Aus der Klink für Kleine Haustiere der tierärztlichen Hochschule
Hannover und der Neurologischen Klinik der Medizinischen Hochschule Hannover
Einfluss von Interferon-β auf Oligodendrozyten: In vitro und in vivo Untersuchungen
INAUGURAL-DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin (Dr.med.vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Sandra Heine aus Braunschweig
Hannover 2006
Wissenschaftliche Betreuung: Prof`in Dr. A. Tipold PD Dr. M. Stangel
1.Gutachterin: Prof`in A. Tipold 2.Gutachter: Prof. Dr. G. Bicker
Tag der mündlichen Prüfung: 21.11.2006
Meinen lieben Eltern
Teile der vorgelegten Dissertation wurden bereits in folgendem Paper veröffentlicht:
HEINE S., J. EEBNET, S. MAYSAMI, M. STANGEL (2006):
Effects of interferon-beta on oligodendroglial cells.
Journal of Neuroimmunology 177:173-180
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG...13
2 LITERATURÜBERSICHT...15
2.1 Krankheitsverlauf und klinische Symptome der Multiplen Sklerose ... 15
2.2 Pathologische Merkmale der Multiplen Sklerose ... 15
2.3 Das Heterogenitätskonzept zur Läsionsentstehung ... 16
2.4 Bestandteile der Myelinscheide ... 17
2.5 Oligodendrozyten... 18
2.6 Oligodendrozyten – Myelinisierung des Zentralen Nervensystems... 18
2.7 Morphologische Veränderungen während der Reifung der Oligodendrozyten... 19
2.8 Myelinisierung der Axone ... 20
2.9 Warum findet in der Multiplen Sklerose keine vollständige Remyelinisierung statt? ... 21
2.10 Interferone... 21
2.11 Immunmodulatorische Effekte von Interferon-ββββ... 22
2.12 Interferon-ß in der Therapie der Multiplen Sklerose... 24
2.13 Das Cuprizonemodell- ein toxisches Tiermodell für die Multiple Slerose ... 24
3 MATERIAL UND METHODEN...27
3.1 Geräte und Materialien... 27
3.1.1 Geräte, Laborbedarf ... 27
3.1.2 Zentrifugen:... 28
3.1.3 Mikroskope: ... 28
3.1.4 Reagenzien und Laborbedarf für die in vitro Untersuchungen: ... 28
3.1.5 Antikörper für die in vitro Färbungen ... 30
3.1.6 Verwendete Kulturmedien und Lösungen... 30
3.1.7 Verwendete Tiere ... 32
3.1.8 Materialien und Reagenzien für die in vivo Untersuchungen ... 33
3.1.9 Lösungen für die Eponeinbettung ... 34
3.1.10 Lösungen für die Luxol Fast Blue-Färbung ... 34
3.1.11 Übersicht über die verwendeten Antikörper für die Immunhistochemie ... 35
3.2 Computer-Software ... 36
3.3 In vitro Untersuchungen ... 37
3.3.1 Präparation der Pimärzellkulturen... 37
3.3.2 Gewinnung der gemischten Gliazellkultur ... 38
3.3.3 Kultivierung der gemischten Gliazellkultur ... 38
3.3.4 Aufreinigung von Oligodendrozytenvorläuferzellen... 38
3.3.5 Kultivierung der gereinigten Oligodendrozytenvorläuferzellen... 39
3.4 In vitro-Versuche ... 39
3.4.1 Poliferationsassay... 39
3.4.2 Differenzierungsassay ... 40
3.4.3 Differenzierungsassay an gereinigten Oligodendrozytenvorläuferzellen ... 41
3.4.4 Statistische Auswertung der in vitro Daten ... 42
3.5 In vivo Untersuchungen ... 43
3.5.1 Gehirnentwicklung bei C57Bl/6-Mäusen und Interferon-β-k.o.-Mäusen... 43
3.5.2 Durchgeführte Färbungen zur Gehirnentwicklung an Paraffinschnitten ... 43
3.5.3 Auswertung der Ergebnisse der vergleichenden Gehirnentwicklung... 44
3.5.4 Interferon-β k.o.-Mäuse im Cuprizonemodell... 44
3.5.5 Durchgeführte Färbungen... 45
3.6 Allgemeine Durchführungen für die vergleichende Gehirnentwicklung und das Tiermodell... 45
3.6.1 Einbettung in Paraffin ... 45
3.6.2 Einbettung in Epon... 45
3.6.3 “Luxol Fast Blue“... 46
3.6.4 Grundsätzlicher Färbevorgang immunhistologischer Färbungen:... 47
3.7 Auswertung der Daten in vivo ... 48
3.7.1 Auswertung der Gewichtsverläufe ... 48
3.7.2 Myelinbeurteilung ... 48
3.7.3 Auswertung der elektronenmikroskopischen Bilder ... 48
3.7.4 Auszählung der Oligodendrozytenvorläuferzellen (NG2)... 49
3.7.5 Auszählung der Astrozyten (GFAP) ... 49
3.7.6 Auszählung der Mikroglia (MAC-3)... 49
3.7.7 Statistik für die NG2-, GFAP- und MAC-3 Färbung ... 49
4 ERGEBNISSE...50
4.1 In vitro Ergebnisse... 50
4.1.1 IFN-β hat keinen Effekt auf die Proliferation von OPCs in gemischten Gliakulturen ... 50
4.1.2 IFN-β hemmt die Differenzierung von OPCs in gemischten Gliazellkulturen... 51
4.1.3 IFN-β zeigte keinen direkten Effekt auf die Differenzierung von gereinigten OPCs... 54
4.2 In vivo Ergebnisse... 55
4.2.1 Vergleichende Untersuchungen zur Gehirnentwicklung bei C57Bl/6-Mäusen und IFNβ-k.o.- Mäusen ... 55
4.2.2 Untersuchung der Myelinbildung... 56
4.2.3 Entwicklung der Astrozyten... 58
4.2.4 Untersuchung der Oligodendrozytenvorläuferzellen... 58
4.3 Ergebnisse von IFN-β-k.o.-Tieren im Cuprizonemodell ... 59
4.3.1 Gewichtsverläufe... 59
4.3.2 Unterschiede im Habitus und Verhalten zwischen Kontrollen und IFN-β-k.o.-Mäusen... 61
4.3.3 Ergebnisse der Demyelinisierung und Remyelinisierung bei IFNβ-k.o.-Mäuse und Kontrolltieren.. ... 61
4.3.4 Elektronenmikroskopische Ergebnisse... 69
4.3.5 Auftreten von Mikroglia und Makrophagen... 72
4.3.6 Astrozyten ... 75
4.3.7 Auftreten von Oligodendrozytenvorläuferzellen... 78
4.3.8 Axonaler Schaden ... 82
5 DISKUSSION ...83
5.1 Diskussion der in vitro Ergebnisse ... 83
5.1.1 Diskussion der Ergebnisse der Proliferation von Oligodendrozytenvorläuferzellen... 83
5.1.2 Diskussion der Ergebnisse der Differenzierung der Oligodendrozytenvorläuferzellen ... 83
5.2 Diskussion der in vivo Ergebnisse ... 85
5.2.1 Das Cuprizonemodell ... 85
5.2.2 Oligodendrozytenrekrutierung ... 87
5.2.3 Mikroglia- und Makrophagendetektion... 88
5.2.4 Astrozytenexpression ... 89
5.2.5 Axonale Schädigung ... 90
5.3 Schlußfolgerungen ... 90
6 ZUSAMMENFASSUNG...92
7 SUMMARY...94
8 LITERATURVERZEICHNIS ...96
9 DANKSAGUNG ...116
Abkürzungen und Termini technici
Abb. Abbildung
AK Antikörper
aqua dest. aqua destillata
A2B5 Hybridomüberstand des A2B5 clons, Marker für OPCs BRDU 5-Bromo-2` Deoxyuridine
BSA bovines Sesumalbumin bzw. beziehungsweise
°C Grad Celsius
CG4-Medium Medium, welches die Proliferation von Oligodendrozytenvorläuferzellen fördert
CIS clinically isolated syndrome (klinisch isoliertes Syndrom)
cm Zentimeter
CNPase 2`,3`-cyclic nucleotide3`-phosphodieesterase
CO2 Kohlendioxid
Cuprizone Biscyclohexanone oxaldihydrazone
d.h. das heißt
DNAase Deoxyribonuklease DNS Desoxyribonukleinsäure
EAE experimentelle allergische Enzephalomyelitis engl. englisch
exkl. exklusive, ausschließlich
Fa. Firma
FCS fetal calf serum (fötales Kälberserum) FGF Fibroblastenwachstumsfactor
g Gramm
GA Glatiramer Acetat
GalC Galactosylceramid, Marker für reife Oligodendrozyten GFAP Glial fibrillary acidic protein, saures Gliafaserprotein ggr./mgr./hgr. geringgradig/mittelgradig/hochgradig
GM Gliamedium, Kontrollmedium für alle in vitro Versuche an gemischten Gliakulturen
GPDH Glycerol Phosphat Dehydrogenase
h Stunde (engl.: hour)
H2O2 Wasserstoffperoxyd
HBSS Hanks Balanced Salt Solution IFN-ββββ Interferon-beta
IFN-γγγγ Interferon-gamma
IgG Immunglobulin G
IL Interleukin
l Liter
Lat. lateinisch
LFB Luxol Fast Blue (Myelinfärbung)
m milli
MAC-3 Microglia-/Makrophagenmarker m Ak monoklonaler Antikörper
MAG Myelinassoziiertes Glycoprotein
MAO Monoaminooxidase
MGP Gemischte Gliazellkutur
MOG Myelin Oligodendrozyten Glycoprotein
mg Milligramm
Min. Minute/n
ml Milliliter
mmol Molarität, milli mol/l MMP Metalloproteinase
mRNA messenger ribonucleic acid
MS Multiple Slerose
N2B3-
Medium Kontrollmedium für die gereinigten Vorläuferzellkulturen NG2 Chondroitin sulfat Proteoglykan NG2
nm Nanometer (=10-9 m)
NO Stickstoffmonoxid
Nr. Nummer
O2O4 Osmiumtetroxid
OPC oligodendrocyte preacursor cell (Oligodndrozytenvorläuferzelle) PBMCs Peripheral blood mononuclear cells (mononukleäre Zellen des
peripheren Blutes = Monozyten, Lymphozyten)
PBS phosphate buffered saline (phosphatgepufferte Salzlösung) PDGF Platelet-derived growth factor
PDGFαR Platelet-derived growth factor alpha receptor Pellet durch Zentrifugation gewonnener Bodensatz pH Potentia Hydrogenii (Stärke des Wasserstoffes) PLP Proteolipidprotein
RR-MS relapsing remitting MS (schubförmig verlaufende MS)
RNS Ribonukleinsäure
rpm Revolutions per minute (Umdrehungen pro Minute)
RT Raumtemperatur
s. siehe
Sp. Spezies
SPF spezifisch pathogen frei
SP-MS secondary progressive MS (Secundär progressiv verlaufende MS) SVZ Subventrikuläre Zone (Bereich unterhalb des Ventrikels)
T3 3,3`,5-Triiodo-L-thyroninesodiumsaiz
T4 Thyroxine
Tab. Tabelle
TH1 inflammatorische T-Zellen TH2 T-Helferzellen
TNF-αααα Tumornekosisfaktor-α
u. und
u.a. unter anderem verw. verwendet/e vgl. vergleiche
VCAM vascular cell adhesion molecule (Adhäsionsmoleküle der Blutzellen) Well Vertiefung der Miktotiterplatte
z.B. zum Beispiel
ZNS Zentrales Nervensystem
z.T. zum Teil
µµ
µµ mikro (x10-6) µµ
µµl Mikroliter
1 Einleitung
Die Multiple Sklerose (MS) ist neben der Epilepsie die häufigste neurologische Erkrankung. Obwohl eine Menge Investitionen in die Erforschung der Ätiologie und Therapie dieser Erkrankung getätigt wurden, ist ihre Ursache bisher nicht geklärt und die Behandlung nur teilweise erfolgreich.
Weltweit sind ca. 1,2 Millionen Menschen betroffen, in Deutschland geht man von über 100.000 Erkrankten aus, wobei ca. zweimal mehr Frauen als Männer erkranken (Noseworthy et al. 2000). Es besteht ein lebenslanges Risiko von 1 zu 400 an Multipler Sklerose zu erkranken (Compston und Coles, 2002). Die Entstehung der Erkrankung wird als multifaktoriell angenommen, wobei insbesondere genetische, infektiöse und Umweltfaktoren diskutiert werden. Ohne spezifische Immuntherapie führt die MS bereits nach wenigen Jahren zu signifikanten Behinderungen (Gold und Rieckmann, 2000). Ca.
25% der Patienten können ein normales Leben führen ohne große Einschränkungen im alltäglichen Geschehen eingehen zu müssen, während bis zu 15% der Patienten in kurzer Zeit schwerste Behinderungen aufweisen. Typischerweise treten Entmarkungsherde in der weißen Substanz des Zentralnervensystems auf, in vielen dieser Läsionen sind neben der Demyelinisierung auch axonale Schädigungen nachweisbar (Trapp 1999). Das Auftreten der klinischen Behinderung korreliert mit dem Ausmaß des axonalen Schadens (Bjartmar et al, 2000; De Stefano, 1998). Arbeiten an Biopsie- und Autopsiematerial beschreiben eine profunde Heterogenität von MS Läsionen bezüglich der Zusammensetzung der infiltrierenden Zellen, dem Ausmaß und Auftreten von Oligodendrozytenschädigung sowie der Inzidenz von Remyelinisierung. Bei der MS können vier verschiedene Subtypen unterschieden werden (Trebst C. et al., 2006; Luchinetti et al., 2000).
Remyelinisierungsvorgänge sind überwiegend in den beiden Subtypen I und II beobachtet worden, die als primär entzündlich/ autoimmun vermittelt angesehen werden.
Elektronenmikroskopische Untersuchungen von 1993 belegen Remyelinisierungsvorgänge in Läsionen (Prineas et al., 1993; Ralne und Wu, 1993), doch das neu gebildete Myelin ist wesentlich dünner und weißt kürzere internodale Abstände auf (Blakemore, 1973). In den anderen beiden Untergruppen, die wahrscheinlich primär durch Oligodendrozytenschädigungen entstehen, wird dagegen nur wenig Remyelinisierung beobachtet. Der Erfolg der Remyelinisierung hängt unter anderem von der Rekrutierung von Oligodendrozytenvorläuferzellen sowie deren Differenzierung ab. Sowohl Oligodendrozyten als auch deren Vorläuferzellen wurden in demyelinisierten Läsionen
gefunden (Chang et al., 2002, Brück et al., 1994). Warum diese Remyelinisierungsvorgänge jedoch in der MS nur unvollständig ablaufen ist bisher unklar.
Aufgrund der Vielgestaltigkeit dieser neurologischen Erkrankung ergeben sich ebenso heterogene therapeutische Maßnahmen, die zum einen aus symptomatischen Behandlungen akuter Verschlechterungen und zum anderen aus präventiven (immunsuppresiven oder immunmodulierenden) Therapien bestehen. IFN-ß wird seit über 10 Jahren aufgrund seiner immunmodulierenden Wirkung vor allem bei der schubförmig verlaufenden Form der MS therapeutisch eingesetzt. Auf welchen Mechanismen die Wirkung des IFN-ß beruht, ist jedoch noch nicht vollständig geklärt. Vor allem über die Wirkung von IFN-ß auf die myelinbildenden Zellen des ZNS, die Oligodendrozyten, ist bisher noch wenig bekannt.
Ziel dieser Arbeit war zum einen die Untersuchung der Wirkung von IFN-ß auf die Proliferation und Differenzierung von Oligodendrozytenvorläuferzellen (OPCs) in vitro, mit dem Ziel neue bzw. zusätzliche Rückschlüsse auf die Zusammenhänge der Wirkung dieses Zytokins bei der Remyelinisierung zu erhalten. Hierzu wurden Untersuchungen sowohl an gemischten Gliakulturen als auch an gereinigten OPC-Kulturen (nur Differenzierung) vorgenommen, die Informationen zu der Frage liefern sollten, ob ein direkter oder indirekter, durch andere Gliazellen vermittelter Einfluss des IFN-ß auf die OPCs vorliegt.
Zum anderen wurden IFN-ß-k.o.-Mäuse in einem toxischen Tiermodell für die MS, dem Cuprizonemodell, mit genetisch unveränderten Mäusen verglichen. Hieraus sollten zusätzliche Erkenntnisse über die Wirkung von IFN-ß bei der Remyelinisierung im lebenden Organismus resultieren und zum weiteren Verständnis der Pathogenese und der Verbesserung der Therapie der MS beitragen.
2 Literaturübersicht
2.1 Krankheitsverlauf und klinische Symptome der Multiplen Sklerose
Der Krankheitsverlauf der MS ist sehr variabel und für die einzelne Person nur schwer vorhersagbar. Grundsätzlich unterscheidet man einen schubförmigen von einem chronisch- progredienten Verlauf, wobei auch Mischformen existieren. Als Schub definiert man nach Ausschluss physiologischer Schwankungen akute, ohne assoziierte Infekte oder Fieber auftretende neurologische Ausfälle bzw. Verschlechterungen, die mindestens 24 Stunden lang anhalten. Häufungen neuer Symptome innerhalb von 4 Wochen werden noch zum selben Schub gerechnet. Nach der Verschlechterung kann es zur kompletten Rückbildung der Symptome kommen oder nur eine Teilremission eintreten. Der chronisch-progrediente Verlauf zeichnet sich durch unterschiedlich rasch zunehmende Verschlechterungen der neurologischen Befunde ohne Remission aus. Aus einer primär schubförmigen Form kann sich zum Beispiel auch im Anschluss eine chronisch-progrediente Form entwickeln, was bei 30-50% der initial schubförmig verlaufenden Erkrankungsformen in einem Zeitraum von 10 Jahren der Fall ist (Gold und Rieckmann, 2000). Welche immunologischen Mechanismen den Verlaufsänderungen der Multiplen Sklerose zugrunde liegen ist bisher nur teilweise geklärt.
Die Initialsymptome der MS, wie zum Beispiel Sehstörungen, Lähmungen, Ataxie, Paresen, und Parästhesien, sind grundsätzlich unspezifisch und können auch bei anderen Erkrankungen in Erscheinung treten (Poser et al., 1979). Im Verlauf der Erkrankung können alle neurologischen Systeme betroffen sein, wobei die oben genannten Symptome dominieren (Noseworthy et al., 2000). Häufig kommt es zur vollständigen Rückbildung dieser Symptome. Persistieren die Behinderungen noch nach dem Ablauf von 3 Monaten nach dem letzten Schub, haben diese insgesamt nur noch eine geringe Rückbildungstendenz. Nach 6 Monaten geht man in 95% der Fälle von einem permanenten Defizit aus (Gold und Rieckmann, 2000).
2.2 Pathologische Merkmale der Multiplen Sklerose
Hauptmerkmal der MS ist neben den axonalen Schädigungen das Auftreten von Entmarkungsherden im Zentralnervensystem (ZNS). Diese Plaques treten typischerweise periventrikulär auf, aber auch radial nach außen angeordnet, dem Verlauf der Blutgefäße folgend. Bevorzugte Lokalisationen finden sich im N. opticus, in der periventrikulären weißen Substanz, im Corpus callosum, Kleinhirn und Rückenmark (Stangel und Lassmann
2003, Noseworthy et al. 2000). Neben diesen typischen Entmarkungsherden kommen bei vielen Patienten auch kleine, kortikale Läsionen vor, die allerdings kernspintomographisch oft nicht gesehen werden. Durch diese Demyelinisierungsherde kann es zur Schrumpfung betroffener Regionen kommen, so dass man bei chronischen Verläufen schwere atrophische Veränderungen finden kann. Der Durchmesser der Läsionen ist mit 1mm bis zu mehreren cm sehr variabel. Finden sich viele Läsionen im selben Bereich, so können diese auch konfluent sein. Man kann die Läsionen auf Grund immunzytochemischer Analysen von Makrophagenpopulationen und der Phagozytose von Myelinprodukten durch Makrophagen in 3 verschiedene Klassen einteilen: Frühaktive- spätaktive- und inaktive demyelinisierende Läsionen. Als frühaktive Läsionen bezeichnet man solche, die sämtliche Hauptbestandteile des Myelins beinhalten. In späten aktiven Läsionen ist der Myelinabbau bereits fortgeschritten, man kann die Myelinproteine Myelin Oligodendrozyten Glycoprotein (MOG) und 2`, 3`-cyclic nucleotide 3`-phosphodieesterase (CNPase) in Makrophagen nicht nachweisen. Histopathologisch fällt bei der MS auf, dass es zum Auftreten von perivaskulären Rundzellinfiltraten kommt. In den Läsionen findet man aktivierte Makrophagen und Mikroglia, so wie Demyelinisierung mit verschiedenen Stadien der Remyelinisierung. Der axonale Schaden tritt sowohl während der aktiven Demyelinisierung als auch in inaktiven Läsionen auf, sein Ausmaß variiert jedoch interindividuell sehr stark (Kornek et al., 2000). Kuhlmann et al. beschrieben 2002, dass der akute axonale Schaden mit der Entzündungsreaktion korreliert, zu Beginn der Erkrankung am ausgeprägtesten ist und in remyelinisierten Plaques kaum zu finden ist (Kuhlmann et al., 2002). Des weiteren kommt es zur Gliose mit Proliferation von Astrozytenfortsätzen, deren Funktion in der Pathogenese der MS noch unklar ist. So besteht zum einen die Diskussion, dass die Gliose ein Hindernis für regenerative Vorgänge darstellen kann (Rosen, 1989) zum anderen werden von den Astrozyten eine Reihe von Wachstumsfaktoren produziert, die für die Regeneration und den Erhalt der Axone und der Myelinscheiden notwendig sein können (Rider, 1997).
2.3 Das Heterogenitätskonzept zur Läsionsentstehung
Der Pathomechanismus zur Entstehung der MS-Läsionen ist bisher weitestgehend ungeklärt. Aufgrund von Studien an mehr als 200 MS-Fällen der Arbeitsgruppen Lucinetti, Brück und Lassmann der letzten Jahre entstand das Konzept der interindividuellen Heterogenität (Trebst et al., 2006; Lucinetti et al., 2000). Dieses Konzept besagt, dass bei bestehender intraindividueller Läsionshomogenität eine Heterogenität der Patienten
nachweisbar ist. Hierbei werden vier MS-Subtypen aufgrund ihrer individuellen Ausprägung der entzündlichen Komponenten, der Oligodendrozytenschädigung und der Histopathologie unterschieden. Die Typen I und II weisen eine ausgeprägte entzündliche Komponente mit Infiltration der Läsionen mit T-Zellen und Monozyten/Makrophagen auf.
Zusätzlich sind im Typ II Komplementfaktoren und Immunglobuline vorhanden. Bei den Typen III und IV treten typischerweise Störungen der Oligodendrozyten auf. So weist der Typ III Zeichen der Oligodendrozytenapoptose auf und einen bevorzugten Verlust des myelinassoziierten Glykoproteins (MAG). Entsprechend der Heterogenität der Typen im histopathologischen Bild geht man auch von unterschiedlichen pathogenetischen Mechanismen der Läsionsentstehung aus. Dementsprechend basieren die Typen I und II auf primär (autoimmun) entzündlich vermittelten Demyelinisierungen und die Typen III und IV auf primären Schädigungen der Oligodendrozyten. Wie es allerdings zum initialen Ereignis der Schubauslösung kommt, bleibt dabei unklar. Als Ursache für die Oligodendrozytenapoptose werden unterschiedliche Mechanismen, wie z.B:
Stickstoffmonoxid (NO), Sauerstoffradikale, bestimmte Zytokine wie Tumornekrosisfaktor- α (TNF-α), mitochondriale Schädigungen, glutamaterge Schädigung oder auch endogene humane Retroviren diskutiert (Merrill und Scolding, 1999).
2.4 Bestandteile der Myelinscheide
Die weiße Substanz des Zentralnervensystems besteht zu 40-50 % aus Myelin, dessen Trockengewicht sich aus 70% Lipiden und 30% Proteinen zusammensetzt, welche durch die Oligodendrozyten gebildet werden (Baumann und Pham-Dinh 2001). Mit ca. 50% des Proteingehaltes stellen das Proteolipidprotein (PLP) zusammen mit dem basischen Myelinprotein (MBP), welches einen Anteil von 10-20% ausmacht, die Hauptkomponenten des Myelins dar. Das PLP ist ein transmembranes Protein, welches in zwei Isoformen (30 kD und 26 kD) vorkommt. Aus Tiermodellen ist bekannt, dass es eine entscheidende Funktion für die Integrität der Myelinscheide erfüllt, es bildet die sogenannte “major dense line“ des Myelins, welche eine Rolle bei der Kompaktierung des Myelins spielt. Daneben gibt es Myelinproteine die einen wesentlich geringerem Anteil am Gesamtmyelin darstellen. Hierzu zählen das Myelin-assoziierte Glykoprotein (MAG), mit einem Anteil von ca. 1%, sowie das Myelin- Oligodendrozyten- Glykoprotein (MOG) mit ca. 0,1% Anteil. Trotz ihres geringen Anteil am Gesamtmyelin besitzen diese Proteine eine hohe immunogene Wirkung. Entsprechend zeigt eine durch MOG ausgelöste EAE in einigen Tierstämmen einen ähnlich rezidivierenden Verlauf, wie die MS. Zusätzlich ist
MOG in seiner extrazellulären Lokalisation exponiert und für Antikörper leicht zugänglich (Kennel De Marczh et al., 2003, Iglesias A. et al., 2001).
2.5 Oligodendrozyten
Der Oligodendrozyt hat als myelinbildende Zelle des ZNS eine besondere Rolle in der Pathogenese demyelinisierender Erkrankungen.
1846 entdeckte der Berliner Pathologe Rudolf Virchow, dass es außer Neuronen noch andere Zellen im ZNS gibt, von denen er glaubte, dass sie das Gewebe zusammenhalten, woraufhin er sie kurzerhand als Nervenkitt, Neuroglia, bezeichnete. Aufgrund von Metallimprägnationsfärbungen konnte die Neuroglia in Astrozyten (Ramon und Cajal, 1913), Oligodendrozyten und Mikroglia (Rio Hortega, 1921) unterschieden werden. Die Bezeichnung Oligodendroglia wurde 1921 von Rio Hortega eingeführt, der diese Zellen der Makroglia als neurogliale Zellen mit wenigen Fortsätzen beschrieb (Hortega, 1921).
Hauptsächlich sind die Oligodendrozyten myelinbildende Zellen, es gibt aber auch Oligodendrozyten, die keine direkte Verbindung zu Myelinscheiden aufweisen und als Satellitenzellen bezeichnet werden. Diese Zellen tragen zur Regulation des Mikrostoffwechsels in der Umgebung der Neurone bei (Ludwin, 1997).
2.6 Oligodendrozyten – Myelinisierung des Zentralen Nervensystems
Wie die Astrozyten sind die Oligodendrozyten neuroektodermalen Ursprungs (Levison und Goldman, 1993; Cameron, Curry und Le Douarin, 1995) und entwickeln sich im Zentralnervensystem von Säugetieren aus proliferierenden neuroepithelialen Zellen der ventrikulären und subventrikulären Zonen (SVZ) (Miller, 1996; Doetsch, 1997). Nicht unerwähnt bleiben soll, dass im ausgewachsenen ZNS auch der Hippocampus (Johe et al., 1996, Palmer et al., 1997) und das Rückenmark (Weiss et al., 1996) multipotentielle Zellen beinhalten, die in vitro fähig sind, Oligodendrozyten, Astrozyten und auch Neurone zu generieren.
Im Gehirn findet die Myelinisierung in kaudorostraler Richtung statt und im Rückenmark rostrokaudal. Für jede Spezies folgt die Myelinisierung einem genauen reproduzierbaren Ablauf. Im Zentralnervensystem von Nagern konnten bereits in den letzten 3-4 Tagen des Embryonalstadiums Chondroitin sulfat Proteoglykan NG2 (NG2) -positive OPCs detektiert werden (Levine et al., 1993). Innerhalb der ersten 10 Tage des postnatalen Lebens kommt es zu einem starken Anstieg dieser Zellen, die durch Migration die entstehende weiße und
graue Substanz besiedeln und sich letztendlich zu myelinformenden Oligodendrozyten differenzieren. So sind bei Mäusen 45-60 Tage nach der Geburt fast alle Bereiche des Gehirns myelinisiert. Bei der Ratte kann der Höhepunkt der Myelinisierung ziemlich genau auf den Tag 18 nach der Geburt bestimmt werden, beim Menschen tritt er während des ersten Lebensjahres auf, der Myelinisierungsprozess beginnt jedoch schon in der zweiten Hälfte der Embryonalentwicklung im Rückenmark (Baumann und Pham-Dingh, 2001).
2.7 Morphologische Veränderungen während der Reifung der Oligodendrozyten In den verschiedenen Entwicklungsstadien von der Vorläuferzelle bis hin zum reifen myelinisierenden Oligodendrozyten weisen die Zellen Unterschiede in ihrer Morphologie, mit entsprechend wechselnden Oberflächenmarkern auf, außerdem ändern sich ihre Fähigkeiten im Bezug auf Migration, Proliferation und Myelinbildung.
Die bipolaren Oligodendrozytenvorläuferzellen sind in der Lage von ihrem Entstehungsort, der SVZ weite Strecken zu migrieren, um das entstehende Gehirn zu besiedeln (Small et al., 1987), wie aus Entwicklungsstudien (Frost, 1996, Levison und Goldman, 1993) und Transplantationsstudien hervorgeht (Espinosa de los Monteros, 1993; Lachapelle et al., 1983). In vitro Studien belegen, dass diese Progenitorzellen, abhängig von verschiedenen Wachstumsfaktoren wie z.B. dem Fibroblasten Wachstumsfaktor (FGF) und dem Platelet- derived growth factor (PDGF) (Gard, Pfeiffer, 1993; Hardy, Reynolds, 1993; Milner et al., 1997; Raff et al., 1988; Ridchardson et al., 1988) proliferieren. Unreife Vorläuferzellen weisen unter anderem A2B5-Antigene auf der Zelloberfläche auf. Zusätzlich zu diesem Marker treten der platlet-derived growth factor alpha receptor (PDGFαR) und das Chondroitin Sulfat Proteoglycan NG2 (NG2) in dieser Entwicklungsphase der Vorläuferzelle in Erscheinung. Am Bestimmungsort angelangt wandeln sie sich zu Präoligodendrozyten mit mehreren Fortsätzen um, die noch zur Zellteilung fähig sind, deren Migrationsfähigkeit jedoch verringert (Orentas und Miller, 1996) bzw. verloren gegangen ist (Pfeiffer et al., 1993). Diese Zellen weisen den Marker O4 auf (Sommer und Schachner, 1981). Die Entwicklung zum unreifen Oligodendrozyten ist durch das Auftreten des Markers GalC und den Verlust des A2B5-Antigens auf der Zelloberfläche gekennzeichnet. Das erste myelinspezifische Protein, welches der entstehende Oligodendrozyt besitzt ist das CNP (Reynolds, Wilking, 1988; Richardson et al., 1980;
Sprinkle, 1989; Vogel, Thomson, 1988) gefolgt von anderen Markern, wie dem MBP (Butt et al., 1995). Das Auftreten der myelinspezifischen Proteine MBP, MAG und PLP während der Differenzierung tritt sequentiell sowohl in vivo als auch in vitro auf (Dubois-Dalcq et
al., 1986; Hardy , Reynolds, 1993; Monge et al. 1986; Pfeiffer et al. 1993) und kennzeichnet das Stadium des reifen Oligodendrozyten. Das Auftreten des Markers MOG findet eher zu späteren Zeitpunkten der Reifung statt (Solly et al., 1996) und zeigt deren volle Ausdifferenzierung zu myelinbildenden Zellen an.
Progenitor
Unreifer Oligodendrozyt
Reifer
Oligodendrozyt Pro-
Oligodendrozyt Prä-oligo-
dendrozyt
Olig2 PDGFα-R
A2B5 PDGFα-R
O4 GD3 NG2
O1 O4 GalC CNP
MBP PLP MAG MOG O1
O4 GalC CNP Migration
Proliferation
Myelinisierung
Marker Progenitor
Unreifer Oligodendrozyt
Reifer
Oligodendrozyt Pro-
Oligodendrozyt Prä-oligo-
dendrozyt
Olig2 PDGFα-R
A2B5 PDGFα-R
O4 GD3 NG2
O1 O4 GalC CNP
MBP PLP MAG MOG O1
O4 GalC CNP Migration
Proliferation
Myelinisierung
Marker
Abb.1 Entwicklungsstadien von der Vorläuferzelle zum reifen myelinisierenden Oligodendrozyten mit ihren entsprechenden Markern (Modifiziert nach Stangel und Hartung, 2002)
2.8 Myelinisierung der Axone
Die Bildung und Anordnung von Myelin im ZNS erfordert viele verschiedene Signale die präzise die Wechselwirkung zwischen Axonen und Oligodendrozyten steuern. Hierbei wird die Menge der reifen myelinisierenden Oligodendrozyten festgelegt durch die Anzahl der proliferierenden Vorläuferzellen und dem Stattfinden des programmierten Zelltods. Die Vorläuferzelle verliert bei Beendigung der Proliferationsphase und Beginn der Differenzierung die Sensitivität für das überlebenswichtige Signal PDGF. Somit bleiben ihr nur 2-3 Tage Zeit, um in Interaktion mit einem nicht myelinisierten axonalen Segment zu gelangen, welches neue überlebenswichtige Signale liefert (Bozalli, 2004). Zellen die diesen axonalen Kontakt eingehen, überleben und beginnen mit der Myelinisierung (Trapp et al., 1997). Ein reifer Oligodendrozyt synthetisiert und unterhält die Myelinscheiden von bis zu 40 benachbarten Axonen im ZNS (Compston und Coles, 2002).
2.9 Warum findet in der Multiplen Sklerose keine vollständige Remyelinisierung statt?
Demyelinisierte MS Läsionen zeigen zumindest teilweise eine spontane Remyelinisierung (Prineas et al.,1993; Ralne et al., 1993), unklar ist jedoch warum diese nicht vollständig ist und nicht alle Läsionen betrifft. Im Vergleich zu physiologisch gebildetem Myelin ist das neugebildete Myelin dünner und weist kürzere internodale Abstände auf (Blakemore WF, 1973). Bei der Remyelinisierung geht man davon aus, dass sich die Vorgänge der physiologischen Myelinisierung wiederholen d.h. es wandern OPCs in die Läsionen ein, proliferieren und differenzieren sich zu reifen myelinbildenden Oligodendrozyten (Stangel und Hartung, 2002; Franklin, 2002). Zu der Frage warum in der MS die entstandenen Läsionen jedoch nicht vollständig remyelinisieren, existieren verschiedene Hypothesen.
Möglich wäre, dass ein Mangel an OPCs vorliegt, der entweder durch die Demyelinisierung bedingt ist oder dass die Zellen bei großen Läsionen nicht weit genug migrieren können (Blakemore und Keirstead, 1999). Zentral in chronischen MS-Läsionen und am Rande der Läsionen konnten NG2-positive Zellen nachgewiesen werden (Scolding et al 1998, Chang et al. 2000, Maeda et al. 2001). Andere Theorien gehen somit davon aus, dass nicht die OPCs der limitierende Faktor sind sondern die Axone für eine Remyelinisierung nicht rezeptiv sind (Chang et al., 2002). Im Gegensatz zur physiologischen Myelinisierung sekretieren infiltrierte Immunzellen eine Vielzahl an Zytokinen, die nicht nur OPCs sondern auch Mikroglia und Astrozyten beeinflussen (Lock et al., 2002; Baranzini et al., 2000). Auch eine verminderte Expression von verschiedenen Wachstumsfaktoren, wie z.B. dem Neuregulin, welches von Astrozyten gebildet wird und in MS-Läsionen verringert ist, könnte zu einer inkompletten Remyelinisierung führen (Viehover et al., 2001). Wahrscheinlich ist allerdings, dass es auch auf diese Frage entsprechend der Heterogenität der Läsionen keine einheitliche Ursache gibt.
2.10 Interferone
Interferone (IFN) werden aufgrund unterschiedlicher Stimuli von Zellen produziert. Sie gehören zu den Zytokinen und werden in zwei Gruppen, die Typ-I-IFN und die Typ-II- IFN, eingeteilt. Zu den Typ-I-IFN gehören das IFN-α und das IFN-β. Diese Typ-I-IFN werden natürlicherweise im Organismus von Fibroblasten, Makrophagen und dendritischen Zellen nach erfolgter viraler Infektion oder als Folge unspezifischer Entzündungsreaktionen produziert. Typ-II-IFN, zu denen das IFN-γ zählt, werden vorwiegend von Immunzellen gebildet. Bei der MS werden therapeutisch die Typ-I- IFN
genutzt und zwar das IFN-β -1a und das IFN-β-1b. IFN-β-1a wird von Säugetierzellen hergestellt, liegt glykosyliert vor und besitzt eine Aminosäuresequenz, die identisch mit dem natürlich vorkommenden IFN-β ist. Im Gegensatz dazu wird das IFN-β-1b von Bakterien hergestellt, ihm fehlen zwei Aminosäuren so wie die Glykosylierung (Gold und Rieckmann, 2000). In ihrer biologischen Wirkung sind beide IFN jedoch ähnlich.
2.11 Immunmodulatorische Effekte von Interferon-ββββ
Die Typ-I-Interferone IFN-α und IFN-β binden an den selben an der Zelloberfläche lokalisierten Typ-I-Rezeptor. Dieser Rezeptor besteht aus zwei Ketten, IFN-αR1 und IFN- αR2. Die Interaktion der Liganden an den extrazellulären Teil des Rezeptor löst eine intrazelluläre Signalkaskade aus, die über Phosphorylierungen von Signalproteinen und Aktivierungen von Transkriptionsfaktoren zur Bindung an bestimmte Gensequenzen und letztendlich zur Proteinbildung führt. Diese genetischen Produkte besitzen antivirale, antiproliferative und immunmodulierende Eigenschaften (Dhib-Jalbut, 2002).
Ergebnissen aus Tiermodellen und humanen Studien lassen den Schluss zu, dass IFN-β durch unterschiedliche Mechanismen in der Lage ist, in den Verlauf der MS einzugreifen (Yong V. W. et al., 1998).Einige Funktionen von IFN-β sind bekannt, doch bestehen noch viele Unklarheiten bezüglich der Wirkmechanismen und Zusammenhänge (Billiau et al.
2004, Hartung et al., 2004).
IFN-β hemmt z.B. die Migration von Zellen durch die Blut-Hirn-Schranke (BBB). Ein vermuteter Mechanismus ist die IFN-induzierte verminderte Expression von Adhäsionsmolekülen wie das vascular cell adhesion molecule (VCAM)-1 auf Lymphozyten (Calabresi P.A. et al., 1997). Ein anderer postulierter Wirkmechanismus ist der Einfluss des IFN-β auf die Interleukin (IL)-2 induzierte Sekretion der Metalloproteinasen MMP-2 und MMP-9. Dieses kann zu einer dosisabhängigen, verminderten Migration von PBMCs oder auch T-Zellen in das Zentralnervensystem führen (Leppert et al., 1996; Stuve, 1996).
Über die Wirkung von IFN-β auf die T-Zellfunktion ist bekannt, dass es deren Aktivierung und die Produktion des proinflammatorischen Botenstoffes IFN-γ inhibieren kann (Noronha et al., 1993).
Zu seinen immunmodulatorischen Eigenschaften gehört des weiteren, die Beeinflussung des Verhältnisses der Th-1- und Th-2-Zytokine. Es ist bekannt, dass IFN-β die
Interleukin12-Produktion unterdrückt und die Bildung von Interleukin-10 induziert (Karp et al., 2000). Des weiteren vermindert es die Interleukin-2 Sekretion und Expression des Interleukin-2 Rezeptors (Noronha A. et al., 1993). IFN-β besitzt blockierende Effekte gegenüber dem schubauslösenden proinflammatorischen Zytokin Interferon-γ (IFN-γ) (Giacomini et al.,1988).
Unter physiologischen Bedingungen gelangen geringe Mengen von natürlich vorkommendem IFN-β in das ZNS (Ross et al., 2004). Durch das Zusammenbrechen der Bluthirnschranke in MS-Schüben kann es allerdings zu einem erheblichen Anstieg des INF-ß-Titers im ZNS kommen und somit auch einen Einfluss auf Gliazellen ausüben.
In Astrozyten kommt es unter dem Einfluss von IFN-β zur Bildung des nerve growth factors (NGF) in vitro (Stweart et al., 1997, Boutros et al., 1997) und dem IL-6 (Okada et al., 2005), welchem neuroprotektive oder anti- inflammatorische Einflüsse zugeschrieben werden (Yamada et al., 1994). Dieser anti-inflammatorische Effekt scheint darauf zu beruhen, dass dieser Botenstoff die Expression von VCAM-1 und die Induktion des IL-1 Rezeptorantagonisten bewirkt und somit als ein negativer Rückkopplungsmechanismus im Entzündungsprozess fungiert (Gadient und Otten, 1997).
In Mikroglia kommt es durch den Einfluss von IFN-β zur Expression verschiedener Chemokin- mRNA (RANTES, IP-10, MIP-1β, MIP-1α und MCP-1) (Hua LL und Lee, 2000; McManus et al., 2000). Kawanokuchi beschrieb 2004, dass die Wirkung von IFN-β auf Mikroglia eine vermehrte Bildung von NO-, TNF-α- und Interleukin1-beta induzierte, was zu einer Verstärkung der Demyelinisierung beitragen kann (Kawanokuchi et al., 2004).
Über die Wirkung von IFN-β auf Oligodendrozyten gibt es bisher nur wenig Informationen. Passaquin et al. (1989) beschrieb eine Hemmung von Hydrocortison induzierter Expression von Glycerol Phosphat Dehydrogenase (GPDH) in Oligodendrozyten. In einer humanen Oligodendrozytenzellinie induzierte IFN-β die vermehrte Ausbildung von Fortsätzen als Zeichen der verstärkten Zellreifung (Mastronardi et al., 2004). Halfpenny und Scolding hingegen beschrieben 2003, dass IFN-β keinen Einfluss auf die Proliferation und Migration von Oligodendrozytenvorläuferzellen der Zelllinie CG4 ausübt. In einem virusinduzierten Tiermodell (Theiler Virus) der MS wurde festgestellt, dass die kurzfristige Therapie mit IFN-β zu einer vermehrten Remyelinisierung
führte, während der Langzeiteinsatz von IFN-β die Demyelinisierung verstärkte (Njenga et al., 2000).
2.12 Interferon-ß in der Therapie der Multiplen Sklerose
Aufgrund seiner immunmodulatorischen Eigenschaften wird Interferon-β (IFN-β) therapeutisch seit über einer Dekade in der Therapie der schubförmig verlaufenden MS (RR-MS) eingesetzt. Es gehört zusammen mit dem Glatiramer Acetat (GA) zu den beiden meist eingesetzten Substanzen bei der Behandlung der schubförmigen MS (Gold und Rieckmann, 2000, Hartung et al., 2004). Die Behandlung von Patienten mit IFN-β im Vergleich zu unbehandelten Patienten zeigte eine geringere jährliche Schubrate. Welche zellulären und molekularen Mechanismen die schubmindernden Erfolge hervorrufen ist noch nicht vollständig geklärt. Es gibt drei zugelassene Formen des IFN-β bei der Therapie der MS, zum einen Interferon-β-1a-Präparate (Avonex™ und Rebif®) und zum anderen Interferon-β-1b-Medikamente (Betaferon® /Betaseron®) (Noseworthy et al., 2000, Compston und Coles, 2002). Das unter dem Handelsnahmen Betaferon® bekannte IFN- ß1b wurde 1993 erstmalig in den USA und 1995 in Deutschland als Immunmodulator für die Therapie von RR-MS zugelassen. Drei Jahre später erfolgte die erweiterte Zulassung für die Behandlung der SP-MS und seit diesem Jahr auch die Zulassung für die Behandlung des klinisch isolierten Syndroms (clinically isolated syndrome, CIS) bei Risikopatienten.
2.13 Das Cuprizonemodell- ein toxisches Tiermodell für die Multiple Slerose
Das Cuprizonemodell gehört zu den toxischen Tiermodellen für die Multiple Sklerose. Der Einsatz von Cuprizone als demyelinisierende Substanz wird seit vielen Jahren untersucht.
1969 beschrieb Blakemore erstmals dessen Einsatz bei der De- und Remyelinisierung in Mäusen und untersuchte den superioren zerebellären Pedunkel (Blakemore, 1969). Ludwin beschrieb 1978, dass es beim Einsatz des Toxins zur Degeneration der Oligodendrozyten und deren Fortsätzen kommt, gefolgt von Demyelinisierung, wobei die Axone jedoch intakt bleiben (Ludwin, 1978). Durch Zugabe des Kupferchelators Cuprizone zum Futter kommt es zu einer Kupferdefizienz und reproduzierbaren Demyelinisierung im ZNS (Blakemore, 1972; Blakemore, 1973, Kerstenson, 1971, Ludwin, 1978, Pattison, 1971, Suzuki, 1969). Es besteht die Hypothese, dass diese cuprizoneinduzierte Kupferdefizienz
schädigend auf die Funktion der Mitochondrien wirkt (Venturini, 1973), wodurch es aufgrund einer Störung im Energiehaushalt der Oligodendrozyten letztendlich zur Demyelinisierung im ZNS führt (Cammer, 1999, Fujita, 1990, Komoly, 1987, Morell, 1998). Kupfer ist ein essentielles Element für verschiedene Metalloenzyme (Walshe, 1995) hierzu zählen auch die Kupfer-Zink Superoxid-Dismutase und das Ceruloplasmin (Zlotkin, 1995). Im Gehirn verursacht das Toxin eine Aktivitätsreduktion der mitochondrialen Enzyme Cytochromoxidase und der Monoaminooxidase (MAO) (Venturini, 1973). Warum die Oligodendrozyten bei geringen Mengen Cuprizonegabe bevorzugt empfindlich für eine Kupferdefizienz sind, andere Zellen jedoch nur minimal geschädigt werden, ist nicht bekannt (Blakemore, 1973, Ludwin, 1978, Komoly et al., 1987; Fujita et al., 1990). Es existiert jedoch die Hypothese, dass das Perikaryon dieser Zellen mit seiner sehr großen Menge Myelin entsprechend großen metabolischen Leistungen unterlegen ist und somit anfällig für Störungen wird, wenn dieser Metabolismus nicht unterhalten werden kann (Matsushima, 2001).
Bei diesem Tiermodell beginnt die Demyelinisierung zeitlich innerhalb der 2./3.
Versuchswoche und ist anatomisch vorhersagbar im Bereich des Corpus callosum sowie der superioren zerebellären Pedunkel (Hiremath, 1998; Morell, 1998; Matsuschima, Morell, 2001). Bei Fütterung von 0,2 % des Toxins erreicht man in der 6. Fütterungswoche eine vollständige Demyelinsierung dieser Bereiche (Matsushima, 2001). Die Remyelinisierungsphase wird durch das Absetzen des Toxins eingeleitet, wobei es auch schon während der Toxingabe zum Einsetzen von Remyelinisierungsvorgängen kommt (Matsushima, 2001). Nicht alle Nagetiere reagieren auf Cuprizonegabe mit Demyelinisierung und die Mausstämme untereinander weisen unterschiedliche Toxinverträglichkeiten auf. Bekannt ist, dass bei Swiss oder ICI Mäuse (Blakemore WF, 1973; Ludwin SK, 1978) und C57BL/6 Mäuse (Matsushima, 2001) die toxische Demyelinisierung induziert werden kann. Änderungen des eingesetzten Mausstammes erfordern eine Neubestimmung der verträglichen Toxinkonzentration (Matsushima, 2001).
Über C57BL/6–Mäuse ist bekannt, dass sie nur einer Konzentration von 0,2% Cuprizone tolerieren ohne signifikante Gewichtsverluste oder Lebertoxizität aufzuweisen (Hiremath, 1998). Matsushima und Morell setzten 8-10 Wochen alte Mäuse mit C57Bl/6-Hintergrund bei einer Toxinkonzentration von 0,2% ein, da diese im Gegensatz zu jüngeren Tieren, gleiche Gewichtsveränderungen wie die C57Bl/6 Mäuse aufwiesen und eine besser reproduzierbarere Demyelinisierung, bei minimierten systemischen Effekten wie z.B. der
Lebertoxizität (Matsushima, 2001) zeigten. Während der Demyelinisierung kommt es zum Auftreten von Mikrogliareaktionen sowie Astrogliose (Blakemore, 1972/73, Ludwin, 1978, Matsushima, 2001, Hiremath, 1998). Eine Aktivierung der mRNA von Myelingenen im Zusammenhang mit dem Auftreten von Mikroglia und Makrohagen wurde von Morell et al. (1998) beschrieben.
Der Vorteil dieses Tiermodells besteht u.a. darin, dass es beständig feststellbare, definierte und anatomisch gut reproduzierbare De- und Remyelinisierung erlaubt. Im Gegensatz dazu kommt es bei anderen gut untersuchten Modellen, wie der Experimentellen Allergischen Enzephalomyelitis (EAE) und der viral induzierten Demyelinisierung (Theiler Virus) zu sporadischen zerstreuten Läsionen (Ludwin, 1980). Im Gegensatz zur EAE bleibt die Blut- Hirn-Schranke im Cuprizonemodell primär erhalten (Bakker, 1987).
Zwischen dem verwendeten Tiermodell und der Erkrankung MS gibt es verschiedene Bezüge, wie z.B. die Astroglianarbe, Aktivierung von Mikroglia (Hiremath, 1998), die selektive Schädigung der Oligodendrozyten, als auch remyelinisierte Axone die im Randbereich von MS-Plaques z.T. zu finden sind (Ludwin, 1994), die Rückschlüsse auf die Zusammenhänge im Krankheitsverlauf der MS erlauben.
Durch den Einsatz von IFN-β-k.o.-Mäusen im Cuprizonemodell wurde in der vorliedenden Arbeit die Wirkung von Interferon-β bei der Remyelinisierung untersucht, um weitere Erkenntnisse über die Pathogenese der MS zu erlangen und zur Verbesserung der Therapie beizutragen.
3 Material und Methoden
3.1 Geräte und Materialien
3.1.1 Geräte, Laborbedarf Einmalpipetten
25 ml (Bestell-Nr.86.1685.001) 10 ml (Bestell-Nr.86.1254.001) 5 ml (Bestell-Nr.86.1253.001)
Fa. Saarstedt, Nümbrecht
Inkubator Fa. Heraeus, Osterode
Laborumlufttrockenschrank, Function line Fa. Heraeus, Osterode
Lamin Air HB2472 Fa. Heraeus, Osterode
Mikrowelle, Euronet MW4270 Fa. HTS Haustechnik-Service GmbH, Bremen
Paraffinschneidegerät RM2245 Fa. Leica Microsystems GmbH, Benshein
Pipetten Fa. Gilson, Langenfeld
Pipetus akku Fa. Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt
Edmund Bühler KS-15 control und TH15 (Schüttler)
Fa. Johanna Otto GmbH, Hechingen
Sterilbank Fa. CEAG-Schirp Reinraumtechnik,
Dortmund
Varioklave 250T Fa. H+P Labortechnik GmbH,
Oberschleißheim
Waagen Fa. Satorius, Göttingen
Wasserbad, 1052 Fa. GFL, Burgwedel
Wasserbad, 1083 Fa. GFL, Burgwedel
Netz Grit 10x10mm (Bestell-Nr.10008.03.143)
Fa. Präzisionsoptik Gera, Gera
Petrischalen
(Bestell-Nr. 150326)
Fa. Nunc, Roskilde, Dänemark
Gewebekulturschale Cellstar (Bestell-Nr.2006-05)
Fa. Greiner, Frickenheim
3.1.2 Zentrifugen:
Megafuge 2,0R Fa. Heraeus, Osterode
Eppendorf centrifuge 5417R Fa. Eppendorf, Hamburg
3.1.3 Mikroskope:
Te Laval 31 Fa. Zeiss, Göttingen
Axiostar, Zeiss 1031-031 Fa. Zeiss, Göttingen
Stemi DCR Fa. Zeiss, Göttingen
Leica DM LB und Leica Kamera DC300 Fa. Leica Microsystems GmbH, Bensheim
3.1.4 Reagenzien und Laborbedarf für die in vitro Untersuchungen:
3,3`,5-Trijodo-L-thyronine sodium salt (Bestell-Nr.T6397)
Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
4-Pregnene-3,20-dione (Progesteron) (Bestell-Nr.P8783)
Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Balanced Salt Solution (Hank`s) (Bestell-Nr.H9269)
Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Biotin
(Bestell-Nr.B-4639)
Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Boratpuffer 99%
(Bestell-Nr.B6768)
Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Bovines Serum Albumin (BSA) (Bestell-Nr. A-7030)
Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Corbit- Balsam Fa. Hecht, Sondheim
Deckgläser ∅12 mm (Bestell-Nr. P2312)
Fa. Roth, Karlsruhe
Deoxyribonuclease (Bestell-Nr. D5025)
Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen
D-MEM
(Bestell-Nr. 41965-039)
Fa. Gibco, New York, USA
Fötales Kälber Serum (Bestell-Nr. S0115)
Fa. Biochrom AG, Berlin
Hepes Buffer (Bestell-Nr. H0887)
Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Interferon-β
(Bestell-Nr.13400-1 Lot Nr. 0000)
Fa. PBL Biomedical Laboratories, New Jersay, USA
Interferon-γ
(Bestell-Nr.400-20 Lot Nr. 018109)
Fa. Peprotech Inc., New Jersay, USA
ITS culture supplement
(Bestell-Nr.354352 Lot. Nr.001403)
Fa. BD Biosience, Bedford, USA
Kulturflaschen
(Bestell-Nr. 83.1813.002)
Fa. Sarstedt AG & Co., Newton, USA
L-Thyroxine (Bestell-Nr. T1775)
Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Methanol
(Bestell-Nr.8045)
J.T.Baker, Deventer, Niederlande
Netz Grit 10x10mm (Bestell-Nr. 10008.03.143)
Fa. Präzisionsoptik Gera,Gera
Neuroblastom-Zellinie B104 Geschenk von PD Dr. Stangel, Hannover Penicillin-Streptomycin
(Bestell-Nr.P 0781)
Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Poly-L-Lysine Hydrobromide (Bestell-Nr. P 1274)
Fa. Sigma, Missouri, USA
Putrescin (1,4-Diaminobutane dihydro- chloride)
(Bestell-Nr.P5780)
Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
SFCA Filter (250ml) (Bestell-Nr.157-0020)
Nalgene NuncInternational, New York, USA
Triethylenediamine (Dabko) (Bestell-Nr.D2522)
Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Trypanblau Lösung (Bestell-Nr.T-6146)
Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmBH, Schnelldorf
Trypsin inhibitor (Bestell-Nr. T-6414)
Fa. Sigma, Missouri, USA
Trypsin
(Bestell-Nr.L 2123)
Fa. Biochrom AG, Berlin
Wellplatten (24 ) mit Deckel (Bestell-Nr. 662102)
Fa. Greiner, Frickenhausen
Wellplatten (4 ) Multidish (Bestell-Nr.176742)
Nunc, Roskilde, Dänemark
3.1.5 Antikörper für die in vitro Färbungen A2B5 (A2B5 clon 105)
(Bestell-Nr. ATCC CRL-1520)
Fa. ATCC, Manassas, USA
Bromo-2`-Beoxy-uridine (BrdU) (Bestell-Nr. 280879)
Fa .Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, USA
5- GalC (Galactosylceramid) (clon IC-07)
ECACC, über Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen
anti-IgG konjugiertes Cy2
(Bestell-Nr.315-225-008, Lot. Nr. 58996)
Jackson Immuno Research, West Grove, USA
anti-IgM konjugiertem Cy3
(Bestell-Nr.315-165-020, Lot. Nr. 45854)
Jackson Immuno Research, West Grove, USA
3.1.6 Verwendete Kulturmedien und Lösungen
A) CG4- Medium: 67 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium + Glutamine + Glucose (D-MEM)
30 ml B104CM (Hybridoma-Überstand der Neuroblastomzellinie B104)
1 ml Penicillin-Streptomycin (PS) 1 ml ITS culture supplement 5 µl Biotin
5 µl Progesteron 50 µl Putrescin
B) Gliamedium: 500 ml D-MEM
50 ml hitze-inaktiviertes FCS 5 ml PS
C) N2B3- Medium: 100 ml D-MEM 0,5 ml FCS 1ml PS 1ml ITS
10 µl Progesteron 100 µl Putrescin 10 µl Biotin
10 µl 3,3`,5- Trijodo-L-thyronine sodium salt (T3) 10 µl l-Thyroxine (T4)
D) Trituating Solution: 1% BSA
0,03 mg/ml Dnase
0,5 mg/ml Trypsin inhibitor
E) Serumfreies Medium für die Herstellung von B104 konditioniertem Medium ( B104 CM):
DMEM 1% IST
1% Penicillin/ Streptomycin
F) Serumhaltiges Kulturmedium für die Herstellung von B104 konditioniertem Medium:
DMEM 5% FCS
1% Penicillin/ Streptomycin
G) Herstellung von B104-Medium:
Für die Herstellung von B 104 konditioniertem Medium (B104 CM) wurden 1,5-2 x 106 Zellen der Neuroblastom-Zellinie B104 in Kulturflaschen (75 cm2) für 24 Stunden mit serumhaltigem Kulturmedium inkubiert. Die Kulturen wurden, nach 2x Waschen mit 10 ml PBS, mit serumfreiem Medium für drei Tage kultiviert. Der Überstand wurde abpipettiert, 5 bis 10 Min. bei 1891 g zentrifugiert, steril filtriert (SFCA Filter) und portioniert bei -20 °C bis zum Gebrauch tiefgefroren.
3.1.7 Verwendete Tiere
Sprague Dawley Ratten CrlT:CD, von Charles River, England importiert, gezüchtet im Tierhaus der MHH
C57Bl/6 Mäuse Harlan, Niederlanden
IFNβ-k.o.-Mäuse GBF, Braunschweig, Referenz: Erlandsson et al., 1998
Tierversuchsnummer: 03/671 “Charakterisierung von Regulationsfaktoren der De- und Remyelinisierung in genetisch veränderten Tieren“
3.1.8 Materialien und Reagenzien für die in vivo Untersuchungen 2-Dodecylsuccinic acid anhydride
(Bestell-Nr.20755)
Fa. Serva, Heidelberg
2,4,6-Tris(dimethylaminometthyl)phemol (DMP30)
(Bestell-Nr. 36075)
Fa. Serva, Heidelberg
ABC Kit (Avidin-Biotin-Komplex) Fa. Vektor Laboratories, Burliname USA Bis(cyclohexanone)oxaldighydrazone
(Bestell-Nr.C 9012)
Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
DAB Chromogen (Bestell-Nr.S 3000)
Fa. Dako, Glostrup, Dänemark
Epon, Gycid Ether100 Roth, Karlsruhe
Essigsäure 96% Fa. J.T. Baker, Deventer, Niederlande Etanol absolut
(Bestell-Nr. 624
Fa. J.T.Baker, Deventer, Niederlande
Eukitt 100ml Fa. Kindler GmbH & Co, Freiburg
Fuchsin-sulfit reagent (Bestell-Nr. S5133-1L)
Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Glutaraldehyd Fa. Polysiences Varrington, PA, USA
H2O2 30%
(Bestell-Nr. 1.07209.0250)
Fa. Merck, Darmstadt
Hämalaun
(Bestell-Nr. 1.09249.0500)
Fa. Merck, Darmstadt
HCL (1N)
(Bestell-Nr.1.09970)
Fa. Merck, Darmstadt
Liquidblocker (PAP-Pen) Fa. SCI Sience Services, München Methylnadic anhydride
(Bestell-Nr. 29452)
Fa. Serva, Heidelberg
Na-Cacodylatpuffer 0,2 M (Dimethylarsensäurenatriumsalz)
Fa. Merck, Darmstadt
Natriumdisulfit (Bestell-Nr.Bt 6528)
Fa. Merck, Darmstadt
Osmium tetroxide (O2O4) (Bestell-Nr.O5500)
Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Paraformaldehyd
(Bestell-Nr.P6148-500G)
Fa. Sigma- Aldrich, Schnelldorf
PBS
(Bestell-Nr. L182-05)
Fa.Biochrom AG, Berlin
Perjodpulver Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
Steinheim Propylenoxid
(Bestell-Nr. 33715)
Fa. Serva, Heidelberg
Solvent Blue 38-Pulver (LFB) (Bestell-Nr. S3382)
Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmBH, Taukirchen
Triton X-100
(Bestell-Nr. 1.12298.0101)
Fa. Merck, Darmstadt
Xylol
(Bestell-Nr. 8080)
Fa. J.T.Baker, Deventer, Niederlande
3.1.9 Lösungen für die Eponeinbettung
1.) 1% Osmium: 1g O2O4 wird in 50 ml a.d. über Nacht abgedunkelt gelöst und am nächsten Tag mit 0,1 M PBS verdünnt, um anschließend lichtgeschützt und kühl bis zum Gebrauch gelagert zu werden.
2.) Epon Stammlösung: 291,9 g Epon (Glycid-Ether 100) wird mit 165,8 g Methylnadic anhydride gemischt und 126,6 g 2-Dodecylsuccinic acid anhydrid zugegeben, dieses Gemisch wird ca. 1 Stunde gerührt und danach mit Parafilm verschlossen im Kühlschrank gelagert.
3.1.10 Lösungen für die Luxol Fast Blue-Färbung
1) Sulfitwasser: Zu 400 ml aqua dest. gibt man 20 ml 1 N HCL und 26 ml 10% wässrige Lösung Natriumdisulfat.
2) 0,5% Perjodsäure: 1g Perjodpulver wird in 200 ml a.d. gelöst.
3) Luxol Fast Blue: 0,5 g Solvent Blue 38-Pulver wird auf einem Magnetrührer in 500 ml 96% Alkohol gelöst und zur Konservierung 10 % Essigsäure zugesetzt.
3.1.11 Übersicht über die verwendeten Antikörper für die Immunhistochemie
Tabelle1: Übersicht über eingesetzte Seren und Antikörper
Serum Eingesetzte Konzentration Firma
normal goat serum (Bestell-Nr.S-1000)
3% Fa. Vektor Laboratories,
Burlingame USA
normal rabbit serum 3% Fa. Vektor Laboratories,
Burlingame USA normal rat serum
(Bestell-Nr.S-5000)
3% Fa. Vektor Laboratories,
Burlingame USA
gt= goat= Ziege, ms= mouse = Maus, rat= Ratte
3.2 Computer-Software Microsoft word 2000 Microsoft Exel 2000 Sigma Plot 2001
Sigma Stat, Version 2,0 Adope Photoshop 7,0 Primärer
AK
Klon Kon-
zentration
Firma Sekundäre biotinylierte
AK
Kon- zentration
Firma
PLP (Bestell-Nr.
MCA839G
plpc1 1:500 Fa. Serotec, Oxford
UK
gt α ms (Bestell-Nr.
BA-9200)
1:500 Vector Laboratories,
Burlingame USA MBP
(Bestell-Nr.
MAB382)
129-138 1:100 Fa.
Chemicon, Temecula,
USA
gt α ms (Bestell-Nr.
BA-9200)
1:500 Vector, Laboratories,
Burlingame USA MOG Überstand
von Hybridom
-zellen
1:5 ein
Geschenk von C.Linington
gt α ms (Bestell-Nr.
BA-9200)
1:500 Vector, Laboratories,
Burlingame USA Antinon-
phospho- neuro- filament
SMI-32
1:1000 Fa.
Sternberger monoclonals, Maryland
USA
gt α ms (Bestell-Nr.
BA-9200)
1:500 Vector, Laboratories,
Burlingame USA
GFAP (Bestell-Nr.
MAB360)
GA5 1:200 Fa.
Chemicon, Temecula,
USA
gt α ms (Bestell-Nr.
BA-9200)
1:200 Vector, Laboratories,
Burlingame USA NG2
(Bestell- Nr.05-710)
132.38 1:200 Fa. Upstate, Lake Placid,
USA
gt α ms (Bestell-Nr.
BA-9200)
1:500 Vector, Laboratories,
Burlingame USA MAC-3
(Bestell-Nr.
550292)
M3/84 1:50 Fa. BD
Pharmingen, San Diego,
USA
gt α rat 1:500 Vector, Laboratories,
Burlingame USA
3.3 In vitro Untersuchungen
Ziel der in vitro Untersuchungen bestand darin festzustellen, ob die Stimulation mit IFN-β in verschiedenen Konzentrationen die Proliferation und die Differenzierung von OPCs beeinflußt. Die in vitro Untersuchungen wurden an Primärzellkulturen durchgeführt, die von neugeborenen bis zwei Tage alten Sprague Dawley Ratten (CrlT:CD,von Charles River, England importiert, gezüchtet im Tierhaus der MHH) gewonnen wurden. Nach der Erstellung der Einzelzellsuspension wurden die Zellen unterschiedlich kultiviert, wodurch zum einen gemischte Gliazellkulturen und zum anderen gereinigte Oligodendrozytenvorläuferzellkulturen (OPC-Kulturen) gewonnen wurden. An den gemischten Gliazellkulturen (MGP) wurden Färbungen zum Proliferations- und Differenzierungsverhalten der Zellen durchgeführt. Im Gegensatz zu der reinen OPC- Kultur, entspricht diese Kulturform durch die Cokultivierung von OPCs mit anderen Gliazellen mehr physiologischen Bedingungen. Aufgrund der Ergebnisse der Differenzierung wurden dann im Anschluss entsprechende Untersuchungen an den gereinigten Vorläuferzellkulturen vorgenommen. Hierbei sollte der direkte Einfluss von IFN-β auf die Reifung der OPCs untersucht und indirekte Effekte, induziert durch Mikroglia und Makrophagen, ausgeschlossen werden.
3.3.1 Präparation der Pimärzellkulturen
Die Präparation der Primärkulturen wurde an neugeborenen bis zwei Tage alte Sprague- Dawley Ratten, nach der Beschreibung von McCathy & de Vellis (1980) durchgeführt (McCathy und de Vellis, 1980; Stangel und Bernhard, 2003). Die Ratten wurden durch einen Nackenschnitt getötet und die Gehirne entnommen. In Petrischalen mit Hank`s Balanced Salt Solution (HBSS) und 10 % Hepes Buffer (s. 3.1.4) wurden die Meningen mit Hilfe eines Mikroskops (Zeiss „Stemi DCR“) von den Gehirnen abpräpariert.
Anschließend wurden die Gehirne zweimal in Hank`s Balanced Salt Solution mit Hepes Buffer gewaschen, bevor sie mit Hilfe einer Rasierklinge zerkleinert wurden. Diese Suspension wurde bei 1891 g für 5 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert, das Zellpellet in 5 ml 0,1% Trypsin (s. 3.1.4) resuspendiert und bei 37°C für 20 Min.
inkubiert. Anschließend erfolgte die Zugabe von 5 ml 0,001% DNase (s. 3.1.4), das Röhrchen wurde mehrmals geschwenkt und im Anschluss erneut bei 1891 g für 5 Min.
zentrifugiert. Danach wurde der Überstand verworfen und 1ml trituating solution (S.
3.1.6.) zugegeben. Mit unterschiedlich großen Pasteurpipetten, wurde durch mehrfaches Auf- und Abpipettieren eine Einzelzellsuspension hergestellt.
3.3.2 Gewinnung der gemischten Gliazellkultur
Für die Kultivierung der gemischten Gliazellkulturen wurden die Zellen nach der Herstellung der Einzelzellsuspension mit Hilfe einer Neubauer-Zählkammer und 0,4%
Trypanblau Lösung (s.3.1.4) ausgezählt. Im Anschluss wurden die Zellen in einer Konzentration von 1 x 10 5 pro Vertiefung auf Poly-L-Lysine (s.3.1.4) beschichtete Glasdeckgläschen (s.3.1.4) in 24-well-Platten (s.3.1.4) ausplatiert und 20 Min. bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Nachdem die Zellen adheriert waren, wurden die Wells mit 500 µl Glia-Medium (GM) mit 10% wärmeinaktiviertem fötalem Kälber Serum (FCS) (s.3.1.4) und 1% Penicillin-Streptomycin (s.3.1.4) geflutet.
3.3.3 Kultivierung der gemischten Gliazellkultur
Am nächsten Tag wurde das Kulturmedium durch Gliamedium ersetzt, welchem IFN-β in verschiedenen Konzentrationen zugesetzt war. IFN-β (s.3.1.4) wurde in den Konzentrationen 1000, 100 und 10 U/ml eingesetzt. IFN-γ (s.3.1.4) wurde als zusätzliche Kontrolle in einer Konzentration von 100 U/ml verwendet. Das Glia-Medium (s.3.1.6) ohne Zusätze stellte in diesem Versuchsansatz die Kontrolle dar, zu der in der Auswertung alle anderen Medien verglichen wurden. CG4-Medium (s.3.1.6) fördert die Proliferation und verlangsamt die Differenzierung der OPCs (Stangel et al., 2000). Daher fungiert es bei Proliferationsversuchen als Positivkontrolle, bei Differenzierungsversuchen als Negativkontrolle. Der Mediumwechsel erfolgte alle drei Tage, insgesamt verblieben die Kulturen 7-10 Tage in Kultur. Mikroskopisch erkennbar bildete sich ein konfluenter Zellrasen aus, bestehend aus einer Astrozytenzellschicht, auf der sich sowohl Mikroglia als auch Oligodendrozytenvorläuferzellen entwickelten (Stangel und Bernhard, 2003). Im Anschluss an die Kultivierung wurden Proliferations- und Differenzierungsuntersuchungen vorgenommen.
3.3.4 Aufreinigung von Oligodendrozytenvorläuferzellen
Für die Isolierung von primären Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPC) wurde die Einzelzellsuspension (siehe oben) auf sechs Poly-L-Lysin beschichtete Kulturflaschen (s.3.1.4) aufgeteilt und im Inkubator bei 37°C und 5% CO2 in Gliamedium für 8 Tage belassen. Mit Hilfe eines Inkubations-Schüttlers (Edmund Bühler KS-15 control und TH15, s.3.1.1) wurde die nur lose anhaftende Mikroglia durch 30 minütiges Abschütteln entfernt und verworfen. Die Kulturflaschen wurden erneut mit 12 ml Gliamedium befüllt
und zur Wiederherstellung des CO2 Milieus für wenige Stunden in den Brutschrank zurückgestellt. Um die OPCs zu gewinnen, wurden die Kulturen für 12-16 Stunden geschüttelt. Die restliche Mikroglia, Makrophagen, Meningealzellen und Astrozyten wurden durch Anheftung an unbeschichtete Kulturflaschen für eine Stunde im Inkubator größtmöglich entfernt. Die im Überstand verbliebenen OPCs wurden gezählt und in einer Konzentration von 5x 104 pro Vertiefung, der 24 ger well-Platten, auf die Poly-L-Lysin beschichteten Objektträger verbracht. Nach 20 Min. Inkubation wurde zu den adherierten Vorläuferzellen 500 µl Medium zugegeben.
3.3.5 Kultivierung der gereinigten Oligodendrozytenvorläuferzellen
In den Versuchen mit gereinigten OPCs sollte der Einfluss des Interferon-β auf die Differenzierung untersucht werden. Aufgrund der hemmenden Wirkung des CG4- Mediums auf die Reifung der OPCs, wurde es daher als Negativkontrolle eingesetzt.
N2B3-Medium fungierte als Positivkontrolle. IFNβ wurde dem N2B3-Medium (s.3.1.6) in den Konzentrationen 1000, 100 und 10 U/ml und IFNγ mit 100 U/ml zugegeben. Die Differenzierungsuntersuchungen wurden nach zwei Tagen Kultivierung im Brutschrank durchgeführt.
3.4 In vitro-Versuche
3.4.1 Poliferationsassay
Untersuchungen zum Proliferationsverhalten der OPCs wurden anhand von Bromo-2`- Beoxy-uridine (BrdU) Inkorporation durchgeführt. Die Zugabe des BrdU (3.1.5) zu der gemischten Gliazellkultur erfolgte 24h vor der eigentlichen Färbung in einem Verhältnis von 1:100. Am darauf folgenden Tag wurden die Zellen im Well mit 300 µl Gliamedium gewaschen. Danach erfolgte die Zugabe des A2B5-Antikörpers (Hybridomüberstand s.3.1.5) in einer Verdünnung 1:2 für eine Stunde bei 37°C. Nach einem erneuten Waschschritt mit Gliamedium wurden die Zellen im Well mit vorgekühltem Methanol bei –20°C für 20 Min. fixiert und danach erneut mit Gliamedium gewaschen. Die DNA wurde mit 2M Salzsäure, die für eine Stunde bei 37 °C zugesetzt wurde, gespalten und im Anschluss durch zweimalige Waschungen mit 0,1% Boratpuffer inaktiviert. Nach einem erneuten Waschschritt mit Gliamedium wurde der primäre Antikörper gegen BrdU in einer Verdünnung mit Gliamedium von 1:100 für eine Stunde bei 37°C zugegeben. Die Zugabe der sekundären Antikörper anti-IgG konjugiertem Cy2 und anti-IgM konjugiertem Cy3