In vitro Ergebnisse

4.1.1 IFN-β hat keinen Effekt auf die Proliferation von OPCs in gemischten Gliakulturen

Für die Remyelinisierung von Entmarkungs-Läsionen ist unter anderem eine ausreichende Proliferation von OPCs notwendig. Um weitere Informationen über die Rolle von IFN-β in diesem komplexen Vorgang zu erhalten wurde getestet, ob durch Zugabe von IFN-β zu gemischten Gliakulturen, ein Einfluss von IFN-β auf das Proliferationsverhalten der OPCs vorliegt. Anhand von BrdU-Inkorporation konnte die Proliferation der OPCs bestimmt werden, ermittelt wurde der prozentuale Anteil der BrdU-positiven Zellen in der Population der A2B5-positiven OPCs. Gliamedium ohne IFN-β wurde als Kontrolle verwendet. CG4-Medium diente in diesem Versuchsansatz als Positivkontrolle (85,5%±8,6), da es die Zellen in einem proliferierenden Stadium mit nur langsamer Differenzierung hält. Die Zugabe von IFN-β in den Konzentrationen 10, 100, und 1000 U/ml zum Medium zeigte im Vergleich zu Gliamedium ohne Zusätze (69,2%±3,8) keine signifikanten Unterschiede. Für diese Konzentrationen ergaben sich Werte von 70,9%±8,7 (10 U/ml IFN-β); 67,8%±10,0 (100 U/ml IFN-β) und 60,5%±20,6 (1000 U/ml IFN-β) proliferierenden OPCs. Ein ähnliches Ergebnis lieferte die Zugabe von 100 U/ml IFN-γ, welches als weitere Kontrolle verwendet wurde, mit einem Proliferationsgrad von 64,8%±13,5.

Zusammengefasst zeigte sich, dass IFN-β keinen Effekt auf die Proliferation von OPCs in gemischten Gliazellkulturen hat (Abb.3) .

Proliferationsindex [% A2B5/BrdU +/+ Zellen]

Abb. 3: IFN-β in den Konzentrationen 10, 100 und 1000 U/ml hatte keinen Einfluss auf die Proliferation von Oligodendrozytenvorläuferzellen in gemischten Gliazellkulturen im Vergleich mit dem Kontrollmedium (GM). Angegeben ist die prozentuale Anzahl an proliferierenden, BrdU-positiven Zellen in der Population der A2B5 positiven Oligodendrozytenvorläuferzellen. CG4- Medium diente als Positivkontrolle.

4.1.2 IFN-β hemmt die Differenzierung von OPCs in gemischten Gliazellkulturen Um den Effekt von INF-β auf die Reifung der OPCs zu myelinformenden Oligodendrozyten zu untersuchen, wurde das Verhältnis von Vorläuferzellen zu reifen Oligodendrozyten ermittelt. Der Einfluss von IFN-β auf die Differenzierung von OPCs wurde zuerst an gemischten Gliazellkulturen untersucht. Diese Cokultur entspricht im Gegensatz zu den reinen Vorläuferkulturen aufgrund der vorhandenen Astrozyten und Mikroglia mehr den physiologischen Bedingungen im lebenden Organismus. Die Kontrolle (GM) ergab einen relativ geringen Wert von 3,87±0,95 für das Verhältnis A2B5-positiven-Zellen zu GalC-positiven-A2B5-positiven-Zellen im Vergleich mit der Negativkontrolle, die einen Differenzierungsindex von 10,04±5,67 aufwies. Die Zugabe von INF-β führte zu einer Zunahme von A2B5 positiven Zellen im Verhältnis zu den GalC positiven Zellen in allen eingesetzten Konzentrationen des INF-β im Vergleich mit dem Gliamedium. 100 und 1000 U/ml wiesen eine statistische Signifikanz mit einem Differenzierungsindex von 7,38±1,0 (p= 0,0006) und 7,50±1,28 (p= 0,006) auf. IFN-γ erreicht mit einem Differenzierungsindex von 7,69± 4,64 einen ähnlich hohen Wert wie IFN-β in den Konzentrationen 100 und 1000

U/ml, es lag jedoch keine statistische Signifikanz vor. Der Einsatz von 10 U/ml ergab einen geringeren Differenzierungsindex von 6,20±3,04 (Abb. 4).

Zusammenfassend konnte eine Hemmung der Differenzierung der Vorläuferzellen zu reifen myelinformenden Oligodendrozyten in MGP festgestellt werden.

Differenzierungsindex [A2B5/GalC Ratio]

Abb. 4: Einfluss verschiedener Konzentrationen von IFN-β auf die Differenzierung von Oligodendrozytenvorläuferzellen in gemischten Gliakulturen. Angegeben ist die Ratio von Vorläuferzellen zu differenzierten Zellen. IFN-β in den Konzentrationen 100 U/ml (p=0,0006) und 1000 U/ml (p=0,006) erwies sich als statistisch signifikant zum Gliamedium (GM). Das CG4-Medium diente als Negativkontrolle in diesem Versuchssetting.

Bei der Differenzierung der OPCs zu reifen Oligodendrozyten kommt es unter anderem zu einer Änderung der Morphologie der Zellen im Sinne einer Zunahme der Zellfortsätze (Mastronardi et al., 2004). Um die Ergebnisse der Differenzierung in MGP zu bestätigen, nutzten wir diesen Aspekt und bestimmten die Anzahl der Fortsätze pro Oligodendrozyt (F/Z) in GalC gefärbten MGPs. Die Anzahl der Fortsätze pro GalC-positiver Zelle in mit IFN-β behandelten Kulturen war im Vergleich zur Kontrollkultur (GM) vermindert. Dies bestätigt, dass weniger ausdifferenzierte Zellen vorlagen. Die Werte für IFN-β in den

Konzentrationen 100 U/ml und 1000 U/ml erwiesen sich mit 2,2± 0,13 und 2,35± 0,34 F/Z geringer als das Kontrollmedium mit 3,2± 0,42 F/Z und geringfügig höher als das CG4-Medium mit 2,15±0,57 F/Z. Interferon-β in einer Konzentration von 10 U/ml und Interferon-γ wiesen beide 2,6 F/Z auf (Abb.5). Die Standardabweichung betrug für 10 U/ml ±0,30 und für Interferon-γ ±1,22.

Fortsätze / Zelle

0 1 2 3 4 5

Negativkontrolle

Kontrolle INF-γγγγ

IFN-ββββ 10 U/ml IFN-β 100

β 100 β 100 β 100U/ml

IFN-ββββ 1000 U/ml

Abb. 5: Die Wirkung von verschiedenen Konzentrationen von IFN-β auf die Differenzierung von Oligodendrozytenvorläuferzellen in gemischten Gliakulturen, dargestellt anhand der Anzahl der Fortsätze pro Oligodendrozyt, n= 3. Das Gliamedium ist die Positivkontrolle zu der die zugesetzten Konzentrationen von IFN-β verglichen wurden.

Als Negativkontrolle wurde das CG4 Medium verwendet.

4.1.3 IFN-β zeigte keinen direkten Effekt auf die Differenzierung von gereinigten OPCs

An isolierten gereinigten OPCs wurde untersucht, ob die Stimulation von IFN-ß einen direkten Einfluss auf die beobachtete verminderte Differenzierung von Vorläuferzellen hat oder die Effekte über Gliazellen wie z.B. Astrozyten oder Mikrogliazellen beeinflusst werden. In diesem Versuchsaufbau stellt das N2B3-Medium die Kontrolle und das CG4-Medium die Negativkontrolle dar. Es zeigte sich, dass kein direkter Effekt des IFN-ß auf die Differenzierung der OPCs festgestellt werden konnte. Im Vergleich mit Kulturen, die mit N2B3-Medium behandelt wurden und einen Differenzierungsquotienten von 2,44±0,80 A2B5-positiven-Zellen zu GalC-positiven-Zellen ergaben, zeigte die Stimulierung von OPCs mit IFN-β in den Konzentrationen 10, 100 und 1000 U/ml mit einem Verhältnis von 3,0±0,67; 3,1±0,87 und 3,2± 0,89 A2B5-positiven-Zellen zu GalC-positiven-Zellen, keinen signifikanten Unterschied. Auch IFN-γ, hatte keinen Einfluss auf die Differenzierung der OPCs, die Ratio für diese Stimulation der Zellen ergab 3,11±1,13. Für die Kultivierung der OPCs mit CG4- Medium als Negativkontrolle konnte ein Differenzierungsindex von 9,94±5,17 A2B5-positiven-Zellen zu GalC-positiven-Zellen erhoben werden, siehe Abb.6.

Aus den vorliegenden Ergebnissen lässt sich schlussfolgern, dass die beobachteten hemmenden Effekte des IFN-β bei der Differenzierung von OPCs zu reifen Oligodendrozyten nicht direkt auf die OPCs sondern indirekt über andere Gliazellen vermittelt werden.

Differenzierungsindex [A2B5/GalC Ratio]

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