In vitro-Versuche

3.4.1 Poliferationsassay

Untersuchungen zum Proliferationsverhalten der OPCs wurden anhand von Bromo-2`-Beoxy-uridine (BrdU) Inkorporation durchgeführt. Die Zugabe des BrdU (3.1.5) zu der gemischten Gliazellkultur erfolgte 24h vor der eigentlichen Färbung in einem Verhältnis von 1:100. Am darauf folgenden Tag wurden die Zellen im Well mit 300 µl Gliamedium gewaschen. Danach erfolgte die Zugabe des A2B5-Antikörpers (Hybridomüberstand s.3.1.5) in einer Verdünnung 1:2 für eine Stunde bei 37°C. Nach einem erneuten Waschschritt mit Gliamedium wurden die Zellen im Well mit vorgekühltem Methanol bei –20°C für 20 Min. fixiert und danach erneut mit Gliamedium gewaschen. Die DNA wurde mit 2M Salzsäure, die für eine Stunde bei 37 °C zugesetzt wurde, gespalten und im Anschluss durch zweimalige Waschungen mit 0,1% Boratpuffer inaktiviert. Nach einem erneuten Waschschritt mit Gliamedium wurde der primäre Antikörper gegen BrdU in einer Verdünnung mit Gliamedium von 1:100 für eine Stunde bei 37°C zugegeben. Die Zugabe der sekundären Antikörper anti-IgG konjugiertem Cy2 und anti-IgM konjugiertem Cy3

(s.3.1.5) erfolgte in einem Verhältnis von 1:100 für eine Stunde bei 37°C nach einem weiteren Waschvorgang mit Gliamedium. Danach wurden die Deckgläschen vorsichtig drei mal mit Gliamedium gespült, zuletzt noch gründlich mit destilliertem Wasser, bevor sie mit Dabko (s.3.1.4) eingebettet wurden. Die Fixation der Deckgläschen wurden mit Corbit- Balsam (s.3.1.4) erzielt. Es wurden mit der 40x Vergrößerung des Leica DM LB Mikroskops, pro Objektträger, in 4-5 Gesichtsfeldern die absolute Anzahl an A2B5 positiven OPCs und die A2B5/BrdU doppelt positiven Zellen ausgezählt. In Abbildung 2 ist die Morphologie BrdU-positiver und A2B5-positiver OPCs dargestellt (s. Seite 42). Der Abbildung 3 ist der Prozentsatz der proliferierenden Vorläuferzellen von der Gesamtzahl der A2B5 positiven OPCs zu entnehmen.

3.4.2 Differenzierungsassay

Um die Differenzierung der Oligodendrozyten zu beurteilen wurden Doppelfärbungen mit dem Marker A2B5 für Oligodendrozytenvorläuferzellen und dem Oligodendrozytenmarker für reife Oligodendrozyten GalC (Galactosylceramid) (s.3.1.5) durchgeführt. Diese beiden Primärantikörper wurden am 9. Tag der Kultivierung in einem Verhältnis von 1:2, nachdem die Zellen mit Gliamedium gewaschen wurden, zusammen für 30 Min. bei 37°C zugegeben. Nach erneutem Waschen wurden die Zellen mit Methanol fixiert (siehe oben) und erneut gewaschen. Die sekundären Antikörper (IgG konjugiertes Cy2 und anti-IgM konjugiertes Cy3) wurden in einer Verdünnung von 1:100 für eine Stunde zugegeben, anschließend drei mal mit Gliamedium und ein mal mit destilliertem Wasser gespült und im Anschluss mit Dabko eingebettet. Es wurden in 5 Versuchen pro Objektträger mindestens 10 Gesichtsfelder in der 40x Vergrößerung des Leica DM LB Mikroskops ausgezählt. Die Morphologie von GalC-positiven Oligodendrozyten ist der Abbildung 2 auf Seite 42 zu entnehmen. Die absoluten Gesamtzahlen der einzelnen Medien wurden dann zueinander (A2B5 zu GalC) ins Verhältnis gesetzt. Ein geringer Wert besagt demnach, dass mehr ausgereifte Oligodendrozyten vorhanden sind als OPCs, bei einem hohen Ergebnis liegen entsprechend mehr Vorläuferzellen als reife Oligodendrozyten vor.

Während der Reifung der OPCs zu Oligodendrozyten nimmt die Anzahl der Fortsätze der Zellen zu (Mastronardi et al., 2004), so dass wir durch das Auszählen der Fortsätze pro Zelle ein weiteres Kriterium für die Differenzierung der OPCs in den gemischten Gliazellkulturen erhielten. Hierzu wurden von drei unabhängigen Experimenten für jedes Medium ca. 10 Aufnahmen mit der Leica-Kamera in der 40x Vergrößerung erstellt. Zwei

unabhängige Untersucher bestimmten von den GalC- gefärbten Zellen die Anzahl der Fortsätze pro Zelle.

3.4.3 Differenzierungsassay an gereinigten Oligodendrozytenvorläuferzellen

Aufgrund der Ergebnisse in den gemischten Gliazellkulturen und um beurteilen zu können ob Interferon-β direkt auf die Reifung der OPCs einwirkt, wurden an den gereinigten Oligodendrozyten nur immunhistologische Färbungen zur Differenzierung mit den Primärantikörpern A2B5 und GalC durchgeführt. Es wurden die selben Marker für reife und unreife Oligodendrozyten (GalC/A2B5) eingesetzt wie in gemischten Gliazellkulturen.

Der Ablauf der Färbung reiner OPCs verief unterschiedlich. Die Zellen wurden bis zur Fixation im Well belassen, erst mit Gliamedium gewaschen und anschließend die Primärantikörper in einem Verhältnis 1:2 appliziert. Nach einer Inkubationszeit von einer Stunde bei 37°C, wurden die Wells erneut gewaschen und anschließend bei Raumtemperatur für 12 Min. mit 4% Paraformaldehyd fixiert. Nachdem die Zellen mit Gliamedium gespült worden waren, erfolgte die Zugabe der Sekundärantikörper (Cy2 gekoppeltes anti-IgG und Cy3 gebundenes anti-IgM) für eine Stunde bei 37°C.

Letztendlich wurden die mehrfach mit Gliamedium und destilliertem Wasser gewaschenen Objektträger mit Dabko und Corbit -Balsam eingebettet.

Wie in den gemischten Kulturen wurde die Ratio von A2B5-positiven Zellen zu GalC-positiven Zellen pro Objektträger aus mindestens 10 Gesichtsfeldern in der 40x Vergrößerung des Leica DM LB Mikroskops ermittelt.

Eine Übersicht über die Färbungen zeigt Abbildung 2.

A

B C

Abb.2: Übersicht zur Morphologie von A2B5-positiven (A) und BrdU-positiven (B) OPCs und reifen GalC positiven Oligodendrozyten (C) in gemischten Gliazellkulturen in der 40x Vergrößerung unterschiedlicher Gesichtsfelder.

3.4.4 Statistische Auswertung der in vitro Daten

Es wurden sowohl in den gemischten Gliazellkulturen, als auch den gereinigten Oligodendrozytenkulturen pro Färbung je 5-6, für die Bestimmung der Fortsätze pro Zelle 3, voneinander unabhängige Experimente ausgewertet. Pro Objektträger wurden ca. 10 Gesichtsfelder ausgezählt. Die einzelnen Medien mit Zusätzen bzw. das CG4-Medium wurden zur Kontrolle (Gliamedium) verglichen. Bei Normalverteilung der Werte (Sigma Stat) wurde der zweiseitige students-t Test bei Gruppen mit gleicher Varianz durchgeführt.

Es wurde eine Irrtumswahrscheinlichkeit von p< 0,05 als signifikant angesehen. Bei nicht normal-verteilten Werten wurde der nicht parametrische Mann Whitney-U–Test (Rangsummen Test) durchgeführt. Auch hierbei wurde eine Irrtumswahrscheinlichkeit von p< 0,05 als signifikant berücksichtigt.