3 MATERIAL UND METHODEN
3.1 Geräte und Materialien
3.1.1 Geräte, Laborbedarf
Inkubator Fa. Heraeus, Osterode
Laborumlufttrockenschrank, Function line Fa. Heraeus, Osterode
Lamin Air HB2472 Fa. Heraeus, Osterode
Mikrowelle, Euronet MW4270 Fa. HTS Haustechnik-Service GmbH, Bremen
Paraffinschneidegerät RM2245 Fa. Leica Microsystems GmbH, Benshein
Pipetten Fa. Gilson, Langenfeld
Pipetus akku Fa. Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt
Edmund Bühler KS-15 control und TH15 (Schüttler)
Fa. Johanna Otto GmbH, Hechingen
Sterilbank Fa. CEAG-Schirp Reinraumtechnik,
Dortmund
Varioklave 250T Fa. H+P Labortechnik GmbH,
Oberschleißheim
Waagen Fa. Satorius, Göttingen
Wasserbad, 1052 Fa. GFL, Burgwedel
Wasserbad, 1083 Fa. GFL, Burgwedel
3.1.2 Zentrifugen:
Megafuge 2,0R Fa. Heraeus, Osterode
Eppendorf centrifuge 5417R Fa. Eppendorf, Hamburg
3.1.3 Mikroskope:
Te Laval 31 Fa. Zeiss, Göttingen
Axiostar, Zeiss 1031-031 Fa. Zeiss, Göttingen
Stemi DCR Fa. Zeiss, Göttingen
Leica DM LB und Leica Kamera DC300 Fa. Leica Microsystems GmbH, Bensheim
3.1.4 Reagenzien und Laborbedarf für die in vitro Untersuchungen:
3,3`,5-Trijodo-L-thyronine sodium salt (Bestell-Nr.T6397)
Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
4-Pregnene-3,20-dione (Progesteron) (Bestell-Nr.P8783)
Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Balanced Salt Solution (Hank`s) (Bestell-Nr.H9269)
Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Biotin
(Bestell-Nr.B-4639)
Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Boratpuffer 99%
(Bestell-Nr.B6768)
Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Bovines Serum Albumin (BSA) (Bestell-Nr. A-7030)
Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Corbit- Balsam Fa. Hecht, Sondheim
Deckgläser ∅12 mm (Bestell-Nr. P2312)
Fa. Roth, Karlsruhe
Deoxyribonuclease (Bestell-Nr. D5025)
Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen
D-MEM
Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Interferon-β
(Bestell-Nr.13400-1 Lot Nr. 0000)
Fa. PBL Biomedical Laboratories, New Jersay, USA
Interferon-γ
(Bestell-Nr.400-20 Lot Nr. 018109)
Fa. Peprotech Inc., New Jersay, USA
ITS culture supplement
(Bestell-Nr.354352 Lot. Nr.001403)
Fa. BD Biosience, Bedford, USA
Kulturflaschen
(Bestell-Nr. 83.1813.002)
Fa. Sarstedt AG & Co., Newton, USA
L-Thyroxine (Bestell-Nr. T1775)
Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Neuroblastom-Zellinie B104 Geschenk von PD Dr. Stangel, Hannover Penicillin-Streptomycin
(Bestell-Nr.P 0781)
Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
SFCA Filter (250ml) (Bestell-Nr.157-0020)
Nalgene NuncInternational, New York, USA
Triethylenediamine (Dabko) (Bestell-Nr.D2522)
Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Trypanblau Lösung (Bestell-Nr.T-6146)
Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmBH, Schnelldorf
Wellplatten (24 ) mit Deckel (Bestell-Nr. 662102)
Fa. Greiner, Frickenhausen
Wellplatten (4 ) Multidish (Bestell-Nr.176742)
Nunc, Roskilde, Dänemark
3.1.5 Antikörper für die in vitro Färbungen A2B5 (A2B5 clon 105)
(Bestell-Nr. ATCC CRL-1520)
Fa. ATCC, Manassas, USA
Bromo-2`-Beoxy-uridine (BrdU) (Bestell-Nr. 280879)
Fa .Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, USA
5- GalC (Galactosylceramid) (clon IC-07)
ECACC, über Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen
anti-IgG konjugiertes Cy2
(Bestell-Nr.315-225-008, Lot. Nr. 58996)
Jackson Immuno Research, West Grove, USA
anti-IgM konjugiertem Cy3
(Bestell-Nr.315-165-020, Lot. Nr. 45854)
Jackson Immuno Research, West Grove, USA
3.1.6 Verwendete Kulturmedien und Lösungen
A) CG4- Medium: 67 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium + Glutamine + Glucose (D-MEM)
30 ml B104CM (Hybridoma-Überstand der Neuroblastomzellinie B104)
1 ml Penicillin-Streptomycin (PS) 1 ml ITS culture supplement 5 µl Biotin
5 µl Progesteron 50 µl Putrescin
B) Gliamedium: 500 ml D-MEM
50 ml hitze-inaktiviertes FCS 5 ml PS
C) N2B3- Medium: 100 ml D-MEM 0,5 ml FCS 1ml PS 1ml ITS
10 µl Progesteron 100 µl Putrescin 10 µl Biotin
10 µl 3,3`,5- Trijodo-L-thyronine sodium salt (T3) 10 µl l-Thyroxine (T4)
D) Trituating Solution: 1% BSA
0,03 mg/ml Dnase
0,5 mg/ml Trypsin inhibitor
E) Serumfreies Medium für die Herstellung von B104 konditioniertem Medium ( B104 CM):
DMEM 1% IST
1% Penicillin/ Streptomycin
F) Serumhaltiges Kulturmedium für die Herstellung von B104 konditioniertem Medium:
DMEM 5% FCS
1% Penicillin/ Streptomycin
G) Herstellung von B104-Medium:
Für die Herstellung von B 104 konditioniertem Medium (B104 CM) wurden 1,5-2 x 106 Zellen der Neuroblastom-Zellinie B104 in Kulturflaschen (75 cm2) für 24 Stunden mit serumhaltigem Kulturmedium inkubiert. Die Kulturen wurden, nach 2x Waschen mit 10 ml PBS, mit serumfreiem Medium für drei Tage kultiviert. Der Überstand wurde abpipettiert, 5 bis 10 Min. bei 1891 g zentrifugiert, steril filtriert (SFCA Filter) und portioniert bei -20 °C bis zum Gebrauch tiefgefroren.
3.1.7 Verwendete Tiere
Sprague Dawley Ratten CrlT:CD, von Charles River, England importiert, gezüchtet im Tierhaus der MHH
C57Bl/6 Mäuse Harlan, Niederlanden
IFNβ-k.o.-Mäuse GBF, Braunschweig, Referenz: Erlandsson et al., 1998
Tierversuchsnummer: 03/671 “Charakterisierung von Regulationsfaktoren der De- und Remyelinisierung in genetisch veränderten Tieren“
3.1.8 Materialien und Reagenzien für die in vivo Untersuchungen
ABC Kit (Avidin-Biotin-Komplex) Fa. Vektor Laboratories, Burliname USA Bis(cyclohexanone)oxaldighydrazone
(Bestell-Nr.C 9012)
Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
DAB Chromogen (Bestell-Nr.S 3000)
Fa. Dako, Glostrup, Dänemark
Epon, Gycid Ether100 Roth, Karlsruhe
Essigsäure 96% Fa. J.T. Baker, Deventer, Niederlande Etanol absolut
(Bestell-Nr. 624
Fa. J.T.Baker, Deventer, Niederlande
Eukitt 100ml Fa. Kindler GmbH & Co, Freiburg
Fuchsin-sulfit reagent (Bestell-Nr. S5133-1L)
Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Glutaraldehyd Fa. Polysiences Varrington, PA, USA
H2O2 30%
Liquidblocker (PAP-Pen) Fa. SCI Sience Services, München Methylnadic anhydride
Natriumdisulfit (Bestell-Nr.Bt 6528)
Fa. Merck, Darmstadt
Osmium tetroxide (O2O4) (Bestell-Nr.O5500)
Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Perjodpulver Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
Steinheim Propylenoxid
(Bestell-Nr. 33715)
Fa. Serva, Heidelberg
Solvent Blue 38-Pulver (LFB) (Bestell-Nr. S3382)
Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmBH, Taukirchen
3.1.9 Lösungen für die Eponeinbettung
1.) 1% Osmium: 1g O2O4 wird in 50 ml a.d. über Nacht abgedunkelt gelöst und am nächsten Tag mit 0,1 M PBS verdünnt, um anschließend lichtgeschützt und kühl bis zum Gebrauch gelagert zu werden.
2.) Epon Stammlösung: 291,9 g Epon (Glycid-Ether 100) wird mit 165,8 g Methylnadic anhydride gemischt und 126,6 g 2-Dodecylsuccinic acid anhydrid zugegeben, dieses Gemisch wird ca. 1 Stunde gerührt und danach mit Parafilm verschlossen im Kühlschrank gelagert.
3.1.10 Lösungen für die Luxol Fast Blue-Färbung
1) Sulfitwasser: Zu 400 ml aqua dest. gibt man 20 ml 1 N HCL und 26 ml 10% wässrige Lösung Natriumdisulfat.
2) 0,5% Perjodsäure: 1g Perjodpulver wird in 200 ml a.d. gelöst.
3) Luxol Fast Blue: 0,5 g Solvent Blue 38-Pulver wird auf einem Magnetrührer in 500 ml 96% Alkohol gelöst und zur Konservierung 10 % Essigsäure zugesetzt.
3.1.11 Übersicht über die verwendeten Antikörper für die Immunhistochemie
Tabelle1: Übersicht über eingesetzte Seren und Antikörper
Serum Eingesetzte Konzentration Firma
normal goat serum (Bestell-Nr.S-1000)
3% Fa. Vektor Laboratories,
Burlingame USA
normal rabbit serum 3% Fa. Vektor Laboratories,
Burlingame USA normal rat serum
(Bestell-Nr.S-5000)
3% Fa. Vektor Laboratories,
Burlingame USA
gt= goat= Ziege, ms= mouse = Maus, rat= Ratte
3.2 Computer-Software