyse (CASA)

Von DOTT und FOSTER wurde 1979 die computerassistierte Spermienanalyse (CASA) eingeführt. Daraufhin wurden mehrere dieser Systeme entwickelt (z.B.:

IVOS, v. 12.2, Hamilton Thorne Research, Berverly, MA, USA; CellSoft-System, CRYO-Resources Ltd., NY, USA; SpermVision™, Fa. Minitüb, Tiefenbach, Deutschland). Die so durchgeführte Form der Spermienmotilitätsanalyse soll als objektive Beurteilungsmöglichkeit im Gegensatz zur subjektiven mikroskopischen Schätzung eine höhere Präzision und Reproduzierbarkeit bieten (BRITO 2010), was auch bereits bei Bullen- (GSCHWEND 1986, LEIDL et al. 1987, 1989) und Hengstspermien (ZIEGLER 1991) nachgewiesen werden konnte. Trotzdem wurde

Literaturübersicht

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bisher keine standardisierte Methode zur Durchführung der Motilitätsbestimmung evaluiert und die Konzentrationsbestimmung ist, wie bereits beschrieben, relativ ungenau. Neben der Möglichkeit unterschiedliche technische Einstellungen zu verwenden, führt insbesondere der Einfluss der verwendeten Messkammern zu variierenden Ergebnissen. In wissenschaftlichen Arbeiten ist es daher unerlässlich eine genau Auskunft über das verwendete CASA-System, die technischen Einstellungen und die eingesetzten Messkammern zu geben (HOOGEWIJS et al.

2012). Mittlerweile setzen nicht nur Forschungseinrichtungen sondern auch zunehmend Besamungsstationen dieses Verfahren ein (VERSTEGEN 2002). Über eine am Mikroskop angebrachte Kamera werden Bildsequenzen aufgenommen, die mit Hilfe einer speziellen Software auf einem Computer analysiert werden. Von jedem Bild werden die Spermienköpfe detektiert und die Strecken zwischen den Spermienkopfmittelpunkten auf den verschiedenen Bildern gemessen (JASKO et al.

1988, BLACH et al. 1989). So können neben der Spermiengeschwindigkeit weitere kinetische Parameter bestimmt werden (WABERSKI et al. 1999, BALTISSEN 2007).

In den meisten Fällen ist es nötig das zu untersuchende Ejakulat, möglichst mit Magermilchverdünner, auf eine vom Hersteller des Systems vorgegebene Konzentration einzustellen. Bei Verwendung von eidotterhaltigem Verdünner oder Vollmilchverdünner könnten Partikel als immotile Spermienköpfe erkannt werden und das Messergebniss verfälschen (JASKO et al. 1988). Zur Ermittlung präziser Messergebnisse empfehlen VOSS et al. (1981) pro Messduchgang mindestens eine Anzahl von 500 Spermien, JASKO et al. (1988) mindestens 400 Spermien zu untersuchen.

2.2.4 Durchflusszytometrie

Die Durchflusszytometrie, wurde in den achtziger Jahren des letzten Jahrhunderts in der spermatologischen Diagnostik eingeführt. Durch die zu Grunde liegende Technik ist es möglich mit Hilfe der verschiedenen Fluoreszenzfärbemethoden tausende Zellen innerhalb von Sekunden zu analysieren (STOLLA 1984, MORELL 1991, SPANO und EVENSON 1993, ANZAR et al. 2009). Dies ist ein wesentlicher Vorteil des Testverfahrens gegenüber der fluoreszenzmikroskopischen Beurteilung, bei der deutlich weniger Spermien analysiert werden (MAGISTRINI et al. 1997). Abhängig

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von den zu untersuchenden Parametern müssen verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe eingesetzt werden. Die Plasmamembranintegrität und der akrosomale Status werden i.d.R. durch eine kombinierte Färbung mit Propidiumiodid (PI) und Peanut-Agglutinin, konjugiert mit Fluoreszeinisothiocyanat (FITC-PNA), beurteilt (RATHI et al. 2001).

2.2.4.1 Sperm-Chromatin-Structure-Assay (SCSA)

Den Sperm-Chromatin-Structure-Assay (SCSA) entwickelten EVENSON et al.

(1980), um die Chromatinintegrität von Spermien zu untersuchen. Mit Hilfe des Sperm-Chromatin-Structure-Assay wird die Empfindlichkeit von Spermienchromatin gegenüber einer induzierten Denaturierung bestimmt (DIGRASSIE 2000). Die Denaturierung wird durch Zugabe von Säure erreicht und führt zu einer Aufspaltung der Doppelstränge fragmentierter DNA in Einzelstränge. Intakte DNA-Doppelstränge werden nicht aufgespalten. Anschließend erfolgt eine Anfärbung mit dem Fluoreszenzfarbstoff Akridinorange, der bei Anlagerung an einen DNA-Einzelstrang rotes Licht und bei Anlagerung an einen DNA-Doppelstrang grünes Licht emittiert (EVENSON et al. 1991). Im Anschluss daran wird der DNA-Fragmentationsindex als Anteil der Rotfluoreszenz an der Gesamtfluoreszenz (rote und grüne Fluoreszenz) berechnet. Das Fertilitätspotential der Samenproben von Hengsten definiert LOVE (2005) folgendermaßen: (1) DFI-Werte von 0-12% = hohes Fertilitätspotential, (2) DFI-Werte von 12-17% = gutes Fertilitätspotential, (3) DFI-Werte von 17-25% = mäßiges Fertilitätspotential.

2.3 Variabilität der Qualitätsmerkmale von Hengstsperma und der Sexualparameter

2.3.1 Deckverhalten

Das Deckverhalten von Hengsten wird geprägt durch die Geschlechtslust (Libido sexualis) und äußert sich in bestimmten Verhaltensweisen und physiologischen Reaktionsabläufen. Sowohl Art und Weise als auch Intensität basieren auf einem Zusammenwirken von angeborenem Instinktverhalten und einer zentralen hormonellen Steuerung (Hypothalamus-Hypophysen-Gonaden-Achse). Dabei erfolgt die Ausschüttung des Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH) pulsatil aus dem

Literaturübersicht

23

Hypothalamus. Dies wiederum initiiert die Freisetzung von Gonadotropinen aus der Hypophyse. LH (Luteinisierendes Hormon) führt zur Ausschüttung von Testosteron und Östrogenen aus den Hoden. FSH ist an der Steuerung der Spermatogenese beteiligt. Auch ein komplexes parakrin-autokrin wirkendes System (Abb. 2.1) ist an der Regulation der testikulären Funktionen beteiligt (ROSER 2008). Die Reaktionszeit als Maß für die Geschlechtslust beschreibt die Zeit, die ein Hengst von der ersten Wahrnehmung des Sprungpartners bis zum Aufsprung benötigt (SIEME et al. 2004). Sie sollte 10 Minuten bei Anwesenheit einer rossigen Stute nicht überschreiten. Sensorische Signale (optisch, akustisch, olfaktorisch) induzieren dabei Verhaltensweisen, die zur Durchführung des Deckaktes führen. Sie initiieren den Erektionsvorgang indem sie im zentralen Nervensystem (Erektionszentrum im Lumbal- und Sakralmark) verarbeitet werden und von dort über efferente Nervenbahnen zu den Genitalorganen führen (KLUG et al. 1999). Der Vorgang kann in drei Abschnitte gegliedert werden (MERKT und KLUG 1989): (1) die präkoitale Phase des Hengstes (Vorspielphase), die sich durch Flehmen, Wiehern, Hindrängen des Hengstes zur Stute und Genitalkontrolle dieser und im weiteren Verlauf durch Ausschachten und Erektion des Penis kennzeichnet; (2) die koitale Phase, die sich in den Aufsprung auf die Stute bzw. das Phantom, Umklammerung, Suchphase, Einführen des Penis und die sich anschließenden Friktionsbewegungen (6-8 Beckenschübe) und die Ejakulation gliedert; und (3) die postkoitale Phase, die aus dem Absprung, der Erschlaffung des Penis und dem Nachspiel besteht. Das Deckverhalten und die Spermaqualität eines Hengstes unterliegen dabei sowohl individuellen Einflüssen, wie dem Alter und dem damit in Verbindung stehenden Entwicklungsstand der Hoden und dem Spermienbildungsvermögen, als auch der exogenen Beeinflussung durch Haltung, Fütterung und Jahreszeit (Aurich et al. 1998, KLUG et al. 1999).

2.3.2 Einfluss des Alters

Die Spermaqualität eines Hengstes wird unter anderem durch das Alter beeinflusst.

Die Hodendimension und die Samenzellproduktion unterliegen genauso einer Altersabhängigkeit, wie die Höhe des Sexualhormonspiegels. Die Hodengröße nimmt nach KLUG (1982) bis zum 7. Lebensjahr kontinuierlich zu, bleibt zwischen dem 8.

24

und 18. Lebensjahr weitgehend konstant und fällt mit fortschreitendem Alter deutlich ab. Bezüglich der Gesamtspermienzahl im Ejakulat befinden sich die Hengste noch bis zum 8. und 9. Lebensjahr in einem Heranreifungsstadium. Nach AURICH et al.

(1998) findet die Größenzunahme der Hoden bis zu einem Alter von 4 bis 5 Jahren statt und beinhaltet eine Zunahme der Anzahl an Sertoli- und Leydigzellen, sowie eine Zunahme der Spermatogenesekapazität. Nachdem die sexuelle Reife mit 5 Jahren vollständig erreicht ist, treten ab dem 15. Lebensjahr bereits altersbedingte Rückbildungen auf. AMANN et al. (1979) geben an, dass die höchste Samenzellproduktion und die damit verbundene beste Samenqualität im Alter von 5 bis 15 Jahren vorliegt. Bezüglich der Motilität der Samenzellen im Ejakulat ist nach KLUG (1982) keine Beeinflussung durch das Alter erkennbar. In einer Studie von JOHNSON und THOMPSON (1983) finden sich bei älteren Hengsten (6 bis 20 jährig) höhere Konzentrationen von FSH, LH und Testosteron im Blutserum als bei jüngeren Tieren (4 und 5 jährig). Dabei sind die LH- und Testosteronwerte bereits bei 6 jährigen Tieren erhöht, die FSH-Werte jedoch erst ab einem Alter von 13 Jahren.

BLANCHARD et al. (2012) beschreiben einen Ablauf von Prozessen, der bei alten Hengsten (>20 Jahre) zu einer Beeinflussung ihrer testikulärer Funktionen und somit ihrer Fertilität führt. Dabei kommt es zunächst zu einer Verringerung des Ejakulatvolumens mit einhergehender Reduktion der Gesamtspermienzahl. Die Hodengröße verändert sich noch nicht. Im weiteren Verlauf wird ein Abfall des prozentualen Anteils morphologisch intakter und progressiv motiler Spermien beschrieben. Die ersten hormonellen Veränderungen gehen mit einem Rückgang der Trächtigkeitsraten einher. Dabei ist eine Reduktion der Östrogenkonzentration ebenso festellbar wie eine Reduktion der Testosteronkonzentration. In fortgeschrittenem Stadium, in dem bereits ein Rückgang der Hodengröße um bis zu 50 % festgestellt werden kann, steigt auch der prozentuale Anteil an Spermien mit erhöhten DFI-Werten.

2.3.3 Einfluss der Jahreszeit

Auch bei Hengsten unterliegt das Fortpflanzungsgeschehen einem saisonalen Einfluss. Dies wird durch die Tageslichtlänge hervorgerufen, aber auch Faktoren wie z.B. das Klima oder die Haltungsform bzw. das Nahrungsangebot können indirekt die

Literaturübersicht

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Regulation der Fortpflanzung beeinflussen (AURICH et al. 1998). Bei zunehmenden Tageslichtlängen wird die Hodenfunktion und damit auch die Konzentration testikulärer Hormone im Blut gesteigert (IRVINE und ALEXANDER 1982, CLAY und CLAY 1992), was zu einer Steigerung der Geschlechtslust und der Spermatogenese, sowie zur Stimulation der akzessorischen Geschlechtsdrüsen führen kann (HARRIS et al. 1983). Nach AURICH et al. (1999) besteht jedoch keine Korrelation zwischen der Testosteronkonzentration und der Libido sexualis. Dem Hypothalamus kommt dabei durch die Ausschüttung des Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH) eine zentrale Rolle zu. So sehen etliche Autoren die Serumkonzentrationen der Gonadotropine LH (THOMPSON et al. 1977, JOHNSON und THOMPSON 1983, BURNS et al. 1984, LOPES GUSMAO 1988, VON BREDOW 1995) und FSH (HARRIS et al. 1983) in den Frühjahrs- und Sommermonaten erhöht. JOHNSON und THOMPSON (1983) konnten jedoch keinen signifikanten Unterschied bezüglich der FSH-Konzentration im Blut zwischen den Sommer- und Wintermonaten feststellen.

Das Steroidhormon Testosteron, das im Hoden gebildet wird, erreicht nach BERNDTSON et al. (1974) im Monat Mai seine höchste Konzentration im Blut, die niedrigsten Werte dagegen in den Monaten Oktober, Dezember und Januar. Eine Zunahme von Größe und Gewicht der Hoden über die Decksaison sahen sowohl JOHNSON und THOMPSON (1983) als auch BURNS et al. (1984). Auch die Beschaffenheit des Ejakulates unterliegt saisonalen Schwankungen. PICKETT et al.

(1980) sehen ein Absinken der Spermiengesamtzahl im Winter. JANETT et al. (2003) untersuchten spermatologische Parameter von 10 Warmbluthengsten über einen Zeitraum von einem Jahr um saisonale Unterschiede hierin zu verdeutlichen und um den geeignetsten Zeitpunkt zur Kryokonservierung von Hengstsperma zu bestimmen. Dabei fanden sie heraus, dass das Ejakulatvolumen, die Gesamtspermienzahl und die Motilität in den Sommermonaten (Juni – August) signifikant höher waren als in den Wintermonaten (Dezember – Februar). Dagegen waren die Spermienkonzentration und der Anteil morphologisch intakter Spermien in den Sommermonaten signifikant niedriger, verglichen mit den Frühjahrs-, Herbst- und Wintermonaten. Aus den Ergebnissen schlussfolgerten sie, dass der beste Zeitpunkt zur Kryokonservierung von Hengstsperma im Herbst ist. Zu einem

26

diesbezüglich abweichenden Ergebnis kamen WRENCH et al. (2010), die den optimalen Zeitpunkt zur Kryokonservierung in den Frühjahrs- und Sommermonaten sehen (März – Juni). Ihre Untersuchungen ergaben in diesem Zeitraum die geringsten Differenzen zwischen Frischsamen und tiefgefrorenem Samen hinsichtlich der untersuchten spermatologischen Parameter. Auch zeigten sich in dieser Studie keine signifikanten Effekte hinsichtlich des Einflusses der Saison auf das Ejakulatvolumen, auf die Spermienkonzentration, auf die Gesamtspermienzahl, auf die Gesamtmotilität und auf die progressive Motilität. Bezüglich der Spermienmorphologie zeigten sich signifikante Unterschiede zwischen allen vier Versuchsabschnitten (Frühjahr/Sommer/Herbst/Winter), mit den höchsten prozentualen Anteilen morphologisch intakter Spermien im Frühjahr (März).

Literaturübersicht

27

Tab.2.1: Parameter zur Charakterisierung der magnetischen Feldexposition (modifiziert nach SCHMIDT-ROHLFING et al. 2000)

1. maximale Flussdichte (B) in Tesla (T) bzw. Gauss 2. Frequenz in Herz (Hz)

3. Anstiegszeit (ta ) eines Impulses in Mikrosekunden (µs) 4. Abfallszeit (tb ) eines Impulses in Mikrosekunden (µs) 5. Dauer der Einzelimpulse in Millisekunden (ms)

7. Länge der Spulen in Meter (m)

Abb.2.1: autokrin-parakrine Regulation der Hodenfunktion (modifiziert nach ROSER 2008)

Viele lokal wirkende Mechanismen gelten beim Pferd als unbekannt. Die Abbildung zeigt Mechanismen, die bei anderen Spezies beobachtet wurden: (GnRH) Gonadotropinfreisetzendes Hormon, (IGF-1) Insulinähnlicher Wachstumsfaktor 1, (INSL3) Insulinähnliches Peptid 3, (INH) Inhibin, (ACT) Activin, (ß-EP) beta-Endorphin, (Trans) Transferrin, (bFGF) basischer Fibroblastenwachstumsfaktor, (TGF) transformierender Wachstumsfaktor, (TGF-ß) transformierender Wachstumsfaktor beta, (TGF-α) transformierender Wachstumsfaktor alpha, (IL-1) Interleukin-1, (SGP) sulfatiertes Glykoprotein, (NGF) Nervenwachstumsfaktor, (PmodS) peritubulär modifizierende Substanz, (OT) Oxytocin, (VP) Vasopressin, (T) Testosteron, (E2) Estradiol. Die hellgrau hinterlegten Substanzen wurden bisher beim Pferd identifiziert.

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a) Sinusförmige Impulsform mit gleichbleibender Amplitude und Frequenz b) trapezoide Impulsform. Diese zeichnet sich durch längere Anstiegs- und Abfallszeiten aus

rise time = Anstiegszeit ; fall time = Abfallszeit pulse width = Impulsdauer bei maximaler Amplitude c) sinusförmige Impulsform, die zusätzlich in der Amplitude moduliert wird d) sägezahnförmige Impulsform. Ein Intervall besteht in dieser

Darstelllung aus mehreren aufeinanderfolgenden Einzelimpulsen

Abb.2.1 Ausgewählte Impulsformen, die bisher in Untersuchungen mit gepulsten magnetischen Feldern eingesetzt wurden (modifiziert nach MARKOV 2007b (a-c) und WATKINS et al. 1985 (d))

Material und Methoden

29 3.

Material und Methoden

3.1 Versuchshengste

Die Untersuchungen erstreckten sich über einen Zeitraum von insgesamt 24 Wochen. Sie fanden während der routinemäßigen Herstellung von Tiefgefriersperma im Jahr 2010 (Oktober 2010 – Dezember 2010) und zu Beginn der regulären Decksaison 2011 (Januar 2011 – April 2011) statt. Für die Untersuchungen standen insgesamt 11 Warmbluthengste und ein Vollbluthengst des Niedersächsischen Landgestüts in Celle zur Verfügung. Die Hengste waren zwischen 4 und 23 Jahren alt. Alle Tiere waren in der Hengstprüfungsanstalt Adelheidsdorf aufgestallt. Vor Beginn der Untersuchungen erfolgte dreimal in einem Abstand von jeweils 48 Stunden eine Samenentnahme, wobei die Ejakulate verworfen wurden. Die Tiere zeigten ein arttypisches Deckverhalten, sie waren im Allgemeinbefinden ungestört, erb- und geschlechtsgesund. Ihre tägliche Futterration bestand aus Heu, Hafer und einem pelletierten Zusatzfutter. Wasser stand jederzeit über Selbsttränken zur Verfügung. Die Hengste (n=12) wurden entsprechend ihres Alters in drei Gruppen unterteilt. Junge Hengste (4–6 jährig, n=4), mittelalte Hengste (7–11 jährig, n=4) und alte Hengste (12–23 jährig, n=4). Sechs Hengste bildeten eine Untersuchungsgruppe (G1 und G2), die aus je zwei Hengsten einer Altersgruppe bestand.

3.2 Medithera VET-System M-1000

Die Hengste wurden einer gepulsten Magnetfeldtherapie unterzogen. Zum Einsatz kam dabei eine Magnetfelddecke („VET-System M1000“, Fa. Medithera AG, Höhn/Ww.). Diese Einheit bestand aus einem Rückenapplikator in Form einer handelsüblichen Pferdedecke, einem Steuergerät und einem Akku-Netzteil, die beide seitlich an der Decke befestigt wurden. Die Magnetfelddecke wurde täglich (Montag bis Samstag) für 20 Minuten im Programm „Aktiv“ mit der Intensitätsstufe „7“

angewendet. Die Technischen Daten sind in Tabelle 3.1 aufgeführt. Die dieser Programmeinstellung zu Grunde liegende Stärke des Magnetfeldes beträgt 22,5 µT (=0,22 Gauß) bei einer dominanten Frequenz von 10 Hz und Trägerfrequenzen von

30

250 Hz und 500 Hz. Die induzierten Impulse haben die Form eines Rechtecks, Anstiegs- und Abfallszeiten ähneln in ihrem Aussehen einer e-Funktion. Die Einstellungen blieben über den gesamten Versuchszeitraum konstant.

3.3 Versuchsaufbau

Der Gesamtuntersuchungszeitraum erstreckte sich über 24 Wochen und war untergliedert in Abschnitte von je sechs Wochen. Wie in Abbildung 3.2 dargestellt, wurden die Gruppen G1 und G2, mit jeweils sechs Hengsten, in sechs- wöchigem Rhythmus alternierend der Magnetfeldtherapie unterzogen. Während des täglichen Behandlungszeitraumes von 20 Minuten wurden die Hengste in ihren Boxen angebunden. Die Samenentnahme aller Hengste erfolgte dreimal pro Woche (Montag/Mittwoch/Freitag), wobei nur zweimal pro Woche eine Untersuchung der Ejakulate jedes Hengstes erfolgte.

Die Untersuchungen gliederten sich in zwei Bereiche. Zunächst wurde morgens während der Samenentnahme im Sprungraum das Deckverhalten mittels Zeitmessungen an zuvor festgelegten Abschnitten des Deckaktes beurteilt (s. 3.4.1).

Danach erfolgte im angrenzenden Labor die standardspermatologische Untersuchung des Ejakulates und die Anfertigung der Eosin-Nigrosin Ausstrichpräparate (s. 3.6). Die computervideographischen Untersuchungen zur Bestimmung von Motilitätsparametern (s. 3.8) fanden am selben Tag statt, die durchflusszytometrischen Untersuchungen zur Bestimmung der Chromatinintegrität (s. 3.7) zu einem späteren Zeitpunkt.

3.4 Samengewinnung und Untersuchung des Deckverhaltens 3.4.1 Untersuchung des Deckverhaltens

Insgesamt wurden drei Zeitintervalle während des Deckaktes gemessen. Dafür war sowohl der Hengstführer als auch der Samennehmer mit einer Stoppuhr ausgestattet. Gemessen wurden: (1) die Zeit vom Betreten der Deckhalle bis zum Beginn des Ausschachtens, (2) die Zeit vom Ausschachten bis zum Aufsprung, (3) die Zeit vom Aufsprung bis zur Ejakulation. Desweiteren wurde die Anzahl der Aufsprünge bis zur Ejakulation dokumentiert. Um stets dieselben Voraussetzungen

Material und Methoden

31

zu gewährleisten, wurden sowohl der Sprungraum als auch die künstliche Scheide jeweils komplett vorbereitet, bevor der Hengstführer den nächsten Hengst zum Decken geholt hat.

3.4.2 Samengewinnung

Für die Samenentnahme wurde eine künstliche Scheide verwendet (Modell

„Hannover“, KLUG 1993), welche für jeden Deckakt mit einer Einmalschlauchfolie (Fa. Minitüb, Tiefenbach) versehen wurde. Der Sprungraum war mit einem Phantom (Modell „Celle“, KLUG 1993) ausgestattet. Eine Stute, die sich fixiert an der Kopfseite des Phantoms in einem Untersuchungsstand befand, war immer anwesend. Zum Auffangen des Ejakulates diente eine sterile, graduierte Glasflasche. Um Verunreinigungen und die Gelfraktion von der spermienreichen Fraktion des Ejakulates zu trennen, wurde ein Gazefilter (Fa. Minitüb, Tiefenbach) in die Glasflasche eingezogen. Als Schutz und um Temperaturschwankungen zu

verhindern wurde die Glasflasche mit einem gepolsterten Kunstoffüberzug (Fa. Minitüb, Tiefenbach) versehen.

Unmittelbar nach dem Deckakt wurden das Volumen (ml), sowie die Farbe (grau/weiß/gelb) und die Konsistenz (wässrig/molkig/milchig/rahmig) des Ejakulates beurteilt. Aus dem Nativsamen wurden Eosin-Nigrosin-Ausstrichpräparate zur Beurteilung der Spermienmorphologie angefertigt. Im Anschluss wurden für die spätere Bestimmung der Chromatinintegrität 2 ml Nativsperma in ein verschraubbares Kryoröhrchen (Fa. Greiner, Frickenhausen) gefüllt und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. In diesem blieben sie bis zur weiteren Untersuchung bei -196°C gelagert. Für die Motilitätsanalyse wurde ein Teil des restlichen Nativsamens mit dem Magermilchverdünner INRA-82 (25 g/I Glukose-Monohydrat, 1,5 g/I Laktose- Monohydrat, 1,5 g/I Raffinose, 0,4 g/I Kalium-Citrat-Monohydrat, 0,3 g/I Tri-Natrium- Citrat-Dihydrat, 4,76 g/I HEPES, 0,5 g/I Penicillin, 0,5 g/I Gentamicin, 0,15%

Magermilch pH 7.0 (0,5 l auf 0,5 I Verdünneransatz), 300-320 mOsm/kg) auf eine Konzentration von 90 x 10⁶ Samenzellen/ml verdünnt.

32

3.5 Dichtemessung und Bestimmung der Viabilität mittels NucleoCounter®

Die Dichte der Ejakulate und die gleichzeitige Bestimmung der Viabilität erfolgte mit Hilfe des NucleoCounter^® SP-100™ (Fa. ChemoMetec A/S, Allerød/Dänemark).

Dieser besteht aus einem Fluoreszenzmikroskop und einer CCD-Kamera (Charge- coupeld-Device). Zur Bestimmung der Dichte des Ejakulates wurden 50µl Nativsamen zusammen mit 5ml Aufschlusslösung Reagent S-100 (Fa. ChemoMetec A/S, Allerød/Dänemark) in ein verschraubbares Kunststoffröhrchen gegeben und durch kurzes Schwenken miteinander vermischt. Durch die Aufschlusslösung wurden die Plasmamembranen der Spermien zerstört. Zur Messung wurden dann 50µl dieser Lösung in die sogenannte SP1-Cassette™ (Fa. ChemoMetec A/S, Allerød/Dänemark) aufgesogen. In der Cassette befand sich in immobilisiertem Zustand der Farbstoff Propidiumiodid (PI), welcher durch die aufgesogene Lösung freigesetzt wurde und so die DNA der Spermien angefärbt hat. Die Cassette wurde nun unmittelbar in die Messkammer des NucleCounter^® eingesetzt und der Messvorgang gestartet. Die Messung dauerte insgesamt 30 Sekunden, danach erhielt man auf dem Display das Ergebnis in der Einheit 1 x10⁶ Spermien/ml. Zur Bestimmung des Anteils plasmamembrandefekter Spermien wurde derselbe Messvorgang wiederholt, jedoch wurde anstatt der Aufschlusslösung Reagent S-100 (Fa. ChemoMetec A/S, Allerød/Dänemark) PBS als Verdünnungslösung verwendet.

Dieses zerstörte die Plasmamembranen nicht, wodurch sich der Farbstoff PI in der SP1-Cassette™ nicht mit der in den Zellkernen befindlichen DNA plasmamembranintakter Spermien verbinden konnte. Somit konnte nur die DNA der Spermien angefärbt werden, deren Plasmamembranen bereits geschädigt war. Aus den Ergebnissen beider Messungen ließ sich der prozentuale Anteil plasmamembrandefekter Spermien bestimmen und somit auch der Anteil plasmamembranintakter Spermien errechnen.

3.6 Eosin-Nigrosin Ausstrichpräparate

Der Anteil morphologisch abweichender Samenzellen wurde nach den Vorgaben von BRITO (2007) bestimmt. Zu jeweils 100 µl Nativsperma wurden 300 µl Eosin- Nigrosin Lösung gegeben (10% Nigrosin, 0,7% Eosin, 3,75 mM Na2HPO4, 1,88 mM

Material und Methoden

33

KH2PO4, 5,78 mM NaK Tartrat, 3,75 mM Glukose). Nach 30-sekündiger Inkubation und Durchmischung wurden von diesem Gemisch zwei Ausstrichpräparate angefertigt. Bei 1000-facher Vergrößerung mit Ölimmersion unter einem Phasenkontrastmikroskop (Olympus BX40, Fa. Olympus, Hamburg) fand die Beurteilung der Spermienmorphologie statt (s. Tab. 3.2). Pro Ausstrich wurden 200 Spermien beurteilt.

3.7 Flowzytometrische Bestimmung der Spermienchromatinintegrität (SCSA) 3.7.1 Geräte und Geräteeinstellungen

Für die durchflusszytometrischen Untersuchungen zur Chromatinintegrität wurde das Durchflusszytometer FACScan™ (Fa. Becton Dickinson, Heidelberg) verwendet. Das Gerät ist mit einem Argonionenlaser mit einer Wellenlänge von 488 nm und einer Leistung von 15 mW ausgestattet. Um die emittierten Fluoreszenzsignale messen zu können, standen drei verschiedene Filter zur Auswahl: FL-1 (BP 530/30 nm) für die

grüne Fluoreszenz, FL-2 (BP 585/42) für die orange Fluoreszenz und FL-3 (LP 650 nm) für die rote Fluoreszenz. Zur Steuerung des Durchflusszytometers war

das Gerät an einen Computer, auf dem das Softwareprogramm Cellquest™

(Fa. Becton Dickinson, Heidelberg) installiert war, angeschlossen.

3.7.2 Messprinzip und Durchführung der Spermienchromatinstrukturanalyse (SCSA)

Die Spermienchromatinintegrität wurde nach der von EVENSON und JOST (2000) beschriebenen Methode SCSA™ (sperm chromatin structure assay) bestimmt. Da fragmentiertes Chromatin eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber einer Säuredenaturierung besitzt, wird hierdurch bei der Spermienchromatin- strukturanalyse eine teilweise Trennung der eigentlich doppelsträngig vorliegenden DNA bewirkt. Nach der sich anschließenden Färbung mit Akridinorange emittiert doppelsträngige DNA Licht im grünen Bereich, wohingegen einzelsträngige DNA eine rote Fluoreszenz zeigt. Bei jedem einzelnen Spermium einer Probe wird somit durchflusszytometrisch die Intensität der grünen und der roten Fluoreszenz bestimmt. Der DNA-Fragmentationsindex (DFI), welcher ein Maß für die Integrität der

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Chromatinstruktur der einzelnen Spermien darstellt (EVENSON et al. 2002) wird dann aus dem Anteil Rotfluoreszenz an der Gesamtfluoreszenz bestimmt. Die Darstellung der einzelnen Fluoreszenzen erfolgte computergestützt in einem Punktwolkendiagramm. Anschließend wurden die DFI-Werte in einem Verteilungshistogramm entsprechend ihrer vorkommenden Häufigkeit nach dargestellt.

Um die Messungen durchzuführen, wurden zunächst die zu untersuchenden, schockgefrorenen Nativspermaproben im Wasserbad bei 38°C für 2 Min. aufgetaut.

Die anschließenden Vorgänge wurden in einem Eiswasserbad (4°C) durchgeführt, bzw. wurden die eingesetzten Substanzen permanent darin gekühlt. Die Nativprobe wurde mit TNE-Puffer (0,15 M NaCl, 0,01 M Tris HCL, 1 mM EDTA, pH 7,4) auf eine Konzentration von ca. 2 x 10⁶ Spermien/ml eingestellt. Danach wurden zu 200 µl dieser Spermiensuspension 0,4 ml Säuredetergenz-Lösung (0,08 M HCL, 0,15 M NaCl, 0,1% Triton-X-100, pH 1,2) gegeben, diese für ca. 30 Sekunden auf einem Vortexer vermischt und anschließend mit 1,2 ml Akridinorangelösung (0,15 M NaCl, 0,037 M Citric acid, 0,126 M Na2HPO4, 0,0011 M EDTA, pH 6,0, beinhaltet 6 µg mL^-1 Akridinorange) versetzt. Nach weiteren 3 Minuten Inkubation in einem Eiswasserbad erfolgte dann die flowzytometrische Messung. Die Bearbeitung und Auswertung der Daten wurde mit dem Softwareprogramm DAS Version 4.40 (BEISKER 1994) vorgenommen.

3.8 Durchführung der computerassistierten Spermienmotilitätsanalyse

Die Motilitätsanalyse erfolgte mit dem computerassistierten Spermienanalysesystem (CASA) SpermVision™ (Fa. Minitüb, Tiefenbach). Zur Verfügung stand dazu ein Phasenkontrastmikroskop (Olympus BX40, Fa. Olympus, Hamburg) mit aufgebautem optischen System (60 Bilder/Sekunde), welches an einen separaten Computer angeschlossen war, auf dem sich die benötigte Software befand. Für die Analyse wurden ausschließlich standardisierte Messkammern (20 Mikron, SSC 20-01-04-B, Fa. Leja, Nieuw-Vennep, die Niederlande) mit einer Einfülltiefe von 20 µm verwendet.

Bei dem zur Verfügung stehenden Gerät wurde der Objektträgertisch manuell

Material und Methoden

35

bedient. Die Einstellungen der Software orientierten sich ebenso an den Vorgaben des Herstellers wie die Durchführung der Messungen.

Die Motilitätsanalysen wurden an dem zuvor bereits verdünnten Sperma (90 x 10⁶ Spermien/ml in INRA 82) durchgeführt. Die zur Durchführung der

Messungen benötigten Gegenstände (Leja-Kammern, Heizblock für Eppendorfgefäße, Pipettenspitzen) wurden zuvor auf 38°C angewärmt. Aus der Spermiensuspension wurde 1 ml in ein 1,5 ml fassendes Eppendorfgefäß pippetiert und für 5 Minuten bei 38°C inkubiert. Nach kurzem Schwenken der Probe wurde umgehend eine Leja-Kammer mit 2,5 µl dieser Spermiensuspension befüllt. Das Befüllen erfolgte nach den Vorgaben der Firma Minitüb. Darauf folgte die Motilitätsanalyse. Hierbei wurden insgesamt acht Felder durch manuelle Betätigung des Objektträgertisches ausgewählt. Die Messung erfolgte auf der Längsachse der Kammer Richtung Kammeröffnung. Mindestens 800 Spermien pro Messung wurden hierdurch erfasst. Die dabei ermittelten Motilitätsparameter sind in Tabelle 3.3 zusammengefasst.

3.9 Statistische Auswertungen

Die Beratung und die Durchführung der statistischen Auswertung erfolgte am Institut für Biometrie und Epidemiologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover. Zur statistischen Auswertung der Versuchsergebnisse wurde das Programm SAS^®- Software (“Statistical Analysis System“, SAS Institute, Iowa, Cary, NC/USA) Version 9.3 verwendet.

Zunächst erfolgte eine Überprüfung der Ergebnisse auf Normalverteilung mit Hilfe des Kolmogorov-Smirnov-Tests und der visuellen Beurteilung von q-q-Plots. Daraus ergab sich eine leichte Rechtsverschiebung der Ergebnisse, die durch Logarithmieren der Werte für die weitere Berechnung behoben wurde. Überprüft wurde daraufhin der Einfluss der gepulsten Magnetfeldtherapie, der Einfluss des Alters und der Einfluss des jeweiligen zeitlichen Therapieabschnitts auf die Parameter, die zur Bestimmung des Deckverhaltens gemessen wurden (Gesamtdeckzeit / Anzahl der Aufsprünge) und auf die spermatologischen Parameter Gesamtspermienzahl, Plasmamembranintegrität, Morphologie, progressive Motilität

36

und Chromatinintegrität. Die Kalkulation wurde mit Hilfe einer drei-faktoriellen Varianzanalyse (SAS-Funktion “Mixed“) durchgeführt. Als Signifikanzgrenze wurde bei allen Tests eine Irrtumswahrscheinlichkeit von p < 0.05 herangezogen. Aufgrund der geringen Anzahl an Individuen in den einzelnen Altersklassen konnten die Ergebnisse zwischen den Altersklassen (jung/mittel/alt) innerhalb und zwischen den Untersuchungsgruppen G1 und G2 nur deskriptiv anhand von Mittelwerten betrachtet werden.

Material und Methoden

37

Tab.3.1: Technische Daten VET-System M-1000 (Fa. Medithera, Höhn/Ww.)

Versorgungsspannung 9V DC

Netzspannung 110/230 V

Netzfrequenz 60/50 Hz

Leistungsaufnahme 10 W max.

Applikatoranschluss 2x3 pol.-6,3 Klinkenbuchse

Intensitätseinstellung,Stufen Tasten 1-10 u. Sensitiveinstellung

Anwendungsdauer 1-59 Min. einstellbar

Anwendungsstrom ca.1600 mA bei Stufe 10 ca.75 µT

ca. 160 mA bei Stufe 1 ca. 7,5 µT

Tab.3.2: Beurteilungsschema Spermienmorphologie (modifiziert nach WEITZE 2001)

Abweichung: Differenzierung:

Kopfkappenveränderung deformiert, in Ablösung / abgelöst

Kopfveränderungen deformierte Köpfe

Halsveränderungen Plasmatropfen, paraxialer / retroaxialer Ansatz, Halsbruch

Verbindungsstückveränderungen Plasmatropfen, deformiert, gebrochen fibrillär

Haupt- und Endstückveränderungen aufgerollt, Plasmatropfen, Schleifenform um den Kopf gerollt, rudimentär

Doppel- und Mehrfachmissbildungen Mehrfachschwänze, Doppelköpfe

Unveränderte Spermien

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Tab.3.3: CASA-Parameter (modifiziert nach KLEWITZ 2009)

DAP= Distance average path (µm): Die errechnete zurückgelegte Strecke der gemittelten Bahn zwischen Anfangs- und Endpunkt der Messung DCL= Distance curve line (µm): Die tatsächlich zurückgelegte Strecke des

Spermiums zwischen Anfangs- und Endpunkt der Messung (Kurvolineare Strecke)

DSL= Distance straight line (µm): Die errechnete Strecke zwischen Anfangs- und Endpunkt der Messung

VAP= Velocity average path (µm/s): Die Durchschnittsgeschwindigkeit des Spermienkopfes entlang der gemittelten Bahn

VCL= Velocity curve line (µm/s): Die Geschwindigkeit des Spermiums auf der tatsächlichen, kurvolinearen Bahn

VSL= Velocity straiht line (µm/s): Die errechnete Durchschnittsgeschwindigkeit des Spermiums entlang der geraden Linie zwischen dem ersten und letzten Punkt der erkannten Bahn

STR= Straightness (VSL/VAP): Die Linearität der gemittelten Bahn

LIN= Linearity (VSL/VCL): Die Linearität der tatsächlichen Bahn

WOB= Wobble (VAP/VCL): Die Abweichung der tatsächlichen Bahn von der gemittelten Bahn

ALH= Amplitude of lateral head displacement (µm): Die Größe des seitlichen Spermienkopfausschlages von der gemittelten Bahn

BCF= Beat cross frequenzy (Schläge/s oder Hz): Die Kopfschlagfrequenz, berechnet aus der durchschnittlichen Anzahl der Kreuzpunkte der tatsächlichen Bahn mit der gemittelten Bahn

MOT= Gesamtmotilität (%)

PMS= Progressive Motilität (%)

Material und Methoden

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Abb.3.1: Schema des Versuchsaufbaus

Samengewinnung n = 12 Hengste Magnetfeldtherapie

t = 20 Minuten 6d / Woche

Beurteilung des Deckverhaltens

Standardspermatologie

 Volumen

 Farbe

 Konsistenz

 Gesamtspermienzahl

Dichtemessung und Bestimmung der Viabilität mittels NucleoCounter™

Eosin-Nigrosin Ausstrichpräparate

 Morphologie

schockgefrorene Nativprobe

Verdünnung mit INRA82 (90 x 10⁶ Spermien/ml)

Computervideomikrographische Untersuchung

 Motilität (SpermVision™)

Durchflusszytometrische Untersuchung

 Chromatinintegrität SCSA™-Test Lagerung bei -196°C

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Oktober 2010 April 2011

6 Wochen 6 Wochen 6 Wochen 6 Wochen Therapie keine Therapie Therapie keine Therapie

6 Wochen 6 Wochen 6 Wochen 6 Wochen

keine Therapie Therapie keine Therapie Therapie

- Therapie: Behandlung mit der Magnetfelddecke für 20 Minuten (Montag bis Samstag)

- Altersgruppe: junge Hengste (4-6 jährig), mittelalte Hengste (7-11 jährig) alte Hengste (12-23 jährig)

Montag Mittwoch Freitag

Samenentnahme Samenentnahme Samenentnahme und Untersuchung und Untersuchung

- Samenentnahme: die Samenentnahme fand bei allen 12 Hengsten dreimal pro Woche statt - Untersuchung: die Untersuchungen fanden Montag/Mittwoch/Freitag statt (hier nur beispiel-

haft dargestellt). Die Ejakulate jedes Hengstes wurden zweimal pro Woche untersucht

Abb.3.2 Zeitschema des Versuchsaufbaus

Gesamtuntersuchungszeitraum Magnetfeldtherapie: 24 Wochen

Gruppe G1, n = 6 Hengste ( zwei Hengste jeder Altersgruppe)

Gruppe G2, n = 6 Hengste ( zwei Hengste jeder Altersgruppe)

Wöchentlicher Untersuchungsablauf

Ergebnisse

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4. Ergebnisse

4.1 Bestimmung des Einflusses einer gepulsten Magnetfeldtherapie auf das Deckverhalten unter zusätzlicher Berücksichtigung des Alters und der Saisonalität

Im ersten Teil der Versuche wurde anhand von Zeitmessungen bei der Samenentnahme untersucht, inwieweit sich gepulste Magnetwellen auf das Sexualverhalten (Libido sexualis) von Hengsten auswirken. Die dabei gemessenen Zeitabschnitte sind Kapitel 3.4.1 zu entnehmen. Aus diesen einzelnen Zeitabschnitten wurde die Gesamtdauer des Deckaktes (Gesamtdeckzeit) bestimmt.

Die Anzahl der Aufsprünge bis zur Ejakulation wurde als weiterer Parameter dokumentiert.

Effekte bezüglich der Magnetfeldtherapie (Abb. 4.1/A) und des Alters der Hengste (Abb. 4.3/A) wurden nicht beobachtet (p ≥ 0,05). Wie in Abb. 4.2/A dargestellt, ergab die Varianzanalyse Unterschiede zwischen Abschnitt 1 und 2 (p = 0,0173), zwischen Abschnitt 1 und 3 (p = 0,0073) und zwischen Abschnitt 1 und 4 (p = 0,003).

Bei der Betrachtung der Mittelwerte konnten in beiden Gruppen (G1/G2) ggr. längere Gesamtdeckzeiten für die Zeiträume mit Magnetfelddecke gesehen werden (Abb. 4.1/A).

Bei der Betrachtung der einzelnen Versuchszeiträume zeigte sich in Gruppe 2 ein stetiger Anstieg der Werte der Gesamtdeckzeiten (in sec.) von Abschnitt 1 (60,13 ± 40,38) bis Abschnitt 4 (107,37 ± 44,51). In Gruppe G1 zeigte sich dieser Anstieg von Abschnitt 1 (104,20 ± 64,47) bis Abschnitt 3 (131,36 ± 71,54). In Abschnitt 4 kam es zu einem deutlichen Abfall der Gesamtdeckzeit (102,57 ± 41,51), der in Gruppe G2 nicht beobachtet werden konnte (Abb. 4.2./A).

In Gruppe G1 zeigte die Mittelwertdarstellung (Abb. 4.3/A) die kürzeste Gesamtdeckzeit (in sec.) für die Hengste der Klasse „jung“ (104,53 ± 30,48) und die längste Gesamtdeckzeit für die Hengste der Klasse „alt“ (138,51 ± 102,57). In Gruppe G2 zeigten die Hengste der Klasse „mittel“ die längste Gesamtdeckzeit (98,36 ± 45,56) und die Hengste der Klasse „alt“ die kürzeste (54,14 ± 14,44).

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Abb.4.1: Darstellung der Gesamtdeckzeit (in sec.) für die Zeiträume mit und ohne Magnetfelddecke (jeweils 12 Wochen) über den Versuchszeitraum von 24 Wochen.

Fig.A: Gesamtgruppendarstellung mit 12 Hengsten, sowie Einzelgruppendarstellung mit jeweils 6 Hengsten

Fig.B: Gruppe 1 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse Fig.C: Gruppe 2 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse

Es wurden Mittelwerte mit Standardabweichungen aus zwei Ejakulaten pro Hengst und Woche ermittelt.

jung / mittel / alt = Altersgruppeneinteilung (4-6 Jahre / 7-11 Jahre / 12-23 Jahre) + / - = Zeitraum mit Magnetfelddecke / ohne Magnetfelddecke